专利名称：：金樱子高纯度总黄酮的提取及在制备心、脑血管药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种中药有效组分的提取纯化方法及提取物的应用，特别是从药用植物金樱子中快速制备高纯度总黄酮的方法及高纯度总黄酮在制备心、脑血管药物中的应用。
背景技术：
：心、脑血管疾病为危害人类三大疾病之一，死亡率居首。其中冠心病、高血压均为常见病、多发病，严重危害人们的生命健康和生存质量。缺血性心、脑血管疾病约占心、脑血管疾病的56.680.8%，生存者生活质量亦大大下降，约50%以上失去生活自理能力，给患者及其家庭造成了极大痛苦，亦给社会带来极沉重负担。目前治疗心、脑血管疾病的药物包括大量的西药，其效果并不理想，并具有毒副作用，在治疗心、脑血管疾病的同时也给身体造成了其他的伤害。众所周知，中药与西药相比具有较明显的特点，毒副作用小，成本低，对某些用西药难以治愈的疾病还具有较好的疗效。金樱子为蔷薇科植物金樱子(及o^/aev^teMichx)的干燥成熟果实，分布于我国的华南、华中、华东和西南等地贵州和云南等地，具有固精、涩肠、縮尿、止泻等功效。目前在金樱子中提取总黄酮的方法比较复杂，速度慢，成本高，且提取的总黄酮纯度低于50%，现有的这种金樱子总黄酮也没有应用于治疗心、脑血管疾病。
发明内容本发明的目的是提供一种速度快、成本低、纯度高的金樱子高纯度总黄酮的提取方法及金樱子高纯度总黄酮在制备心、脑血管药物中的应用，克服现有技术的不足。本发明的金樱子高纯度总黄酮的提取方法，其特征在于它包括如下步骤:a、首先利用药用乙醇对药用植物金樱子进行提取，药用乙醇的浓度选定在30%~60%之间，将药用植物金樱子的粗粉用6~8倍量的药用乙醇提取2~3次，每次12小时，合并各次提取液后减压浓縮至浸膏；b、利用大孔吸附树脂对a步骤产生的浸膏进行分离纯化处理，将浸膏加到已经处理好的大孔吸附树脂上，树脂和浸膏的用量比为12克树脂1毫升浸膏；在大孔树脂层析中先用水洗脱至流出液接近无色，接着用58倍树脂床的40%60%药用乙醇洗脱，接收乙醇洗脱流份，浓縮后减压干燥得金樱子高纯度总黄酮。所述的大孔吸附树脂为D101、AB-8等弱极性大孔吸附树脂。所述的a步骤中药用乙醇的浓渡选定在40%~50%之间，所述的药用植物金樱子的粗粉用7倍量的药用乙醇提取2次或3次，每次1.5小时；所述的b步骤中树脂和浸膏的用量比为1.5克树脂1毫升浸膏，所述的用水洗脱至流出液接近无色后，接着用67倍树脂床的50%药用乙醇洗脱。本发明的金樱子高纯度总黄酮的提取方法所得的高纯度总黄酮在制备心、脑血管药物中的应用。本发明的金樱子高纯度总黄酮的提取方法与现有技术相比，具有提取速度快、成本低、产品纯度高等优点；本发明的金樱子高纯度总黄酮在制备心、脑血管药物中的应用，可减轻心、脑血管病员的毒副作用，效果明显。具体实施例方式金樱子高纯度总黄酮的快速制备方法实施例1:1、取金樱子干燥成熟果实100g，利用普通方法粉碎成粗粉，其粒度为IO目或20目或30目或40目，即在10-40目之间均可。用6倍量或7倍量或8倍量的30%或40%或50%或60%的药用乙醇回流提取2次或3次，每次1小时或2小时，过滤，合并滤液，减压浓縮至浸膏约100ml。2、取100g或150g或200gD101或AB-8大孔吸附树脂，用95%乙醇浸泡12-24小时后，再用水浸泡12-24小时后加到层析柱上(4.0x60cm)，用大量水反复冲洗。将100ml浸膏加到树脂上端，打开活塞，流速为10ml/min，上样完成后，关闭活塞，静止吸附约2h，接着用蒸馏水冲洗至无色，接着用5倍或6倍或7倍或8倍树脂床的40%或50%或60%药用乙醇洗脱，弃去前200ml流出液，合并其余乙醇洗脱流份，减压回收乙醇后真空干燥，得红褐色粉末，平行操作3份，平均得率为5.37—5.54%。3、应用国家药典2000年版测定黄酮含量方法测定总黄酮含量，平均含量在76.04%—79.86%之间。实施例2:金樱子总黄酮的抗氧化活性金樱子总黄酮体内抗氧化活性-KM小鼠适应一周后随机分成2组，分别为对照组和给药组，每组10只，雌雄各半。对照组每天灌胃NG组0.9。/。生理盐水，给药组100mg/kg/d，共给药10d。实验期间均给予普通饲料，且自由摄食和饮水。实验第lld空腹过夜后处理小鼠取材。眼眶采血，低温离心分离血清(4。C，3000r/min，10min)-20°C保存待测。取血后的小鼠颈椎脱臼处死，取肝、肾，以冰生理盐水洗去浮血，滤纸吸干，液氮迅速冷却，称重。以预冷的PBS缓冲液(0.2mol/l,pH7.4)做匀浆介质在冰浴下将各器官组织机械匀浆(l.Og湿组织加9.0ml缓冲液)，得10%组织匀浆。于4。C，6000r/min离心10min，分离上清，-20。C保存待测。按照南京建成所提供试剂盒说明测定各组血清及组织T-AOC,MDA和SOD的值，并用SPSS11.5软件对数据进行统计。得下表l:表1各组小鼠不同样本T-AOC,MDA和SOD值(Mean±S.D.，n=10)样本指标对照组给药组T國AOCOJ/ml)4.798±0.8539.348±0.714'，血清MDA(腦ol/ml)5.093±1.0192.963±0.488**SOD(U/ml)288.776±63.300382.829±84.876*T-AOC(U/mgprot)0.280±0.0900.497±0.064'肝MDA(nmol/mgprot)1.292±0.1690.971±0.183*SOD(U/mgprot)132.444±15.301186.205±29.660*T-AOC(U/mgprot)0.650±0.1240.932±0.153*肾MDA(nmol/mgprot)3.319±0.8501.814±0.428*SOD(U/mgprot)162.797±35.854233.566±71.997*注给药组与对照组比较，><0.05，**p<0.01机体防御体系的抗氧化能力强弱与健康程度存在着密切联系，防御体系机能的降低常导致各种疾病的发生，因而测量人体的体液、组织等的T-AOC具有重要意义。从表1可知，给药组的血清及其各组织的T-AOC与对照组比较，存在显著性或极显著性差异。MDA作为脂质过氧化的代表产物，是衡量机体自由基代谢的敏感指标，其含量能客观地反映机体产生自由基的水平。给予金樱子总黄酮溶液后，小鼠血清和组织MDA水平均显著或极显著降低，说明口服金樱子总黄酮溶液能减少体内自由基的形成，增加体内过氧化脂质的排泄，表现出明显的体内抗氧化作用。SOD是机体抗氧化系统中重要的酶类，从表1可知，给药组的血清及其各组织的SOD与对照组比较，存在显著性差异。分析实验结果发现，金樱子总黄酮能显著地降低体内MDA水平，提高T-AOC和SOD，显示其具有良好的体内抗氧化作用。金樱子总黄酮的体外抗氧化实验DPPH自由基清除率测定按照相关文献进行操作，可得，金樱子总黄酮清除DPPH的IC5C为0.01mg/ml，最大清除率为88.3%;维生素C清除DPPH的IC5Q为0.008mg/ml,最大清除率为96.5%。清除超氧阴离子自由基能力测定将金樱子总黄酮粉末用去离子水配制成质量浓度5mg/ml的溶液，并稀释成不同的浓度梯度，具体操作见相关试剂盒说明书。可得，金樱子总黄酮清除超氧阴离子自由基的IC5o为0.08mg/ml，最大清除率为50.3%;维生素C清除超氧阴离子自由基的IC5o为0.01mg/ml，最大清除率为97.23%。清除羟基自由基OH-能力测定-将金樱子总黄酮用去离子水配制成质量浓度5mg/ml的溶液，并稀释成不同的浓度梯度，具体操作见相关试剂盒说明书。可得，金樱子总黄酮清除羟基自由基的IC5()为0.041mg/ml,最大清除率为94.03%;维生素C清除羟基自由基的ICso为0.005mg/ml，最大清除率为96.67%。还原力的测定按照相关文献进行操作，可得，在00.05mg/ml范围内，金樱子总黄酮最大吸光度为1.17;维生素C最大吸光度为1.45。过氧化氢清除率测定按照相关文献进行操作，可得，金樱子总黄酮与维生素c对过氧化氢的清除，都随着浓度的增大而不断增大，当到一定浓度时，清除率开始下降。金樱子总黄酮的最大清除率为31.4%;维生素C的最大清除率为96.67%。红细胞溶血抑制率测定按照相关文献进行操作，可得，金樱子总黄酮抑制红细胞溶血的ICs。为0.35mg/ml，最大抑制率为71.62%;维生素C抑制红细胞溶血的IC5。为0.15mg/ml，最大抑制率为94.63%。脂质过氧化抑制率测定按照相关文献进行操作，可得，在02.00mg/ml范围内，金樱子总黄酮最大抑制率为48.45%;维生素C最大抑制率为50.14%。实施例3:金樱子总黄酮对小鼠高脂血症和高胆固醇血症的影响KM小鼠在实验环境下适应一周后，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。各组(除空白组)均在给予高脂饲料(基础饲料97.6%，胆固醇2%，胆盐0.4%)前提下进行如下灌胃(i.g.)处理。空白对照组，模型对照组，给予0.9%生理盐水；阳性药物组，给予100mg/kg/d脂必妥(成都地奥制药厂生产)；高剂量组给予200mg/kg/d;低剂量组，给予100mg/kg/d，每天9:00给药，连续4周，实验期间动物自由饮水和摄食。最后一周采用摘眼球取血法采血。血样于4°C，6000r/min离心20min分离得血清。按照试剂盒说明书测定TC,TG和HDL-C,并通过公式LDL-C(mmol/l一TC-(TGx0.456+HDL-C)计算低密度脂蛋白(LDL-C)。结果见下表2。表2.各组血清TC、TG、HDL-C、LDL-C的值(Mean士S.D.,n=10)组别TC(mmol/1)TG(mmol/1)HDL國C(蘭o1/1)LDL-C(mmo1/1)空白2.74±0.620.65±0.091.25±0.211.19±0.37模型1.76±0.12#"*0.42±0.07#，'8.57±1.00##'"阳性6.02±1.2"0.60士0.23'0.94±0.29*4.80±0.81*高剂量5.01±1.39"0.70±0.23"1.01±0.18'3.68±1.10"低剂量5.19±1.22**0.53±0.16**0.71±0.14'4.24±1.01*注模型组中TC，TGHDL-C和LDL-C值与空白组比较，#/<0.05，##/7<0.001;给药组指标值与模型组比较，》<0.05,*><0.001从表2可知，模型组胆固醇、甘油三酯与空白对照组比较有显著性差异，说明小鼠实验性高脂血症建模成功。阳性组、金樱子总黄酮高剂量组和低剂量组与模型组比较都存在显著性或极显著性差异。而且可知高剂量组降脂效果比阳性对照组要稍好一些。说明金樱子总黄酮具有显著的治疗心血管疾病的生物活性。实施例4:金樱子总黄酮对大鼠高脂血症和高胆固醇血症的影响SD大鼠在实验环境下适应一周后，随机分为4组，每组10只，雌性。各组在给给予高脂饲料(基础饲料93.6%，猪油4%，胆固醇2%，胆盐0.4%)的条件下造高脂血症模型，每周检测其血脂水平，两周后，造模成功。根据不同血脂水平，随机分组，各组继续给予高脂饲料前提下进行如下灌胃(i.g.)处理。模型对照组，给予0.9%生理盐水；阳性药物组，给予40mg/kg/d力平之(法国利博福尼制药公司)；高剂量组给予200mg/kg/d;低剂量组，给予IOOmg/kg/d，每天14:OO给药，连续4周，实验期间动物自由饮水和摄食。最后一周采血测其血脂水平和血液流变学各指标。按照试剂盒说明书测定TC，TG和HDL-C，并通过公式LDL-C(mmol/l)-TC-(TGx0.456+HDL-C)计算低密度脂蛋(LDL-C)。全血比粘度、取抗凝血，用比粘度计测不同切变率(低切:20s",高切200s")下的比粘度；RBC压积(％):选用内径约0.8mm长约75mm均匀光滑的毛细玻璃管，吸入抗凝血30ul，约占管长的3/4处。封好底口，以高转(12000r/min)平板离心机离心5min。测量血液总长度和红细胞长度，计算红细胞所占百分率,即为红细胞压积;血浆比粘度抗凝血，1000r/min离心5min，分离血浆，用比粘度计测定；血清比粘度取非抗凝血，3000r/min离心10min，取血清测比粘度。并计算全血还原比粘度=全血比粘度/RBC压积；纤维蛋白含量(mg/ml)^血浆比粘度-血清比粘度)x5/0.002;RBC聚集指数二全血低切比粘度/全血高切比粘度。结果见表3、表4和表5。表3.各组血清TC，TG，HDL-C和LDL-C的值(Mean±S,D.，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注给药组指标值与模型组比较，》<0.05，》<0.001表5.金樱子总黄酮对各组血液流变学的影响(Mean士S.D.，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注给药组指标值与模型组比较，》<0.05,》<0.001从表3可知，阳性组、金樱子总黄酮高剂量组和低剂量组与模型组比较都存在显著性或极显著性差异。而且可知高剂量组降脂效果比阳性对照组要稍好一些。与模型组比较，金樱子总黄酮具有显著的治疗心血管疾病的生物活性。动脉粥样硬化(As)是心脑血管疾病的主要病理基础。As发病机制复杂，涉及到脂蛋白浸润、动脉内皮(EC)损伤、血小板黏附聚集、血栓形成、平滑肌细胞(SMC)增殖等。高脂血症及AS均有血液流变学异常的表现，纤维蛋白原对血浆粘度的影响最大，并可直接损伤EC，促进LDL-C潴留，SMC增殖，单核细胞趋化等参与AS的形成，金櫻子总黄酮大剂量可明显降低纤维蛋白原含量，降低RBC聚集指数和压积，显示其对高脂大鼠血液浓、粘、凝聚有较好的拮抗作用，有利于改善AS引起的缺血症状。总之，金樱子总黄酮可对高脂血症大鼠血脂水平和血液流变学有明显的作用效果，具有明显的降脂活性。9权利要求1、一种金樱子高纯度总黄酮的提取方法，其特征在于它包括如下步骤a、首先利用药用乙醇对药用植物金樱子进行提取，药用乙醇的浓度选定在30％～60％之间，将药用植物金樱子的粗粉用6～8倍量的药用乙醇提取2～3次，每次1～2小时，合并各次提取液后减压浓缩至浸膏；b、利用大孔吸附树脂对a步骤产生的浸膏进行分离纯化处理，将浸膏加到已经处理好的大孔吸附树脂上，树脂和浸膏的用量比为1～2克树脂1毫升浸膏；在大孔树脂层析中先用水洗脱至流出液接近无色，接着用5～8倍树脂床的40％～60％药用乙醇洗脱，接收乙醇洗脱流份，浓缩后减压干燥得金樱子高纯度总黄酮。2、根据权利要求1所述的金樱子高纯度总黄酮的提取方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂为D101、AB-8等弱极性大孔吸附树脂。3、根据权利要求2所述的金樱子高纯度总黄酮的提取方法，其特征在于所述的a步骤中药用乙醇的浓度选定在40%~50%之间，所述的药用植物金樱子的粗粉用7倍量的药用乙醇提取2次或3次，每次1.5小时；所述的b步骤中树脂和浸膏的用量比为1.5克树脂l毫升浸膏，所述的用水洗脱至流出液接近无色后，接着用67倍树脂床的50%药用乙醇洗脱。4、一种根据权利要求1至3中任意一项所述的金樱子高纯度总黄酮的提取方法所得的高纯度总黄酮在制备心、脑血管药物中的应用。全文摘要金樱子高纯度总黄酮的提取步骤如下a.首先利用药用乙醇对药用植物金樱子进行提取，药用乙醇的浓渡选定在30％～60％之间，将药用植物金樱子的粗粉用6～8倍量的药用乙醇提取2～3次，每次1～2小时，合并各次提取液后减压浓缩至浸膏；b.利用大孔吸附树脂对a步骤产生的浸膏进行分离纯化处理，将浸膏加到已经处理好的大孔吸附树脂上，树脂和浸膏的用量比为1～2克树脂∶1毫升浸膏；在大孔树脂层析中先用水洗脱至流出液接近无色，接着用5～8倍树脂床的40％～60％药用乙醇洗脱，接收乙醇洗脱流份，浓缩后减压干燥得金樱子高纯度总黄酮。金樱子高纯度总黄酮在制备心、脑血管药物中的应用。文档编号A61K36/185GK101385793SQ20081022821公开日2009年3月18日申请日期2008年10月22日优先权日2008年10月22日发明者刘克辛,刘月涛,彭金咏,许丽娜,郑玲俐,旭韩申请人:大连医科大学