专利名称：：黃芪甲苷在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及黄芪甲苷的新用途，特别是在抗乙型肝炎病毒方面的应用。黄底甲苷(astragalosideIV)为从中药黄芪中提取出来的三萜皂苷类化合物，其分子式为C41H68014,分子量784，化学名为3-0-"-D-吡喃木糖基_6-0^_1>吡喃葡萄糖基黄芪皂醇，结构式如下所示。黄芪是传统中药，祖国医药认为黄芪有补气升阳、利水消肿、益气固表之功效，而将其归属"补气"之药。现代药理研究表明黄芪具有多种功效，黄芪的提取物具有抗水疱性口炎病毒(VSV)，流感病毒、副流感病毒I型、柯萨奇病毒、孤儿病毒等功效。黄芪甲苷具有抗柯萨奇B病毒以及治疗脑血管疾病的疗效(CN1502336A、CN1843370A)。黄芪药材用于多种抗乙肝的复方中药，混合物黄芪总皂苷具有一定的抗乙肝病毒活性，但单体化合物黄芪甲苷抗乙肝病毒的活性没有被发现。
背景技术：
：另一方面，乙肝病毒(HBV)可引起病毒性乙型肝炎、肝硬化及肝癌等疾病，严重影响人类的健康。目前针对HBV没有特效药，现在具备疗效的药物如核苷类、干扰素等药物价格昂贵、副作用大。因此开发抗HBV疗效好、价格低，副作用较小的天然药物是目前医药行业的一个热点。
发明内容本发明要解决的技术问题即是提供一个中药的单体化合物一一黄芪甲苷在制备抗乙肝病毒的药物中的应用。其中，本发明所说的"抗乙肝病毒"包括抑制乙肝病毒表面抗原(如HBsAg)和/或e抗原(如HBeAg)的表达，和/或抑制乙肝病毒DNA(如HBV-DNA)的复制。本发明人在体外细胞试验时发现黄芪甲苷具有明显地抑制HBsAg和HBeAg的活性，动物体内试验则提示黄芪甲苷对DHBV鸭血清中的DHBVs抗原和DHBV-DNA，以及DHBV鸭肝脏中的DHBV-DNA均有显著的抑制作用。因此，黄茛甲苷可以开发成制备抗乙肝病毒、特别是预防或治疗病毒性乙型肝炎的药物。具体实施方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。实施例中所用的黄芪甲苷标准品为成都思科华生物技术有限公司产品，对照品拉米夫定(3TC)取自上海市食品药品监督管理局。实施例l:体外细胞试验按照国家卫生部药政局制定的《新药(西药)临床前研究指导原则》(1993)所规定乙肝病毒细胞方法进行体外细胞试验。1、细胞及细胞培养本研究采用的实验模型为HepG22.2.15细胞，该细胞株被转染了HBVDNA，能产生HBV病毒颗粒。细胞培养液为DMEM培养液，含10。/。(v/v)胎牛血清，0.03%(g/ml)谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素，380吗/mlG418(抗生素)。细胞于37。C，5%<:02进行培养。2、药物的细胞毒性检测HepG22.2.15细胞在96孔细胞培养板中培养48小时后，加入不同浓度黄芪甲苷培养液(800，400,200,100，40吗/ml)及作为对照的拉米夫定培养液，继续培养9天(每3天换液一次)，用MTT法检测细胞存活率，确定药物对HepG22.2.15细胞的毒性浓度。3、药物对HBsAg和HBeAg的抑制率检测HepG22.2.15细胞在96孔细胞培养板中培养48小时后，加入不同浓度黄芪甲苷培养液及作为阳性药物对照的拉米夫定培养液(无毒浓度下)，继续培养9天(每3天换液一次)，收集上清液，用上海实业科华生物技术公司的HBsAg和HBeAg诊断试剂盒(ELISA)检测HBsAg和HBeAg(按试剂盒说明书进行操作)。抑制率(％)=(未用药的抗原值-用药的抗原值)/未用药的抗原值X100。/。实验结果样品细胞毒性HBsAg抑制率HBeAg抑制率(%)(%)黄芪甲苷40吗/mL未见毒性17.720.5黄芪甲苷100pg/mL未见毒性23.622.9黄芪甲苷200jLig/mL未见毒性31.823.3拉米夫定(3TC)1OOpg/mL未见毒性20.119.7拉米夫定(3TC)200吗/mL未见毒性34.923.1以上实验和结果表明黄芪甲苷对HepG22.2.15细胞分泌的HBsAg和HBeAg具有明显的抑制作用，黄芪甲苷具有抑制乙肝病毒的作用。实施例2黄芪甲苷体内抗乙肝病毒药效试验51、抑制鸭血清DHBVs抗原试验1.1试验材料l丄l毒株鸭乙肝病毒(DHBV)，新鲜分离的阳性麻鸭血清。l丄2动物北京雏鸭，1日龄，上海稳德福食品公司昆山周市联营厂提供(l丄3血清DHBVs抗原的检测方法见参考文献[闻玉梅、张维、楼惠珍等.PLC/PRF/5肝癌细胞系产生乙型肝炎表面抗原的研究.复旦学报(医学版)(上海第一医学院学报)，1982，9(1):1-6]。l丄4受试药物(黄芪甲苷)用0.5%CMC溶液配制成三个不同剂量的供试液黄芪甲苷120mg/kg(大剂量组)，40mg/kg(中剂量组)和10mg/kg(小剂量组)供试液。1.2试验方法(参见赵艳玲，蔡光明，张新金等.赋肝能抗病毒作用实验研究.中国药学杂志，2001，5:305-308及黄正明，杨新波，曹文斌等.水芹提取物抗鸭乙型肝炎病毒机理的研究.科学通报，1997，17:1863-1867):1曰龄北京雏鸭取血检测，阴性鸭静脉感染病毒后7-10天取血检测，去除阴性鸭，将阳性鸭按三个剂量给药(120mg/kg，40mg/kg，10mg/kg)，另设病毒对照组(给生理盐水)和阳性药物对照组(恩替卡韦Entecarvir，上海中美施贵宝制药有限公司，批号0703681，剂量0.01mg/kg)。口服给药一日一次。给药后第10天和停药后3天取鸭血分离血清。将各组鸭感染前、后、治疗期间和停药后血清标本测定血清DHBVs抗原用geneQuant定量，计算不同剂量组抗原的变化，应用Totallab(Version1.1)软件计算抑制率(％)。第13天杀剖鸭，采血，检测各项指标。拙a/ft、(病毒对照组DHBVs抗原值一药物使用组DHBVs抗原值)"廳，抑制率(％)=-病毒对照组DHBVs抗原值-"00%1.3结果，如表2所示。表2黄芪甲苷对鸭血清DHBVs抗原的抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、黄芪甲苷对DHBV鸭血清中DNA的抑制率(。/cO2.1试验材料中HBV-DNA检测，采用地高辛试剂盒。余同上述试验材料1.1。2.2试验方法阳性药物对照组采用拉米夫定200mg/kg。将各组鸭感染前、后、治疗期间和停药后血清标本测定血清DHBV-DNA，计算不同剂量组DHBV-DNA的变化，计算抑制率(％)。第13天杀剖鸭，采血，检测各项指标。应用Totallab(version1.1)软件计算抑制率(％)，余同上述试验方法1.2。0/、(病毒对照组DNA值一药物使用组DNA值)y，m。,抑制率(％)=病毒对照组DNA值X100/02.3结果，如表3所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>552.00/o32.0%18.0%67.5%1047.00/026.0%15.0%78.5%1339.0%23.0%10.0%31.26%实验结果显示黄芪甲苷对DHBV鸭血清中DNA有显著的抑制作用。3、黄芪甲苷对肝脏DHBV-DNA的抑制作用3.1试验材料中DHBV-肝脏DNA检测，采用地高辛试剂盒。余同上述试验材料1.1。3.2试验方法1日龄北京雏鸭取血检测，阴性鸭静脉感染病毒后8天取血检测，去除阴性鸭，将阳性鸭按三个剂量给药(120mg/kg，40mg/kg，10mg/kg)，另设病毒对照组(给生理盐水)和阳性药物对照组(拉米夫定3TC200mg/kg)。口服给药一日一次。给药后共10天，停药后3天(第13天)杀剖鸭，取肝，均浆后提肝脏DNA，做southern杂交，检测肝脏DHBV-DNA。应用Totallab(version1.1)软件计算抑制率(％)。满i承/o八(病毒对照组DNA值一药物使用组DNA值)______,抑制率(％)=-病毒对照组匪值-X画％3.3结果，如表4所示。表4黄芪甲苷对DHBV鸭肝脏中DHBV-DNA的抑制黄芪甲苷量120mg/kg40mg/kg10mg/kg3TC(200mg/kg)抑制率27.30/018.4%8.0%40.06%实验结果显示黄芪甲苷对鸭肝脏DHBV-DNA有显著的抑制作用。综上所述，各项实验结果表明黄芪甲苷具有显著抗乙肝病毒活性<权利要求1、黄芪甲苷在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用。2、如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物为防治病毒性乙型肝炎的药物。全文摘要本发明公开了黄芪甲苷的一种新用途，即在制备抗乙肝病毒的药物，包括防治病毒性乙型肝炎的药物中的应用。文档编号A61K31/7042GK101244075SQ200810083838公开日2008年8月20日申请日期2008年3月6日优先权日2007年4月10日发明者珮周,孔德云,王曙光,海黃申请人:上海医药工业研究院