专利名称：脂质化干扰素及其应用的制作方法
技术领域：
本发明总的涉及生物医药领域。本发明涉及有效增加哺乳动物中多肽 的吸收与存留的方法和组合物。更特别地，本发明涉及肝摄取增加以及血 浆半衰期增加的脂质缀合干扰素。
背景技术：
干扰素a (IFN-a)被认为是目前影响了全世界约8亿人的慢性病毒性 肝炎的最有效抗病毒药物(Hoofnagle等，iV.五"g/.J.MW.336:347(1997))。然而， 半衰期短以及缺少肝脏特异亲和性妨碍了 IFN-a应答。持续应答仅在三分 之一的慢性乙肝病毒患者以及五分之一的慢性丙肝病毒患者中出现(Davis 等，iV.五"g/.J.Med.321:1501(1989);Poynard等，Hepatology 24:778(1996))。
最常见的用于修饰IFN-a的是聚乙二醇修饰。聚乙二醇化的IFN-a例 如，PEG-INTRON，因而被开发出来以延长其半衰期。然而，聚乙二醇修 饰导致了异质物种(Wang等,^fifv.Z)rwg Z)e"ve^ i ev.54:547(2002))。对于 PEG-INTRON，采用了一种非选择性琥珀酰亚胺碳酸盐化学并因此产生了 聚乙二醇化形式的混合物平均分子量为12,000道尔顿的聚乙烯乙二醇 (PEG)通过共价连接附着至IFN-a的至少14个氨基酸残基的氨基基团 (Wang等，39:10634(2000))。尽管用增加的PEGs分子量的聚 乙二醇化IFNs的血清半衰期增加，体外的效力显著减少了超过75%。增加 的亲水性以及蓬松性相应地减少了 IFN-ct对于肝脏的亲和性。
发明概述
本发明涉及脂质缀合的多肽，如治疗性多肽。修饰的多肽展示了增加 的血浆半衰期以及增加的肝脏摄取，从而增强了所述多肽的治疗效果。本发明的一个具体实施方式
涉及增加施用给对象后多肽的肝脏摄取的 方法，包括以脂质缀合所述的多肽。
本发明的另一个具体实施方式
涉及增加施用给对象后多肽的血浆半衰 期的方法，包括以脂质缀合所述的多肽。
本发明进一步涉及治疗对象的肝脏疾病的方法，包括给所述对象施用 脂质缀合的治疗性多肽。
在另一个的具体实施方式
中，本发明涉及脂质缀合的多肽，其中所述
多肽是治疗性多肽。
在附加的具体实施方式
中，本发明涉及包含脂质缀合多肽的药物组合物。
在一个具体实施方式
中，所述蛋白对肝脏疾病，如肝炎，是治疗性的。
在一个具体实施方式
中，所述多肽是干扰素，如IFN-a。在另一个的具体实
施方式中，所述脂质是棕榈酰半胱氨酸。
在一个具体实施方式
中，所述脂质是通过可逆连接，如多肽中的二硫
键的修饰，共价缀合至所述多肽的。 附图简述
本发明可通过相关的附图更好地理解。
图1A-1C是LC-MS谱的图形，阐明了棕榈酰半胱氨酸通过Cysl 、Cys29 和Cysl38位点(SEQIDNO:l-3)的二硫键缀合至IFN。
图2阐明了通过静脉注射施用给CF-1小鼠的PAL-IFN和IFN，相对于 时间分布的血浆浓度。
图3A禾n 3B分别是图形和柱状图，其阐明了 PAL-IFN、 IFN和 PEG-INTRON在静脉注射给CF-l小鼠15分钟、60分钟以及240分钟后的 血浆水平以及肝脏存留。
图4A禾n 4B分别是图形和柱状图，其阐明了 PAL-IFN、 IFN以及 PEG-INTRON在Sg-PC2细胞系以及原代培养的小鼠肝细胞中的吸收。
图5是柱状图，阐明了 PAL-IFN或IFN静脉注射至小鼠后，血清中IFN 的活性恢复。图6A和6B分别是免疫印迹图以及柱状图，其阐明了静脉注射PAL-IFN 或IFN至小鼠后肝脏中0AS1的表达。
图7是圆二色谱图，阐明了 PAL-IFN和IFN的相似结构。
发明详述
本发明涉及具有增加的血浆半衰期以及肝脏摄取的脂质缀合多肽，及 其在治疗疾病如肝脏疾病中的应用。
本发明可以任意的多肽如治疗性多肽来实施。就本发明的目的而言， 术语"多肽"涉及包含三个或更多个氨基酸的氨基酸链。多肽可以是由天然 来源分离的，或由本领域熟知的方式诸如重组DNA技术或固相合成而制 备。用于本发明的多肽可以仅包含天然存在的L氨基酸、L氨基酸和其它 氨基酸(包括D氨基酸和修饰的氨基酸)的组合、或仅有除L氨基酸以外 的氨基酸。在本发明的一个具体实施方式
中，脂质缀合通过在多肽上至少 一个活性巯基基团而形成。在很多情况下，多肽包含半胱氨酸残基(一种 包含巯基基团的氨基酸)。不包含巯基基团的多肽可通过本领域所熟知的步 骤修饰，特别地，已知的硫醇化制剂(如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二巯基) 丙酸盐(SPDP)以及2-亚氨基硫醇(Traut，s试剂))可常规应用于该目的。
治疗性多肽的例子包括但不限于免疫球蛋白，促红细胞生成素，干 扰素诸如IFN-a、 IFN-(3、 IFN-y， al蛋白酶抑制剂，血管生成素，抗凝血 酶ni， beta-酸脱羧酶，人生长激素，牛生长激素，猪生长激素，人血清白 蛋白，牛小肠碱性磷酸酶，囊性纤维化跨膜调节子，因子vm，因子IX， 因子X，胰岛素，乳铁蛋白，组织型纤溶酶原激活剂，髓鞘碱性蛋白，胰 岛素，胰岛素原，催乳素，乙型肝炎抗原，免疫球蛋白片段(如FABs)， 单克隆抗体CTLA4Ig，标签72单克隆抗体，标签72单链抗原结合蛋白， 蛋白质C，细胞因子及其受体，包括例如肿瘤坏死因子cx和P，其受体及其 衍生物；肾素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋 白；CX-l-抗胰蛋白酶；卵泡刺激素；降转素；促黄体生成素；胰高血糖素； 威勒布兰特因子；心房纳尿因子；肺表面活性物质；尿激酶；蛙皮素；凝 血酶；造血生长因子；脑啡肽酶；人巨噬细胞炎性蛋白质(MIP-1-alpha);血清白蛋白诸如繆勒氏管抑制因子(mullerian-inhibiting substance);松弛
素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；(3-内酰胺酶； DNA酶；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF);激素或生长因子 的受体；整合素；蛋白质A或D;类风湿因子；神经营养因子诸如骨髓来 源神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3、 -4、 -5或-6 (NT-3,NT-4，NT-5 或NT-6)，或神经生长因子诸如NGF-P;血小板衍生生长因子(PDGF); 成纤维细胞生长因子诸如aFGF以及bFGF;表皮生长因子(EGF);转化生 长因子(TGF)诸如TGF-a禾卩TGF-(3，包括TGF- 1、 TGF-2、 TGF-3、 TGF-4 或TGF-5;胰岛素样生长因子I和II (IGF-I和IGF-II); des(l-3)-IGF-I(大 脑IGF-I);胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白诸如CD-3、 CD-4、 CD-8
以及CD-19;骨诱导因子；免疫毒素；骨形成蛋白(BMP);集落剌激因子
(CSFs)如M-CSF、GM-CSF以及G-CSF;白细胞介素(ILs)如IL-1至IL-12;
超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原诸 如例如AIDS包膜的部分；转运蛋白；归巢受体；禀呈素(addressins);调 节蛋白；抗体；嵌合蛋白诸如免疫粘附素，以及上面所列任意多肽的片段 或融合物。这些蛋白的核酸以及蛋白质序列可从公开数据库诸如GenBank 获得。
在一个具体实施方式
中，所述的治疗性多肽对肝脏疾病具有疗效，从 而利用缀合多肽增强的肝脏摄取。肝脏疾病的例子包括并不限于肝炎(如 病毒性肝炎)、肝硬化、肝癌、脂肪变性以及酒精肝疾病。对肝脏疾病具有 疗效的多肽包括但不限于，干扰素诸如IFN-a、 IFN-(3或IFN-y。
就本发明的目的而言，术语"脂质"涉及脂质基团本身或包含脂质基团 的烃基基团(特别地， 一个或多个氨基酸)。术语"脂质基团"意思是由4到 26个碳原子，优选5到19个碳原子组成的疏水取代基。合适的脂质基团包
括但不限于下列棕榈基(C15H31);油烯基(C,5H29);硬脂酰基(<:17^5);
胆酸以及脱氧胆酸。
脂质可以通过本领域已知的任何连接方式缀合到多肽(参见例如，美
国专利5,907,030; 6,590,071)。在本发明的一个具体实施方式
中，脂质通过
可逆性连接缀合至多肽。可逆连接的机制包括并不限于二硫键还原、水解以及光解键切割(参见例如美国专利5,505,931及其引用的参考文献)。 已公开的PCT申请WO 96/22773以及WO 98/13007公开了包含巯基的肽和 蛋白质的跨细胞递送和释放。包含巯基的多肽的细胞吸收可通过二硫键缀 合脂质而增加。不稳定的二硫键容易还原，提供了一旦在体内从脂质释放 多肽的机制。基于水解的递送系统是本领域已知的，其中多肽与整合了单 克隆抗体或靶向其它特定细胞的底物的有机酸相缀合(参见美国专利 4,764,368; 4,618,492; 5，505,931以及5，563，250)。特异性结合至靶细胞后， 这些缀合子递送所述多肽至细胞内，其中水解反应在细胞内释放游离多肽。
在本发明的一个具体实施方式
中，脂质缀合的多肽是IFN-a。在另一个 的具体实施方式
中，IFN-a与棕榈酰半胱氨酸如至少两个、如三个或四个棕 榈酰半胱氨酸分子缀合。在一个具体实施方式
中，IFN-a与棕榈酰半胱氨酸 可逆地缀合，如通过在IFN-a的一个或多个半胱氨酸残基与棕榈酰半胱氨 酸的半胱氨酸基团之间形成二硫键。
本发明进一步涉及通过给对象施用本发明的脂质缀合多肽治疗对象的 疾病或病症的方法。术语"治疗"涉及用于包括预防、缓解或治愈疾病或病 症的目的的、针对对象的脂质缀合多肽的施用。修饰的多肽可应用本领域 已知用于治疗疾病或病症的技术，通过多肽的递送而施用给对象。在一个具体实施方式
中，脂质缀合多肽存在于药物组合物中或作为药物组合物的 部分施用。
本发明的用于施用的药物组合物可包括至少一个药学上可接受形式的 本发明的脂质缀合多肽，任选地与药学上可接受的载体组合。这些组合物 可以通过任何能达到它们预期目的的方式施用。例如，施用可通过口服、 胃肠外、皮下、静脉内、肌肉内、腹腔内、经皮、鞘内、颅内或鼻腔内途 径。施用的剂量取决于受者的年龄、健康状况以及体重、并行治疗的类型， 如果有的话，治疗的频率以及所期望效果的性质。本发明的施用量以及方 案可由那些临床治疗领域的普通技术人员容易地确定。
施用的形式也可包括乳液、纳米颗粒(如固体脂质纳米颗粒)、脂质体、 微球、微胶囊、气溶胶通过吸入以及透皮剂形式。
合适的胃肠外施用的制剂包括水溶形式化合物的溶液。此外，可施用化合物的悬浮液如合适的含油注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括 脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯。水性 注射悬浮液可含增加悬浮液的粘度的物质，包括例如，羧甲基纤维素钠、 山梨醇和/或葡聚糖。任选地，水溶液/或悬浮液还可以含有稳定剂和/或缓 冲液，诸如硼酸盐缓冲液等等。
本发明的药物制剂以其已知的方式制备，例如，通过常规的混合、制 粒、糖衣制作、溶解或冻干步骤的方式。因此，用于口服的药物制剂可通 过活性化合物与固体赋形剂的混合而获得，如果需要或必须，任选地在添 加合适的助剂后研磨得到的混合物以及加工颗粒混合物，以获得片剂或糖 衣丸。
合适的赋形剂是，如填充剂诸如糖类、乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇； 纤维素制剂和/或磷酸钙，诸如磷酸三转或磷酸氢钙；以及粘合剂诸如淀粉 糊，采用例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、塔卡 蓝胶(tagamnth)、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/ 或聚乙烯吡咯垸酮。如果需要，可加入崩解剂诸如上面所提到的淀粉和羧 甲基淀粉、交联聚乙烯吡咯垸酮、琼脂或褐藻酸或其盐诸如藻酸钠。助剂 是，首先，流量调节剂以及润滑剂，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸或其 盐，诸如硬脂酸镁或硬脂酸钙，和/或聚乙二醇。给糖衣丸提供合适的包衣， 如果需要，该包衣能抵抗胃液。为此目的可应用浓縮的糖溶液，其任选地 含有阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶 液和合适的有机溶剂或混合溶剂。为了生产抵抗胃液的包衣，应用了合适 的纤维素制剂溶液诸如乙酰纤维素邻苯二甲酸酯或羟丙基甲基纤维素邻苯 二甲酸酯。也可以提供包被来保护本发明的脂质缀合多肽避免过早暴露于 酸性环境。参见美国专利4，786，505以及4,853,230中制备具有保护不受胃 酸影响的核的剂量单位的方法。优选地，所述核是中性或碱性的。
碱性核包含有一个或多个碱性反应化合物诸如描述于美国专利 4,786,505以及4,853,230。可加入染料或色素至片剂或糖衣丸包衣，例如用 于识别以区分活性化合物剂量的组合。
其它的可采用的药物制剂包括但不限于由明胶制成的口服推入配合
8(push-fit)胶囊、直肠栓剂、用于口服和/或鼻腔施用的吸入制剂、鼻腔或 直肠乳膏或软膏(任选地与药学上可接受的载体组合、渗透促进剂、赋形 剂和/或填充剂)。采用的适合的渗透促进剂包括阳离子、阴离子、两性和中
性渗透促进剂诸如苯扎氯铵、三氯叔丁醇(chlorbutanol)、阿佐蒽(azone)
以及本领域己知的其它物质。
下面的实施例是示例性的，不限制本发明的方法。通常在医学治疗和 药物科学中常遇到的、且对本领域技术人员来说明显的各种不同病症和参 数的合适修饰和改编在本发明的范围和精神之内。
实施例1 "
棕榈酰化人干扰素ct的合成(PAL-IFN)
人IFN-a通过二硫键特异性缀合棕榈酰半胱氨酸至IFN-a的半胱氨酰 残基而可逆地脂质化。通过这种合成策略，产生了均质、单种缀合的 PAL-IFN。更重要地，PAL-IFN中的二硫键连接将确保体内(可能是肝脏) 还原反应后未修饰IFN-a的释放(Shen等，"肽和蛋白质药物送递"(Peptide and Protein Drug Delivery) , S.Frokjer， L.Christrup， P.Krogsgaard-Larsen，编 (Munksgaard,哥本哈根,1998)第397-408页)。结果是，释放的IFN-a在肝 脏局部延长了循环期，从而增强了对病毒性肝炎的治疗效果。比较PAL-IFN 和聚乙二醇化以及未修饰IFN-a的药物动力学、生物学分布以及体内生物 学活性，证明了 PAL-IFN作为具有改善了递送和肝脏靶向性质的新型修饰 IFN的效能。
人干扰素a(hIFN-a)从生物远见公司(BioVision，芒廷维尤，加利福尼 亚州)获得。在随后的说明和附图中，IFN仅指hIFN-a。将50微克(pg)IFN 溶解于包含0.5。/。Chaps的200^iLPBS中。将新制备的二硫苏糖醇(DTT) (811L，lmg/ml)加入到溶液中以还原IFN的二硫键。在37。C孵育1小时后， 加入24pLN-棕榈酰半胱氨酰2-吡啶二硫化物(Pal-CPD)至反应混合物， 并在室温下继续孵育一小时。
使用HPLC分析监测整个反应。HPLC在Hewlett-Pcckard 1050 HPLC 系统(宾夕法尼亚州的阿文达勒(Avondale))上，应用250x4.6mmPhenomenex Jupiter C4柱(美国加利福尼亚州的托兰斯)实施。流动相是 5%的乙腈的0.1%的三氟醋酸溶液(A)以及95%的乙腈的0.1%的三氟醋酸 溶液(B)。预先设定梯度洗脱，以10%的B开始，在15分钟内增加至100%B 并在100%B再停留5分钟。在214nm检测。通过HPLC分析，IFN在10.98 分钟洗脱，并且PAL-IFN缀合物作为单峰在13.112分钟洗脱。
实施例2 PAL-IFN的鉴定
应用液相色谱-离子阱质谱(LC-MS)鉴定PAL-IFN的修饰。10pg的 PAL-IFN以新制备的1%胰蛋白酶在37"C消化2小时，重复所述消化另外2 小时，然后补充新的1%胰蛋白酶过夜。通过添加5%的乙酸终止胰蛋白酶 消化。所述样品应用C18旋转柱脱盐。
应用与RP-LC联用的Thermo Finnigan LCQ Deca XPPlus质谱仪进行 PAL-IFN的质谱分析，所述RP-LC配有采用来源于微技术科技公司 (Micro-Tech Scientific)的150mmx75, C-18反相(RP)柱(5拜300A粒 子)的Ultra Plus II LC系统(微技术科技公司，安大略的布罗克维尔)。处 于95。/o溶剂A (2%乙腈，0.1%甲酸)禾B5o/o溶剂B (95%乙腈，0.1%甲酸) 的肽被加载至Michrom Bioresources肽帽阱，随后以5-60%溶剂B线性梯度 洗脱65分钟，并以60-90%溶剂B洗脱10分钟。串联MS/MS谱通过Xcalibur 1.2软件获得。全质谱扫描后跟随着前述全扫描的三个最高离子峰的三个连 续MS/MS扫描。
允许动态排除，使得在1分钟内1个离子3次出现后，所述离子被置 于排除列表上3分钟。其它质谱数据产生参数如下所述碰撞能35%，全 质谱扫描质量范围400-1800m/z，最小MS信号5xl0"计数，最小MS/MS 信号5xl()3计数。质谱仪装配有应用未包被10|im-ID SilicaTipTMPicoTipTM 纳米发射源(新物镜公司(New Objective)，沃本，马萨诸塞州)的纳米喷雾 离子源(热电公司(Thermo Electron))。质谱仪的喷雾电压是1.9kV并且 加热的毛细管温度是180°C。
获得的MS谱如下面所分析。应用热电公司的利用SEQUEST算法的九节点(2cpu/节点)聚群计算机上的Bioworks Beta测试版(Bioworks 3.1) 确定获得的图谱与人干扰素ct蛋白质数据库中的交叉相关性评分。为鉴定 Cys缀合的PAL肽，应用了+358.559(PAL分子重量)的微分修饰。其它的 SEQUEST参数包括阈值1000;单一同位素；酶胰蛋白酶；电荷状态 自动。为鉴定肽，检查超过交联阈值vs.电荷状态(1.5用于+1离子，2.0 用于+2离子，2.5用于+3离子)的图谱，以证实所有主要的离子均被鉴定。 MS/MS图谱也可以手动验证。
IFN-a中有4个半胱氨酰残基形成2个二硫键(Cysl-Cys98; Cys29-Cys138)。棕榈酰半胱氨酸与Cysl、 Cys29和CysH8的缀合通过 LC-MS鉴定。图1显示了 Cysl(A)、Cys29(B)以及Cysl38(C)修饰的质谱图。 含有Cys98的胰蛋白酶消化片段太大而不能从LC-MS的C18 RP色谱柱中 被洗脱。然而，由于还原的半胱氨酰残基在蛋白质中是不稳定的，Cysl (图 1A)的修饰推断出Cys98也已经被脂质化。
实施例3
体内的PAL-IFN相对于时间的血浆水平
雄性CF-1小鼠，每只重27-30克，实验前可自由获取食物和水，用于 动物实验。'"I-PAL-IFN和^I-IFN通过尾静脉施用给小鼠。在注射后5分 钟、15分钟、30分钟、1、 2、 4以及8小时，每个实验组处死3只动物并 从心脏收集血液。通过6000rpmlO分钟离心血液收集200)LiL血浆。全蛋白 以20%冰冷三氯乙酸沉淀，用伽马计数器测定沉淀物中的放射性。
图2显示，PAL-IFN在各个观察时间点的血浆浓度显著高于IFN。血 浆PAL-IFN水平展示了分布相和消除相，然而IFN主要显示消除相。从曲 线上计算，PAL-IFN的消除半衰期是3.28小时，与未修饰IFN的半衰期(0.73 小时)相比，其显著地延长了。
实施例4
体内IFN、 PAL-IFN和PEG-INTRON血浆浓度和肝脏停留的比较 PAL-IFN的血浆水平及其肝脏停留进一步与IFN和PEG-INTRON的相比较。125I-IFN、 125I-PAL-IFN以及125I-PEG-INTRON静脉注射至CF-1小鼠。 小鼠在注射后15、 60以及240分钟处死。测量每只小鼠200(aL血浆及全肝 脏内的放射性。
显示PAL-IFN的消除速率比PEG-INTRON和IFN的慢(图3A)。此夕卜， PAL-IFN以显著的更高浓度停留在肝脏中(图3B)。作为注射60分钟后的 例子，PAL-IFN注射剂量(ID)的18.89%被吸收至肝脏，相比之下在同一 时间点肝脏中的IFN为3.66%的ID ，PEG-INTRON为5.92%的ID 。
实施例5
PAL-IFN的细胞摄取
在Sg-PC2细胞系以及原代培养肝脏细胞中测量PAL-IFN、 IFN和 PEG-INTRON的细胞摄取。
Sg-PC2是转染了 HCVRNA自我复制子的人肝脏细胞系huh-7。Sg-PC2 以2.5xl05每孔的密度接种于12孔板，在37°C、加湿5%(302气氛、 DMEM/10%FBS中培养直至细胞达到汇合。细胞以PBS洗涤一次，然后以 含有125I-IFN、125I-PAL-IFN或125I-PEG-INTRON的DMEM/10%FBS在37°C 孵育2小时。然后细胞以胰蛋白酶消化并收获来测量放射性。所述结果显 示于图4A。 Sg-PC2中的PAL-IFN摄取比PEG-INTRON高17倍，比IFN 高9倍。
PAL-IFN肝细胞摄取的增加在原代培养小鼠肝细胞中进一步得到确 认。原代培养的肝细胞通过小鼠肝脏的胶原酶溶液灌注而获得。肝细胞以 2.5xl()S每孔的密度接种于12孔板，在含有10%FBS的DMEM/F12中培养 24小时。然后细胞以125I-IFN、 125I-PAL-IFN或125I-PEG-INTRON孵育。在 孵育10分钟、30分钟以及2小时的时候收集细胞以测量放射性。数据以摄 取均值(ng/孔)iSD来表达。如图4B所显示的，摄取入细胞的PAL-IFN随 孵育时间的延长而增加。在每个观测时间点，PAL-IFN的摄取显著高于 PEG-INTRON或IFN。例如，孵育后2小时，细胞内的PAL-IFN水平比IFN 高2.5倍，比PEG-INTRON高8.6倍。实施例6
PAL-IFN静脉注射至小鼠后血清中IFN活性的恢复
PAL-IFN或IFN以O.lmg每kg体重(BW)通过尾静脉施用给CF-l 小鼠。每个实验组的3只小鼠在注射后IO分钟、2、 4和8小时处死。从心 脏收集血液，血液在4'C凝结过夜后通过6000rpm离心30分钟获取血清。
血清中的IFN活性采用针对Daudi细胞的抗增殖分析来定量。Daudi 细胞以2.5xl0"细胞/ml的密度接种于96孔板，并在加湿5%(:02气氛、371: 培养。三倍系列稀释的血清和IFN标准品添加至细胞。四天后，每孔中移 液20|iL CellTiter 96 Aqueous One溶液试齐ij (普咯美卡公司(P腿ega)，麦 迪逊，新泽西州)，记录490nm的吸收值以分析每孔中的细胞增殖。从相应 IFN标准.曲线的刺激而生成的计算公式，计算每孔中的血清IFN活性的量。
图5显示，PAL-IFN在体内以低但持续的水平(达8小时)再生IFN 活性。与之相比，在天然IFN施用给小鼠后，血清IFN活性在注射两小时 后迅速地减少至不可检测的水平。
实施例7
体内2',5'寡腺苷酸合成酶1 (0AS1)表达的诱导
肝脏0AS1表达用作IFN诱导的抗病毒活性的替代品标志。27-30克重 的CF-1小鼠随机分组。每组中的3只小鼠分别静脉注射PBS、0.2mg/kgBW 的IFN，以及0.2mg/kg BW的PAL-IFN。注射后24小时，处死小鼠并切除 肝脏。
一片湿肝脏组织(0.5g)在5ml修饰的裂解缓冲液(50mMTris-HCl， 50mMKCl， 3mMMg(OAc)2， 0.3mM EDTA， 10%的甘油，0.01%NaN3， 0.5% Triton-XlOO， O.lmM苯甲基磺氟酸酯(PMSF)， 7mM2-巯基乙醇，pH7.5) 中匀浆。肝脏匀浆液在20，800xg、 4。C离心30分钟，并且将上清分成等份 在-8(TC保藏。上清液中的总蛋白浓度通过BCA蛋白质分析(Pierce Biotechnology, Rockford， IL)来确定。
肝脏提取物的等分式样(对应于300吗的湿组织)被纳入12%的十二 垸基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，并随后通过在恒定的200mA进行湿法印迹90分钟，将其转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。所述 的膜在5%脱脂奶粉中室温封闭1小时，然后以1: 500稀释的兔抗0AS1 多克隆抗体(阿比根公司(Abgent)，圣迭戈，加州)在4。C孵育过夜。随 后洗涤膜并以1: 50,000稀释的过氧化物酶缀合山羊抗兔IgG在室温孵育1 小时。信号的检测通过膜与ECL plus试剂(阿莫沙姆生物科学公司 (Amersham Biosciences),皮斯卡塔市，新泽西州)孵育l分钟，随后将膜 暴露至X射线胶片2分钟进行。每道的密度通过Quantity One软件(生物 辐射公司(BioRad)， Hercules, CA)定量。为规范每张膜的蛋白加载量， 在剥去膜并以小鼠抗卩肌动蛋白单克隆抗体重新杂交后而测量13肌动蛋白。 如图6所显示，以PAL-IFN处理显著增强了肝脏中的0AS1蛋白质水 平，相对于以天然IFN处理，在24小时后增加了 2.5倍。OASl是一种良 好定义的千扰素诱导的蛋白质。其催化源于ATP的2',5'连接的寡腺苷酸的 合成，命名为2-5A。 2-5A结合并激活核糖核酸酶L，其剪切mRNA，导致 病毒复制的抑制。OAS1诱导直接地与IFN抗病毒效率相关。因此，肝脏 局部OAS1表达上升显著增强PAL-IFN对病毒性肝炎的治疗效果。
实施例8
以远紫外圆二色谱鉴定PAL-IFN
PAL-IFN和IFN从HPLC洗脱和收集。为获得远紫外(Far-UV)圆二 色谱(CD)，将lpMPAL-IFN的50Q/。乙腈/0.1。/oTFA溶液加载至具有1.0cm 路径长度的比色杯中。比色杯位于Jasco J810分光光度计(杰斯科公司 (Jasco Inc)，伊斯顿，马萨诸塞州)中。以室温下100次在190-260nm波 长范围的扫描收集完整谱图。在相同条件下收集IFN和缓冲液(50%乙腈 /0.1%TFA)谱图。PAL-IFN和IFN谱图减去缓冲液谱图。最终的谱图数据 采用Origin7软件(起源实验室公司(OriginLab Corporation),北安普敦， 马萨诸赛州)分析。
如图7所显示，PAL-IFN的CD谱图实质上被IFN的所重叠，其指示 PAL-IFN具有近似天然IFN的结构。222nm的深峰(deep peak)指示PAL-IFN 和IFN均主要含有a螺旋。本发明至此已经完整地描述，本领域技术人员应当理解，相同的技术 方案可在广泛的以及等效范围的条件、配方以及其它参数施行，而不影响 本发明或其任意具体实施方式
的范围。本发明所引用的所有专利、专利申 请以及出版物在此以其全部内容以引入的方式纳入本发明。
权利要求
1、一种多肽，其包含可逆地与棕榈酰半胱氨酸缀合的干扰素α。
2、 权利要求1的多肽，其中所述干扰素cc是人干扰素(x。
3、 权利要求1的多肽，其中所述干扰素ct通过一个或多个半胱氨酸 残基缀合。
4、 权利要求1的多肽，其中所述干扰素oc与至少两个棕榈酰半胱氨 酸分子缀合。
5、 权利要求4的多肽，其中所述干扰素a与四个棕榈酰半胱氨酸分 子缀合。
6、 一种包含权利要求1所述多肽的药物组合物。
7、 一种治疗对象的肝脏疾病的方法，包括对所述对象施用权利要求 1的多肽。
8、 权利要求7的方法，其中所述肝脏疾病是病毒性肝炎。
9、 一种增加施用给对象后的干扰素a的肝脏摄取的方法，包括用棕 榈酰半胱氨酸可逆地缀合多肽。
全文摘要
本发明针对有效增加哺乳动物中多肽的吸收与存留的方法和组合物。本发明提供了具有增加的肝脏摄取以及增加的血浆半衰期的脂质缀合干扰素。
文档编号A61K38/21GK101568350SQ200780039858
公开日2009年10月28日 申请日期2007年10月29日 优先权日2006年10月27日
发明者沈维强, 袁莉云 申请人:沈维强;袁莉云