萘酸、1,10-邻菲啰啉稀土配合物、制备方法及其抗真菌的应用的制作方法

专利名称：：萘酸、1,10-邻菲啰啉稀土配合物、制备方法及其抗真菌的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种稀土配合物，特别是一种以萘酸、1,10-邻菲喂啉为配体的稀土配合物，属于微生物抑菌
技术领域：
。技术背景稀土，我国储备资源占世界80%左右，稀土有着独特的电子层和核结构，并具有很好的抗菌、消炎、抗肿瘤等作用。二十世纪以来，有关稀土在生命科学领域的研究不断被报道。由于低毒特性，使其抗菌性能在农业、医疗卫生方面有着很好的应用前景。如硝酸铈由于对烧伤有很好的治疗作用已经作为杀菌消炎剂而应用到临床。稀土通过抑制病原菌的生长和繁殖来提高作物的抗病性等。随着高新技术的日益发展，配位化学的研究也迈向了一个新的台阶，其中，具有特殊物理、化学和生物化学功能的配位化合物不断合成，从而为医学界发现真正独特而新颖的药物提供了基础。考虑到稀土离子有很好的配位能力，所以其配合物的合成及活性的研究受到人们的重视。大量实验表明稀土有机配合物具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等作用，且多数稀土配合物的抗菌活性高于配体及稀土离子，主要是由于稀土与配体发生了协同作用，并且比许多有机合成物或过渡金属配合物的毒性低，为开发稀土抗菌剂提供了理论依据。现有技术中公开的研究成果主要集中在简单的稀土无机或者有机盐类对细菌的抑制作用，虽然其抑菌性强，抑菌谱广，但溶液的酸性较强，对真菌的生长呈双重效应，其抗真菌性能有待进一步研究。因多数稀土配合物具有杀菌能力强，抑菌谱广，溶液酸性接近生理pH等优点，研制新的稀土配合物将有利于抑菌剂研发，对微生物工业领域的应用将提供有益的借鉴。为此，研制一种具有强的抗真菌性，价格低廉，且能广泛应用到微生物、农业、医疗、环境等方面的稀土配合物具有重要意义。
发明内容本发明的目的是提供一种以萘酸、1，10-邻菲啰啉为配体，抑菌效果优于单纯的稀土离子的稀土配合物，.其制备方法以及其在抑制真菌中的应用。本发明采取的技术方案是这样的本发明提供的稀土配合物的结构式为REL3pheivnH20;其中RE是稀土元素Eu3+、Tb3+、Gd3+、La3+、丫3+中的任何一种；L是a-Naphthoicacid、,Naphthoicacid、a-Naphthlceticacid、"-Naphthlceticacid四种萘酸中的一禾中，四种萘酸的中文名称分别为a-萘甲酸、P-萘甲酸、a-萘乙酸、P-萘乙酸，英文简写为a-NMA、p-NMA、a-NAA、卩-NAA，化学式分别是，a-Cnt^O"p-CuHW"a-C12H902、|3-C12H902;Phen是1,10-邻菲啰啉(l，10-phenanthroline)的縮写，化学式为Q2HgN2;11=0或1。本发明所说的稀土配合物的制备方法包括以下步骤(1)分别将Eu203、Tb407、Gd203、La203、Y203溶于浓盐酸中，蒸发水分，浓縮结晶，制得相应的五种稀土氯化物EuCl3*6H20、TbCl3*6H20、GdCl3.6H20、LaCl3.6H20、YC13,6H20;(2)以L为第一配体，选择a-萘酸，I,IO邻菲喂啉为第二配体，上述五种稀土氯化物都按照RECl3.6H20丄:phen-l:3:l的物质的量的比称取，分别用95%的乙醇溶解，得到五种稀土氯化物的乙醇溶液、两种配体(x-萘酸和phen乙醇溶液-,(3)将两种配体溶液混合，调节pH值至67;将混合溶液逐滴加入到RECV6H20稀土氯化物溶液中，期间有白色沉淀生成，搅拌反应3~5h;REC13'6H20代表EuCl3.6H20、TbCly6H20、GdCl3.6H20、LaCl3'6H20、YC13'6H20中的一种；(4)混合液静置12h，抽滤，用95%的乙醇洗涤3次，在红外干燥箱中烘干，即为合成的配合物，分别得到以a-萘甲酸和1，10-邻菲啰啉为配体的五种配合物；以另外三种萘酸配合物为第一配体的配合物的合成方法与a-萘甲酸、1,10-邻菲啰啉稀土配合物的合成方法相同，将第一配体a-萘甲酸分别用卩-萘甲酸、a-萘乙酸、P-萘乙酸替换即可。按以上方法所合成物质的化学式为-Eu(cc画CuH702)3d2H8N2.H20、Tb(a-CuH702)3d2HsN2.H20、Gd(a-CH702)3C12H8N2.H20、La(a-CH702)3C12H8N2、Y(a-CuH^CuHsN^Eu((3-CH702)3C12H8N2、Tb(p-CH702)3C12H8N2、Gd^CuH^O^CuHsN^Y(p-CH702)3C12H8N2、Eu(a-C12H902)3C12H8N2、Tb(a-C12H902)3C12H8N2、Gd(a-C12H902)3C12H8N2、La(a-C12H902)3C12H8N2、Y(a-C12H902)3C12H8N2、Eu(|3-C12H902)3C12H8N2、Tb((3-C12H902)3C12H8N2、Gd()3-C12H902)3C12H8N2.H20、La(p-C12H902)3C12H8N2、Y(13-C12H902)3C12H8N2。共19种。稀土配合物抑菌实验(1)比较稀土配合物、配体、稀土离子的抑菌效果用滤纸片法对典型的真菌进行抑菌实验将活化好的菌接种于液体培养基中，3(TC培养1618h(约109个/1111);取YPD酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基(YeastPeptoneDextroseAgar)培养基融化后冷却至4850°C，每20ml加入500^1菌液迅速摇匀，倒板，贴滤纸片在平板上，每个滤纸片加2(^1待测溶液；置于3(TC恒温生化培养箱培养23d;并做三组平行实验，观察结果，统计数据，计算平均值；(2)测定配合物对酵母菌的浓度效应，配制浓度梯度药品，同样采用滤纸片法进行测定；(3)用锇酸-戊二醛双固定法固定菌体，通过扫描电镜观察配合物对菌体的作用。结果显示药品对其细胞壁有破坏作用，而且配合物的抑制酵母菌作用有浓度剂量效应。本发明取得的有益效果是本发明给出的稀土配合物合成方法简单；经对合成的稀土配位化合物进行抑菌测定，证明稀土配合物对酵母菌有显著抑制效果，比单纯的离子、配体抑菌效果显著。图1给出的是酵母菌的扫描电镜照片。图2给出的是用稀土离子Eu处理以后酵母菌的扫描电镜照片。图3给出的是用1,10邻菲啰啉处理以后酵母菌的扫描电镜照片。图4给出的是用EU(a-NMA)3phervH20处理以后酵母菌的扫描电镜照片。具体实施方式以下实施例用于说明本发明。实施例1稀土配合物的合成本发明提供的稀土配合物的结构式为REL3phervnH20;其中RE:可以是稀土元素中Eu"、Tb3+、Gd3+、La3+、Y"的任何一种；n=0或1;L为第一酉己体可用oc-Naphthoicacid,Naphthoicacid,a曙Nap固ceticacid,"-Naphthlceticacid四种萘酸中的一种，四种萘酸的中文名称分别为a-萘甲酸、P-萘甲酸、a-萘乙酸、p-萘乙酸；Phen为第二配体Phen是l,lO-邻菲卩罗啉(l，lO-phenanthroline)的縮写，化学式为C12H8N2;—共是19种配合物，稀土配合物的组成和化学式由下表列出表一合成的稀土配合物的组成和化学式列表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>稀土配合物的合成步骤如下(1)稀土氯化物的制备准备五个烧杯做好标记，依次加入Eu203、Tb407、Gd203、La203、Y203。稀土氧化物的纯度均为99.99%。然后都加入浓盐酸；蒸发水分，浓縮结晶；分别制得氯化稀土EuCly6H20、TbCl3.6H20、GdCl3'6H20、LaCl3.6H20、YC13.6H20，备用；(2)以a-萘甲酸为第一配体，l，lO-邻菲啰啉为第二配体，稀土氯化物按照RECly6H20:a-萘甲酸:pher^l:3:l的物质的量的比分别称取；取五个烧杯标号1，2，3，4，5，将称取的稀土氯化物EuCl3.6H20、TbCl3.6H20、GdCl3.6H20、LaCl3'6H20、YC13'6H20，依次放入五个烧杯中。再取两个烧杯标号6，7分别称取a-萘甲酸、l,lO-邻菲啰啉；7个烧杯的药品都分别用适量95%的乙醇溶解；(3)将两种配体溶液混合，在电磁搅拌情况下用lmol丄"NaOH溶液调节配体混合溶液pH值至67;然后将配体溶液分别逐滴加入到以上五个烧杯的稀土氯化物溶液中，期间有白色沉淀生成，搅拌反应35h。(4)将混合物静置12h，抽滤，用95%的乙醇洗涤3次，在红外干燥箱中烘干，得到以a-萘甲酸和1，10-邻菲啰啉为配体的五种配合物；1号烧杯得到Eu(a-NMA)3phen'H20;2号烧杯得到Gd(a-NMA)3phen'H20;3号烧杯得到Tb(a-NMA)3phen，H20;4号烧杯得到La(a-NMA)3phen;5号烧杯得到Y(a-NMA)3phen;(5)以另外三种萘酸配合物为配体的配合物的合成方法与a-萘甲酸、l，lO-邻菲啰啉稀土配合物的合成方法相同。第二配体不变，第一配体cx-萘甲酸分别用p-萘甲酸、a-萘乙酸、(3-萘乙酸替换即可。实施例2配体，DMF(N,N-二甲基甲酰胺)，稀土离子，稀土配合物抑菌性的比较以DMF为溶剂，配制0.012mol/L的1,10-邻菲卩罗啉、四种萘酸、Eud3、Tbcl3、Gdcl3、Lacl3、Ycl3以及Eu(a-NMA)3phen.H20、Tb(a-NMA)3phen.H20、Gd(a-NMA)3phen'H20、La(a-NMA)3phen、Y(a-NMA)3phen、Eu(p-NMA)3phen、Tb(f3-NMA)3phen、Gd(|3-NMA)3phen、Y(J3-NMA)3phen、Eu(a-NAA)3phen、Tb(a-NAA)3phen、Gd(a-NAA)3phen、La(a-NAA)3phen、Y(a-NAA)3phen、Eu(卩-NAA)3phen、Tb(j3-NAA)3phen、Gd(|3-NAA)3phen.H20、La(p-NAA)3phen、Y(卩-NAA)3phen溶液。用滤纸片法(d=0.6cm)比较配体、DMF、稀土离子、配合物对酵母菌生长的影响。配制YPD(酵母膏胨葡萄糖培养基，英文名YeastPeptoneDextrose)培养基，1000mL(蛋白胨20g酵母粉10g)定溶至950rnL调PH-6.5灭菌121°C20min。液体培养基冷却后加入40%灭过菌的葡萄糖50ml。固体培养基用时再加葡萄糖。选取酵母菌保藏菌种，活化34次，得到活性较好的菌。将活化好的菌接种于YPD(酵母膏胨葡萄糖培养基，英文名YeastPeptoneDextrose)液体培养基中，30°C180rpm摇培16~18h(约1()9个/ml)。取YPD酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基(YeastPeptoneDextroseAgar)融化后冷却至4850°C，加入灭过菌的40%葡萄糖(950mL/50mL)摇匀。然后每20ml加入500|li1菌液迅速摇匀，倒板，贴滤纸片在平板上，每个滤纸片加20(il待测溶液。置于30。C恒温生化培养箱培养23d。并做三组平行实验，观察结果，统计数据，计算平均值。实验结果表明配合物有显著抑菌效果，对照有机溶剂DMF(N，N-二甲基甲酰胺)、a-NMA等萘酸配体没有抑菌性。稀土离子有弱抑菌性，Phen抑菌性没有配合物抑菌效果显著。实施例3药品浓度对酵母菌生长影响的测定采用滤纸片法(d-0.6cm)进行定量抑菌实验配制浓度梯度(0.004mol/L、0.008mol/L、0.01mol/L、0.012mol/L)的各种配合物，将有同种药品不同浓度的滤纸片贴在同一平皿上观察药品浓度对真菌生长的影响。培养基的配制与实例2相同。选取酵母菌保藏菌种，活化34次，得到活性较好的菌。将活化好的菌接种于液体培养基中，3(TC180rpm培养18h(约109个/1111)。取YPD酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基(YeastPeptoneDextroseAgar)培养基融化后冷却至4850。C，每20ml加入50(^1菌液迅速摇匀，倒板，贴滤纸片在平板上，每个滤纸片点加20pl待测溶液。置于3(TC恒温生化培养箱培养23d。观察结果。做三组平行实验，并统计结果，计算平均值。实验结果表明稀土配合物的浓度与其对酵母菌的抑制作用成正比关系，药品浓度越大对酵母菌的抑制性越显著。表2奈甲酸稀土配合物对酵母菌的抑菌圈直径列表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例4扫描电镜观察本实验采用锇酸一戊二醛双重固定法进行电镜样品的制备。(1)取培养好的新鲜菌悬液各1000mL装入1.5mlEP管，分三组。并加一管做对照。(2)取上述其中三管菌液离心，弃上清，各组分别加Eik13'6H20、Phen、Eu(a-NMA)3phen'H20500pl进行处理。(3)将处理好的菌株及其对照离心，弃上清，用制备好的磷酸缓冲液清洗3次(清洗时轻轻吹吸，离心，弃上清)。(4)加戊二醛40(Hil固定23h，再用磷酸缓冲液清洗3次(方法同3)。(5)换用锇酸固定0.5lh，磷酸缓冲液清洗3次(同上)。(6)乙醇梯度脱水，取梯度30%，50%,70%，90%，100%(100%两次)。(7)叔丁醇置换两次，将叔丁醇处理好悬浊液适量均匀涂在事先裁好的盖玻片上，一起固定在载物台上。(8)抽真空干燥，彻底千燥的样品经离子溅射仪溅射4分钟，进行电镜观察。结果分析在照片中可以看到未处理过的酵母菌表面光滑，用Phen配体处理后菌体表面没有可见的变化。用离子处理后菌体表面有少量的沉积物，配合物处理后的酵母菌菌体表面有大量的沉积物。这可能与配合物的较好脂溶性有关。稀土元素及其配合物对菌体细胞形态有不同程度的破坏，较之单纯的稀土盐离子或相应的配体，稀土配合物对菌体细胞形态破坏作用尤其明显，从SEM图片上可以看出，配合物使菌体粘连，并大量沉积在菌体表面，破坏细胞壁，使细胞壁变形，菌体死亡。认为配合物的抗菌性可能是由于配合物脂溶性较好，易于和细胞壁上C=0、P=0结合，浓度较大时，细胞壁通透性被破环，不再是菌体完整的屏障。配合物进入细胞影响胞内酶的活性，影响DNA的复制。权利要求1、一种以萘酸、1，10-邻菲啰啉为配体的稀土配合物，其特征在于结构式为REL3phen·nH2O；其中RE是稀土元素Eu3+、Tb3+、Gd3+、La3+、Y3+中的任何一种；L是α-Naphthoicacid，β-Naphthoicacid，α-Naphthlceticacid，β-Naphthlceticacid四种萘酸中的一种；Phen是1，10-邻菲啰啉；n＝0或1。2、如权利要求1所说的稀土配合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤:(1)分别将Eu203、Tb407、Gd203、La203、Y203稀土氧化物溶于浓盐酸中，蒸发水分，浓縮结晶，制得相应的稀土氯化物EuC1^6H20、TbCl36H20、GdCl3.6H20、LaCl3.6H20、YC13.6H20;(2)以L为第一配体选用a-萘酸，I，IO邻菲啰啉为第二配体，五种稀土氯化物都按照RECl3'6H20i(a-萘酸)phen=l:3:l的物质的量的比称取，分别用95%的乙醇溶解，得到五种稀土氯化物的乙醇溶液、两种配体L((x-萘酸)和phen乙醇溶液；(3)将两种配体溶液混合，调节pH值至67,将混合溶液逐滴加入到RECly6H20稀土氯化物溶液中，搅拌反应3~5h;(4)混合液静置12h，抽滤，用95%的乙醇洗涤3次，在红外干燥箱中烘干，得到以a-萘甲酸和l，10-邻菲啰啉为配体的五种配合物。3、根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中第一配体L分别用p-萘甲酸、cc-萘乙酸、p-萘乙酸替换，制备的稀土氯化物为EuCl3'6H20、TbCl3.6H20、GdCl3-6H20、LaCl3.6H20、YC13.6H20。4、一种如权利要求l所述的稀土配合物的应用，其特征是稀土配合物在抑制真菌中的应用。全文摘要本发明公开了萘酸、1，10-邻菲啰啉稀土配合物及其抑制酵母菌的作用。稀土配合物结构式为REL₃phen·nH₂O；其中RE是稀土元素Eu³⁺、Tb³⁺、Gd³⁺、La³⁺、Y³⁺中的任何一种；L是α-Naphthoicacid，β-Naphthoicacid，α-Naphthlceticacid，β-Naphthlceticacid四种萘酸中的一种；n＝0或1。以L为第一配体，邻菲啰啉为第二配体，按照RE³⁺∶L∶phen＝1∶3∶1的物质的量的比，加乙醇溶解，混合两种配体，加入到稀土氯化物溶液中，搅拌反应合成配合物；采用滤纸片法对真菌进行抑菌实验，发现稀土配合物对酵母菌有显著抑制效果，比单纯的离子、配体抑菌效果好，而且配合物的抑制酵母菌作用有浓度剂量效应。本发明为研发微生物抑菌剂提供了有益的借鉴。文档编号A61P31/10GK101235048SQ200810054579公开日2008年8月6日申请日期2008年2月29日优先权日2008年2月29日发明者刘金玲,楠杨,王瑞芬,娜赵,赵宝华,马亚娟申请人:河北师范大学