专利名称：：靶向lmp1的寡核苷酸及其作为放疗增敏剂的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种靶向EBV病毒LMP1的寡核苷酸。本发明还涉及该寡核苷酸在鼻咽癌治疗和放疗增敏中的应用。
背景技术：
：鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)是一种具有种族和地理分布差异的上皮细胞性恶性肿瘤，在中国南方人群中发病率比白种人群高100倍以上，为25-30/10万。NPC是中国及东南亚地区最常见的恶性肿瘤之一，在中国的各省市均有发病，南方沿海地区明显高于北方和内地，发生于任何年龄，男性高于女性，在儿童期少见，在20-40岁年龄组发病率聚升，40-60岁为高峰期，70岁以后逐渐下降。NPC是鼻咽部粘膜上皮发生的恶性肿瘤。临床上，放射治疗是首选治疗方式，但常因放疗抵抗导致治疗失败。EBV(Epstein—Barrvirus)为一禾中Y抱疫病毒，病毒DNA全长约170kb。流行病学研究显示EBV感染十分广泛，成年人的感染率可达98%;在发展中国家，EBV的感染通常发生于幼年时代(5岁以前)，在发达国家，EBV的感染多发生于青春期。EBV感染以两种形式存在潜伏感染和裂解复制。裂解复制使得宿主细胞凋亡，而潜伏感染使得病毒与宿主细胞长期共存。在大多数情况下，EBV感染宿主后以潜伏感染状态存在。在鼻咽癌，Hodgkin病中主要表达EBNAl、LMPl、LMP2、BamHIA，而在移植后淋巴瘤中则表达所有抗原。在潜伏状态中，病毒DNA大多以一种游离体的形式存在于细胞内，在宿主细胞发生分裂时，与细胞的染色体同步进行DNA的复制，并随宿主细胞的染色体的分离而均匀分配至两个子代细胞内，从而在子代细胞内不致产生EBV的丢失。EB病毒潜伏感染主要与鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤、与HIV感染或其他免疫抑制疾病有关的B淋巴细胞瘤、T细胞淋巴瘤、Hodgkin等多肿瘤发生发展密切相关。最近的研究发现EB病毒还与其他肿瘤有一定关系，例如，肺癌、胃癌、乳腺癌、胆管癌、平滑肌瘤、结肠癌、前列腺癌等。LMP1(latentmembraneprotein1)是EBV编码的目前已被确证的具有瘤基因功能的致瘤蛋白，在EBV相关肿瘤的发病中起着重要作用。编码LMP1的基因为BNLFl，其转录由ED-LI和L1-TR激活子所控制。LMP1是由386个氨基酸残基组成的跨膜蛋白，其分子量约62kD，包括三种不同的结构域1)亲水性氨基端胞浆区；2)6个疏水性跨膜区，这两个区域与LMP1蛋白在膜上的定位及聚合有关；3)亲水性氨基端羧基区。羧基末端有三个结构域与LMP1功能密切相关。位于194-231位氨基酸残基的CTAR1，通过与TRAFs相作用，调节AP-1活性以及约20-30%NF-kB的活性。位于351-386位氨基酸残基的CTAR2通过与TRADD和TRAF2形成的复合物直接作用，诱导70-80%NF-kB的激活。而位于前两者之间的232-351位氨基酸残基组成的CTAR3，可能与JAK/STATs转录激活有关。LMP1具有多种重要的生物学功能，研究证实LMP1主要介导NF-kB、AP_1和STAT三条信号传导通路及信号传导通路之间的cross-talk,导致细胞周期紊乱、凋亡阻滞、细胞增殖失控和放疗抵抗。NPC的发病与EBV密切相关，在NPC病人中LMP1阳性率高达72%。在LMP1与NPC关系的临床研究中发现LMP1阳性的NPC根治性放疗后完全缓解(complete3remission,CR)率为69.0%，阴性者为100.0%，两组比较有显著性差异(P<0.05)。LMPl阳性表达者远处转移率为31.0%(9/29)，阴性者为0.0%。可以认为LMPl不仅在NPC发病中具有重要作用，而且是判断病人放疗疗效与预后的重要因素。因此，寻求靶向LMPl的放疗增敏策略，提高放疗疗效将具有重要的临床意义。本申请人在中国专利(申请号200610032257.0)中，具体公开了未经修饰的耙向LMPl的脱氧核酶。本申请是在该中国专利申请基础上的继续研究。研究优选的修饰后的靶向LMPl的寡核苷酸结构。
发明内容本发明的目的是提供一类经修饰的靶向LMPl的寡核苷酸，使该类修饰后的寡核苷酸具有相对较高的抗酶解能力和生物活性，并且该寡核苷酸能作为有效的治疗或辅助治疗鼻咽癌或EBV相关疾病的药物。本发明提供的寡核苷酸具有如下特征(1)通过其结合序列与EBVLMPl基因互补；(2)由1170核苷酸组成，自5'到3'的方向，由磷酸酯键连接；(3)在核糖2'位上带有甲氧基取代基团；(4)在3'末端连接丁醇基团。本发明所述的寡核苷酸是脱氧核酶，其还具有如下的特征(5)5'和3'的结合序列分别为7-12个核苷酸；(6)5'和3'的结合序列由GGCTAGCTACAACGA催化功能序列连接，[OO19](7)由2939核苷酸组成；(8)特异性地切割位于LMPlmRNA中的嘌呤与嘧啶间的连接键。本发明所述的寡核苷酸还可以是具有其特征的核酶。本发明所述的寡核苷酸是具有其特征的反义寡核苷酸。本发明所述的寡核苷酸还可以是具有其特征的，抑制EBVLMPl基因表达的干扰型RNA(RNAi);这些干扰型RNA为2125核苷酸组成的双键RNA，在每条链的3'端有2个突出的核苷酸；双链的G+C含量为3052%;在正义链上的15至19位置上为A/U配对；无分子内重复序列。上述所述的各种寡核苷酸可用于制备多种抑制鼻咽癌生长药物组合物。所述药物组合物中可以含有各种药学上可接受的赋形剂、辅剂。所述药物组合物中，可以含有一种或几种所述寡核苷酸。比如，可含二种，三种，四种，五种或五种以上的本发明提供的寡核苷酸。用本发明所述的寡核苷酸作为活性物质可以制备增强鼻咽癌放疗敏感性的药物。本发明提供的寡核苷酸对于动物或人的给药剂量为每公斤体重150mg。寡核苷酸指的是含核苷酸(核糖核酸，脱氧核糖核酸或两者)的分子，这些核苷酸通过5'或3'端或5'或2'端连接，所用的核苷酸可以是天然的，也可以是化学合成的类似物，这些类似物可与天然核酸形成配对。例如，氮杂(Aza)和脱氮杂(deaza)嘧啶类似物，氮杂(aza)和脱氮杂(deaza)嘌呤，及其它杂环碱基类似物。这些碱基类似物包括在嘧啶或嘌呤中的一个或多个碳氮原子由氧、硫、硒、磷等取代。为了有效地在体内应用寡核苷酸，对其进行化学修饰可显著地增加寡核苷酸抗酸和抗酶降解的稳定性，例如，2'-0-甲基，2'-O-烯丙基，交接式核酸(Locked皿cleicacids，區)禾口肽链核酸(p印tide皿cleicacids，PNA)。本发明所提供的寡核苷酸可以用化学的方式进行修饰。所述修饰是在分子水平上对天然核酸分子结构进行一处或多处化学修饰。包括以下化学修饰1)对碱基，糖基，核苷酸之间的磷酸酯键的修饰，及增加一些取代基，例如，二胺(diamine)，胆固醇或其它亲脂性基因。抗核酸内解酶降解的核酸分子。这种抗酶特性可以通过多种化学修饰而获得，包括2'-0-甲基磷酸二酯键，，2'-0-甲烷-n(0-甲烷)，2'-氟，杂合连接键，其它主干结构的修饰。另外，这些修饰还包括对碱基的修饰，例如，甲基化碱基、羟甲基化的碱基等。修饰性核苷酸还包括对糖基的修饰，例如在2'位3位取代的核糖核酸或脱氧核糖核酸。核糖基和单核苷酸之间的连接键称为核酸的主干结构。对主干结构的修饰包括连接键以及其它可以增强稳定性和亲和性的修饰，例如，对糖结构的修饰。具体的例子有，在碱基相对于天然右旋异构体糖为反向时，可使用左旋(L-)异构体脱氧核糖；或将糖基的2'_羟基因，2'-卤素元素，2'_0-烷基，2'-O-烷基-n(O-烷基)取代；或者使用下列连接键2'-0-甲基磷酸二酯键，2'-0-乙基，2'-0-丙基，丁基，2'-O-烷基-n(烷基)，2，-甲氧乙氧基，2'-氟；2，-脱氧erythropentofuranosyl;3，-0-甲基；异丁基寡核苷酸，2'-0-(CH2CH2)xCH3以及Butyne连接键。本发明优选的是2'-0-甲基修饰。本发明的寡核苷酸可具有部分修饰，或全部修饰，或是不同修饰的组合。2)末端保护在分子的末端加入保护基因，以防止分子的降解。这种保护可以是5'端，也可以是3'端，或是两端均被保护。寡核苷酸可以通过对其5'端和3'端修饰而获得这种抗酶特性。这些末端修饰包括反向连接碱基，双脱氧核苷酸，甲磷酸基，烷基、芳基，cordyc印in，cytosinearabanoside，2'_甲氧基、乙氧基核苷酸、phosphorothioate连接键，3'-0-甲基碱基，荧光素，肽键连接，二氮苯基，胆固醇，生物素，acridine，rhodaminepsoralen,glyceryl,丁醇基，丁基，已醇基和3'-O-烷基。本发明优选的丁醇基结构为0H-CH2CH2CH2CH2-。本发明优选修饰性寡核苷酸的连接键是非手性的(achiral)，可以含至少38个连续的非手性连接键，优选为712个非手性连续的连接键；最为优选的是全部的连接键为非手性的。在某些情况下，非手性连接键和手性连接性可以相间存在，例如，两个连续非手性连接键后接一个手性连接键，再跟二个连续非手性连接键；或三个连续的非手性键接一个手性连接键；或四个连续的非手性连接键跟二个手性连接键等。非手性连接键包括，但不限于，磷酸二酯键，硫代磷酸二酯键。磷酸二酯键可以是3'至3'，5'至2'或5'至5'或以上的组合方向。这种连接键的修饰可以是分子内的(单一或重复)，也可以是在RNA或DNA的末端。使用脱氧核酶是一种新型的基因抑制技术，其具有反义寡核苷酸的化学稳定性，同时又具有核酶的催化切割RNA的功能，且其合成费用很低。基于这些独特的优点，该技术已被广泛用于体内和体外的基因调控(Sun等Pharmacol.Rev.52(3):325-347)。5因此，本发明提供了可以抑制EBV基因表达的修饰性脱氧核酶。这种脱氧核酶的结构包括(l)催化功能基因，其核苷酸序列为GGCTAGCTACAACGA。(2)位于催化功能基因5'端结合序列；(3)位于催化基因3'端的结合序列。脱氧核酶通过这二个结合序列，特异性地与EBV基因表达的RNA结合。因而由催化基因在嘌呤与嘧啶结合点诱导对耙RNA的切割。本发明所提供的药物组合物的功能效应可用本领域熟知的方法进行测定。这些方法包括体内和体外的，例如，在细胞培养系统中分析药物组合物对靶基因表达的影响和对细胞表型的影响；在体内模型和临床试验中，测定药物组合物的生物学效应，包括药效，药理，药剂，毒理等。体内模型包括建立的疾病动物模型和正常动物。本发明提供的药物组合物含有抑制EBV基因表达的一种以上的寡核苷酸。根据寡核苷酸的数量、类型、耙基因等，药物组合物中寡核苷酸的有多种不同的组合方式。药物组合物中可以只含单一寡核苷酸，其耙基因可以是EBV基因，也可以是宿主相关基因。药物组合物中可以含一种以上的寡核苷酸，寡核苷酸的种类可以达100种以下，优选的为220种。药物组合物中的寡核苷酸可以是一种类型，例如分别选自脱氧核酶，反义寡核苷酸，或是核酶；或是干扰性RNA。药物组合物中也可以包括不同类型的寡核苷酸，例如，脱氧核酶与干扰RNA的组合，脱氧核酶与反义寡核苷酸的组合等。本发明包括药物组合物含至少一种本发明所提供的寡核苷酸。在有些药物组合物中，可以含100种以下不同的寡核苷酸，例如2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，30，40，50，75种。在有些药物组合物中，寡核苷酸是反义寡核苷酸，核酶，干扰性RNA，脱氧核酶，或以上的组合。在有些药物组合物中，一种或多种寡核苷酸是修饰性寡核苷酸。在有些化合物中，含一种以上的反义寡核苷酸，其可以是部分或全部修饰的药物组合物。药物组合物中还含有适合于药用的赋形剂和其它辅剂。本发明的耙向基因可以是单一的，也可以是多种基因的组合。耙向多种基因的药物组合物，可以对不同的信号传导途径进行同时调控，将比靶向单一基因的方法更为有效。另外，由于使用的多个寡核苷酸中的每个寡核苷酸的量相对比较低，因此会大大降低产生毒性的可能性。本发明使用的寡核苷酸为修饰性的，因此要比天然寡核苷酸更加稳定，且与目前常用的修饰方法相比，例如，硫代磷酸二酯键，本发明的寡核苷酸的毒性更低。本发明的药物组合物可以采用非肠道的，口服或局部的给药方式。本发明的药物组合物可按本
技术领域：
熟知的技术进行制备。药用载体的选择可根据制剂类型和给药途径，例如，静脉注射，口服，局部，喷雾剂，栓剂，非肠道，或骨髓注射等。赋形剂可含几种药用载体。另外，药物组合物中所含的稳定剂，防腐剂以及其它的成份一般为药物组合物重量的0.5%2%。本
技术领域：
的技术人员可确定出适当的给药方式和递药系统。本发明的药物组合物可按要求制成不同的剂型，包括液体，片剂，药丸，粒状，粉末，软膏，乳剂，针剂或栓剂。任何药物可接受的介质和辅剂均可使用，例如，水，甘油，油类，乙醇，调味剂，防腐剂，食物染料等用于液体制剂，淀粉，糖，稀释剂，颗粒剂，润滑剂，粘合6剂，分散剂等用于制备固体制剂。注射用制剂为寡核苷酸的水溶液，溶剂为符合药用标准的水或生理盐水。注射用液体还可以含适当的液体介质，悬浮剂以及可以调节渗透压的制剂，防腐剂等。实际制作方法和程序对于一个本领域的技术人员来说是熟知的。局部用药剂型可以制成乳剂、敷料、凝胶、洗液、软膏、液体等。可以加入表面活性剂，以增加药物的深层穿透。这些表面活性剂包括天然的，也可以是化学合成的，例如异丙十四烷酸盐。喷雾剂型的制备可采用将寡核苷酸溶于或悬浮于喷发剂或喷发剂与溶剂中，例如乙醇作为溶剂。在局部用药剂型和喷雾剂型中，药物比例(寡核苷酸)一般为总重量的0.001%40%。栓剂的制备可以将寡核苷酸与脂质介质混合而制成，例如theobroma油，可可奶油，甘油，明胶或聚氧乙烯二醇。寡核苷酸还可以制成脂质体，以增加寡核苷酸在体内的半衰期。所用脂类包括，但不限于，Cardiolipindimyristoyl，dipalmifoyl，dioleoylphosphatidylcholine,phosphatidylglycerol，palmitoyloleotlphosphatidylcholine或phosphatidylglyceroe，phosphatidiacidcysophosphatidicacid，phosphatidylserine,phosphatidyeinositol,cholesterol。本发明的药物组合物的给药剂量为每公斤体重0.015mg所述寡核苷酸，如每公斤体重分别可以是0.01，0.05，0.1，0.5，1，5mg所述寡核苷酸。优选的剂量为每公斤0.01mglOmg，或每公斤重O.01lmg，或O.1lmg。在有些情况下，单位剂量可以是每公斤体重O.01100mg。当实施肿瘤内注射给药时，每110天可给药一个剂量单位，或每天给药，每天110个剂量单位，直到治愈，或症状得到减轻。在有些情况下，病人按医嘱每天用药23个剂量单位。在有些情况下，在放疗前1-24小时给药，用药剂量为每天14次。将本发明提供的靶向EBV-LMP1寡核苷酸应用于临床患者，发现靶向EBV-LMP1寡核苷酸能够增加鼻咽癌患者对放疗的敏感性，加快肿瘤縮小速率。同时依据RT0G急性放射损伤分级标准，通过试验过程中对其指标的观察，表明寡核苷酸均不增加对患者的造血系统、皮肤、粘膜、唾液腺及肝肾功能的损伤。表明靶向EBV-LMP1的寡核苷酸不仅可能成为靶向基因治疗的新策略，同时可能发展为一种具有明确靶向性的、新型的放疗增敏剂。图1.2'-0-甲基修饰/3'-丁醇加尾修饰的脱氧核酶与未修饰的脱氧核酶处理结果对比；图2.脱氧核酶在CNE1-LMP1细胞中剂量依赖性的诱导细胞凋亡并增强放射诱导的凋亡；图3.脱氧核酶在CNE1-LMP1细胞中诱导细胞凋亡并增强放射诱导的凋亡；图4.靶向LMP1的脱氧核酶DZ1抑制CNE1-LMP1的增值。结果来自三次独立实验，以平均值加减标准差表示；图5.脱氧核酶单独作用或与放射联合使用后p53，survivin在CNE1-LMP1细胞中表达明显受到抑制；图6.脱氧核酶单独使用或与放射联合使用后能显著抑制裸鼠移植瘤。A特异性脱氧核酶单独使用或与放射联合使用后能显著抑制移植瘤的生长。B治疗24小时后切下的肿瘤重量；图7.A免疫组化分析LMP1和Bcl_2在裸鼠移植瘤中的表达。切片分别用LMP1和Bcl-2抗体孵育。没有一抗孵育处理的作为负对照。(200X)BHE染色对不同处理组肿瘤组织进行病理学检测(200X);具体实施方式实施例实施一修饰性脱氧核酶的化学合成合成过程由计算机控制的ABI合成仪完成。不同反应组分程序化地经不同管道进入反应室(反应柱)。1.固相反应的建立合成反应在含共价连接的3'_丁醇基单体的反应拄中进行。2.链延伸反应合成采用Cy咖-ethyl-phosphor咖idite化学进行。每个单体均含2，_0_甲基。每个反应周期包括反应基团的去保护；结合新的单体；保护非反应基团；氧化反应将三磷酸化物(triphosphite)转化成三磷酸盐(triphophate)。以此过程，每个周期引进一个新的单体。3.去保护反应在完成最后一个单核苷酸反应后，使用氢氧化氨将反应产物从反应拄中释放和去除保护基团，然后通过真空过滤除去固相物质。4.后处理反应产物通过真空干燥除去氢氧化氨，然后经HPLC纯化，获得>99%的纯品。实施二修饰性脱氧核酶与未修饰脱氧核酶的活性比较为了证明修饰性脱氧核酶因其稳定性和与LMP-1mRNA结合力增加而获得更高的生物活性，实验将本发明修饰性脱氧核酶Dzl(5'gcaaaggaaGGCTAGCTACAACGAagaggacaa3')和未修饰脱氧核酶Dzl分别转染CNEILMPI细胞，提取总蛋白进行WesternBlot分析。从图1可见，经2'-0-甲基修饰和3'-丁醇加尾，针对LMP-1的脱氧核酶抑制LMP-1表达的活性显著提高(10倍)。实施三修饰性脱氧核酶在体外的抑瘤和放疗增敏效应修饰性脱氧核酶增强鼻咽癌细胞对放疗的敏感性结果表明，与单独放疗或单独脱氧核酶处理相比，本发明提供的脱氧核酶Dzl与放疗联合应用能够显著增强放射线诱导的细胞凋亡，并且具有剂量依赖性，在5Gy时，80X的细胞发生凋亡(图2)。选择2Gy的放疗剂量与活性脱氧核酶联合应用，发现与单独脱氧核酶或放疗相比，3条活性脱氧核酶均能显著增强细胞对放疗的敏感性(图3)。修饰性脱氧核酶与放疗联合应用抑制鼻咽癌细胞增殖结果表明，与对照组及单独脱氧核酶或放疗组相比，脱氧核酶与放疗联合处理组8显著抑制鼻咽癌细胞的增殖(图4)。修饰性脱氧核酶与放疗联合应用抑制鼻咽癌细胞周期行进放疗抵抗与细胞周期行进密切相关。应用流式细胞术观察3条活性脱氧核酶与放疗联合应用对鼻咽癌细胞CNEl-LMPl的细胞周期行进的影响。结果表明，活性脱氧核酶能够引起鼻咽癌细胞CNEl-LMPl的细胞周期改变，与单独放疗相比，使S期细胞增加，而G2/M期细胞减少(表1)。表1活性脱氧核酶对鼻咽癌细胞CNEl-LMPl细胞周期的影响*<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*图中数字表示细胞在不同细胞周期中所占的百分比。脱氧核酶与放疗联合应用抑制p53和Survivin的表达研究表明LMP1参与放疗抵抗的可能机制为LMP1通过反式激活p53和Survivin的表达，进而参与放疗拮抗的产生。因此，应用westernblotting检测脱氧核酶与放疗联合处理对p53和Survivin的表达的影B向，结果发现与对照相比，本发明修饰后的脱氧核酶与放疗联合应用能够下调p53和Survivin的表达(图5)。实施四修饰性脱氧核酶在体内动物模型中的抑瘤和放疗增敏效应建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型，观察脱氧核酶与放疗联合应用对鼻咽癌裸鼠移植瘤的影响。结果表明，与对照相比，脱氧核酶与放疗联合应用能够显著抑制裸鼠移植瘤的生长(图6)。将肿瘤组织进行病理学观察。HE染色结果显示，在对照组以及单独放疗组中，细胞形态未见改变；而在修饰性脱氧核酶处理组以及修饰性脱氧核酶与放疗联合处理组中，部分肿瘤细胞出现坏死；说明脱氧核酶在体内能够增强肿瘤细胞对放疗的敏感性(图7-B)。免疫组化检测肿瘤切片中LMP1和Bcl-2的表达，单独放疗组以及对照加放疗组，LMP1和Bcl-2均为强阳性；而修饰性脱氧核酶与放疗联合处理组，LMP1和Bcl-2的表达均显著下调(图7-A)。实施五修饰性脱氧核酶放疗增敏的临床研究v将靶向LMPl的脱氧核酶应用于临床上EBV-LMP1阳性的鼻咽癌患者，观察靶向EBV-LMP1脱氧核酶能否增强鼻咽癌患者对放疗的敏感性，同时观察其毒副作用。研究对象入选标准1.来自中南大学湘雅医院肿瘤科2007年3月_2007年11月经病理学确诊为低分化鳞癌的初治鼻咽癌患者20例；2.年龄在20-65岁之间，男女不限；3.临床诊断无远处转移；4.免疫组化示LMPl阳性表达的患者；5.自愿签署知情同意书；6.放疗中不需要结合化学治疗及其他特殊治疗者；7.卡氏(KPS)评分>70，无心血管、肝肾及造血系统等严重原发性疾病，能顺利完成放疗。研究设计将符合入组标准的20例鼻咽癌病人按双盲法随机分为两组，试验组(A组，放疗加耙向EBV-LMP1脱氧核酶)和对照组(B组，放疗加生理盐水)，两组放射治疗方法完全相同，使用不规则铅挡块的体外常规放射治疗，鼻咽照射剂量DT7076Gy，77.5周完成，阳性颈淋巴结DT6670Gy，67周完成；颈淋巴结阴性预防照射DT5056Gy，56周完成。A组在每周一、四放疗前2小时，肿瘤局部注射脱氧核酶0.lml，120mg/ml，共10次。B组予生理盐水O.lml，其他治疗及处理A、B两组完全相同。每周内窥镜下观察肿瘤大小变化；通过导入放疗前、放疗50Gy、放疗结束和放疗后3月复查的4次MRI图象精确测量肿瘤体积；采用实体肿瘤WHO客观疗效评价标准计算CR、PR;并按照RTOG急性放射损伤分级标准观察其使用过程中的毒副反应。研究结果试验组与对照组患者的一般项目分组组间一致性好，说明试验组与对照组的同质性、均衡性都较高。根据MRI所示瘤体体积(cm3)进行率的转换(RTR值)并行t检验，结果显示RTR3即3月后复查与放疗前相比较试验组与对照组组间P值为0.04，有显著性差异，认为靶向EBV-LMP1脱氧核酶能够增强LMP1阳性的鼻咽癌病人的放疗敏感性(表2)。两组的CR、PR相比较，P值二0.092，因例数过少暂时未发现明显差别，无显著性差异。两组间造血系统、皮肤、粘膜、唾液腺、肝肾功能的损伤无显著性差异。靶向EBV-LMP1脱氧核酶增强了LMP1阳性的鼻咽癌患者对放疗的敏感性，提高了肿瘤消退速率。在放疗过程中不会增加鼻咽癌放疗患者的急性放射损伤，具有良好的安全性。表2:不同处理组多时点间RTR的t检验结果时间点分组XSnP值试验组0.1980.0669RTR,0.128对照组0.3490.24611试验组0.1030.1809RTR20.189对照组0.2210.19911试验组0.0090.0199RTR30.040对照组0.0930.Ill11综上所述，将本发明提供的靶向EBV-LMPl脱氧核酶应用于临床患者，发现靶向EBV-LMPl脱氧核酶能够增加鼻咽癌患者对放疗的敏感性，加快肿瘤縮小速率。同时依据RTOG急性放射损伤分级标准，通过试验过程中对其指标的观察，表明脱氧核酶均不增加对患者的造血系统、皮肤、粘膜、唾液腺及肝肾功能的损伤。表明靶向EBV-LMPl的脱氧核酶不仅可能成为靶向基因治疗的新策略，同时可能发展为一种具有明确靶向性的、新型的放疗增敏剂。1权利要求一种寡核苷酸，具有如下特征(1)通过其结合序列与EBVLMP1基因互补；(2)由11～70核苷酸组成，自5′到3′的方向，由磷酸酯键连接；(3)在核糖2′位上带有甲氧基取代基团；(4)在3’末端连接丁醇基团。2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于寡核苷酸的连接键是含至少38个连续的非手性连接键，优选为712个非手性连续的连接键；最为优选的是全部的连接键为非手性的。3.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于寡核苷酸的连接键是非手性连接键和手性连接性可以相间存在。4.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其特征在于所述的寡核苷酸是脱氧核酶，其还具有如下的特征(5)5'和3'的结合序列分别为7-12个核苷酸；(6)5'和3'的结合序列由GGCTAGCTACAACGA催化功能序列连接，(7)由2939核苷酸组成；(8)特异性地切割位于LMPlmRNA中的嘌呤与嘧啶间的连接键。5.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其特征在于所述的寡核苷酸是具有其特征的核酶。6.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其特征在于所述的寡核苷酸是具有其特征的反义寡核苷酸。7.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其特征在于所述的寡核苷酸是具有其特征的，抑制EBVLMP1基因表达的干扰型RNA(RNAi);这些干扰型RNA为2125核苷酸组成的双键RNA，在每条链的3'端有2个突出的核苷酸；双链的G+C含量为3052%;在正义链上的15至19位置上为A/U配对；无分子内重复序列。8.抑制鼻咽癌生长药物，含有权利要求1至7所述的寡核苷酸中的一种或多种；或含有权利要求1至7所述的寡核苷酸中的一种或多种以及各种药学上可接受的赋形剂、辅剂。9.增强鼻咽癌放疗敏感性的药物，含有权利要求1至7所述的寡核苷酸中的一种或多种，或含有权利要求1至7所述的寡核苷酸中的一种或多种以及各种药学上可接受的赋形剂、辅剂。10.根据权利要求8或9所述的药物，其特征在于含有的寡核苷酸为2-20种。11.根据权利要求8或9所述的药物，其特征在于所说的寡核苷酸中还含有未修饰的寡核苷酸。12.根据权利要求8或9所述的药物，其特征在于按一个剂量单位为每公斤体重`0.015mg所述寡核苷酸给药。13.根据权利要求12所述的药物，其特征在于实施肿瘤内注射或肿瘤局部喷雾给药时，每110天可给药一个剂量单位；或每天给药，每天110个剂量单位，优选2-3个剂量单位。14.根据权利要求12所述的药物，其特征在于在放疗前1-24小时给药，用药剂量为每天14次。全文摘要本发明涉及一种靶向EBV病毒LMP1的寡核苷酸。本发明还涉及该寡核苷酸在鼻咽癌治疗和放疗增敏中的应用。该寡核苷酸具有如下特征(1)通过其结合序列与EBVLMP1基因互补；(2)由11～70核苷酸组成，自5′到3′的方向，由磷酸酯键连接；(3)在核糖2′位上带有甲氧基取代基团；(4)在3’末端连接丁醇基团。该类修饰后的寡核苷酸具有相对较高的抗酶解能力和生物活性，并且该寡核苷酸能作为有效的治疗或辅助治疗鼻咽癌或EBV相关疾病的药物。文档编号A61K31/7088GK101712710SQ200810143058公开日2010年5月26日申请日期2008年10月8日优先权日2008年10月8日发明者孙仑泉,曹亚申请人:中南大学