从乳中提取蛋白质的方法

专利名称：：从乳中提取蛋白质的方法
技术领域：
：本发明涉及一种或多种蛋白质，尤其是其三级结构形成疏水区并且存在于乳中的^M犬蛋白质的提耳^t程，该提^W:程^^]一种载体，该载体与同时具有疏水f生和离子性的配体结合。
背景技术：
：市场上买得到的多数药物由通过合成而获得的化学物质组成。事实上，直到目前，现代医学已严重^l负于通过化学合成而生产的药物^i行治疗和疾病诊断。然而，蛋白质表现了携带生物信息的衬的有效部分。尤其对于大量激素、生长因子、血液凝固因子、和甚至4沐来说，情况就是这样。一^^说，蛋白质为由tti^且成的聚合物，通常具有高分子量、并且不育诚过合理成本下的化学合成方式获得。治疗^fM的蛋白质通常是从，例如活体、组织或者人类或动物的血液等中分离和纯^^寻到的。对于从猪胰腺中提取的胰岛素、例如因子vm或因子dc等A^浆中提取的凝固因子、以戏疫球蛋白来说情况ti^这样。然而，尽管前述蛋白质的制备过程今天被广泛^^),但是它们具有缺点。乂Ajk小板中提取的某种蛋白质的低含量使满足日益增长的治疗需求的足够量的离析无法进行。而且，血浆中病毒、朊病毒、或其它病原体的存在使得对于血浆蛋白的制造过程来说包括附加的病毒中和和/或病毒消去步骤是必需的，以获得可以用于治疗目的的该产品。为了弥补这些缺点，已经4^力于基因工程，该技术也同样广泛用于将孤立基因转移至细胞的蛋白质合成，！^进行正被讨论的蛋白质的分泌过程。从其自有原始细胞系统外部获得的这种蛋白质为^H口的"重组"蛋白质。根据该技术，可以^J1各种细胞系统。例如E.coli等细菌系乡W皮非常广^i似M并且非常有效。它们使以l线本生产重4组蛋白质成为可能。然而，该系统只限于用于不需要精细折叠过程的简单、非糖基化蛋白质的制备。真菌系统也用于分泌蛋白质的制备。该真菌系统的缺点在于以下事实，即它们引起翻译后修饰，包括，例如多糖单元和辟應基团的接枝，这极大影响了合成蛋白质的药物特性，尤其是通^口成各种甘S4唐衍生物基团。^if]杆状病毒的系统使生产例如疫苗蛋白质或生长激素等多种蛋白质成为可能；然而，它们的工业应用并不乐观。哺乳动物细月^tt在例如单克隆抗体等复杂重组蛋白质的制备中生长。细月^4达系统导致适当;^y斤叠和^^重组蛋白质。关于产品成本的低收率是主^点。作为对该细胞系统的剩戈，转基因植4辆ttJI]，以获得有效数量的蛋白质。然而，这些系统；1起植物特异性翻译后修饰，尤其是通过将高免疫^f唐歹^i口成到合成蛋白质上，因而限定了它们用于治疗目的的使用。对以上所提及细胞系统的一个^^包括^JD转基因动物，用于重组疫苗或复杂治疗蛋白质的生产。所合成蛋白质展示了非常类似于人类蛋白质的糖基化，并且被适当:NW斤叠。这些复杂蛋白质不仅仅包括例如生长激素等单独的多肽链；相反，它们在氨基^i且合之后以各种方式修饰，尤其是通过特异性断裂、糖_&化和羧曱基化。在绝大多数情况下，该^^不能通过细菌细月线酵母来批f亍。相瓦地，转基因动物使得在细菌细胞系统中所发现的表ii7K平和^^]细月媳养所获得的翻译后^^这两者的结合成为可能，其所有产品^4氐于通过^^细月汰达系统而担负的成本。在转基因动物的生物材料中，乳已成为已导致其被考虑作为重组蛋白质的非常良好的分泌源的研究主体。从转基因动物的乳中所生产的重组蛋白可以轻易的通过将编码有期望得到的蛋白质的基因^斜妄到乳中的蛋白质合tt因之一的调控区而获得，这将该蛋白质特定地导向乳腺，并随后在乳中分泌。作为一个实例，可以参考欧洲专利申请号EP0527063,期苗述了转基因哺乳动物的乳中的期望蛋白质的生产，其中编码期望蛋白质的基因表达由乳清蛋白启动子控制。其它专利或专利申^t苗述了转基因哺乳动物的乳中的抗体的制备(EP0741515)、月^f、(WO96/03051)、人类因子IX(US6046380)、以及因子Vm/血管')iik^病因子^4勿(EP0807170)。尽管在蛋白质表达方面这些方法结果令人满意，但是<錢乳作为重组蛋白源具有缺点。主魏点在于一方面是难以具有令人满意收率;hM人乳中提取它们、另一方面是随后的纯化的困难。事实上，乳是一种包括90%水以及可以划分入三类中的各种其它组分的〉V^物。第一类，被称作"抗孝Ljk清"(或乳清)，包括碳水^^4勿、可溶f生蛋白质、无才;i4为和水溶性维生素。第二类，被称作"脂相，，(或乳脂)，包含IW匕形式的脂肪材料。第三类，被称作"蛋白质相"，包括大约80%,白，形成一组蛋白，其在钩存在的情况下，可以在pH值为4.6时或通过凝乳酶的作用而沉淀。各种酪蛋白可以与磷钧盐形成iiJ'j跟0.5iam类似直径的胶体月^il^4勿，例如磷酸三4丐聚^("族")，即Ca9(P04)6。该月棘由白亚1^且成，该白亚基由富含有k-終白的亲水层围绕疏7jofe组成，磷4丐盐通过静电相互作用而与亲水层结合。这些磷钾盐也可以存在于M^体内部，不与*白结合。该蛋白质相也包含可溶性蛋白质，例如乳清蛋白和享U求蛋白，以^自血液的清蛋白和免疫球蛋白。依赖于转基因动物乳中所分泌的重组蛋白质的种类，该蛋白质可以或者存在于抗导Lk清中或者存在于蛋白质相中，或者甚至同时存在于它们两者中。乳组分中^""种类的富足和复杂使得进行蛋白质的提取更加困难，尤其是在i^白月棘中的一种。另一个困难在于以下事实，即在两个相中任意一个中的该蛋白质的优势不育g皮确定'^也预测。重组蛋白质也可以展示乳中钩离子的亲和力，其以盐和/或各种可溶性复^4勿的形态、或以S^白月^^钩磷酸盐的形态存在。这些亲和力通过蛋白质和二价i丐阳离子之间的静电^^反映。蛋白质/钩离子亲和力使得定义亲和常凄诚为可能，其^*负于它们的值，并确定了键的强度。"i&^说，大部分具有钙离子亲和力的蛋白质与月妹的钙磷,结合。它们的提取需^/f亍复杂步骤，具有相应的扭/ft^收率的问题。乳业中所使用的传统解决方法是隔离蛋白质，其包括巴氏灭菌法，随后是酶凝聚或酸沉降(在pH值为4.6处)，#该情况下并不能应用，因为重组蛋白质通常由于温度和pH值的组合影响而变性。而且，蛋白质圈闭入喊白月緣中导致^^取收率。其它解决方法，包才射躺过滤、离心分离、和/或^定或沉降技术来#^亍射留乳的物理方法，也导致不可接受的提取收率以^^斤提取重组蛋白质的纯度低。文档EP0264166描述了在转基因动物的乳中的期望蛋白质的分泌。该文档没有提朋于从乳中纯化该蛋白质的《封可步骤。美国专利号4519945描述了通过从乳中制^蛋白和抗fLjk清的沉淀来提取重组蛋白质的过程，其进行具有如上所述的酸化和加热步骤。该过程导致所讨论的蛋白质活性的^损失以及^^取收率。美国专利号6984772批露了从转基因哺乳动物乳中纯化重组纤维蛋白原的过程。该过程包括有^^]连续离心^ft乂A^白颗4沐蛋白质相中分离^ILjk清的步骤。抗孝Lii^i皮分离并且F4^被^f诸用于该过程的其他步骤，其给出了纯化纤维蛋白原的解决方法。然而，该过程不能以令人满意的收率应用于重组蛋白质的产品，蛋白质，例如因子vn、因子vm和因子ix等血浆凝聚因子，净皮圏闭入#白月^^之中和/或^^上。专利申请WO2004/076695描述了从转基因动物乳中过滤重组蛋白质的过程。该过程包括初始化的乳澄清步骤，即包括去除乳组分，以获得能够通过其孔具有0.2jim直径的滤膜而被过滤的溶液。该步-骤导致SW白^^的去除。其结果，依据收率，如果酪蛋白胶束能够包^""种被圈闭入它们结构内部的期望蛋白质，该步骤的拟亍可能是禁止的。美国专利号6183803描述了例如乳清蛋白等天然存在于乳中的蛋白质、以及例如Aii清蛋白或al-4^夷蛋白,来自乳的重组蛋白质的分离。该过程包括初始化步骤，其包^^置^^与包含期望蛋白质的4'W矣触。该步骤引起^白月緣的分裂，这依次导致包^SW白的澄清乳清、抗l'b6L清蛋白质、以及期望蛋白质的形成。该过程随后包括一包含有通过不可溶的二价阳离子盐附加到液体载体(即澄清乳清)的白胶束的结构再形成的步骤。这些月^;冗淀物，导致包括期望蛋白质的液相的形成，因为盐充满了錄白的静电结^位，该期望的蛋白质不被圈闭A^棘中。因而，根据该过程，期望蛋白质的分离最终通ii^殊的结构再形^A其^i定来实现。该过程复杂并且难以才丸行，并且不能应用于具有对钾离子相对高亲和力的蛋白质。凝聚蛋白质，尤其包括那些z^口的在维生素K的作用下合成的，属于该类别。从两个观察开始一一即转基因动物乳中分泌的和存在于抗享Ui清中的特定种类的重组蛋白质的分离和纯化的过程导致非常低的收率，以及白胶束中所收集的其它种类蛋白质的过程复杂并难以扭行一一本申请将其目标定位于提供从乳中提取不管是天然的还是其它形式的为乳的组分的蛋白质的过程，例如重组因子vn、因子vm、以及因子K，它们尤其表现出对于乳中的钙离子具有亲和力，该过程可以以简单的方式净;M亍，具有令人满意的产品收率，并且保留了蛋白质的生物活性。
发明内容基于应对该技术问题的目的，本申请提供了对于存在于乳中的蛋白质的提取的过程，该蛋白质具有至少一个疏水区以A^乳的固有pH值下带负电荷，包括以下步骤，包括a)糊又并脱脂所述乳，b)将包含所述蛋白的经im脂并撇清后的馏分转移到层析载体上，在该层才斤载体上，在允许该蛋白质在该载体上被捕获的pH值下，在其上接枝有同时为疏水的和离子的配体，所述pH值高于4.6，c)舰蛋白质，d)通过从该所洗脱馏分中去除乳蛋白质而纯化所洗脱的馏分，以及e)回J)W斤述蛋白质。本发明的过程的优点在于它非常容易实施，因为，一方面，它仅包含很少的步骤，并且另一方面，它不必要需要先于第一步骤实施之前实施乳澄清步骤，该第一步骤用于在其上4斜妾有@沐的载体_11^得期望的蛋白质。根据本发明的过程可以应用于新鲜專UU水冻乳。乳可以来自于包含期望蛋白质的任意雌性哺乳动物，例如奶牛、母羊、山羊、兔子、小鼠、老鼠或母猪，所列出的是非限定性的。4^负于所讨论的哺乳动物乳的天然流动性，有利于先于l^咏腳旨步骤之前使乳流动。作为一个实例，可以参考兔子乳，其相当稠密，有利地流动以更容易扭行本发明。然而，即使斜目当稠密的乳的情况下，流动步骤也只不过^^可选的。该流动步骤可以通过将水l"ii^剂力口入到生乳中而^U亍。例如，水f:ii^剂可以是浓度低于100mM的磷齢溶液，其pHii^7.5和8.5之间，伊Ci^錄8.0和8,3之间，例如浓度为30mM磷酸钠溶液，pH值为8.0,该列出的不是限定性的。例如水l^i^剂也可以包含氯^^内，其最大浓度大约为40mM。该溶液维持乳的稳:^^i吉构(悬浮酪蛋白胶束)。出于本申请的目的，术语"4糾又，，应当理解为指的是乳的脂肪性物质的分离，以获得两^H留分，即4W4'L和乳脂。^^是一种所属领域技术人员/》如并且可以扭軒的技术，例如^^撇乳器或依靠诸如三氯乙酸的有枳i^剂，这并不是限定性的。在一个特定实施例中，乳的4Wit过具有正zKta电位的玻璃纤维载体的it^虑来执行。作为该过滤器的一个实例，可以参考Ultipo漲GFPlus过滤器以及HPserieSupradisk过滤器或AKS活性炭系列(PallLifeScience)、GF过滤器(whatman)、VRZetaplusi^虑器或Delipid过滤器(Cuno3M)。具有l|im阈值的Ultipo漲GFPlus过滤器(Pall)和深度it)虑器VR02或VR04(Pall)^i^f錢。该过滤步骤也使得对该馏^ii行脱脂成为可能，即，去除例如脂肪酸、甘油酯和固醇等脂质。该脱脂可以在将被稀糾的乳静置30^4中^用Ultipo涨GFPlus过滤器通过乳的正面过滤而完成(以使得脂脉性物质悬浮到表面，从而促进乳脂从乳中的分离)。该4W^则旨步-骤是必要的，因为4斜妾到载体上的酉沐吸附脂质，该@沐同时为疏水的和离子的。因此，该脂质必须先于步骤b)之前被去除，因为要不然，期望的蛋白质不能由配体保留，或者可能仅被很少地保留。该情况的结果将是期望蛋白质提取的过程收率的减少。本发明优势方面之一在于以下事实，即经过步骤a)后产生的镏分已简单地3皮撇取并则旨，可直接适于步骤b)的执行，步骤b)非常优势地是一个经由亲和层析纯化的步骤。因而，不严档必需进行中间步骤用以佳所^^脱脂馏^t合于步骤b)中亲和层冲斤的纯化。步骤b)应当不会在低于S^白等电点(pl)的pH值下l5W亍，即在4.6和5之间。事实上，如果步骤b)在低于S^白pI的pH值下^f亍，后者将^CJ定，从而引^于层析载体的^^损坏的风险。特别地，当层析步骤^^柱^/f亍，,白的^tJ定可能阻塞该柱，从而损坏该一i^其内^^勿，即层析^^交。而且，在低于4.6的pH值下，也可能导致其它蛋白质沉淀，例^^者如#4失蛋白或白蛋白，其能够引起收率P争低。i^，某些蛋白质在酸性pH值下变性，例如因子vn、因子vm、因子DC、纤维蛋白原以及补充因子H，该列出的并不是限定性的。步骤b)有利地在5和8,5之间的pH值下执行。在步骤a)中所生产的所4W^变性的乳因而在5和8.5之间的？11值下应用于步骤13)中的层析载体。该pH值有利地在5.5和8之间，或者在6和7.5之间。该pH值优i4i也在6.5和6.8之间。该pH值更伊Ci^也是乳的天然pH值。在该pH值下(即，在5和8,5之间的pH值下)，具有天然相互作用点的蛋白质，例iai者如抗原/抗体、酶/酶解物、或酶/抑制剂的亲和力或伪亲和力的蛋白质，该列出并不是限定性的，在关于^Dt匕的相对位置上天然地具有它们的电荷和疏水区域，并且不会在pH值5和pH值8.5之间大幅变动。因此，在该pH值下，这些蛋白质是负电荷。有利地，在该pH值下，酉沐和蛋白质之间的相互作用实质上是疏水^。有利的，本发明的过程中使用的的层析技术允许包含有期望蛋白质的所脱脂和撇取的馏分在载体上被捕获，载^J^斜妄有同时是疏水的和离子的酉己体。出人意料地，该酉己体使得^if由于其结构而具有疏水片的期望蛋白质成为可能，同时不^if包4織蛋白月^^内的杂质。蛋白质的内部疏水区域可以^if到该种配体，并将允许与所期望的蛋白质产生相互作用，从而确保与所期望的蛋白质的高亲和力并增力口对即将要纯化的蛋白质的i4棒性。未^^if的蛋白质本质上包括大部分SW白、乳清酸蛋白(WAP)、4M失蛋白、孝U求蛋白、乳白蛋白禾7血清蛋白。而且，该过考lit于提取具有指定特性的任意蛋白即在乳的天然pH值下，即在从大约6,5到6.8的范围内，蛋白质具有疏水区域并且携带负电荷；或者，M少，电荷的综M衡非常有利地偏向负电荷。在本发明的范围内，pH^f牛允i條白质被保留、或通常来i^ic^if到层析载体的酉己体上，或者通iti5M^目互作用、或者通过静电相互作用以A^7j^目互作用。该状况很大程^Ji依赖于将被纯化的蛋白质的等电点，并且因》化该pH值下完成过程。可負^f賴的层析载体是具有(阴离子交换体型的)正电荷酉沐的载体，并且pH值可适合于使^^白质携带总的负电荷。相反地，负电荷的闺沐可以^J]，当过禾1^利地用于4Aff本发明即在5和8.5之间的pH值下^(/f亍时。该酉沐的末端官能团例如可以是^tl^^l^官能团，并且pH值可以设置到大于6的值，使#^白质具有总的正电荷。该实施例是可以应用的，当将被纯^^白质的等电点是^U成性pH值下、尤其是在大于6的pH值下，蛋白质具有正电荷。也应该注意确保pH值与该过程的l^f于兼容，以便不显著损坏一夺被提取的蛋白质或乳。在另一个实施例中，^f亍步骤b)所处的口^錄5和8.5之间，并且pH值以这样的方式选择使蛋白质和l沐t间的相互作用本质上是疏7K的。步骤c)(洗脱)的扭行可以佳月所y^贞域技术人员么如的任意'舰剂来^vf亍，其允许蛋白质停止被保留，例如由于离子排斥效应以及离^it应。^^优i4i也包括离子排斥效应。蛋白质的结构形态和蛋白质的电荷可以通过调整洗脱緩冲剂的pH值、或者通iii^W当的^Mi爰沖剂来修改。在^/f亍步骤b)之前，层片械体伊^i也用具有低于100mM浓度的基于磷S組的溶液(负^M冲剂)来平衡，其pH值包括在7.5和8.5之间，伊^i脉8.0和8.3之间，例如从20到30mM、pH值为8.0的磷酸钠溶液。该溶液也可以包含氯^l内，其最大浓度大约为lOOmM,并且优i^tk^J:于20-60mM范围内。该溶液也可以基于柠檬卧組，尤其是三钠柠^i臾盐0.20-030M,优iti也为0.25M,pH值为7.5-8.5，其电导率在30和40mS/cm之间，尤其是35mS/cm。更进一步，在步骤b)^可以立即用緩冲剂才似亍的洗涤步骤，伊述的，緩冲剂和负^M沖剂相同。该洗涤步骤的有效寸組奴义波狄的光学密度测定(OD)^f企查，该定义波长例如为280nm，其应当返回空值或者返回U戋值。在这种情况下，可以收集因此而获得的馏分。；m步骤c)的^f亍可以以所44页域^支术人员7^P的允许蛋白质不再被保留的任意^^剂来^^亍，作为一个实例是通过离子排斥效应或者^Lit过离^i丈应。伊^4i也，通过离子排斥效应来4似ii舰。蛋白质结构形态和负荷可以利用;m緩冲剂的pH值、或者也利用选择皿緩冲剂来修改。作为一个实例，^^析载体具有正电荷(阴离子交换体型)的酉己体，可以参考尿素和tt乙酸的〉V曰^f勿,尿素浓度在1.2和8M之间，絲乙^^农度在25mM和50mM之间，该浓;l^在"曰t/H勿中的最终浓度。应当指出具有蛋白质tt与尿素碧可能产生其一些变性，并且在外因性^^勿(i^E是氨基乙酸)的tt4在情况下，尿素随后将产生更少的蛋白质以及目标蛋白质的变性。;舰剂的其它实例包括包括pH值在4和6之间的酸性水溶液，含水';^^4勿包括多种组分，伊Citi也为从包括以下的组中选择出的两种或三种，该组包括磷酸钠和乙二醇，磷酸钠浓度在5mM和50mM之间，优选地为30mM;柠#^钠和乙二醇，杵檬酸钠的浓度在5mM和50mM之间，优iti也为30mM;磷酸钠和乙二醇，磷酸钠浓度在5mM和50mM之间，优选地为30mM;TRIS/NaCl及钩盐、和乙二醇，前者的浓度在lmM和10mM之间，优i^t也为5mM;辛酸钠和乙二醇，辛酸钠的浓度在10mM和lOOmM之间，优选地为30mM;含水混合物，由于化合物的存在其导电率低于3Ms/cm,例如30mM的磷酸钠溶液，也可以使用。上述浓^^曰^物的最终浓度。对于包含乙二醇的上述二元〉V給物，乙二醇的体积比尤其在20和70%之间。对于所有这些包含乙二醇的緩沖剂，可以用毒f生更小的丙二S享^^,或者用任意其它溶剂脊氏。尿素有利地可以用作tt^存在时的洗脱剂，(其最终浓度对于尿素来il^从1.2到8M之间变动、对于氨基乙酸或任意其它募^^L说从25到50mM)，该溶液由于其离液力而使得抑制酉己体和所吸收蛋白质之间的相互作用成为可能。含水';F^^勿的pH值非常伊Ci^脉7和8.5之间，过于酸性的pH值可能导致所考虑的蛋白质变性，并且可能因而导致不溶解的蛋白质。这些含水〉T^4勿也可以包含从0.5。/。到1.5%,并且尤其是1%的非离子洗涤剂，^Li^也如TritonXIOO。申请人已经注意到在一些实施过程中，具有在7和8.5之间的pH值的该洗涤剂的存在可以改i^斤^M/蛋白质的回收率。也可能^J1水并且伊逸的是WFI(注射用水)。在一个特定实施例中，当用于^^f亍步骤b)的pHH^5和8.5之间时，'^y^可以通过降低pH值到低于酉沐pKa之下的值而^f亍，如絲者低于蛋白质的等电点，否则通过I^氐pH值到低于蛋白质等电点之下的值而才似亍，如K者低于酉沐的pKa。在包含有期望的蛋白质的馏分^Mi冬了时，仍然必需纯化步骤，以便从乳中去除污物蛋白质，例如乳铁蛋白、乳白蛋白、#1失蛋白、白蛋白和免疫5求蛋白。该纯化装置对于所属领域技术人员来i^/^口的。作为实例，可以参考亲和层析、疏水层析、阳离子或阴离子交才^^层析、或尺寸排阻层析，该列出不是限定性的。步骤d)^利地使得获得目标蛋白质的良好地复性成为可能，即适当^y斤叠，因而给予蛋白质等价于天然蛋白质生物活性的生物活性。可选地，复性也可以通过简单渗析或渗滤来执行，以去除变性剂。可以以任意标准层析装置来才;y亍各种层析步骤，层析装置尤其包括抽吸设备、和冲&则系统，尤其是通过UV可见吸收。在去除包含期望蛋白质的馏分中存在的最后乳蛋白质的步W^冬了之后，回收包含纯化的期望蛋白质的馏分。用于回收包含期望蛋白质的馏分的装置对于所^4页域技术人员是/^口的。作为实例，可以参考亲和层析、疏水层析、阳离子或阴离子交换体层析、或尺寸排阻层析，它们^fM通常所^J]的^Ht剂。在本发明的一个实施例中，包括澄清乳的步骤伊Ci^^W^MJ旨步骤(步骤a))^、并且先于步骤b)之前树亍。术语乳的"澄清，，应当理解为指包括经由分裂而去除月棘的步骤，从而获得包含*白、抗ILir清蛋白以及期望蛋白质的澄清的乳清。该实施例使得获得更好的收率成为可能，因为在这种情况下，与喊白月^f关的期望蛋白质能够增加纯^i留分的浓度，在不包括澄清步骤的实施例的情况下，并非如此，在那其中月^^被去除，而且胶束中带有与它们有关的所期望的蛋白质。该实施例也使得能实现用于去除任意农化物或细胞剂以及存在于乳中的细l醉片(例如细菌、上皮细月线乳淋巴细胞)的亚孩沐i^虑。更特别;也，乳澄清步-^过增加一定浓度的螯^f'J进行，佳^寻在与乳';^^后，乳的月^i吉构消失，获得澄清的乳(溶液中S^白或抗享Ljk清)。4顿螯射'J的乳的澄清对于所属领域技术人员是^^口的。作为^剂的一个实例，可以参考三钠柠檬酸盐或EDTA。例如，0.25M的最终柠檬酸钠浓度提供了乳的完全澄清。在本发明的另一个实施例中，在4^则旨步骤(步骤a))^并且先于步骤b)之前，白亚基束被沉淀，尤其是通过根据通常实施过程中的过滤或离心过滤。^^管^:可选的，但该步骤使得经由沉淀而使乳的胶^1夫态不稳^^为可能。期望蛋白质被乂A^白月^iL亚U^文或分离，从而使得与月^目关的蛋白质的回4线为可能。在本发明的一个特定实施例中，同时是疏水的和离子的酉沐为4-统基-乙基p比咬。包^i亥酉沐的载体的一个实例为MEPHypeiCe膨^!^交(Cipheigen⑧)。作为一个实例，允许吸收期望蛋白质发生在该载体上的^^牛可以包括在蛋白质的等电点(蛋白质上的负电荷)U至少0.5pH单位以4酉沐的pi(^y交上的正电荷)之下至少IpH^f立。如果期望蛋白质是FVH,则所选择pH值可以是8。在酉沐上蛋白质的吸收伊逸i脉pH条件下发生，使#^白质和酉沐之间的相互作用本质上是疏水的。该pH值优选i脉5和8.5之间。本发明的一^#定实施例中，其中将被纯化的蛋白质是因子vn，^t^可以通过将pH值降^JiJ低于配体pKa的pH值来发生，即低于4.8。如果西e/^是4-统^^-乙基p比咬，扭/fiim步骤c)可以佳月水溶液和前面所描述混合物，以高于配体pKa的pH值，即高于4.8,尤其是以高于6并且低于9的pH值，并且非常有利地包括在7.0和8.5之间，并且具有水，且优i^也具有WFI(注射用水)。在那种情况下，蛋白质例如是因子vn。进一步地，本申请人惊奇i4^^L^有4-發u^-乙基pri/划沐的MEPHyperCd⑧凝胶、或具有2-悉li^比吱类型酉沐的HitopIgY^^^示了关于FVE的一定程ytJi的选棒性，其结构与参考衬相"一致"，即能够被活化。事实上，关于没有在该^RJi吸收的形态，本申请4规则基准上已注意到能够被活化的形态(酰胺基FVn测定)和#^形态(抗原Fvn测定)之间的区别。酰胺基Fvn测定与抗原的体外活^^目对照，l血浆^^、^f立产出定义为1酰胺基单位，活化比率为1。蛋白质在纯化过程期间可以经受物理化学或生物化学变性的多种情况。当该比率在0.8和1.2之间时被认为是正常的，并Ji4"利地，它等于i。在转基因动物中，因子vn的乳分泌并不ioo。/。同质，并且所^^页域技术人员知道翁^f后转化中的区别，尤其包括蛋白质三维结构的糖基化和折叠。因而，乳腺细月練转基因后生产FVH，并且该FVH被糖基化并JLf話在由乳腺分泌到乳中之，前净皮^^成。并不保证所创造的100%的^^^作用的。很可能天然包括的控制机制将在转基因细胞中被修改；特别地，转基因蛋白质中与天然蛋白质相比，其糖形成熟间存在着差别。因而，FVII形态没有^皮吸附到具有4-巯基-乙基-p比咬类型酉5^的MEPHyperCelai交，或者具有2-悉^^p比咬类型酉沐的HitrapIgYl^交，具有0.4到0.5的比率，并且所^^L形态具有l.O到1.4的比率。因此，MEPHyperCel⑧^l交通过吸附而选4f^类似于天然形态的^^、形态，相反，可以假设未被吸附的形态可以显示出转基因动物制造中的缺陷。i^XMA—个优点，因为目标是从乳中提取可以注射到人类体内而没有显著副作用的人类Fvn,并且出于这个目的，Fvn应当尽可能类似于天然形态。^Ufe基/抗原活化比率是一个显示出是否*^该条件的一个工具。在本发明的另一个特定实施例中，同时是疏水的和离子的酉己体为sl^-苯并咪哇磺酸。包含该配体的载体的一个实例为MBIHyperCe膨凝力交(Ciphe堪en⑧)、或Capto-画C(GEHealthcare)。当^^]这种类型载体时，适当采用轻微更酸的、具有在5和6之间的pH值的保留^f牛(步骤b)。在该pH值下，白的溶解>_低的，并且^i定甚至可能开始发生。例如1MNaCl等盐的增加使得在pH值5和pH值6之间##^白可溶解成为可能。洗脱可以用先前所定义的水溶液和^^4勿进行。步骤d)有利地经由阴离子交换体层析而实施，尤其是通过强碱型阴离子交换载体而实施，即-NR3+型的季铵组，R为烷基，例如曱M乙基。市售的该载体可以适于该步骤的实施。有利地低离子强度和pH值使得阴离子交换体步骤尤其适合，因为它允许期望分子，即Fvn,聚集并且转换到活化因子vn,并Jiite经由构象^yt而纯化(即特别;fe^接到钙结合形式的改变，这使得N端部分(gla域)的电荷改变，使得娜上蛋白质电荷在钓^^后变成负的)。在步骤d)中，伊Ci^秘过阴离子交换体层析进行，有利地，蛋白质的^tM/fM钙离子溶液进行，其浓度包括在l和50mM之间，^i4^2和25mM之间，更伊逸地在3和12.5mM之间，或者在4和6mM之间，^离子源例如由氯化钓提供。有利地，在步骤d)，蛋白质的;规用5mM钙离子溶^^l/f亍。在另一个实施例中，用于洗脱的溶液可以基于铜、锌或《^it根据本发明的过程可以为了提取重组蛋白质或提取所讨论的天然存在于哺乳动物乳中的蛋白质而实施。蛋白质可以是天然存在于乳中的蛋白质，并且例如可以邻-孝U求蛋白、乳铁蛋白、a-乳白蛋白、或朊间质蛋白胨，或者上述的';^^f勿。蛋白质也可以是非天然存在于乳中的蛋白质。实例包括因子VH、因子Vffl、因子DC、因子X、a-U;y夷蛋白酶、*i^m、白蛋白、纤维蛋白原、胰岛素、髓鞘碱性蛋白、胰岛素原、组织纤^"原活化剂、以及3脉。在一个伊速实施例中，蛋白质为重组蛋白质并且包含它的乳为转基因乳。事实上,非天然存在于乳中的蛋白质可以通过使用重组DNA和转基因技^if过非人类转基因哺乳动物来合成。这些技树于所J^贞域技权员/^口的，这使得在转基因动物的乳中合成任意期望蛋白质成为可能。该蛋白质则是重组或转基因蛋白质，由于il^这两个术语在本申请中被认为是等价的，并且随后通过使月重組DNA技术而合成。术语"转基因动物"应当理解为任意非人类动物，在其基因组中已经被引入一外生DNA片段，尤其是编码有期望蛋白质的片段，使得所讨i^物表达由夕卜生DNA编码的蛋白质，并且可以遗传该外生DNA到其后代。相应地，任意非人类哺乳动物适于生产该乳。有利的使用可以由兔子、母羊、山羊、奶牛、母猪和老鼠组成，该列出不是P艮定性的。通过乳腺分泌期望蛋白质，导致转基因哺乳动物在乳中的分泌包含重组蛋白的表达以组织依赖的方式控制。该控制方法对于所^4页域技术人员是/^口的。表达的控制通过导致特定动物组织中蛋白质的表达的序列来实现。这些序列尤其包括启动子序列、以及它们的信号AUf列。所^^贞域技术人员公知的启动子的实例包括WAP(乳清酸蛋白)启动子、酪蛋白启动子、以及j3-IU求蛋白启动子，该列出不是P艮定性的。用于在转基因动物的乳中生产重组蛋白质的一种方法可以包括以下步骤合成包含编码期望蛋白质的基因的DNAM，该基因由乳中天然分泌的蛋白质启动子控制，合成的DNA^H^皮4S多到非人类哺乳动物的胚胎中。胚胎Pte引入到相同种类雌性哺乳动物中，其随后生产转基因动物。一旦该i^分改进，哺乳动物的泌乳被诱发并且IW皮收集。乳则包^^期望的重组蛋白质。用于在除人类"卜的雌性哺乳动物的乳中蛋白质制备的过程的一个实例在文档EP0527063中提供，其教导可以应用到根据本发明的期望蛋白质的生产中。包含WAP启动子的质粒通过51入包含用于WAP基因的启动子的序列而构造，并且该质粒以该这样的方式被创造从而其能够接收依赖于WAP启动子的外源基因。编码期望蛋白质的基因被结合*赖于WAP启动子。包含启动子的质粒和编码期望蛋白质的基因^^]^:得转基因动物，例如兔子，ill至由显微注射到兔子胚胎的精原核中。胚胎船传i^jij激素特制难性的输卵管。转基因的存在通过Southernblotting;^则，检测佳月从所生产的年轻转基因兔子提取的DNA。动物乳中的浓;K^I特定;^^免疫测定来评估。蛋白质有利地为凝聚蛋白质。根据本发明的蛋白质有利;^人因子n(Fn)、因子VII(FVn)、因子DC(FDO以及因子X(FX)、以及它们的活化形态；以及C蛋白质，活化C蛋白质、S蛋白质、以及Z蛋白质、或上述的〉V曰D^的中选择。在一个特定有利的方式中，根据本发明的蛋白质为FVn或活化FVE(FVEa)。在这点上，FVII或FVHa可以依据文档EP0527063的教导而生产，该文档简要提供了上i^法。一个序列是人类FVn的序列的DNA片段l^在WAP启动子的控制下^Cit^。例如，如文档EP0200421中所描述的，该DNA序列出J脉序列号lb中。有利地，根据本发明的FVE被活化。FVEa通过各种蛋白酶(FIXa、FXa和/或FVHa)酶原的解理成由^^克键桥连接的两链而在体内获得。FVIIa单独具有非常小的酶活性，但是当与糊因子(组织因子(FT))复合时，它通iti舌化FX和FDC而触发凝聚过程。当其与组织因子(FT)相互作用时，FVEa的凝f^t^比FVn的大25到100倍。在一个特别有利的方式中，蛋白质为因子vn(因子vn)。在本发明的一个实施例中，FVn可以由因子Xa、VIIa、IIa、IXa和XHa而在活体外活化。根据本发明的Fvn也可以在其纯化过程期间活化。本发明的另一个目标是^J]具有正zeta电势的玻璃过滤器用于同时*咏脱脂哺乳动物乳。该实施过程有利地脊RJ寿毛时的经由离心沉淀的传统分离、或者对工业范围使用是个问题的用于脱脂的特定溶剂(三氯曱烷或t^克衍生物，类似氟利昂)的使用。本发明的另一个目标是载体的^^],其J^斜妄有同时是疏水的和离子的、用于提耳睹在于经过^f咏脚旨的乳中的蛋白质的闺沐。本发明的其它方面和优点将在以下实例中描述，其仅提供来用作阐述目的而不限定本发明的范围。具体实施例方式实例1:在期L中生产人类FVII蛋白质的转基因兔子的生产首先，通过将WAP基因的BamHl-Hindni序列(6.3Kb的片段)(在Devinoy等人于NucleicAcidsResearch,vol.16,no.16(1988年08月25日，第8180页)的论文中描述)？1入到在BamHI和HindIE序列之间的p~polyIH-I媒刺在Lathe等人于Gene(1987)57，193-201的论文中描述)的多位点接头(polylbker)而制备pl质粒。在该克隆期间，BamHl位点被删除并且被出J脉pi媒介中的Clal位点^f义。因而，pi媒介为可以在6.3Kb的WAP启动子控制之下接J)O卜源基因的质粒。例如，外源基因可以被引入到多位点接头的Sall位点。包含启动子和外源基因胁的该插入物可以在位于p"polyEH质粒多位点接头的末端的两个Notl位点分裂^从质粒中分离。从pi质fe^得的p2质粒包含兔子WAP基因(6.3Kb)和人类FVH基因的启动子。用于获得转基因兔子的片段位于两个Notl位点之间。为了用作克隆位点，Hindm位点通it^点突变而被引入到基因前导序列。转基因兔子经由传统显微注射技术而获得(Brinster等A^表于Proc.Natl.AcadSci.USA(1985)82,第4438442页)。包含500份基因拷贝的一个或两个pi质4對皮注射到老鼠胚胎的精原核中。构#P"polyEH媒介中产生(Lathe等Aj^表于Gene(1987)57,第193-201页)。包含重纟IL^因的该媒介的Notl-Notl片段净經微注射。胚胎te被传itSij激素制备雌性的输卵管。所才^f乍胚胎的大约10%产出年轻的兔子，并J^射ff乍胚胎的2到5%产出年轻的转基因兔子。转基因的存在经由^jl从兔子尾巴中所提取DNA的Southern印迹法而枱3则。动物血液和乳中的FVII浓度使用特定放射免疫测定来评估。FVII的生物活性由将乳添加到细月^咅养载体或兔子吝U^卜植培养载体中而评估。根据本发明的用^其乳中生产Fvn的转基因兔子的获得技术更详细地在欧洲专利EP0527063中描述。实例2:a^^l^馏分的制备因为包括原兔子乳(即为未纟糾又水冻乳)的原材料每升中大体包含150克蛋白质以及可比较量的脂质(15%乳月旨)，所以首先必需"流化并脱脂，，该介质，以便使其能够相容于层析糾。做法如下-一体积的解冻原乳与两^i口、的水溶剂混合，-所有的流体-^^4勿通过具有正zeta电位的3皮璃纤维载体而i^虑，即UltiporGFPlusit^虑器(由PallLifeScience制造)。结^^^斤有^^^原才才^NM^^L脂，以用于>^片斤#支术。式验"A":水溶剂是具有低离子强度(低于lOOmM)的磷醋溶液,有或者没有氯化钠添加。微"B，，溶剂包含一定浓度的^^'J，例如三钠柠檬酸盐或EDTA，与享U曰t/^后，乳的月交^i吉构消失，保留所谓的"澄清"乳(溶液中SW白或^ILi^清)。例如，在pH值8.0下最终柠^S^钠浓^0.25M，4吏乳完全7企清。实例3:根據实例2中#"A"的所#^^0旨>^^亲和>^才斤MEP-HyperCel^l交稳定的乳中转基因或重组FVH(rFVH)的捕获使用以下测定来絲，其中a)MEP^^交的体积=2mL/原乳的^^只Fl=4mL孝Lf^积与mep^i交体积比率=2在该实例中，427ml乳与3843ml磷酸钠緩冲剂混合(混合物l:9),在pH值8.2719下为0.015M,在25。C下具有4.5Ms/cm的电导率。该混^4勿在具有1m阈值的it)凌、器UltriporGF+上过滤，得到用于断层析的澄清乳4240ml,澄清乳的pH值为8.2,并且在25t:下电导率为8mS/cm。40ml的该溶液(相应于4ml的原乳)注射到^R中，IO交以被制成l.lcm直径的柱。稳定^l緣的高奴2cm,因而提供有2ml的封装凝胶(比率原專1/^^交=2)。在注射生物材料之前，凝月^UpH值8.2的包含40mM氯化钠的25mM磷酸钠溶液平衡，其电导率在25匸下为8mS/cm(负^li冲剂)。泵的流it调整到1.5ml/分冲，即^y交中估计的4妄触时间为大约1分钟E/E(ii/出)。该斗i^接到280nm的UV灯检测器，并且光密度信号连续地记彭)J纸上。注射40ml的生物材料，一个'TVEP开始"样品另外留作分析。注射后，凝月躺包含40mM氯化钠的25mM磷酸钠负载溶液洗涤，需要大约8.5ml以在280nm处的OD记录器上的重新获得絲。收集被称作"非保留MEP，，的48.3ml未被吸附蛋白质馏分。净似亍三个连续的i^^。溶液A=20.6ml的MEP^M;液1—80%负|^爰冲剂+20%乙二醇溶液B=17ml的MEP^fe^液2—50%负裁>爰冲剂+50%乙二醇溶液O9ml未测试—负^M冲剂用冰乙酸调整到pH值3。^0交随后用1MNaOH再生，并且##在1M的包含20。/。乙醇(v/v)的氯^l内^h质中。分析数据收集到文中以下表格中。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>结论百分之三十(30%)的Fvn';丈有^皮^^妇呆留，并且洗脱的总量占所采用的Fvn59%。4艮据结果(89%),大约10。/。的FVII没有回收。b)1体积的MEP!^交=10mL/Fl原乳的体积=20QrnL享W^K和MEP^^交体积的比率从3增加到20,增力口100mL进行射留。馏分体积(mL)Fvn抗原浓度(IU/mL)Fvn絲量(IU)收率(％)初始MEP62491.356,971100%未被吸附110020.62,05722.5%未被吸附210023.72,39426.2%未被吸附310028.92，91431.9%未被吸附4脂28.52,96732.5%未被吸附510032.23，24735.6%未被吸附613035.74,64441%未被吸附，合并63728.618,22232%舰'液画MEP(50%EG)130156.320,32336%结论:由于^M负荷(22到41%)的作用，百分^十二(32%)的FVII没有被I^交保留。最理想的享U于^M的比率是从10到15。'组液(含有50yoEG的30mM磷卧組、pH值为8)占所采用的FVII的44%。根据结果(68%)，30%的FVE没有被回收，錄明捕获形态是高度疏水的。在第二代(所谓的'Tr)转基因兔子乳中l^亍的这两个测定，大约30%的rFVH没有在所谓的"混合才莫式"MEP-HyperCel^^交中吸附。MEP-HyperCel的负载结果这里，或者根才射&验"A"(稳定酪蛋白胶束)、或者根据试验"B"(可溶酪蛋白)，目的是要支持第一代(称之为'To")转基因兔子乳的初步结果，以財"未p及附"到MEP-HypeiCel劍交中的馏^ii行再处理。a)1体积的MEP^^交=lQmL/F0原乳的体积=133mL吝'L^^口^fMEP^!交体积的比率=13.3根据微"A，，的原乳的初始处理<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>根据:^验"A"(稳^^妹)的未p及附-1的再处理<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>结论:在第一处理，百分之四十六(46%)的Fvn没有被^l交保留。对于第二处理，该比率上升到71%。F。乳收率比&乳的收率具有这种形态的更大比率。相反，19%的FVII在第一处理期间被^M^(MEP1结果=65%)，而在第二处理期间11%被洗脱(MEP2结果82。/。)。全部地(MEPl+2),33。/。的FVII未被吸附，与^目比24%的FVH被吸附以财EG中被;舰。根据结果(57%),大约40%的FW没有^皮回收，这表明，净皮〗呆留的形态是高^1疏水的。b)MEP劍交棘=lQmL/F0原鉢积=14QmLIW^i口对MEP^y交体积的比率=14根据:^验"A"的原乳的初始处理<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>根据"^验"B"(不稳^lg)的^L净皮卩及附-1的再处理<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>结论:在第一处理之后，百分之四十六(46%)的FVE没有被^l^交吸收。在具有0.25M浓度的充足数量柠檬S交盐的"乳的澄清，，的第二传代期间，该比率^#在46%。当^^細30mM磷itt緩沖剂洗涤(在注射后洗涤)时，发现FVinm了^，的19%。该洗脱清楚:^^映了FVH的更小的疏水形态。总共17%的FVH在第一处理期间被洗脱(MEP1结果=63%),而14%在第二处理期间被洗脱(MEP2结果-79。/。)。全部地(MEPl+2)，29%的FVE没有保留或者被过早地;m,与^f目比23。/o的FVn在EG中吸4沐^yiL。根据结果(52%),大约40。/。的FVII没有保留，錄明，所保留形态是高度疏水的。实例4:关于MEPHyperCe峻皿的';9y^缓冲剂测试纽，目标是通过测试乙二醇和各种辅助剂的组合来改进;m收率。乙二醇pH值清洁剂溶剂盐收率1(标准)50%7.0—一30mM磷酸钠26%250%6.0—-柠檬^Jt/30mM柠微10%350%5.0--柠檬^ik/30mM柠微2%450%4.0-柠檬^/30mM柠微7%<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>非离子清洁剂(TritonX100)的增加和碱性pH值改进了;舰收率。该测试也包括用丙二醇(CH2OH-CHrCH2OH)替代乙二醇(CH2OH-CH2OH),丙二醇更小毒性，以财一种变性剂尿素(NH2-CO-NH2)中在6M浓度时的复性测试。iii^f亍了^4t^^方法的测、逸，结果如下用50%乙二醇(v/v)洗脱MEP-HyperCel注射'.用柠檬酸钠(0.25M)澄清过的乳MEP凝胶的接触时间1.7分钟(不是最优的)洗脱混合物50%乙二醇+1%TritonX100+49。/q的15mM柠檬酸钠，pH值为8<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>注意1IU的FVII:Ag=0.5)ng/mL的FVII(标准血浆)用具有50%乙二醇(v/v)^y^MEP-HyperCel注射用柠_钠(0.25M)澄清过的乳MEP^^交的4妾触时间8^4中(最优的);规〉V曰o^4勿50%丙二醇+1%TritonX100+49%的15mM磷酸钠，pH值为8<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>注意1IU的FVII:Ag=0.5|iig/mL的FVH(标准血浆)用2M的尿素^M^MEP-HyperCel注射用柠檬酸钠(0.25M)澄清过的乳MEP^^交的接触时间8^4中洗脱混合物2M的尿素+20mM的氨基乙酸+50mM的HEPES緩冲剂，pH值为8.2<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>注意1IU的FVE:Ag=0.5|ng/mL的FVII(标准血浆)用0.5M的^^素i^^MEP-HyperCel注射用柠檬酸钠(0.25M)澄清过的乳MEP^^交的接触时间8^4中洗脱混合物0.5M的尿素+20mM的氨基乙酸十50mM的HEPES緩冲剂，pH值为8.2<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>MEP-HyperCel洗出液21.72%1,533(0.77mg)45%3.5%MEP结果102%MEP结果52%注意1IU的FVH:arn=1IU的功能FVII:Ag,或者大约0.5吗/mL的FVE(标准血浆)未朋尿素的MEP-HyperCel舰注射用柠檬酸钠(0.25M)澄清过的乳MEP;IO交的^矣触时间8^4中洗脱》't曰洽物20mM的氨基乙酸+50mM的HEPES緩沖剂，pH值为8.2馏分蛋白质量(mg)蛋白质分布(%)FVH:Ag的量(IU&mg)Fvn抗原收率(％)FVE纯度(%)聰'的澄清乳，GF+0.45拜1,733100%4，442(2.2mg)100%0.13%未吸附到MEP-HyperCelNDNANDNANAMEP-HyperCel洗出液45.93%2，496(1.25mg)56%2.7%ND-未才^则到；NA-不可用注意1IU的FVH:Ag=0.5|ig/mL的FVE(标准血浆)MEP-HyperCel酸;舰(pH值=3<pKa的MEP)注缺用柠檬酸钠(0.25M)澄清过的乳MEP^M的接触时间洗脱〉V曰洽物0.1M的氨基乙酸+足够量的HCl使pH值为3馏分FVII:Ag的量(IU&mg)Fvn稀、收率(％)纖、的澄清乳，GF+0.45pm44,275(22mg)100%未吸附到10，081(5mg)23%<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>*在洗脱期间通过添加i成中和洗出液注意1IU的FVII:Ag=0.5(ig/mL的FVII(标准血浆)用纯化水(WFI)进行MEP-HyperCen舰注射用柠檬酸钠(0.25M)'澄清过的乳MEP;IO交的接触时间8^4中舰二再蒸馏丽<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>注意1IU的FVn:Ag=0.5fig/mL的FVE(标准血浆)FVII:Ag=ELISA系统中FVII的^t^、测定(基于特定^#的才^则)；血浆中，1IU/mL的FVII等价于0.5iLig/mL的纯的FVII蛋白质；FVn:am-可凝固FVE^f:,在FVE缺乏的人类血浆中与组织因子接触后所观'J得的。FVn(酶原)转化成FVHa(酶)，期寻FX转^械FXa,这导致血浆凝聚(经由凝*的产生，其充当纤维蛋白原的作用)。理论上，如果所有的衬(在国际标;tii浆中)^^作用的，则iIU的FVH:Ag大约等于1IU的FVH:arn(r=100%)。在该测定中，如果FVIIa(部分活化的FVII)已经存在，则FXa的产生会稍孩^口速(『=100%至200%)。然而，如果Fvn被损坏或者是"非典型的"(没有关联有组织因子)，则1<100%FVn:am/FVE:Ag比率(表示为百分比)反映了纯化期间FVIIM的功能状态。FVH:Ag(IU/mL)FVn:am(IU/mL)FVn:am/FVH:Ag(%)初始MEP38.647.4123%未p及附的，MEP6.94.870%功能性缺陷MEP洗出液(丽)151.9179.3118%结论:在未吸附的MEP中，FVH看^^示(构iiJi的)缺陷和蛋白水解。实例5:OSepharoseFF上MEP-HyperCd^!^的处理FVE自身在O-S印h画eFF离子交4姚上划分成两种形态，即5mM4丐(指"5mMCa2+"馏分)的近乎纯的FVH皿和50mM钙(指"50mMCa2+"馏分)的低纯度FVH;舰。所MJ^'J(n=7批次)的传统比率分别为36%±8%以及40%±12%。l体积QSFF劍交10mLMEP1舰(根据微"A"处理U的第一种处理)的处理馏分似只(mL)兩抗原浓度(IU/mL)Fvn抗原量(IU)收率(％)MEP1舰馏分16345.57，416100%5mMCa2+馏分3963.62,48033%50mMCa2+馏分482831,35818%MEP2^yi3L(根据"^验"A"处理之后的第4处理)的处理馏分絲CmL)兩城浓度ClU/mUFvn禱量(IU)收率(％)MEP2舰馏分9819.61，921100%5mMCa2+馏分3126.080642%50mMCa2+馏分4810.449726%可以看到，在两个实例中，占优势i4f立的馏分是"5mMCa2+"馏分。4r^地，3,286IU的"5mM"FVH被提取。依据乳的体积，该收率相应于每升乳12.5mg的rFVH。1体积的QSEF劍交=lOmLMEP1(根据:^验"A"处理^的第一种处理)的处理馏分糾只(mL)Fvn城浓度(IU/mL)Fvn録量(IU)收率(％)MEP1舰馏分15445.57，007100%5mMCa2+馏分5071.63,57451%50mMCa2+馏分2758.41,54822%MEP2^W(根据"^险"B"处理^的第4处理)的处理馏分斜口、CmL)兩録浓度(IU/mL)(IU)收率(％)MEP2舰馏分9627.92,678100%5mMCa2+馏分29.423.167925%50mMCa2+馏分4019.176428%可以看到，根据H睑"A"的处理中的占优辨留分为"5mMCa2+，，馏分，该比率在礼验"B"中改变了。ii^示具有柠檬酸盐的处理喜好更少的期望"50mM"形态的存在。全部地，4,253IU的"5mM"FVH被提取。依4t乳的体积，该收率相应于每升乳15mg的rFVn。实例6:从MEP-HyperCel+OSepharoseFF的5mM钙洗脱序列获得的FVII的特性分析特性如下-FVII:Ag=252.9IU/mL-蛋白质=123jug/mL(计算纯度98%)30-TO在TO时FVH:C=3,224UI/mL,或者比率为13.4-T24在26h并且在室温(RT)时，FVH:O3,721到4,365UI/mL，或者比率为15.5到18.2，rFVHa的质^^空制(来自NovoNordisk)—比率=21.5到25.1-密度分桥在T0:50.3。/。的未甜的rFVH;18小时之后在室温下存在5.3%的未分开的rFVH。从MEP"+QSFF序列所获得的FVII产出高纯度FVH，其以大约50%的比率发生活化；然而，该活^^载体中天然JIi爰慢:l4^生。权利要求1、一种用于乳中所存在蛋白质的提取方法，该蛋白质在乳的正常pH值下具有至少一个疏水区以及负电荷，包括以下步骤a)撇取和脱脂该乳，b)在允许所述蛋白质在层析载体上被捕获的pH值下，将包含所述蛋白质的脱脂和撇取后的馏分转移到层析载体上，在该层析载体上，嫁接有同时为疏水的和离子的配体，所述pH值高于4.6，c)洗脱该蛋白质，d)通过从所洗脱留分中去除乳蛋白质来纯化该所洗脱留分，以及e)回收所述蛋白质。2、根据权利要求1所述的方法，特4球于，在mf^脱脂步骤(步骤a))并且步骤b)之前，进行乳澄清步骤。3、根据权利要求2所述的方法，特征在于，所述乳澄清步-,iti(口入一定M的螯^'Ji^f于，该^剂与所述乳;^^之后，乳的月a结构消失，获得澄清乳(白溶液或抗孝Lii清)。4、根据权利要求1或2所述的方法，特4球于，在4tJ^则旨步骤(步骤a))并雖步骤b)之前，崎白亚基簇被縱。5、才財居权利要求1~4中任意一项所述的方法，特4i^于，所述的同时为疏水的和离子的酉沐为4-^^-乙基-p比卩定。6、根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，特4雄于，包括^fl^斤述蛋白质的步骤c)使用浓度在1.2到8M之间的尿素、浓度在25mM和50mM之间的氨基乙酸、酸1~生pH值在4和6之间的水溶液的〉V曰d^4勿，含水:^^4勿包括从以下组中选择出的组分，优i^也为两种或三种磷酸钠和乙二醇，其中磷酸钠浓度在5mM和50mM之间，优i^i也为30mM;柠檬酸钠和乙二醇，其中柠檬酸钠的浓度在5mM和50mM之间，伊^l也为30mM;磷酸钠和乙二醇，其中磷S吏钠浓度在5mM和50mM之间，^i^也为30mM;TRIS/NaCl及铞盐、和乙二醇，前者的浓度在hnM和10mM之间，M地为5mM;辛酸钠和乙二醇，其中辛酸钠的浓度在10mM和lOOmM之间，优i^也为30mM;—7J^生^c^物，其与存在的混^4勿相关联的传导率低于3mS/cm，或者水，并且伊[i^也为WFI(注射用再蒸馏水),。7、根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，特^i于，步骤d)通过阴离子交胁层析进行。8、根据权利要求7所述的方法，特4球于，在阴离子交换体层析步骤^，蛋白质的洗脱使用lmM到50mM的钓离子溶液进行。9、根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，特征在于，所述蛋白质为重组蛋白质。10、根据权利要求9所述的方法,特44于，所述蛋白质为凝聚蛋白质。11、根据权利要求io所述的方法，特4雄于，所述蛋白质为因子vn和/或活化FVE(因子VEa)。12、具有正zeta电势的玻璃过滤器用于同时*译脱脂哺乳动物乳的用途。13、连接有一同时具有疏水性的和离子的商沐的载体的用途，用于提料在于被*^^则旨过的乳中的蛋白质。全文摘要本发明涉及一种从乳中提取蛋白质的方法，具有至少一个疏水腔和在乳固有pH值下的负电荷，该方法包括以下步骤a)乳的撇取和脱脂；b)在能使蛋白保留在基体上的pH条件下，将包含该蛋白质的所脱脂并撇取的馏分通过层析基体，其上嫁接有既具有疏水特性又具有离子特性的配体，该pH值高于4.6；c)蛋白质的洗脱；d)通过从馏分中去除乳蛋白质进行馏分的净化；以及e)回收该蛋白质。文档编号A61K35/20GK101600358SQ200880001548公开日2009年12月9日申请日期2008年1月2日优先权日2006年12月29日发明者拉兰·勒雅尔,米歇尔·诺格雷,莫妮克·奥利维耶申请人:Lfb生物技术公司