专利名称：：一种中药成分的新用途的制作方法
技术领域：
：-本发明属于天然药物化学领域和医药领域，涉及一种中药有效成分抗细菌生物膜方面的新用途。
背景技术：
：金银花来源于忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb)、红腺忍冬(LonicerahypoglaucaMi。)、山银花(LoniceraconfusaDC)、或毛花柱忍冬(LoniceradasystylaRehd)的干燥花蕾或带初开的花。该药材同属植物约200种，我国有98种，分布于全国各地，广西是金银花的主要产地。在市场流通可供药用的商品药材可达47种，应用于临床的该药材制剂达百种以上。其主要成分包含绿原酸(chlorogenicacid)等有机酸，该成分具有一定的抑菌、抗炎、抗氧化作用。细菌生物膜(Biofilm，BF)是细菌在白然界存在的主要形式，细菌附于物体表面，在不利于其生长的环境下产生藻酸盐多糖使细菌相互粘连，并被细菌分泌的基质所包裹的具有一定功能的膜样结构。研究认为，多数细菌以BF菌的方式粘附于组织或物体表面，既能获得营养物质，又能保护细菌免受巨噬细胞吞噬以及表面活性物质、抗菌药物对其的不利影响，因此BF菌常常对抗菌药物耐药。在一定条件下，细菌可从生物被膜中游出，成为浮游细菌，引起感染。根据近年美国国立卫生研究院(Nm)的报告，60%以上的微生物感染是由BF菌引起的。该感染具有常见、难治、易反复发作、高死亡率等特点。特别是目前各种医学生物材料，如气管导管、静脉置管、外科生物材料和各种引流管应用的R益增多，使控制BF菌感染显得更加重要。目前防治细菌生物膜相关疾病的研究主要有以下几方面1改变生物医学材料的质地，选用表面光滑、低表面能的材料；镀银或涂布有洗必泰/磺胺嘧啶银、氯已定的生物材料对细菌的黏附有抑制作用；制造含有抗菌药物的生物材料通过控释技术缓慢释放，杀灭在生物材料定植的细菌。2药物作用14、15元环大环内酯类抗生素具有抑制和破坏细菌生物膜的作用。3采用藻酸盐单克隆抗体和酶学调控降低细菌生物膜感染。4阻断QS系统或者基因调控，进而抑制细菌生物膜感染。5中药制剂穿心莲内酯以及大蒜素等药物对细菌生物膜具有一定的3干预作用。本课题组研究发现，金银花水煎液B」以抑制绿脓杆菌生物膜的形成，并对已形成的生物膜具有破坏作用。因此本课题组对金银花干预绿脓杆菌生物膜的有效成分进行筛选发现，绿原酸可以抑制绿脓杆菌黏附、生物膜的形成，并对已形成的生物膜具有一定的破坏作用。目前尚未见相关报道。
发明内容本发明的目的，在于提供一种新型抑制细菌生物膜形成和破坏细菌生物膜的药物，为研制开发抗细菌生物膜药物和新材料提供新的天然活性物质。本发明通过以下技术方案完成，具体内容包括与空白对照组和红霉素组比较，金银花有效成分能抑制细菌对无机固体表面的黏附、抑制细菌生物膜的形成并能破坏已形成的细菌生物膜，并进一步研究可能的医药用途。本发明所说的金银花活性成分的分子式是(216111809，分子结构式如式I所示-OHHOOCHOHOH式I:绿原酸分子结构式具体实施方式-l绿原酸(chbrogenicacid)、头孢他啶(CAZ)、红霉素(EM)、对实验菌的最低抑菌浓度(MIC):用试管二倍稀释法测定每种药物对实验菌的MIC，同时平行测定其对质控菌株ATCC27853的MIC作质量控制。表1药物对细菌的MIC(ug/ml)bacterialchlorogenicacidEMCAZPA0130001282ATCC27853300012822绿脓杆菌生物膜模型的建立将培养过夜的PAOl，调至0.5麦氏单位，再用生理盐水1:200稀释，每试管加入5毫升，每管置入无菌BF载体1片(lcit^的气管导管片断)，37'C培养24小时后换液，以后每48小时用1/2LB-生理盐水换液。3抑制RaBF形成实验分为空白对照组、EM组和绿原酸组。开始建模时，就加入药物干预。EM组药物浓度为16ug/ml，绿原酸组为1/4MIC。每组均于建模24小时、7天后采用连续稀释法行活菌计数，每次测定均重复测定3次取平均值。建模3天行SEM，建模7天行银染法和SEM观察BF。3.124小时黏附实验结果SEM观察，空白对照组可见大量分布均匀的微菌落和游离细菌，而EM组和绿原酸组仅见少量散在的游离细菌。载体表面活菌计数结果分析，EM组和绿原算组载体表面黏附细菌少于空白对照组，绿原酸组载体表面活菌计数少于EM组。详见图1、图2、图3和表2。表2绿原酸作用24小时后载体表面的活菌计数(X±s，l。g'。CFUTable2.ViablebacterialcountsoforganismonthesurfaceofcarriersafterprocessedbychlorogenicacidandEMrespectivelyafter24hours(X±s,">CFLTmr1)controlEMgroupchlorogenicacidgroup4.22±0.263.48±0.28※3.26±0.23※众Note:dataareexpressedby士S，，※户〈(3.01，comparedwithcontrolgroup,众尸<0.05，comparedwithEMgroup.3.2建模3天结果SEM观察观察，空白对照组可见均匀、密布堆积的稀薄生物膜，可见细菌轮廓及细菌间黏液样物质(详见图4)。红霉素组可见散在的早期生物膜，分布较空白对照组稀疏(详见图5)。绿原酸组仅偶见聚集的细菌，期间有少量稀薄的黏液样物质，细菌轮廓仍可清晰显示(详见图6)。3.3建模7天实验结果银染法观察载体表面BF发现，空白对照组可见分布均匀的片状似棉絮样黑染物质，周边散在黑色颗粒样物质，高倍镜下观察为游离细菌(详见图7)。EM组和绿原酸组载体可见少量规模较小的淡染颗粒样物质，高倍镜下为局部聚集堆积的细菌，菌体被黏液样物质包绕，但较空白对照组规模较小，染色较淡(详见图8和图9)。SEM观察，空白对照组载体表面可见浓厚黏液样物质，菌体轮廓模糊不清，BF呈立体结构(详见图10)，而EM组和绿原酸组仅见稀少的薄层生物膜(详见图11和图12)。载体表面活菌计数结果显示绿原酸组和EM组均低于空白对照组，且绿原酸组低于EM组(详见表3)。_表3绿原酸作用7天后载体表面的活菌计数(X±s，l。g1(,CFUml')controlEMgroupchlorogenicacidgroup5.51±0.234.45±0.30※4.19±0.29※众Note:dataareexpressedby:ts,，※P<0.01,comparedwithcontrolgroup,众尸<0.05,comparedwithEMgroup.4破坏P.aBF实验分为空白对照组、EM组、绿原酸组、头孢他啶(CAZ)组、EM联合CAZ组和绿原酸联合CAZ组。各组EM浓度为16ug/ml，绿原酸为1/4MIC,CAZ组为4ug/ml观察对早期(3天)BF和晚期(7天)BF的作用。每组各于0小时和药物作用后4、8、24小时行活菌计数，每组2个标本，另于0小时和24小时行扫描电镜检查。4.1对早期生物膜破坏实验结果空白对照组、EM组和绿原酸组各组内各时间点活菌计数无差异。而CAZ组、EM联合CAZ组和绿原酸联合CAZ组内不同时间点活菌计数比较，随着时间的延长，杀菌作用明显。绿原酸组联合CAZ组活菌计数少于EM联合CAZ组(详见表4)。表4早期BF经不同药物及其组合作用后BF内的活菌数(f±s,l。g,CFUml—')Table4.ViablebacterialcountsoforganismwithinBFaftertheearlyBFprocessedbymedicament(义±s,logioCFU'ml—')__groupOh4h8h24hcontrol4.20±0.224.43±0.204.50±0.164.47±0.19EM4.38±0.4.44±0.18A4.36±0.Chlorogenicacid4.40±0.4.40±0.2"4.41±0.20ACAZ4.15±0.13A4.11±0.15A4.08±0.09AEM+CAZ3.75±0.11A※3.42±0.14A※3.37±0.22A※Chlorogenicacid+3.68±0.17A※众3.31±0.22A※众3.11土0.27A※众CAZNote:dataareexpressedbyX±S，，A尸〉0.05，comparedwithcontrolgroup,A尸〈0.01'comparedwithcontrol，EM，Chlorogenicacidgroup;※尸<0.01，comparedwithCAZgroup;A,<0,05，comparedwithEMcombinedwithCAZgroup-4.2绿原酸对晚期RaBF的破坏作用实验空白对照组、EM组和绿原酸组各组内各时间点活菌计数无差异。而CAZ组、EM联合CAZ组和绿原酸联合CAZ组内不同时间点活菌计数比较，随着药物作用时间的延长，药物依然显示有杀菌作用。绿原酸组联合CAZ组活菌计数少于EM联合CAZ组(详见表5)。表5晚期BF经不同药物及其组合作用后BF内的活菌数(I±s，kgwCFUml')Table5.ViablebacterialcountsoforganismwithinBFafterthematureBFprocessedbymedicament(X±s，logioCFU'mr1)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>Note:dataareexpressedbyX土S，，〉0.05，CQmparedwithcontrolgroup,<0.01，comparedwithcontrol,EM，Chlorogenicacidgroup;※尸<0.01,comparedwithCAZgroup;众尸<0.05，comparedwithEMcombinedwithCAZgroup.5实验结论绿原酸可以抑制绿脓杆菌黏附于无机材料表面，抑制细菌生物膜的形成，并对已经形成的生物膜具有破坏作用，与头胞他啶有协同杀菌作用。1图1空白对照组24小时细菌黏附(SEM,2500X)2图2EM组24小时细菌黏附(SEM,2500X)3图3绿原酸组24小时细菌黏附(SEM，2500X)4图4空白对照组3天BF(SEM,2500X)5图5EM组3天BF(SEM,2500X)6图6绿原酸组3天BF(SEM,2500X)7图7空白对照组7天BF(400X)8图8EM组7天BF(400X)9图9绿原酸组7天BF(400X)10图10空白对照组7天BF(SEM，3750X)11图11EM组7天BF(SEM，3750X)12图12绿原酸组7天BF(SEM,3750X)权利要求1、一种具抑制绿脓杆菌生物膜形成的中药有效成分——绿原酸，分子式是C16H18O9结构如式I所示结构式I1、一种具抑制绿脓杆菌生物膜形成的中药有效成分——绿原酸，分子式是d6H,809结构如式I所示2、依照权利要求1所述的化合物在制备具抑制和破坏细菌生物膜药物组合物及其制剂中的用途，其中所述的药物组合物及其制剂中含有具干预细菌生物膜的绿原酸，以及一种或多种在药学上可接受的药用辅料或材料复合品。3、如权利要求1所述的化合物，或以该化合物为主要有效成分为复方成分之一，在制备具抗细菌生物膜作用药物中的应用。4、如权利要求2所述的制剂，包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液和注射剂。5、如权利要求2所述的包含该化合物的医用或生活用材料。全文摘要本申请为一种中药成分的新用途。本发明涉及金银花有效成分能抑制绿脓杆菌生物膜的形成，并能增强抗生素的杀菌作用，可制成具抑制生物膜形成的作用药物制剂以及医用或生活用新材料。文档编号A61L27/54GK101433532SQ200810107420公开日2009年5月20日申请日期2008年12月26日优先权日2008年12月26日发明者温红侠,陈一强申请人:广西医科大学