防治2型糖尿病的药物组合及制备方法

专利名称：：防治2型糖尿病的药物组合及制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种中药组合物，尤其涉及一种预防和治疗2型糖尿病的药物组合.背录珐术糖尿病(DiabetesMeHitus,简称DM)通常指2型糖尿病(T2DM),占DM总数的90%以上，是一种常见的、多发的内分泌代谢失常性疾病，在发达国家已被列为仅次于心血管疾病和肿瘤之后的第三大类严重威胁人类健康的疾病.其临床表现为代谢紊乱症候群，如"三多一少"即多尿、多饮、多食和体重减轻，糖尿病后期可出现严重的并发症，多表现为感染、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、白内障、神经病变及嗣症酸中毒等，其对人体的危害远远超过了糖尿病本身，所以糖尿病又被称为"百病之源".随着我国人民生活水平的提高，生活方式的改变和老龄人口的增多，糖尿病发病率正以0.1%的1^变逐年递增.目前我国糖尿病的患病率为2%-3%，患者超过3000万，另外还存在相当数量的糖耐量异常患者.与糖尿病直接或间接相关的治疗费用占整个国家健康保健费用的2°/0^6%，对个/^良国家都是很大的负担.因此对糖尿病及其并发症的治疗至关重要.目前口服抗糖尿病药物，主要有刺激胰岛素分泌作用(如磺sy^类)及加强外周糖的利用(如双胍类)降血糖药物，此外还有胰乌素增敏剂、糖苷酶抑制剂、搭糖还原抑制剂及糖化蛋白抑制剂等.然而从目前临床所用或即将应用的降糖药物来看，各种西药都有一定的局限性和不良反应，如胰岛素抵抗、低血糖、乳酸性酸中毒，长期使用引起并发症等.因此，这为中医药治疗糖尿病提供了一个空间.糖尿病及其并发症重在预防，大多数中药降血糖具有综合作用的特点，因此降血糖同时又能防治并发症的药物是最理想的选择>_中医治疗糖尿病的历史源远流长，中医将多饮、多食、多尿，久则身体消瘦或尿有甜味为主要症状的一类病症称为"消渴"。中医认为消渴病的主要病机为阴虚热盛，气阴两虚，其治则主要为滋阴清热，益气养阴，重视补肾、健脾及活血化瘀等。虽然中药药效学及临床研究表明，多数中药的降血糖作用不如化学药物明显，起效也较慢，但是中药根据上述治则组方之后，可以发挥整体调节优势，起到标本兼顾的治疗作用。临床上已有数十种治疗感冒的中成药问世，如消渴丸、降糖舒、玉泉丸、降糖甲片、六"5M4黄丸、参芪降糖片、消渴灵片、金芪降糖片等.虽然上述中成药对糖尿病及其慢性并发症有一定的疗效，但普遍存在技术含量低、剂型落后、服用量大、生物利用度低、起效慢、疗效欠稳定等缺陷.
发明内容针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处，提供一种用于防治2型糖尿病的药物组合及制备方法.本发明采用具有降血糖、改善胰岛素抵抗、降脂、降压功效的葛根总黄S同和黄芪总皂苷作为主要成分，制成口服剂型.葛根总黄嗣是从豆科植物野葛根中提取分离的总黄明类物质，主要成分为葛根素、大豆苷、大豆苷元等.现代药理研究表明葛根总黄稱具有降血睹、降血脂、解热、抗心肌缺血等作用.现已制成葛根素注射药物在临床上广泛用于治疗冠心病、心绞痛等.黄芪总皂苷是从豆科植物黄芪中提取分离的总皂苷类物质，主要成分为黄芪曱苷等.药理研究表明黄芪总皂苷具有降血糖，增强机体免疫力以及对心血管保护作用等.现已制成黄芪注射液在临床上广泛用于治疗糖尿病、糖尿病肾病、冠心病等.目前，临床应用上，黄实注射液与葛根素注射液常联合使用，用于治疗糖尿病、冠心病、心绞痛等心血管疾病，效果显著，比单用黄芪注射液或葛才艮素注射液效果好。因此，将葛根总黄嗣和黄芪总皂苷配伍应用具有协同作用.为达上述目的，本发明的防治2型糖尿病的药物组合，采用以下的技术方案一种防治2型糖尿病的药物组合，由以下重量配比的原料药组成葛根总黄酮40-50份、黄芪总皂苷20~25份.进一步地，本发明原料药的重量配比优选为葛根总黄酮50份、黄芪总急芬25份；进一步地，所述药物组合物以及提取物或精制物可以加入常规辅料或赋形剂，制成临床可接受的剂型，为口服剂型；口服剂型选自于丸剂、片剂、胶囊剂当中的一种；上述的药物组合物应用在内分泌系统疾病方面，用于2型糖尿病预防和治疗。本发明原料药的来源为葛根总黄頃为豆科植物野葛PweraWa/otofeO/w/或粉葛(Pwera他ftomstw//Sen仿)的干燥根茎经乙醇提取、大孔树脂纯化所得的提取物.黄芙总惠苦为豆科植物蒙古黄莱>4s￡raga/us/nemibranaceus(FZscft.J8ungevarmongho/Zcws(Su〃geJWs/ao或膜荚黄芪A.memfiranacet/sf/sc/.JSunge的干燥根经乙醇提取、大孔树脂纯化所得的提取物.质量标准《中华人民共和国药典》2005年版一部.一种防治2型糖尿病的药物组合的制备方法，包括下述步骤①、首先制备葛根总黄酮，取葛根原药材饮片，添加12倍量80°/。乙醇加热回流2次，每次2小时，过滤药渣，合并滤液，所得滤液进行减压回收乙醇制得药液;上述药液上AB-8大孔树脂吸附，上样浓度为0.1g生药/ml，上样量为10BV,流速1ml/min,预吸附2小时，重吸附2次，再对吸附部位进行水洗至无还原糖反应；吸附部位进行50%乙醇10BV体积进行洗脱，流速为2ml/min,减压回收乙醇液，冷冻干燥后用粉碎机粉碎成14目颗粒，总黄嗣纯度60%,备用；②、制备黄芪总皂苷，取黄芪饮片添加10倍量60%乙醇加热回流2次，每次2小时，过滤药渣，合并滤液，所得滤液进行减压回收乙醇制得药液；上述药液上AB-8大孔树脂吸附，上样浓度为0.1g生药/ml,上样量为10BV，流速1ml/min，预吸附2小时，重吸附2次，再对吸附部位进行水洗至无还原糖反应；吸附部位用0.5%氳氧化钠(NaOH)洗脱，流速为2ml/min,继用10%乙醇洗至中性，再用800/。乙谏10BV体积洗脱，流速为2ml/min，减压回收乙醇液，冷冻干燥后用粉碎机粉碎成14目颗粒，总皂苷纯度60%，备用；③、将上述制备的葛根总黄酮、黄芪总皂苷，按药物组合的各成份重量配比葛根总黄嗣40-50份、黄芪总皂苷20-25份，以上材料混合搅拌均匀，然后制得药物组合.本发明是一种具有益气养阴，生津止渴功效的药物组合，药理研究表明其具有具有降血糖、改善糖耐量、减少尿量、抑制胰岛素抵抗、降脂减肥的作用。而且，该药物组合降血糖、改善糖耐量、抑制胰岛素抵抗作用均比单独用葛根总黄稱、黄芪皂苷要强。可用于2型糖尿病的预防和治疗.,鹏图1是本发明制备葛根总黄明的工艺流程图；图2是本发明制备黄芪总皂苷的工艺流程图.具体实施例方式为能进一步了解本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能，下面将通过动物实验对本发明作进一步详细描述。本发明的药物组合，重量配比的原料药组成葛根总黄嗣40-50份、黄lt悉皂苷20-25份；各成分重量配比优选为葛根总黄酮50份、黄芪总惠苦25份。本发明的药物组合物应用在内分泌系统疾病方面，用于2型糖尿病的预防和治疗，该药物组合物以及提取物或精制物可以加入常规辅料或賦形剂，制成临床可接受的剂型，为口服剂型，口服剂型选自于丸剂、片剂、胶囊剂当中的一种.本发明的药物组合的制备方法，包括下述步骤①、首先制备葛根总黄酮，取葛根原药材饮片，添加12倍量80%乙醇加热回流2次，每次2小时，过滤药渣，合并滤液，所得滤液进行减压回收乙醇制得药液;上述药液上AB-8大孔树脂吸附，上样浓度为0.1g生药/ml，上样量为10BV，流速1ml/min，预吸附2小时，重吸附2次，再对吸附部位进行水洗至无还原糖反应；吸附部位进行50%乙醇10BV体积进行洗脱，流速为2ml/min,减压回收乙醇液，冷冻干燥后用粉碎机粉碎成14目颗粒，总黄胡纯度60%，备用；②、制备黄芪总皂苷，取黄芪饮片添加10倍量60%乙醇加热回流2次，每次2小时，过滤药渣，合并滤液，所得滤液进行减压回收乙醇制得药液；上述药液上AB-8大孔树脂吸附，上样浓度为0.1g生药/ml，上样量为10BV,流速1ml/min,预吸附2小时，重吸附2次，再对吸附部位进行水洗至无还原糖反应；吸附部位用0.5%氢氧化钠(NaOH)洗脱，流速为2ml/min,继用10%乙醇洗至中性，再用80%乙醇10BV体积^J乾，流速为2ml/min,减压回收乙醇液，冷冻干燥后用粉碎机粉碎成14目颗粒，总皂苷纯度60%,备用；③、将上述制备的葛根总黄嗣、黄芪总皂苷，按药物组合的各成份重量配比葛根总黄嗣40-50份、黄芪总皂苷20-25份，以上材料混合搅拌均匀，然后制得药物组合。例1(硬胶囊刑)取50g葛根总黄酮、25g黄芪总皂苷，加100g糊精，加淀粉至250g，混匀，喷洒400/0乙醇润湿，制成颗粒，60X:以下干燥，过筛，装入1号胶囊，制成硬胶囊1000粒(0.25g/粒)。服用剂量为每天2次，每次2粒。例2(片剂)取50g葛根总黄酮、25g黄芪总皂苷，加100g糊精，加淀粉至200g，混匀，制成颗粒，601C以下干燥，压制成1000片(0.20g/片)，包薄膜衣，即得。服用剂量为每天2次，每次2片.例3(颗粒剂)取50g葛根总黄嗣、25g黄芪总皂苷，用加100g糊精，加淀粉至250g，混匀，制成颗粒，60TC以下干燥，分装成500袋(0.5g/袋).服用剂量为每天2次，每次1袋.以下是动物实發汪明本发明具有的技术效果一、防治2型糖尿病的药物组合降血糖作用的药效筛选实验1材料1.1动物KM小鼠，雄性，体重(20士2)g，SPF级。1.2试药与仪器受试药物本发明药物组合(含葛根总黄酮50g，纯度60%;黄芪总皂苷25g,纯度60%)、葛根总黄稱，纯度60%;黄芪总皂苷，纯度60%;由广州中医药大学新药开发研究中心提供；阳性对照药优降糖(格列美脲)，4mg/片，扬子江药业生产，批号080104,临用前研碎用蒸镏水配制成0.1mg/ml溶液；葡萄糖、柠檬酸、柠檬酸钠均为分析纯；鄉佐菌素(STZ),美国sigma公司生产；血糖试剂盒；酶标仪.2实验方法剂量换算药对中，葛根与黄芪的比例为1:1(葛根30g、黄莱30g)。根据药材考察，所用药材葛根中总黄辆的含量为40.0mg/g,黄芪中总皂苦含量为20mg/g'按照100%转移率及提取物纯度，#^&人每公斤体重(60kg)折算小鼠的临床等效剂量分别为葛嗣(葛根总黄酮)为335mg/kg,黄苷(黄芪总皂苷)为165mg/kg,葛-黄有效部位为500mg/kg(葛根总黄鲷为335mg/kg+黄芙总皂苷为165mg/kg).取KM种小鼠约180只，入室适应性饲养2天，取16只作为正常对照组，其余小鼠禁食12h,于次日腹腔注射STZ160mg/kg(STZ由柠檬酸緩冲盐配制，PH值为4.4,临用前配制)，72h后，小鼠禁食12h,用毛细玻管眼底静脉4^L血，并测定FBG(空腹血糖)，选择FBG2l1.1mmol/L的小鼠为糖尿病小鼠，将动物随机分为10组，每组16只，分別为模型组和各药物组(见表3).各组动物灌胃给药，每天1次，连续15天，末次给药后，动物禁食12h,检测糖耐量(OGTT).方法分别于小鼠灌胃葡萄糖溶液(1g/kg)后Omin、30min、60min、120min，眼底静脉i^血，用葡萄糖氣化膝法测定各时间点的血糖值，并计算血睹曲线下面积(AUC),计算方法mmol.h/L=(A+B)x15/60+(B+C)x15/60+(C+D)x30/60(A、B、C、D分别为O、30、60、120minjMt值)。3.实验结果结果显示，腹腔注射相同剂量的葡萄糖后，所有小鼠血糖均先升高后逐步下降，呈现葡萄糖吸收代谢的过程.各組与正常组比较，各时间点血糖值及AUC均具有非常显著性差异(P<0.001)，表明糖尿病小鼠造模成功.給瞎负荷Omin时，优降糖组、黄苷组、葛-黄组与模型组相比，其FBG(空腹血睹)具有显著性差异(P<0.05);絲负荷后30min时，优降糖组血糖值明显低于模型组(P<0.05),其余各组药物虽有降^^势，但无显著性差异；给糖负荷后60min时，葛嗣组、黄苷组和葛-黄有效部位组血糖值明显较低(P《0.05);给糖负荷后120min时，各药物组血糖值与模型组相比，均无显著性差异；计算各组糖耐量曲线下面积(AUC)，发现优降糖组、葛酮組、葛-黄有效部位组AUC值明显低于模型组(P《0.05).结果表明优FNt、葛根总黄稱、黄芪总皂苷和葛-黄有效部位均可降低糖尿病小鼠的FBG，改善糖尿病小鼠的糖耐量，且葛-黄有效部位组作用优于葛根总黄酮、黄芪总皂苷，说明两者有协同降血糖和改善糖耐量的作用.结果见表1.1表1.1葛-黄有效部位对STZ所致糖尿病小鼠糖耐量的影响(,n=12)组刑量血糖值(mmol/L)AUC■(mmol.h/L)別(mg/kg)0min30min60min120min正常一9.58±1.6212.56±1.3310.67±1,299.55±1.2621.45±1.553組模型一41.00±4.43*49.39±4.3*44.65±5.65*41.24±3.53*89.05±6.54*组优降1.3336.08±4.05厶43.05±8.27厶43.85±6.6738.85±3.4282.00土8.72A38.57±4.6146.66±3,7640.25士4.17A41.26±6.8782.80士7.43A36.53±4.47A47,50±3.9639.81±40.89±4.2583.19±7.465.33A36.47±5.74A44.95±6.4639.50±37.92±8.3880.18士12.02厶_6.23A_注与正常组比较*P<0.001;~~与模型组比较AP〈0.05;4,小结葛根总黄酮、黄芪总皂苷和葛-黄有效部位均可降^^尿病小鼠的FBG，改善糖尿病小鼠的糖耐量，且葛-黄有效部位组作用优于葛根总黄酮、黄芪总皂苷，说明两者有协同降血睹和改善糖耐量的作用.二、葛_有效部位胰岛素抵抗的药效筛选实验1材料1.1动物KM小鼠，雄性，体重(20士2)g，清洁级。1.2试药与仪器受试药物本发明药物组合(舍葛根总黄嗣50g,纯度60%;黄芪总皂苷25g,纯度60%)、葛根总黄稱，纯度60%;黄芪总皂苷，纯度60%;由广州中医药大学新药开发研究中心提供；罗格列酮，4mg/片，贵州圣济堂制药有限公司；葡萄糖、柠檬酸、柠檬酸钠均为分析纯；链脲佐菌素(STZ)，美国sigma公司生产；血糖试剂盒；氢化可的松琥珀酸钠(HCSS)，临用前用生理盐水配制成7mg/mL溶液；胰岛素注射液，临用翁用生理盐水配制成0.025U/mL，血楣试躬盒，酶标仪.2实验方法2.1实验原理HCSS可以通过影响机体糖、脂肪、蛋白质等的物质代谢来诱导小鼠产生胰岛素抵抗.这种胰岛素抵抗模型小鼠空腹血糖与正常小鼠的空腹血糖差异不大，糖耐量却明显异常，类似于胰島素敏感性明显降低而尚未形成糖尿病的"健康人"。对于这种胰岛素抵抗模型的小鼠，腹腔注射一定剂量的胰岛素后，观察其血糖变化，可体现小鼠体内胰岛素对jMt代谢的能力，从而反映小鼠的胰岛素敏感性。2.2剂量换算药对中，葛根与黄芪的比例为1:1(葛根30g、黄芪30g).根据药材考察，所用药材葛根中总黄酮的含量为40.0mg/g,黄芪中总皂苷含量为20mg/g.按照100%转移率及提取物纯度，根据人每公斤体重(60kg)折算小鼠的临床等效剂量分别为葛制(葛根总黄酮)为335mg/kg，黄苷(黄芪总皂苷)为165mg/kg，葛-黄有效部位为500mg/kg(葛根总黄酮为335mg/kg+黄芪总皂苷为165mg/kg).2.3实验方法取KM小鼠若干只，雌雄各半，按表1随机分为14组.各组灌胃给药同时皮下注射HCSS70mg/(kgd)(7mg/ml)，正常对照组皮下注射生理盐水，连续9d。第10曰给药前禁食3h，再灌胃给药1次，1h后蒯险注射(ip)胰岛素0.5U/kg,测定给胰岛素后0、40、120min时的iMI值，计算给胰岛素后血糖下降的百分率.3.实验结果结果显示，ip相同剂量的胰島素后，小鼠血糖呈下降趋势，30min后各组动物血糖均有较大幅度的下降，120min时各组动物血糖值均有所回升，但下降与回升幅度有所不同.其中在30min、120min时，模型组与正常对照组相比，血糖下降率有显著性差异(P<0.05).与模型组相比罗格列酮组30min、120min血糖下降率有显著性差异(P<0.05);葛鹏组30min时血糖下降率有显著差异(P<0.05);黄芬组、葛-黄组30min、120min时血糖下降率均有非常显著性差异(P<0.01;P<0.001).提示葛根总黄稱、黄芪总皂苷、葛-黄有效部位均可提高HCSS所致胰岛素抵抗小鼠的胰乌素敏感性，且葛-黄有效部位组作用优于葛根总黄酮、黄芪总皂苷，说明两者有协同改善胰岛素抵抗作用.结果见表2.1表2.1各组药物对HCSS诱导的胰岛素抵抗小鼠血糖的影响(x±s,n=9)S音血糖下降的百分率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注与正常组比较*P<0.05与模型组比较AP〈0.05;AAP〈0.01;AAAP〈0.0014.小结葛根总黃鈉、黄芪总皂苷、葛-黄有效部位均可提高HCSS所致胰岛素抵抗小鼠的胰岛素敏感性，且葛-黄有效部位组作用优于葛根总黄酮、黄芪总皂苷，说明两者有协同改善胰岛素抵抗作用.三、葛-黄有效部位对2型糖尿病大鼠的干预作用及机制研究1材料1.1动物SD大鼠，雄性，体重200±20g，SPF级，由广东省医学实验动物中心提供.1.2试药与试剂受试药物本发明药物組合(含葛根总黄稱50g，纯度60%;黄芪总皂苷25g,纯度60%)、葛根总黄酮，纯度60%;黄芪总皂苷，纯度60%;盐酸罗格列嗣，规格4mg/片，贵州圣济堂制药有限公司。葡萄糖、柠檬酸、柠檬酸钠均为分析纯；链脲佐菌素(STZ),美国sigma公司生产；血糖试剂盒；总胆固醇试剂盒、甘油三酯试剂盒、高密度脂蛋白试剂盒、低密度脂蛋白试剂盒、胰岛素放免试剂、肿瘤坏死因子放免试剂盒、瘦素放免试剂盒、GLUT4和IRS-1免疫组化全套试剂盒，RT-PCR试剂盒；高热量飼料，由广东省医学实验动物中心加工.1.3仪器分光光度计；酶标仪；电热恒温水槽；罗氏血糖仪、血糖试纸1.4统计方法所有数据均用SPSS统计软件进行统计，两组间比较用方差分析(AVONA)。2.实發没计<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2.1动物分組选择造模成功的2型糖尿病大鼠50只，随机分为5组，分别为模型对照组、阳性对照药盐酸罗格列明组、葛-黄有效部位高、中、低剂量组.另取同批正常大鼠作为正常組，每组动物10只.2,2剂量设计药对中，葛根与黄芪的比例为1:1(葛根30g、黄芪30g)。根据药材考察，所用药材葛根中总黄嗣的含量为40.0mg/g,黄芪中总皂苷含量为20mg/g。按照100%转移率及提取物纯度，根据人每公斤体重(60kg)折算大鼠的临床等效剂量分别为葛辆(葛根总黄稱)为200mg/kg,黄苷(黄莱总皂香)为100mg/kg，葛-黄有效部位为300mg/kg(葛根总黄明为200mg/kg+黄芪总皂苷为100mg/kg).葛-黄有效部位高、中、低剂量组剂量，分别为600mg/kg、300mg/kg、150mg/kg体重，盐酸罗格列酮剂量为1mg/kg体重。2.3给药方法灌胃给药。其中正常组和对照组以水灌胃，给药体积为1ml/100g体重，每天给药一次，连续给药8周。2.4动物实验和取材开始给药后，除正常对照组大鼠哏养普通饲料，其余各组继续喂以高热量饲料。每周称体质量，记录称重结果，按新体质量调整药量，同时监测各组大鼠的进食量和饮水量，并观察大鼠的一般状态.于给药第8周进行葡萄糖耐量实验(OGTT)、胰岛素耐量实验(ITT).实验结束时，大鼠禁食12h，用水合氯搭麻醉，腹主动;i^血测定空腹血糖(FBG)、血脂四项(TC、TG、HDL-C、LDL-C)以及游离脂肪酸(FFA),同时测定血清胰岛素(FINS)、TNF-a、瘦素(L印tin),另取部分肝脏，测定肝脏中TC、TG、HDL-C、LDL-C,FFA.-快速分离部分肝脏骨骆J3/L^腹腔内脂肪组织置于液氮中迅速冷冻，然后置于-80XM氐温水箱保存，用于检测葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)mRNA、胰岛素受体底物-1(IRS-1)mRNA、PPAR-ymRNA的表达.另分别取肝脏、骨格肌和脂肪组织置于中性曱搭中固定，切片后进行免疫组织化学实验，测定组织中GLUT4和IRS-1蛋白的表达。分离m，固定于中性甲搭中，切片，做HE染色，病理检查.3.实验方法和指标检测3.12型糖尿病大鼠的模型建立雄性SD大鼠若干只，体重180~220g,在饲养观察室里适应性祠养7d后，取10只作为正常对照组，喂以基础饲料，其余大鼠喂以高热量饲料(配方组成基础饲料52%,酪蛋白12%,蔗糖10%，猪油24%,磷酸氢钙2%，复合多维0.1%，矿物质0.4%，盐0.2%，共100.7%),连续4周，禁食12h后给予餘注射STZ溶液30mg/kg,于一周后禁食12h，眼眶静脉4^血分别测定空腹血糖以及糖负荷(1g/kg)后2h的血糖值，选择空腹血睹正常、且糖耐量异常的大鼠确定为2型糖尿病大鼠，并在给药同时继续哏以高脂饲料.3.2口服糖耐量实验(OG丌)动物禁食12h后，分别于大鼠灌胃葡萄糖溶液(1g/kg)后Omin,30min、60min、120min，尾静脉取血，用血糖试纸测定各时间点的血糖值，并计算血糖曲线下面积(AUC),计算方法mmol.h/L=(A+B)x15/60+(B+C)x15/60+(C+D)x30/60(A、B、C、D分别为0、30、60、120minjMt值)，3.3胰島素耐量实验(ITT)动物禁食12h后，分别于大鼠皮下注射胰岛素溶液(0.3U/kg)后0min、40min、90min,尾静Jii^血，用血糖试纸测定各时间点的血糖值，并计算血糖曲线下面积(AUC),计算方法mmol.h/L-(A+B"20/60+(B+C"25/60(A、B、C分别为O、40、90min血糖值).3.4空腹血糖(FBG)、空J3tJ淡岛素(FINS)测定以及胰岛素抵抗的评价FBG采用葡萄糖氣化酶法测定，FINS采用放免法测定，并计算胰島素敏感指数(ISI)=Ln[1/(FinsxFBG)和IR指数(HOMA画IR)=(FBGxFINS)/22.5.3.5脂质代谢实验结束后，大鼠禁食不禁水12h，7%的水合氯搭麻醉，经腹主动脉取血，3500rpm/min4X:离心15min，^jfe清，血、肝脏中TC、TG、HDL-C、LDL-C及FFA水平测定，均采用酶法，按照试刑盒说明书操作。3.6细胞因子的测定血清中TNF-a和Leptin的水平采用^JL法测定.3.7肝脏、骨辂肌、脂肪组织中GLUT4蛋白表达采用免疫组化方法测定肝脏、骨格肌、脂肪组织中GLUT4和IRS-1蛋白的表达.具体过程主要有①组织切片5pm,常皿堵至水，蒸馏水洗；②3%过氧化氢，371C孵育10min以抑制内源性过氣化物酶活性，PBS洗4x5min;③正常羊血清371C袢育10min以减少非特异性U;⑤一抗(1:100)37"孵育1h，PBS洗4x5min;⑥生物素标记的二抗，37X:孵育10min,PBS洗4x5min;⑦链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物37"孵育10min,PBS洗4x5min;⑧DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；⑨苏木精复染，脱水，透明，封片.用PBS代替一抗作为阴性对照.⑩显微照相和半定量分析(采用图像分4斤系统软件分析a.3.8肝脏、骨骼肌、脂肪组织中GLUT4mRNA和IRS-1mRNA表达以;SJ旨肪组织中PPAR-YmRNA表达过程如下(1)总RNA提取按试剂盒说明书进行总RNA提取.RNA电泳进行验证，如果28SRNA:18SRNA约等于2:1，则说明RNA提取成功并且RNA没有降解'(2)逆转录及扩增取总RNA提取物，按照试剂盒说明操作。(3)RT-PCR半定量结&险测取产物用2%琼脂糖凝胶电泳，60V电泳1hr透射紫外灯下观察结果并拍照，通过电泳图像分析仪进行1良测量，基因表达水平用U比值表示.3.9g组织病理检查末次给药后，大鼠禁食12h，取J!^l组织，福尔马林固定，HE染色，石蜡包埋，切片，光4^见察。3.10—般状态检查体重、进食量、饮水量、尿量等一般观察.4.实验结果(部分)4.1模型合格大鼠筛选模型组大鼠采用高脂饲料喂养4周后，ip小剂量的STZ,筛选出造模成功大鼠50只，其空腹血糖与正常组相比有升高的趋势，但没有显著性差异，而糖负荷2h后血糖值与正常组相比明显升高(P<0.01)，表明模型成功.(见表3.1)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>Oh2h正常组107.03±0.737.59±0.83模型组507.75±1.459.01±1.47"注与正常组比较*P<0.005;**P<0.01;***p<0.001与模型组比较#P<0.05;##P<0.01;###P<0.001(下同)4.2葛-黄有效部位对2型糖尿病大鼠体重及进食量和饮水量的影响在造模前，各组大鼠体重均衡，无显著差异，在喂以高脂饲料至笫4周时，各组大鼠与正常组大鼠体重相比升高非常明显(P<0.001)，高脂饲料喂养各组大鼠之间体重无明显差异，在给予ipSTZ后的一周内即第5周，动物体重有明显变化，模型干预的各組动物体重明显下降，与正常组比较无差异，各组之间也无显著差异，表明STZ对大鼠的体重具有影响.开始给药后，动物体重开始升高，尤其是模型组体重增加明显，而各药物组大鼠与模型组相比体重增加緩慢，尤其是葛-黄有效部位中刑量组更为明显(P<0.001)，表明葛-黄有效部位具有减轻2型糖尿病所引起的肥胖的作用.(参见表3.2)给药初期，各组大鼠的进食量和饮水量相近，随着给药时间的延长，各组大鼠的进食量和饮水量出现不同的趋势，模型组呈增长趋势，而其余各组增长緩慢，至第八周，各药物组进食量、饮水量明显少于模型组，表明葛-黄有效部位具有改善2型糖尿病多饮多食的作用。表3.2葛-黄有效部位对2型糖尿病大鼠体重的影响(x±J，n=8)刑置造模期(g)给药期(g)组别(mg/kgow4W5W4W8W正常组一203.9±9.02336.7±22.53355.9±13.04450.4±19.83462.4±17.39模型组一200.6±12.45370.1±10.39**365.3±15.94477.0±22.54499.6±26.27**ROG1195,7±9.49363.7±12.77360.5±16.14432.9±27.61441.4±30.19#GH-H600201.4±9.95380.8±16.27354.5±20.58446.0±32.85#454.0±34.5##GH-M300201.5±10.68376.1±23.61354.0±8.59424.4±30.79420.1±28.66#胖GH-L150205.2±"-28366.4±15.53350.4±20.85458.6±33.17474.29±29.754.3葛-黄有效部位对2型糖尿病大鼠糖耐量的影响结果显示，模型组与正常组相比，糖负荷后血糖明显升高，葡萄糖耐量实验血糖曲线下面积也显著增加(P<0.01),表明2型糖尿病大鼠的糖耐量异常，而罗格列酮组和葛-黄有效部位中剂量组均可显著减糖尿病大鼠糖负荷后的血糖上升及AUC(P<0.05，P<0.01).说明葛-黄有效部位中剂量能改善肥胖大鼠的糖耐量异常.(见表3.3)表3.3葛-黄有效部位对2型糖尿病大鼠糖耐量的影响(*±J,n-7)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>4.4葛-黄有效部位对2型糖尿病大鼠胰島素耐量的影响结果显示，模型組与正常组相比，注射胰岛素40、90min血糖下降的程度小于正常组，血糖曲线下面积AUC明显高于正常組(P<0.01),表明2型糖尿病大鼠对胰烏素的敏感性降低，具有胰岛素抵抗特性.药物干预后，葛-黄有效部位中刑量组大鼠注射胰乌素后40、90min血糖下降的程度和AUC显著高于模型组(P<0.05,P<0.01),表明葛-黄有效部位中剂量具有改善2型糖尿病大鼠的胰島素耐量异常.(见表3.4)表3.4葛-黄有效部位对2型糖尿病大鼠胰島素耐量的影响(x±s,n=7)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>4.5葛-黄有效部位对2型糖尿病大鼠空腹血糖、血清胰岛素、胰岛素敏感指数及胰岛素抵抗指数的影响结果显示，模型组与正常组相比，其FBG、FINS明显身高(P<0.01)、胰岛素敏感指数显著下降(P<0.001)、胰岛素抵抗指数显著增加(P<0.01)，表明2型糖尿病大鼠具有高血糖、高胰岛素血症、胰島素的敏感性降低和胰岛素抵抗特性.各组药物中罗格列酮具有降低FBG、FINS以及改善胰岛素敏感性，改善胰島素抵抗的作用(P<0.01),葛-黄有效部位各剂量组仅高剂量具有降低2型糖尿病大鼠FBG的作用.因此葛-黄有效部位对降低血清胰島素、改善胰岛素的敏感性和抵抗性没有明显的改善.(见表3.5)表3.5葛-黄有效部位对T2DM大鼠FBG、FINS、ISI及HOMA-IR的影响(,n-7)刑重FBGFINS旧lHOMA-IR<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>4.6葛-黄有效部位对2型糖尿病大鼠脂质代谢的影响结果显示，葛-黄有效部位各剂量均可显著降低大鼠的血清总胆固醇和低密度脂蛋白水平(P<0.001),对升高的血清甘油三酯没有明显影响，各组药物对高密度脂蛋白均无明显影响.表明葛-黄有效部位具有一定的降脂的作用.(见表3.6)表3.6葛-黄有效部位对2型糖尿病大鼠脂质代谢的影响(，n=7)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>4.7葛-黄有效部位对2型糖尿病大鼠TNF-a和Leptin含量的影响结果显示，葛-黄有效部位中、低剂量均可显箸降低大鼠的血清中TNF-a和Leptin水平(P<0.01),其中葛-黄有效部位低剂量可非常显著的降低Leptin水平，表明葛-黄有效部位对TNF《和Leptin具有显著的抑制作用(见表3.7)表3.7葛-黄有效部位对2型糖尿病大鼠TNF-a和L印tin水平的影响(吐s，n=7)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>4.8葛-黄有效部位对2型糖尿病大鼠/yu泉组织形态学的影响^组织形态学观察①正常组大鼠胰腺细胞分布均匀，胰乌结构完整，边缘清晰，内分泌腺体胰岛和外分泌腺体未见异常改变。②模型组胰岛素抵抗大鼠胰腺细胞分布较均匀，但胰岛边缘模糊，结构完整性受到一定破坏，胰岛成纤维细胞增加和腺泡间质纤维组织增生.③罗格列制组胰腺组织中轻度充血，胰腺细胞分布均匀，胰岛结构完整，边缘清晰，腺泡间纤维组织轻度增生.④葛-黄有效部位高剂量组大鼠胰腺细胞分布均匀，胰岛结构完整，边缘清晰，胰岛内成纤维细胞轻度增加.葛-黄有效部位中剂量组大鼠胰腺细胞分布均匀，胰島结构完整，边缘清晰,腺泡间质纤维组织增生.⑥葛-黄有效部位低剂量组胰腺組织，脱泉细胞分布均匀，胰岛边缘模糊，结4.7葛-黄有效部位对2型糖尿病大鼠肝脏、骨駱肌和脂肪组织中GLUT4表达的影响结果显示，盐酸罗格列嗣可显著增加肝脏、脂肪和骨格肌中GLUT4蛋白的表达(P《0.05)，葛-黄有效部位高、中剂量均可增加肝脏中GLUT4的表达(P《0.05),另外葛-黄有效部位中剂量增加脂肪组织中GLUT4的表达(P<0.05)。5.小结葛-黄有效部位对2型糖尿病大鼠具有一定的治疗作用.四、防治2型糖尿病的药物组合对糖尿病大鼠心肌病变的影响I材料与方法1.1材料受试药物本发明药物组合(含葛根总黄酮50g，纯度60%;黄芪总皂苷25g,纯度60%)、葛根总黄酮，纯度60%;黄芪总皂苷，纯度60%;盐酸罗格列酮，恥格4mg/片，责州圣济堂制药有flb公司.葡萄糖、柠檬酸、柠檬酸钠均为分析纯；,佐菌素(STZ)，美国sigma公司生产；SOD、MDA、考马斯亮兰蛋白测定等试剂盒均购自南京建成生物工程研究所.1.2实验性糖尿病大鼠模型制备及分组剂量换算药对中，葛根与黄芪的比例为1:1(葛根30g、黄芪30g)。根据药材考察，所用药材葛根中总黄酮的含量为40.0mg/g,黄芪中总皂苷含量为20mg/g.按照100%转移率及提取物纯度，根据人每公斤体重(60kg)折算大鼠的临床等效剂量分别为葛胡(葛根总黄酮)为200mg/kg,黄苷(黄芪总皂苷)为100mg/kg,葛-黄有效部位为300mg/kg(葛根总黄嗣为200mg/kg+黄芪总皂芬为100mg/kg)。葛-黄有效部位高、中、低剂量组剂量，分别为600mg/kg、300mg/kg、150mg/kg体重，盐酸罗格列酮剂量为1mg/kg体重.SD大鼠70只，雌絲半，体重180g-200g，由广东省医学实验动物中心提供.其中60只用于造成糖尿病模型，另10只用于正常对照组，参考文献，采用链尿佐菌素(STZ)加高脂高热量饮食，造成糖尿病大鼠性心肌病变模型.实验分为正常组，模型組，阳性药组，葛-黄有效部位高，中，低刑量组.正常对照组用基础饲料喂养4周后，3ml0.1mmol/L柠檬酸緩冲液腹腔注射，再基础饲料喂养8周；糖尿病组先用高脂饲料(配方组成基础饲料52%，絲白12%，蔗糖10%,猪油24%，磷酸氢钙2%，复合多维0.1%，矿物质0.4%,盐0.2%，共100.7%)喂养4周，再采用30mg/kgSTZ腹腔注射，1周后测血糖和葡萄糖耐量异常者判断为糖尿病成模大鼠.将成模大鼠随机分为五组(模型组，阳性药组，葛-黄有效部位高，中，低剂量组)，并分别给药，每天1次，并继续高脂饲料喂养8周.1.3检测指标①一般状态检查对大鼠进行体重、进食量、饮水量、尿量等一般状态的观察.②血液样本的采集实验结束后，大鼠禁食不禁水12h,7%的水合氯搭麻醉,经腹主动I^L血，3500rpm/min离心15min，馭血清，测血糖血脂等，③心脏指数检测末次给药后，大鼠禁食12h，处死各组动物后，普通天平称取大鼠体重(BW),迅速取出心脏，电子天平称取大鼠心脏湿重(HW),计算BW/HW比值，观察模型组心脏指数情况以及药物的千预作用.④心肌组织形态学观察末次给药后，大鼠禁食12h，取心脏组织，置于生理盐水中反复冲洗，洗净残留积血，置入10%中性甲醛溶液固定；梯度酒精脱水，浸蜡，包埋，切片，片厚4um，HE染色，光镜下观察心脏组织形态学改变.进一步于电镜下观察对大鼠心肌组织超微形态学的影响将左心室切成1mm3小块，戊二醛固定，裤酸緩冲液冲洗，俄酸固定，磷酸緩冲液冲洗，氧化丙烯透明，Epon812工作液包埋，切成1jjm半薄切片，醋酸铀初染，枸橼酸鉛复染，最后里于透射电镜下观察超薄切片.⑤抗氧化能力检查处死各组动物，迅速取出心脏，剪除包膜、血管，用冷等渗盐水洗净，滤纸吸干，立即在1-41C条件下，分別制成100g/L心肌组织生理盐水匀浆，3000rpm/min离心15min,取上清液备用，检测心肌组织中超氧化物岐化酶(SOD)，丙二醛(MDA)水平以及蛋白含量，按试剂盒说明测定，通过比色法得出各指标吸光度，带入公式求出最后数据.1.4统计学处理各组实验数据均用均数士标准差表示，组间差异的显著性用t检验方法进行统计学处理。2实验结果2.1各组大鼠血糖的比较采用葡萄糖氣化酶法检测大鼠血糖，由表4.1可见，与正常对照组相比，糖尿病模型组大鼠iMt值显著升高(P《.05);与模型组相比，葛-黄有效邰位中剂量纽、阳性药血糖值显著降低，差异有显著性(P<0.05).表4.1各组大鼠血糖的变化(土SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>与"正常组"相比，#P<0.05;##P<0.01与"模型组"相比，*P<0.05;**P<0.01(下同)2.2各组大鼠尿量的比较采用代谢笼收集大鼠24h尿量.由表4.2可见，与正常对照组相比，糖尿病模型组大鼠尿量显著升高，差异有高度显著性(PO.01);与模型组相比，葛-黄有效部位高、中剂量组，阳性组尿量显著降低，差异有显著性.表4.2各组大鼠尿量的变化。土SD)组另'剂量(mg/kg)尿量(ml/100g体重)正常组一4.82±1.35模型组一9.22±4.80##ROG13.09±1.04**GH-H6004.39±1.49*GH-M3004.51±1.60"GH-L1506.14±3.942.3各组大鼠体重和心脏指数的变化实验初期，大鼠随机分组，各组体重无统计学差别.实验末期，正常组体重明显低于模型组，有显著性差异(P<0.05).葛-黄有效部位高、中剂量组体重与模型组比较有极显著性差异(P<0.01),阳性药组体重与模型组比较也有显著性差异(P<0.05)。在抑制心脏肥大方面，所有造模大鼠的心脏指数与正常组相比都有不同程度提高，而经过用药后，葛-黄有效部位高、中剂量组，阳性组的心脏指数与模型组相比均有显著差异。结果详见表4.3.表4.3各组大鼠体重和心脏指数的变化(x士SD)组别刑量(mg/kg)体重(g)心脏/体重指数正常组448.6±48.10.00261±0.00025模型组一504.8±62.8#0.00311±0.00033##ROG1445.1±60.1*0.00273±0.00043'GH-H600410.2±54.2"0.00275±0.00020"GH誦M300408.5±48.45**0.00282±0.00021*GH-L150456.2±64.10.00299±0細332.4各组大鼠心/PL^微结构的比较正常组心肌细胞排列整齐，细胞间由闰盘相连接，闰盘清晰、连续，结构完整.胞浆充满大量纵向平行排列的肌原纤维，l带、A带、H带与Z线、M线均明显易辨，形成明暗相间的肌节结构.细胞核位于心肌细胞中央部位，核内以常染色质为主，少量异染色质分布于核膜下或分散存在于核质中。胞浆中有丰富的线粒体，呈圃形或卵圃形，结构完整，嵴密集，排列有序，充满整个线粒体。心肌细胞间可见微血管，基底膜完整清晰.模型组心肌细胞的肌原纤维排列紊乱、断裂、分离、局部溶解，闰盘扭曲模糊断裂，肌浆网扩张.核膜不完整并呈节段性溶解消失病变，异染色质凝聚.线粒体增多非常明显，呈堆积状，线粒体肿胀变性，嵴断裂、溶解，线粒体M溶解、消失，形成空泡区.心肌细胞可见糖原颗粒和脂滴沉着，还可见到髄样小体。萬-黃有效部位高剂量组最接近正常组，其次是中剂量组也比较正常，低剂量组則有较明显的病变.其中，高剂量组肌原纤維排列整齐，与正常组相同，线粒体和细胞核形态正常，糖原颗粒存在状况与正常组相似.中剂量组肌原纤维排列尚可，线粒体形态大致正常，个别有畸形与肿胀病变.低剂量组肌原纤维排列有紊乱现象，局部出现肌丝溶解、断裂病变，线粒体较模型组有所改善，但仍可见为数不少的变性线肿胀，但整体病变较模型组轻.阳性组肌原纤维排列较整齐，线粒体和细胞核形态正常，个别有畸形与肿胀病变。糖原颗粒存在状况与正常组相似。2.5各组大鼠心肌组织中SOD活性、MDA含量的变化实验动物心肌组织中超氣化物歧化醉(SOD)活性测定，糖尿病模型组大鼠心脏中SOD活性低于正常对照组(P<0.01),经葛-黄有效部位干预治疗后，心脏中SOD活性升高，与糖尿病组比较差异显著.而氧化产物MDA的含量模型组与正常组相比显著升高(P"c0.05)，葛-黄有效部位干预組较模型组降低(P<0.05).以上结果说明葛-黄有效部位可以提高心肌组织的抗氧化能力。3.小结实验结果显示葛-黄有效部位对糖尿病大鼠的心肌病变具有保护作用.权利要求1、一种防治2型糖尿病的药物组合，其特征在于由以下重量配比的原料药组成:葛根总黄酮40～50份、黄芪总皂苷20～25份。2、根据权利要求1所述的防治2型糖尿病的药物组合，其特征在于各成分重量配比优选为葛根总黄酮50份、黄芪总皂苷25份。3、根据权利要求1所述的防治2型糖尿病的药物组合，其特征在于所述药物组合物应用在内分泌系统疾病方面，用于2型糖尿病的预防和治疗。4、根据权利要求1所述的防治2型糖尿病的药物组合，其特征在于所述该药物组合物以及提取物或精制物可以加入常规辅料或赋形剂，制成临床可接受的剂型，为口服剂型。5、根据权利要求4所述的防治2型糖尿病的药物组合，其特征在于所述口服剂型选自于丸剂、片剂、胶囊剂当中的一种。6、一种防治2型糖尿病的药物组合的制备方法，其特征在于，包括下迷步骤①、制备葛根总黄酮取葛根饮片添加12倍量80%乙醇加热回流2次，每次2小时，过滤药渣，合并滤液，所得滤液进行减压回收乙醇制得药液；上述药液上AB-8大孔树脂吸附，上样浓度为0.1g生药/ml，上样量为10BV,流速1ml/min，预吸附2小时，重吸附2次，再对吸附部位进行水洗至无还原糖反应；吸附部位进行50%乙醇10BV体积进行洗脱，流速为2ml/min,减压回收乙醇液，冷冻干燥后用粉碎机粉碎成14目颗粒，总黄酮纯度60%,备用；②、制备黄芪总皂苷取黄芪々夂片添加10倍量60%乙醇加热回流2次，每次2小时，过滤药渣，^并滤液，所得滤液进行减压回收乙醇制得药液；上述药液上AB-8大孔树脂吸附，上样浓度为0.1g生药/ml，上样量为10BV，流速1ml/min,预吸附2小时，重吸附2次，再对吸附部位进行水洗至无还原糖反应；吸附部位用0.5%氢氧化钠(NaOH)洗脱，流速为2ml/min，继用10%乙醇洗至中性，再用80%乙醇10BV体积洗脱，流速为2ml/min,减压回收乙醇液，冷冻干燥后用粉碎机粉碎成14目颗粒，总急芬纯度60%，备用；③、将上述制备的葛根总黄酮、黄芪总皂苷，按药物组合的各成份重量配比葛根总黄酮4050份、黄芪总皂苷2025份，以上材料混合搅拌均匀，然后制得药物组合。全文摘要本发明提供一种用于防治2型糖尿病的药物组合及制备方法。本发明的防治糖尿病的药物组合，由以下重量配比的原料药组成葛根总黄酮40～50份、黄芪总皂苷20～25份。本发明是一种具有益气养阴、生津止渴功效的药物组合，药理研究表明其具有降血糖、改善糖耐量、减少尿量、抑制胰岛素抵抗、降脂减肥的作用，可用于2型糖尿病的预防和治疗。文档编号A61P3/00GK101380353SQ200810218458公开日2009年3月11日申请日期2008年10月20日优先权日2008年10月20日发明者王春怡,赖小平,英高申请人:东莞广州中医药大学中医药数理工程研究院