专利名称：：半胱氨酸改造的抗muc16抗体和抗体药物偶联物的制作方法
技术领域：
：本发明一般涉及用反应性半胱氨酸残基改造的抗体，且更具体地说，本发明涉及具有治疗或诊断应用的抗体。可以使半胱氨酸改造的抗体与化疗药；毒素；亲和配体，诸如生物素和4全测标记，诸如焚光团偶联。本发明还涉及使用抗体和抗体-药物偶联物化合物在体外、原位和体内诊断或治疗哺乳动物细胞或相关病理性情况的方法。
背景技术：
：已经为靶向治疗患有癌症、免疫学和血管生成性病症的患者建立了抗体疗法。已经将与正常的非癌性细胞相比在癌细胞的表面上特异性表达的跨膜的或别样的肿瘤相关多肽鉴定为癌症诊断和抗体疗法的细胞靶物。此类肿瘤相关细胞表面抗原多肽，即肿瘤相关抗原(TAA)的鉴定容许特异性靶向癌细胞以便通过基于抗体的疗法实现破坏作用。抗体-药物偶联物(ADC)即免疫偶联物在局部递送细胞毒剂或细月包抑制剂即在癌症治疗中杀死或抑制肿瘤细胞的药物中的应用(Lambert，J.(2005)Curr.OpinioninPharmacology5:543-549;Wuetal(2005)NatureBiotechnology23(9):1137-1146;Payne,G.(2003)CancerCell3:207-212;Polakis,RArmingantibodiesforcancertherapy.CurrOpinPharmacol5，382-387,2005;SyrigosandEpenetos(1999)AnticancerResearch19:605-614;Niculescu-D歸zandSpringer(1997)Adv.DrugDel.Rev.26:151-172;US4975278)容许将药物模块靶向递送至肿瘤，并在其中发生胞内蓄积，其中系统施用这些未偶联的药剂在对试图消除的肿瘤细胞之外也对正常细胞产生了不可接受水平的毒性(Baldwinetal(1986)Lancetpp.(Mar.15,1986):603-05;Thorpe,(1985)"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview",于MonoclonalAntibodies'84:BiologicalAndClinicalApplications,A.Pincheraetal(编)，pp.4乃-506)。改进ADC的治疗指数(即最高的功效与最低的毒性)的努力已经聚焦于多克隆(Rowlandetal(1986)CancerImmunol.Immunother.，21:183-87)和单克隆抗体(mAb)的选择性以及药物连接和药物释方文特性(Lambert，J.(2005)Curr.OpinioninPharmacology5:543-549)。抗体药物偶联物中所使用的药物模块包括细菌蛋白质毒素诸如白喉毒素，植物蛋白质毒素诸如蓖麻毒蛋白，小分子诸如auristatin、格尔德霉素(geldanamycin)(Mandleretal(2000)J.oftheNat.CancerInst.92(19):1573-1581;Mandleretal(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters10:1025-1028;Mandleretal(2002)BioconjugateChem.13:786-791)、美登木素生物石咸(EP1391213;Liuetal(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623)、力口矛J车審素(Lodeetal(1998)CancerRes.58:2928;Hinmanetal(1993)CancerRes.53:3336-3342)、柔红霉素、多柔比星、曱氨蝶呤、和长春地辛(Rowlandetal(1986)supra)。药物模块可实行影响细胞毒性和细胞抑制性机制，包括微管蛋白结合、DNA结合、或拓朴异构酶抑制。有些细胞毒性药物在偶联至大的抗体或蛋白质受体配体时趋向于失活或活性降低。已经一夸auristatin月太，auristatinE(AE)和monomethylauristatin(MMAE),多拉司他汀的合成类似物(WO02/088172)作为药物才莫块偶联至多种抗体(Klussman，etal(2004),BioconjugateChemistry15(4):765-773;Doroninaetal(2003)NatureBiotechnology21(7):778-784;Franciscoetal(2003)Blood102(4):1458-1465;US2004/0018194;WO04/032828;Maoetal(2004)CancerResearch64(3):781-788;Bhaskaretal(2003)CancerRes.63:6387-6394;WO03/043583;US5767237;US6124431;US2005/0238649)。以常规手段(即经由共价键的连接)将药物模块附着至抗体一般产生不均一的分子混合物，其中药物模块附着于抗体上的许多位点。例如，通常经由抗体的通常大量的赖氨酸残基或通过还原链间二硫键活化的半胱氨酸疏氢基(硫醇基)将细胞毒性药物偶联至抗体，产生不均一的抗体-药物偶联物混合物，其含有具有不同的药物对抗体摩尔比、在不同位点连接的多个种类，每种具有不同的药动学、功效、和安全性的体内谱(Hambletteta1(2004)12Clin.CancerRes.10:7063-7070;Wangetal(2005)ProteinSci.14:2436-2446)。取决于反应条件，所述不均一的混合物通常含有附着有0个到约8个或更多个药物模块的抗体的分布。此外，具有药物模块对抗体的特定整数比的偶联物各亚组是可能的不均一的混合物，其中药物模块附着于抗体上的各种位点。分析和制备方法可能不足以分离和表征由偶联反应产生的不均一混合物中的抗体—药物偶联物种类分子。抗体是较大的、复杂的且结构多样的生物分子，常常带有许多反应性官能团。它们与接头试剂和药物-接头中间体的反应性取决于诸如pH、浓度、盐浓度、和共溶剂等因素。此外，多步骤偶联过程因控制反应条件和表征反应物和中间体方面的困难而可能不可再现。半胱氨酸硫醇基在中性pH具有反应性，这与在接近pH7时质子化和亲核性降低的大多数胺不同。由于游离硫醇基(RSH,硫氬基)相对具有反应性，所以带有半胱氨酸残基的蛋白质常常以它们作为二硫化物连接的寡聚体的氧化形式存在或具有内部桥接的二硫化物基团。胞外蛋白一般不具有游离疏酉孚基(Garman,1997,Non-RadioactiveLabelling:APracticalApproach,AcademicPress,London,p.55)。抗体半胱氨酸硫醇基一般对亲电子偶联试剂比对抗体胺或羟基更具反应性，即更具亲核性。溶剂可及链间二硫键半胱氨酸及丝氨酸容许直接偶联至剩余的半胱氨酸(McDonaghetal(2006)ProteinEng.Des.Sel.19:299-307)。然而，消除这些二石克4建会石皮坏抗体的四级结构，由此扰乱抗体在体内的行为，包括抗体效应器功能的改变(Michaelsenetal(1994)ProcNatlAcadSciUSA91:9243-9247;Romansetal(1977)ProcNatlAcadSciUSA74:2531-2535;Seeganetal(1979)ProcNatlAcadSciUSA76:卯7-911)。已经通过遗传工程技术将半胱氨酸残基引入蛋白质以形成与配体的共价附着物或形成新的分子内二硫键(Betteretal(1994)J.Biol.Chem.13:9644-9650;Bernhardetal(1994)BioconjugateChem.5:126-132;Greenwoodetal(1994)TherapeuticImmunology1:247-255;Tuetal(1999)Proc.Natl.Acad.SciUSA96:4862-4867;Kannoetal(2000)J.ofBiotechnology,76:207-214;Chmuraetal(2001)Proc.Nat.Acad.Sci.USA98(15):8480-8484;US6248564)。然而，通过将蛋白质的各个氨基酸残基突变成半胱氨酸氨基酸进行的半胱氨酸硫醇基改造可能存在问题，特别是就未配对的(游离的Cys)残基或那些相对易于反应或氧化的残基而言。在蛋白质的浓缩溶液中，无论是在大肠杆菌的周质中，在培养物上清液中，或者是在部分或完全纯化的蛋13白质中，蛋白质表面上的未配对的Cys残基能配对并氧化以形成分子内二硫化物和由此的蛋白质二聚体或多聚体。二硫化物二聚体的形成使得新的Cys没有与药物、配体、或其它标记物偶联的反应性。此外，如果蛋白质以氧化方式在新改造的Cys与已存在的Cys残基之间形成分子内二斩u键，那么这两个Cys硫醇基对活性位点的参与和相互作用而言都是不可利用的。此外，可以通过错误折叠或丧失三级结构使蛋白质失去活性或特异性(Zhangetal(2002)Anal.Biochem.311:1-9)。已经将半胱氨酸改造的抗体设计成Fab抗体片段(thioFab)并表达成全长IgG单克隆(thioMab)抗体(US2007/0092940,通过述及收入其内容)。已经通过接头在新引入的半胱氨酸硫醇基处用硫醇反应性接头试剂或药物-接头试剂偶联ThioFab和ThioMab抗体以制备抗体药物偶联物(ThioADC)。MUC16是一种肺瘤相关抗原多肽，由人眼表面上皮表达(Arguesoetal(2003)InvestigativeOphthalmology&VisualScience44(6):2487-95),在.支气管、输卯管、和子宫的粘膜中表达(Kabawatetal.(1983)InternationalJournalofGynecologicalPathology2:275-85)。有人提出，MUC16的一种功能是在粘膜表面提供针对颗粒和传染剂的保护性的、润滑的屏障。高度多态性的MUC16由三个结构域构成，即富含Ser/Thr的N端结构域、重复结构域(ll个到超过60个部分保守的串联重复，每个平均156个氨基酸)、和C端不重复结构域(其含有跨膜序列和短的胞质尾)。MUC16是高度0-糖基化和N-糖基化的(O'Brienetal(2002)TumourBiol.23:154-169;O'Brienetal(2001)TumourBiol.22:348-366(2001);Fendricketal(1997)TumourBiol.18:278-289;Wongetai(2003)J.Biol.Chem.278:28619-28634;McLemoreetal(2005)biol.Res.Nurs.6:262-267)。自MUC16基因表达的、编码MUC16多肽的mRNA,在某些类型的人癌性卵巢、乳腺和胰腺肿瘤中，分别与相应的正常人卵巢、乳腺和胰腺組织相比，有显著的、可再现的和可检测的过表达(WO2007/001851)。定量分析MUC16表达的多份独立的和不同类型的癌性人卵巢组织样品显示了癌性样品中MUC16的表达水平是可变的，其中显著数目的癌性样品显示MUC16表达与所分析的正常卵巢组织样品组的MUC16表达水平均值相比升高至少6倍(至高达大约580倍)。特别地，与正常卵巢组织相比，对多种卯巢癌类型；子宫内膜样腺癌、浆液性嚢腺癌，包括乳头状和透明细胞腺癌，观察到可检测的和可再现的MUC16过表达。由于它在某些人肿瘤中过表达，MUC16多肽及编码该多肽的核酸成为各种哺乳动物组织样品间定量和定性比较的靶物。可以对MUC16多肽的独特表达语及编码该多肽的核酸开发哺乳动物中某些类型的癌性肿瘤的诊断和治疗性处理。CA125(癌抗原125(0772P,CA-0772P，CA-125)是由MUC16基因编码的胞外脱落蛋白(Yinetal(2002)Intl.J.ofCancer98(5):737-740)，而且是例行用于监测卯巢癌患者的血清标志物。CA125是一种苗勒管分化抗原，在上皮卵巢癌细胞中过表达并分泌到血液中，但是它的表达并不完全局限于卵巢癌(Bastetal(1981)J,Clin.Invest68:1331-1337)。血清CA125水平在大约800/0的上皮卵巢癌(EOC)患者中，但在少于l。/。的健康女性中升高(Bastetal.(1983)N.Engi.J.Med.309:883-887)。CA125是存在于肿瘤细胞的细胞表面上的巨型粘蛋白样糖蛋白，与结合P-半乳糖苷的细胞表面凝集素结合，所述凝集素是参与调控细胞粘附、凋亡、细胞增殖和肿瘤进展的胞外基质的成分(Seele腿eyeretal(2003)JournalofCellScience116(7):1305-1318)。CA125的高血清浓度在浆液性卵巢腺癌中是典型的，而在粘质(mucinous)卵巢癌中不升高。不推荐将CA125用于卵巢癌筛选，因为正常水平不排除肿瘤。然而，CA125检测是在具有经组织学证实的恶性肿瘤的患者中监测临床进程和疾病状态的标准工具。众多研究证实了CA125水平在监测EOC患者进展中(Bastetal(1998)Int.J.Biol.Markers13:179-187;Verheijenetal(1999)Sem.CancerBiol.9:117-124;Menonetal(2000)Curr.Opin.Obstet.Gynecol.12:39-42;Meyeretal(2000)Br.J.Cancer82:1535-1538),和作为癌症血清标志物的有用性。CA125水平的升高通常比临床检测早大约3个月。在化疗期间，血清CA125水平的变化与疾病进程有关。在新药物的试验中，使用CA125作为临床响应的代用标志物。另一方面，CA125在EOC的初始诊断中没有用，因为它在许多良性疾患中升高(Bastetal(1998)Int.J.Biol.Markers13:179-187;Medenetal(1998)Int.J.Biol.Markers13:231-237)。CA125特异性抗体MAb-B43.13(oregovomab，OvaRexMAb-B43.13)作为卵巢癌患者的免疫治疗剂，正在进^亍)降床i式马全(Mobusetal(2003)AmericanJournalofObstetricsandGynecology189(1):28-36;Ehenetal(2005)Internationaljournalofgynecologicalcancer15(6):1023-34)。某些抗MUC16抗体，包括3A5和11D10，已经披露于WO2007/001851;美国流水号11/452，990,2006年6月14日提交，Dennis等，"CompositionsandMethodsfortheDiagnosisandTreatmentofTumor",通过述及而4欠录其内容。3A5单克隆抗体结合MUC16多肽的多个位点，根据OVCAR-3Scatchard分析，亲和力为433pM。已经将3A5和llD10抗MUC16抗体偶联至auristatin药物模块MMAE和MMAF。这些偶联物在体外抑制肿瘤细胞增殖(WO2007/001851)。将11D10抗MUC16抗体偶联至美登木素生物碱类DM1药物模块(US2005/0276812)。已经将某些抗MUC16抗体变体进行半胱氨酸改造(通过引入半胱氨酸氨基酸单元来进行)并偶联至DM1(US2007/0092940，通过述及而收录其内容)。发明概述在一个方面，本发明包括半胱氨酸改造的抗MUC16抗体，其包含一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸和选自SEQIDNO:9-40的序列。该半胱氨酸改造的抗MUC16抗体结合MUC16多肽。可制备肿瘤相关抗原(TAA)诸如0772P(CA125,MUC16)多肽，用于使用本领域公知的和例如WO2007/001851中的方法和信息来生成半胱氨酸改造的抗体。该半胱氨酸改造的抗MUC16抗体可通过如下方法来制备，包括用半胱氨酸替换亲本抗MUC16抗体的一个或多个氨基酸残基。该半胱氨酸改造的抗MUC16抗体的一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸残基位于轻链或重链中。在一个方面，本发明包括测定怀疑含有MUC16蛋白的样品中测定所述蛋白质的存在的方法，所述方法包括以下步骤将所述样品暴露于半胱氨酸改造的抗MUC16抗体；并测定所述抗体对所述样品中所述MUC16蛋白的结合，其中所述抗体对所述蛋白质的结合指示所述样品中存在所述蛋白质。半胱氨酸改造的抗MUC16抗体可作为棵抗体(未偶耳关至药物或标记物冲莫块)或作为抗体-药物偶联物(ADC)使用。可将该半胱氨酸改造的抗MUC16抗体共价附着至auristatin药物模块，由此抗体药物偶联物得以形成。该抗体-药物偶联物可包含半胱氨酸改造的抗MUC16抗体(Ab)和auristatin药物模块(D),其中所述半胱氨酸改造的抗MUC16抗体是经由一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸通过接头模块(L)附着至D的；所述化合物具有式I:Ab-(L-D)pI其中p为l、2、3、或4。Auristatin药物模块包括MMAE和MMAF。本发明的另一个方面是抗体-药物偶联物化合物的混合物，所述抗体-药物偶联物化合物包含结合MUC16多肽且包含一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸、选自SEQIDNO:9-40的序列、和auristatin药物模块(D)的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体(Ab),其中所述半胱氨酸改造的抗MUC16抗体是经由一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸通过接头模块(L)附着至D的；所述化合物具有式I:Ab-(L画D)pI其中p为l、2、3、或4，且平均药物栽荷为l-2。Auristatin药物模块包括MMAE和MMAF。本发明的一个方面是用于检测癌细胞的测定法，包括(a)将细胞暴露于半胱氨酸改造的抗MUC16抗体-药物偶联物；并(b)测定所述半胱氨酸改造的抗MUC16抗体-药物偶联物化合物结合所述细胞的程度。本发明的一个方面是药物配制剂，其包含半胱氨酸改造的抗MUC16抗体药物偶联物及药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂。本发明的一个方面是抑制细胞增殖的方法，包括用半胱氨酸改造的抗MUC16抗体-药物偶联物化合物处理细胞培养培养基中的哺乳动物肿瘤细胞，由此所述胂瘤细胞的增殖受到抑制。本发明的一个方面是治疗癌症的方法，包括对患者施用药物配制剂。可以半胱氨酸改造的抗MUC16抗体-药物偶联物化合物组合地给患者施用化疗剂。本发明的一个方面是制品，其包括药物配制剂、容器、和包装插页或标签，该包装插页或标签指明所述化合物可用于治疗以MUC16多肽过表达为特^正的癌症。本发明的一个方面是用于制备式I抗体药物偶联物化合物的方法，包括以下步骤(a)使半胱氨酸改造的抗体的改造的半胱氨酸基团与接头试剂反应以形成抗体-接头中间体Ab-L;并(b)使Ab-L与活化的药物模块D反应；由此抗体-药物偶联物化合物得以形成；或者包括以下步骤(c)使药物模块的亲核基团与接头试剂反应以形成药物-接头中间体D-L;并(d)使D-L与半胱氨酸改造的抗体的改造的半胱氨酸基团反应；由此抗体-药物偶联物化合物附图简述图1显示了人源化半胱氨酸改造的抗MUC16抗体A117Cthiohu3A5的重链序列SEQIDNO:1和轻链序列SEQIDNO:2。图2显示了嵌合半胱氨酸改造的抗MUC16抗体A117Cthioch3A5的重链序列SEQIDNO:3和轻链序列SEQIDNO:4。图3显示了人源化曲妥单抗(trastuzumab)轻链(HuTMAb-LC，SEQIDNO:5)、人源化标准3A5抗MUC16轻链(Hu3A5-LC,SEQIDNO:2)、和嵌合标准3A5抗MUC16轻链(Ch3A5-LC,SEQIDNO:4)序列的比对。编号方式遵循顺序编号》见则。图4显示了人源化曲妥单抗重链(HuTMAb-HC,SEQIDNO:6)、人源化标准3A5抗MUC16重链(Hu3A5-HC,SEQIDNO:7)、和嵌合标准3A5抗MUC16重链(Ch3A5-HC,SEQIDNO:8)序列的比对。编号方式遵循顺序编号规则。图5显示了半胱氨酸改造的抗MUC16抗体药物偶联物(ADC)的绘图，其中药物模块附着至轻链(LC-ADC;重链(HC-ADC);和Fc区(Fc-ADC)中的改造的半胱氨酸基团。图6a显示了以下步骤(i)还原半胱氨酸改造的抗MUC16抗体(ThioMab)中的半胱氨酸二硫化物加合物(adduct)及链间和链内二硫化物；(ii)部分氧化，即再氧化以重新形成链间和链内二硫化物；并(iii)偶联再氧化的抗体与药物—接头中间体以形成半胱氨酸改造的抗MUC16抗体药物偶联物(ADC)。图6b显示了还原的抗体的再氧化的时间过程。将曲妥单抗还原并在阳离子交换柱上于pH5.5纯化。顶图a显示了还原的抗体在时间为O分钟时的反相图谱。保留时间7分钟处的三个峰(从左到右)为轻链(LC),重链(HC)和少量未完全还原的HC+LC。容许纯化的、还原的抗体在pH7再氧化，并采集等分试样，作为时间的函数。中图b显示了在90分钟内大部分轻链和重链被再氧化以形成含有2条LC和2条HC的完整抗体(大约保留时间10分钟峰)。在180分钟反应时间点没有看到另外的完整抗体形成(底图c)。图7a显示了偶联反应产物的两幅HIC(疏水相互作用层析)层析图(顶)stdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE，3.1平均MMAE/3A5;和(底)thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE，1.5平均MMAE/3A5，其中stdch3A5是称作3A5的亲本嵌合抗MUC16抗体，而thioch3A5是半胱氨酸改造的嵌合抗MUC163A5抗体。将样品注射到丁基HICNPR柱上并以0.8ml/min用0至70。/。B的线性梯度洗脱(緩沖液A:含1.5M硫酸铵的50mM磷酸钾pH7，緩冲液B:50mM磷酸钾pH7,20%异丙醇)。使用配备有多波长检测仪和Chemstation软件的AgilentIIOO系列HPLC系统来解析和定量抗体中的抗体种类。基于LC/MS分析来指派峰身份。为相应的峰指明了DAR值。图7b显示了图7a中分析条件下大规模thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE偶联反应的HIC(疏水相互作用层析)层析图，其中平均药物载荷值为1.9。图8a显示了还原和去糖基化后偶联反应产物的质谱分析(顶)stdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE;和(底)thioch3A5画MC-vc-PAB画MMAE。图8b显示了抗体中用于细胞毒性药物附着至TDC-Fab的区域的定位作图。顶图(a)显示了MC-vc-PAB-MMAE-偶联Fab的还原的、变性的轻链和重链部分的280nm吸光谱。中图(b)部分中轻链和底图(c)部分中重链的解巻积质量(deconvolutedmass)与只在重链上标记的药物一致。在(c)中观察到的质量24189源自MMAE-C02的损失(减去762道尔顿)，这是该药物的特征性碎裂。图8c显示了肽作图-TDC-Fab中含有细胞毒性药物的肽的鉴定。未偶联的(顶图a)和已偶联的(中图b)Thio-3A5和TDC的肽图是自马来酰亚氨基化的纯化的Fab的胰蛋白酶消化物生成的。用MC-vc-PAB-MMAE标记的肽具有升高的疏水性，而且预期在层析图中较晚洗脱。四种药物偶联肽(用*标记的)在梯度结束时洗脱。它们还能通过在所有含有MC-vc-PAB-MMAE的质i普中观察到的特征性内部来源的石争裂离子(in-sourcefragmentationion)(m/z718.5)而被鉴定为含有细胞毒性药物的肽。底图(c)显示了自未偶联的和已偶联的消化物提取的离子层析图的覆盖图。最强的峰与偶联物消化物的晚洗脱峰一致。所有四个峰被鉴定为位于Fab-HC中第114位中突变的半胱氨酸附近的完全或部分胰蛋白酶切割片段。29.05分钟处主峰中的m/z离子解巻积而得出质量3962道尔顿，这是肽1":99-120+l药物的预期质量。含有药物的肽质没有定位至该蛋白质的任何其它区域。顶图(a)中用箭头标记的峰是马来酰亚胺标记的肽HC99-120。图9汇总了通过标准人源化3A5-VC-MMAE偶联物(stdhu3A5-VC-MMAE)和两种相应的thio偶联物(thiohu3A5-VC-MMAE)制备物的串联液相层析和质语(LC-MS)分析检测到的主要种类。在还原性条件("还原(DTT)")下(用以破坏链间二硫4建)和在天然条件下("完整的")分析蛋白19质。图IO显示了体外细胞增殖测定法的结果图，其中表达(PC3/MUC16)和不表达(PC3亲本)MUC16的肿瘤细胞用不同浓度(O.l至lOOOOngADC每ml)的以下各项处理(A)stdhu3A5(v4b.52)-MC-vc-PAB-MMAE，3.5MMAE/Ab加载，PC3/MUC16;(B)thiohu3A5-MC-vc-PAB-MMAE,1.9MMAE/Ab加载，PC3/MUC16;(C)thiohu3A5-MC-vc-PAB-MMAE，1.60MMAE/Ab加载，PC3/MUC16;(D)stdhu3A5(v4b.52)画MC-vc-PAB-MMAE,3.5MMAE/Ab加载，PC3亲本；(E)thiohu3A5-MC画vc-PAB-MMAE,1.9MMAE/Ab加载，PC3亲本；和(F)thiohu3A5-MC-vc-PAB-MMAE,1.60MMAE/Ab加载，PC3亲本。来自接受没有ADC的培养基的细胞的数据以0.46ng/mL绘图。stdch3A5是称作3A5的亲本嵌合抗MUC16抗体，而thioch3A5是半胱氨酸改造的嵌合抗MUC163A5抗体。图11显示了体外细胞增殖测定法的结果图，其中肿瘤细胞用不同浓度(1.4至9000ngADC每ml)的以下各项处理(A)stdch3A5-MC-vc-PAB陽MMAE,3.1MMAE/Ab加载，PC3/MUC16细胞；(B)thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE,1.6MMAE/Ab加载，PC3/MUC16细胞(C)stdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE,3.1MMAE/Ab力口载，PC3/neo细胞；(D)thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE，1.6MMAE/Ab力口载，PC3/neo细胞；(E)stdch3A5-MC-VC-PAB-MMAE,3.1MMAE/Ab加载，OVCAR-3细胞；(F)thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE，1.6MMAE/Ab加载，OVCAR-3细胞。stdch3A5是称作3A5的亲本嵌合抗MUC16抗体，而thioch3A5是半胱氨酸改造的嵌合抗MUC163A5抗体。来自接受没有ADC的培养基的细胞的数据以0.46ng/mL绘图。图12显示了在大鼠中单次施用0.5mg/kgthioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE和stdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE后血浆清除随时间的药动学图，通过总抗体和ADC测量。图13显示了ch3A5-VC-MMAE和thiach3A5-VC-MMAE在细胞毒性药物的1934ug/m"暴露时在大鼠中的毒性，通过嗜中性粒细胞(左上)、血清AST(右上)、和血小板(右下)测量。图14显示了服用以下各项的大鼠(6只/组)的体重随时间的变化媒介(琥珀酸盐i爰冲液)；24.19mg/kg=1934ug/m2ch3A5-VC-MMAE;49.99mg/kg=1934ug/m2thioch3A5-VC-MMAE。图15显示了服用以下单剂后具有OVCAR-3乳房脂肪垫肿瘤的SCID米色小鼠中体内肿瘤体积均值随时间的变化媒介(10mL/kg琥珀酸盐緩沖液)；6mg/kg=328jng/m2stdhu3A5隱MC-vc-PAB誦MMAE,3.5MMAE/Ab加载；或6mg/kg=150pg/m2thiohu3A5-MC画vc-PAB-MMAE,1.6MMAE/Ab加载。图16显示了服用以下单剂后具有OVCAR-3乳房脂肪垫肿瘤的SCID米色小鼠中体内肿瘤体积均值随时间的变化A)媒介(PBS);B)ADC緩沖液；C)stdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE,1.5mg/kg;D)stdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE,3.0mg/kg;E)stdch3A5-MC画vc-PAB-MMAE,6.0mg/kg;F)thioch3A5-MC陽vc-PAB-MMAE，1.5mg/kg;G)thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE,3.0mg/kg;H)thioch3A5-MC-vc-PAB匿MMAE,6.0mg/kg。图17显示了来自在猕猴中进行的安全性研究的数据，其中在第1天和第22天服用标准抗MUC16-MC-vc-PAB-MMAEADC,药物暴露为120(mg/m2药物(5.9mg/kg抗体)；和thio抗MUC16-MC-vc-PAB-MMAEADC(TDC),药物暴露为1200、2400和3600Pg/m2。在服药后8、22(第二剂之前)、32、和43天测量嗜中性粒细胞水平。将嗜中性粒细胞水平相对于在给定时间点用媒介处理的动物中的相应水平标准化。发明详述详细内容参照本发明的某些实施方案，其实施例在附带的结构和通式中例示。尽管结合列举的实施方案描述了本发明，但是应理解它们并非指定用于将本发明限定到那些实施方案。相反，本发明覆盖所有的备选、变型和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。等同的许多方法和物质。本发明决不限于所述的方法和物质。定义除非另有定义，本文中所使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义，而且符合Singletonetal(1994)DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology,第2版，J.Wiley&Sons,21NewYork,NY;及Janeway，C.,Travers,P.，Walport，M.，Shlomchik(2001)Immunobiology,第5版,GarlandPublishing,NewYork。本文的术语"抗体"以其最广泛的含义使用并且特别覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性(Miller等(2003)Jour,ofImmunology170:4854-4861)。抗体可以为鼠、人、人源化、嵌合的抗体或来源于其它物种。抗体为能够识别和结合特异性抗原的蛋白质(Janeway,C.,Travers，R，Walport,M.,Shlomchik(2001)ImmunoBiology,5thEd"GarlandPublishing,NewYork).靶抗原一般具有由多种抗体的CDR识别的大量结合位点，也称作表位。特异性结合不同表位的各抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可以具有一种以上相应的抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分即含有抗原结杏位点的分子，所述抗原结合位点免疫特异性结合所关注耙标的抗原或其部分，这类靶标包括，但不限于癌细胞或产生与自身免疫性疾病相关的自身免疫抗体的细胞。本文披露的免疫球蛋白可以具有免疫球蛋白分子的任意类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类另U(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亚类。免疫球蛋白可以来源于任意的物种，诸如人、鼠或家兔。关千不同类的抗体的结构和特性参见例如BasicandClinicalImmunology,第8版，DanielRStites，AbbaI.TerrandTristramG.Parslow(编)，Appleton&Lange,Norwalk,CT，1994,第71页和第6章。"抗体片段"包含全长抗体的一部分，该部分通常指所述全长抗体的抗原结合区或可变区。其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；樣i抗体(minibody)(US5641870,Example2;Zapataetal(1995)ProteinEng.8(10):1057-1062);Olafsenetal(2004)ProteinEng.Design&Sel.17(4):315-323);由Fab表达文库生成的片段；抗独特型(抗Id)抗体；CDR(互补决定区)；和以免疫特异性方式结合癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的上述任意各项的表位结合片段；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。术语"单克隆抗体，，在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变形式。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。另外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性以外，单克隆抗体的优势在于它们可以在不受其它抗体污染的情况中合成。修饰语"单克隆，，指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，有待依照本发明使用的单克隆抗体可以通过首次由Kohleretal.(1975)256:495记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法来制备(参见例如US4,816,567;US5,807,715)。"单克隆抗体"也可以使用Clacksonetal.(1991)A^"w352:624-628;Marksetal.(1991)/Afo/.Bfo/.222:581-597中记载的4支术/人噬菌体抗体库分离。可以修饰编码抗体的DNA以生成嵌合或融合抗体多肽，例如通过用人重链和轻链恒定域(CH和CL)序列替代同源鼠序列(US4816567;及Morrison,etal.,Proc.NatlAcad.Sci.USA,81:6851(1984)),或者通过融合免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的整个或部分编码序列。非免疫球蛋白多肽序列可替代抗体的恒定域，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变域以创建嵌合二价抗体，其包含对一种抗原具有特异性的抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一抗原结合位点。"天然抗体，，指通常由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的约150，000道尔顿的异四聚体糖蛋白。在轻链和重链Fab的可变域以及恒定域之间保持的数项疏水性相互作用之外，每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有可变域(VH),接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有可变域(vo,而另一端是恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变域之间形成界面。单克隆抗体在本文中明确包括"嵌合"抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(US4,816,567;Morrisonetal.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855)。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类动物(例如旧大陆猴类(OldWorldMonkey)、猿等)的可变域抗原结合序列和人恒定区序列的"灵长类化"抗体。非人(例如啮齿类)抗体的"人源化，，形式指最低限度包含衍生自非人抗体的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望抗体特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类动物)的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫琢蛋白恒定区(Fc),通常是人免疫球蛋白的恒定区。Fc片段包含通过二硫键和数个氨基酸残基之间的疏水相互作用保持在一起的所有两条重链的羧基末端部分。抗体的效应器功能是由Fc区中的序列决定的，该区还是受到在某些类型的细胞上找到的Fc受体(FcR)所识别的部分(Jonesetal(1986)Nature321:522-525;Riechmannetal(1988)Nature332:323-329;Presta,(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596;Verhoeyenetal(1988)Science,239:1534-1536;Simsetal(1993)丄Immunol.151:2296;Chothiaetal(1987)J.Mol.Biol.,196:901)。其它方法孑吏用自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区(Carteretal(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285;Prestaetal(1993)J.Immunol.151:2623)。"人抗体，，指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可得到能够在免疫后在没有内源免疫球蛋白生成的情况中生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)(Jakobovitsetal(1993)Proc.Natl,Acad.Sci.USA,90:2551;Jakobovitsetal(1993)Nature,362:255-258;Bruggemannetal(1993)YearinImmuno.7:33;US5545806;US5569825;US5591669;US5545807;及WO97/17852)。"完整抗体"在本文中指包含VL和VH结构域以及轻链恒定域(CO和重链恒定域Ch1、Ch2和Ch3的抗体。恒定域可以是天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可具有一项或多项"效应器功能"，指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括Clq结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用；和细胞表面受体(诸如B细胞受体)下调。术语"氨基酸序列变体"指具有在一定程度上不同于天然序列多肽的氨基酸序列的多肽。通常，氨基S^f列变体会与至少一种天然序列多肽的受体结合域或与至少一种天然受体的配体结合域拥有至少约70%序列同一性，而且优选的是，它们会是在序列方面与此类受体或配体结合域至少约80%、更优选至少约90%同源的序列。氨基酸序列变体在天然氨基酸序列的氨基酸序列内的某些位置拥有替代、删除、和/或插入。氨基酸以惯用名、单字母和三字母代码来指代。"序列同一性，，定义为在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，氨基酸序列变体中同样的残基的百分比。比对的方法和计算机程序是本领域公知的。一种这样的计算机程序是由Genentech公司编写的"Align2"，其已经于1991年12月IO日连同用户文档一起提交给美国版权局(UnitedStatesCopyrightOffice,Washington,DC20559),且其代码可见于WO2007/001851。术语"Fc受体"或"FcR"指结合抗体Fc恒定区的受体。优选的FcRA天然序列人FcR。此外，优选的FcR是能结合IgG抗体的FcR(y受体)，包括FcyRI、FcYRII和FqRni亚类的受体，包括这些受体的各等位变体和各可变剪接形式。Fc,II受体包括FcyRIIA("活化受体")和FcyRIIB("抑制受体")，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcyRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FqRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(综述参见Dagron，(1997)」""w.Aw/wmw"o/.15:203-234)。FcR的综述参见RavetchandKinet,(1991)iev./附7wm"o/.9:457-492;Capel"a/.,(1994)/m画/7ome决c^4:25-34;及deHaasa/.,(1995)■/丄a6.C7/".Med.126:330-341。术语"FcR"在本文中涵盖其它FcR,包括那些未来将会鉴定的。该术语还包括新生儿受体，FcRn，其负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer""/.，(1976)//mmimo/.117:587及Kim(1994)丄/mmwno/.24:249)。术语"可变的"指可变域中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR,它们大多采取P-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成p-折叠片结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近地保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat(1991)iSfe《we"c&so/尸ro/e/zzso//wwwwo/og/ca/第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.)。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。术语"高变区"、"HVR"或"HV"在用于本文时指抗体可变域(区)中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个高变区三个在VH中(Hl、H2、H3),三个在VL中(Ll、L2、L3)。本文中使用且涵盖许多高变区的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础的且是最常用的(Kabat"a/.,Se《we"cesq/"尸rate/m/mmw"o/og/ca//"femst,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991))，而Chothia指结构环的位置(ChothiaandLesk(1987)Mo/.所o/.196:901-917)。"接触"高变区是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些高变区中每一个的残基。除非另有说明，会采用依照Kabat蛋白质比对序列数据库的Kabat编号方式(WuandKabat(1970)丄Exp.Med.132:211-250;JohnsonandWu(2000)Nuc.AcidsRes.28(1):214-218)。高变区位置通常如下氨基酸24-34(HVR-Ll)，氨基酸49-56(HVR-L2),氨基酸89-97(HVR-L3),氨基酸26-35A(HVR-H1)，氨基酸49-65(HVR-H2),和氨基酸93-102(HVR-H3)。高变区还可包括如下"延伸的高变区"VL中的氨基酸24-36(Ll)和氨基酸46-56(L2)。对于这些定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等，见上文编号的。"改变的高变区"就本文目的而言指其中包含一处或多处(例如1处至约16处)氨基酸替代的高变区。"未修饰的高变区"就本文目的而言指具有与衍生它的非人抗体相同的氨基酸序列的高变区，即其中缺少一处或多处氨基酸替代的高变区。术语"如Kabat中的可变域残基编号方式"或"如Kabat中的氨基酸位置编号方式，，及其变化形式指Kabat等，《SequencesofProteinsofImmunologicalInterest》，第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)中用于抗体重链可变域或轻链可变域编辑的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可以包含较少的或另外的氨基酸，对应于可变域FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变域可以包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat的残基52a)和重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat的残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号可以通过将抗体序列与"标准"Kabat编号序列对比同源区来确定。"结合亲和力，，通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，"结合亲和力"指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间l:l相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的那些。低亲和力抗体通常緩慢地结合抗原且趋于容易解离，而高亲和力抗体和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了具体的示例性实施方案。"抗原"指抗体能选择性结合的预定多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其它天然存在的或合成的化合物。"框架区，，或"FR，，残基指可变域中那些除此处定义的高变区残基以外的残基。"人共有框架"指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常见的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变区序列亚型。通常，序歹'J亚型是i口Kabatetal.，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)中的亚型。在一个实施方案中，对于VL,亚型是如Kabat等人中的亚型Kl。在一个实施方案中，对于VH，亚型是如Kabat等人，见上文中的亚型III。"VH亚型m共有框架，，包含从Kabat等人的可变重链亚型m中的氨基酸序列获得的共有序列。"VL亚型I共有框架，，包含从Kabat等人的可变轻链K亚型I中的氨基酸序列获得的共有序列。"Fv"是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。正是在这种构造中，每个可变域的三个高变区相互作用而在VH-VL二聚体表面上限定了抗原结合位点。六个高变区一起i武予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。Fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体4交链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab')2抗体片段最初是作为在Fab'片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。根据其恒定域的氛基酸序列，来自任何脊推动物物种的抗体的"轻链"可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡巾自(K)和拉姆达(人)。"单链Fv，，或"scFv"抗体片段包含抗体的Vh和Vl結构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。优选的是，FV多肽在VH与VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构(Pliickthun，于《ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies》，第113巻，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，NewYork,第269-315页，1994)。术语"双抗体，，指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(VH-VJ中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点(EP404,097;WO93/11161;Hollinger"a/.(1993)Prac.廳.园90:6444-6448)。"游离半胱氨酸，，指已经工程改造入亲本抗体的、具有硫醇官能基(-SH)的、且没有配对或以其它方式成为分子内或分子间二硫桥一部分的半胱氨酸残基。术语"硫醇反应性值(thiolreactivityvalue)"是游离半胱氨酸氨基酸的反应性的定量表征。硫醇反应性值指经过半胱氨酸工程改造的抗体中与硫醇反应性试剂反应的游离半胱氨酸氨基酸的百分比，且换算成最大值l。例如，经过半胱氨酸工程改造的抗体上与石克醇反应性试剂(诸如生物素-马来酰亚胺试剂)以100%产率反应(以形成生物素标记的抗体)的游离半胱氨酸氨基酸具有1.0的硫醇反应性值。已工程改造入相同或不同亲本抗体、与硫醇反应性试剂以80%产率反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有0.8的硫醇反应性值。28已工程改造入相同或不同亲本抗体、完全不能与硫醇反应性试剂反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有O的硫醇反应性值。特定半胱氨酸的疏醇反应性值的测定可以通过ELISA测定法、质谱、液相层析、放射自显影、或其它定量分析测试来进行。容许捕捉经过半胱氨酸工程改造的抗体及比较和定量半胱氨酸反应性的硫醇反应性试剂包括生物素-PEO-马来酰亚胺((+)-生物素基-3-马来酰亚氨基丙酰氨基-3,6-二d恶辛烷二胺((+)-biotinyl-3-maleimidopropionamidyl-3,6-dioxaoctainediamine),Oda等(2001)NatureBiotechnology19:379-382，PierceBiotechnology,Inc.)、生物素-BMCC、PEO-吲哚乙酰基生物素、吲哚乙酰基-LC-生物素、和生物素-HPDP(PierceBiotechnology,Inc.)、及Na-(3-马来酰亚氨基丙酰基)生物胞素(MPB,MolecularProbes,Eugene,OR)。生物素化、双功能和多功能接头试剂的其它商业来源包括MolecularProbes(Eugene,OR)和Sigma(St.Louis,MO)。"亲本抗体"指包含其中一个或多个氨基酸残基有待用一个或多个半胱氨酸残基替换的氨基酸序列的抗体。亲本抗体可以包含天然的或野生型的序列。亲本抗体可具有相对于其它天然的、野生型的、或修饰形式的抗体而言的现有氨基酸序列修饰(诸如添加、删除和/或替代)。亲本抗体可以针对感兴趣的耙抗原，例如生物学重要的多肽。还涵盖针对非多肽抗原(诸如肿瘤相关糖脂抗原；参见US5091178)的抗体。"分离的"抗体指已经鉴定且自其天然环境的成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(l)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95%，最优选重量考马斯蓝或优选的银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。"结合，，靶分子或感兴趣抗原(例如MUC16或CA125抗原)的抗体指能够以足够亲和力结合该抗原，使得该抗体在靶向表达该抗原的细胞中是有用的的。若抗体是结合MUC16多肽的抗体，则它通常会优先结合MUC16,而且可以是不显著与其它蛋白质发生交叉反应的抗体。在此类实施方案中，根据非MUC16蛋白的程度(例如结合内源受体的细胞表面)会小于对MUC16的结合的10%。"处理"或"治疗"或"緩和"指治疗性处理及预防性或防范性措施二者，其中目标是预防或减缓(减轻)所针对的病理学状况或紊乱。需要治疗的受试者包括早就患有紊乱的受试者以及倾向于患上紊乱的受试者或要预防紊乱的受试者。如果在依照本发明的方法接受治疗量的抗CA125/0772P抗体诸如半胱氨酸改造的抗MUC16抗体或其抗体药物偶联物后，患者在如下一项或多项中显示出可观察和/或可测量的降低或消失，那么受试者或哺乳动物成功"治疗"了表达CA125/0772P多肽的癌症癌细胞数减少或癌细胞消失；肿瘤体积缩小；癌细胞浸润到周围器官中，包括癌传播到软组织和骨中受到抑制(即一定程度的减緩，优选停止)；肿瘤转移受到抑制(即一定程度的减緩，优选停止)；肿瘤生长受到一定程度的抑制；和/或与特定癌症有关的一种或多种症状得到一定程度的减轻；发病率和死亡率降低；及生命质量提高。就半胱氨酸改造的抗MUC16抗体或其抗体药物偶联物可预防癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞而言，它可能是抑制细胞的和/或毒害细胞的。这些体征或症状的减轻还可以由患者感受到。用于评估疾病的成功治疗和改善的上述参数可以容易地通过内科医师所熟悉的常规流程来测量。对于癌症治疗，可通过例如评估疾病进展时间(TTP)和/或测定响应速率(RR)来测量功效。转移可通过分期测试(stagingtest)来测定，及通过骨扫描及钙水平和其它酶的测试以测定是否传播到骨。还可进行CT扫描以查明是否传播到骨盆及该区域中的淋巴结。分别使用胸腔X射线和通过已知方法进行的肝酶水平测量来查明是否转移到肺和肝。用于监测疾病的其它常规方法包括经直肠超声检查(TRUS)和经直肠针吸活组织检查(TRNB)。术语"癌症，，和"癌性"指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理状况。"肿瘤，，包含一个或多个癌性细胞，而且指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的或者是良性的，及所有癌前或癌性细胞和组织。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、及白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括卵巢癌、鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌("NSCLC")、肺的腺癌和肺的鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌包括胃肠癌、胰腺癌(包括胰腺的腺癌)、成胶质细胞瘤、宫颈癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、曱状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、以及头和颈癌。"过表达"抗原性受体的癌指与同一组织类型的非癌性细胞相比，在其细胞表面上具有显著更高水平的受体诸如MUC16的癌。此类过表达可以是由基因扩增或者是由转录或翻译提高引起的。可在诊断或预后测定法中通过评估细胞表面上存在的受体蛋白质水平的升高(例如通过免疫组织化学测定法；IHC)来确定受体过表达。或者/另外，可测量细胞中受体编码核酸的水平，例如通过荧光原位杂交(FISH;参见WO98/45479)、Southem印迹、Northern印迹、或聚合酶链式反应(PCR)技术，诸如实时定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)。术语"细胞增殖性病症"和"增殖性病症"指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细^^增殖性病症指癌症。术语"治疗有效量"指在哺乳动物中有效治疗疾病或病症的药物(例如半胱氨酸改造的抗MUC16抗体药物偶联物或化疗剂)的量。在癌症的情况中，治疗有效量的药物可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的尺寸；抑制(即一定程度的减缓，优选阻止)癌细胞浸润入周围器官；抑制(即一定程度的减緩，优选阻止)胂瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻一种或多种与癌症有关的症状。根据药物可阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。术语"细胞抑制性的"指限制细胞功能的效果，诸如限制细胞生长或细胞增殖。对于癌症疗法，功"化疗齐'j"为可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包4舌Erlotinib(TARCEVA,Ge顧tech/OSIPharm.)、Bortezomib(VELCADE,MilleniumPharm.)、氟维司群(Fulvestrant)(FASLODEX⑧，Astrazeneca)、Sutent(SU11248，Pfizer)、来曲唑(LetrozoIe)(FEMARA⑧，Novartis)、甲石黄酸伊马^^尼(Imatinibmesylate)(GLEEVEC⑧，Novartis)、PTK787/ZK222584(Novartis)、奥沙利铂(Oxaliplatin)(Eloxatin,Sanofi)、5-FU(5-氟尿嘧啶(5-fluorouraci1))、亚叶酸(Leucovorin)、雷帕霉素(Rapamycin)(Sirolimus,RAPAMUNE,Wyeth)、Lapatinib(TYKERB,GSK572016,GlaxoSmithKline)、Lonafarnib(SCH66336)、Somfenib(BAY43-9006,BayerLabs.)、卡培他滨(capecitabine)(XELODA,Roche)、多西他塞(docetaxel)(TAXOTERE)、和Gefitinib(IRESSA,Astrazeneca)、AG1478、AG1571(SU5271;Sugen);烷化剂类(alkylatingagents),诸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN环磷酰胺(cyclophosphamide);石黄酸义克基酯类(alkylsulfonates),^者如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)矛口艰泊舒凡(piposulfan);氮丙口定类(aziridines),i者i口苯佐替;泉(benzodepa)、卡;皮酉昆(carboquone)、美妥替;泉(meturedepa)和乌5离替;泉(uredepa);乙撑亚胺类(ethylenimines)和曱基蜜胺类(methylamelamines),包括六曱蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙才掌石危X石岸酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟曱蜜胺(trimethylolomelamine);番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布4^也辛(builatacin)和布ji^也辛酮(buliatacinone));喜才对》威(camptothecin)(包4舌合成类似物托泊替康(topotecan));苔藓抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1);艾4留塞f各素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;〉每纟帛4卬素(spongistatin);氮芥类(nitrogenmustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、月旦石奔酰胺(cholophosphamide)、站,莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基曱胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美'法仑(melphalan)、#f氮芥(novembichin)、苯芥月旦甾酉享(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲石粦月妄(trofosfamide)、尿口密口定氛齐(uracilmustard);亚石肖脉类(nitrosoureas),i者i口卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如力。利车霉素(calicheamicin),尤其是力口利车霉素yll和加利车霉素coll(Angew(1994)Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186);蒽环类抗生素(dynemicin),包括dynemicinA;二膦酸盐类(bisphosphonates)，i者如氯膦酸盐(clodronate);i矣斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酉交(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、力文线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、噪吟霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代谢物类，诸如曱氨蝶呤和5-氟尿嘧咬(5-FU);叶酸类似物，诸如二曱叶酸(denopterin)、曱氨蝶呤、±莱酰三谷氨酸(pteropterin)、三曱曲沙(trimetrexate);嘌p令类似物，诸如氟达4立滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、碌b。米嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌口令(thioguanine);嘧口定类似、物，i者如安西他滨(ancitabine)、阿4U包苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苦(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿普(floxuridine);雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、表石克力食醇(epitiostanol)、美名,烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone);抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinicacid);醋葡醛内酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid);恩尿嘧卩定(eniluracil);安吖。定(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate);;也石粦酰胺(defosfamide);;也美可辛(demecolcine);;i也p丫酉昆(diaziquone);elfornithine;依利醋4妄(elliptiniumacetate);epothilone;依4乇才各鲁(etoglucid);》肖酉交4家；,5脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼达明(lonidamine);美登木素生物碱类(maytansinoids),诸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol);安丝菌素(ansamitocin);米才乇胍月宗(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫艰达醇(mopidamol);二胺硝吖咬(nitracrine);喷司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);。比柔比星(pirambicin);洛索蒽醌(losoxantrone);鬼臼酉l(podophyllinicacid);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);PSK⑧多糖复合物(JHSNatural33Products,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西索菲兰(sizofiran);虫累;J走4者(spirogermanium);纟田交链孑包菌酉同酸(tenuazonicacid);三亚胺醌(triaziquone);2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin));乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine);达卡巴口秦(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴卫矛醇(mitolactol);口底泊澳》克(pipobroman);gacytosine;阿斗唐月包苦(arabinoside)("Ara-C");环磷酰胺(cyclophosphamide);塞替派(thiotepa);类紫杉醇(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)(TAXOL,Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N丄)、ABRAXANEtm不含克列莫佛(Crem叩hor)、清蛋白改造的纳米颗粒剂型紫杉醇(AmericanPharmaceuticalPartners,Schaumberg,Illinois)和TAXOTERE⑧多西他塞(doxetaxel)(Rh6ne-PoulencRorer,Antony,France);笨丁酸氮芥(chlorambucil);GEMZAR⑧吉西他滨(gemcitabine);6-硫鸟噤呤(thioguanine);3克基口票p令(mercaptopurine);曱氨虫某口令(methotrexate);4白类似、物，i者^口力i页4白(cisplatin)和卡4白(carboplatin);长春石咸(vinblastine);4白；依才乇泊苦(etoposide)(VP-16);异环磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);长春新碱(vincristine);NAVELBINE长春瑞滨(vinorelbine);能灭瘤(novantrone);替尼泊芬(teniposide);依达曲沙(edatrexate);道i若霉素(daunomycin);氨基虫菜口令(aminopterin);希罗达(xeloda);尹本膦@史盐(ibandronate);CPT-11;拓朴异构酶抑制剂RFS2000;二氟曱基鸟氨酸(DMFO);类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoicacid);卡培他滨(capecitabine);任何上述物质的药学可4妻受盐、酸或书f生物。"化疗剂"的该定义还包括(i)起调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素药，诸如抗雌激素药和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX⑧他莫昔芬)、雷洛昔芬(mloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和FARESTON托瑞米芬(toremifene);(ii)抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE⑧醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、AROMASIN⑧依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR⑧伏罗哇(vorozole)、FEMARA⑧来曲唑(letrozole)和ARIMIDEX⑧阿那曲唑(anastrozole);(iii)抗雄激素类，i者如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞4木(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)芳香酶抑制剂；(v)蛋白激酶抑制剂；(vi)脂质激酶抑制剂；(vii)反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉粘着细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-a、Raf和H-Ras;(viii)核酶，诸如VEGF表达抑制剂(例如ANGIOZYME⑧核酶)和HER2表达抑制剂；(ix)疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN⑧疫苗、LEUVECTIN㊣疫苗和VAXID⑧疫苗；PROLEUKINrlL-2;LURTOTECAN⑧拓朴异构酶l抑制剂；ABARELIXrmRH;(x)抗血管发生剂，诸如贝伐单抗(bevacizumab)(AVASTIN,Genentech);及(xi)任何上述物质的药学可4妻受盐、酸或衍生物。术语"细胞因子"是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，诸如人生长激素、N-曱硫氨酰人生长激素和牛生长激素；曱状旁腺素；曱状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH);肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-a和-(3;穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO);神经生长因子，诸如NGF-P;血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-a和TGF-[3;胰岛素样生长因子-I和-II;红细胞生成素(EPO);骨诱导因子(osteoinductivefactor);干扰素，诸如干扰素-a、-卩和-y;集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF);白介素(IL),诸如IL-1、IL-lot、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-ll、IL-12;肿瘤坏死因子，-漆如TNF-a或TNF-卩；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。术语"标记物，，指可共价附着于抗体并发挥如下功能的任何模块(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记物相互作用以改变由第一或第二标记物提供的可检测信号，例如FRET(荧光共振能量转移)；(iii)稳定与抗原或配体的相互作用或提高与之结合的亲和力；(iv)通过电荷、疏水性、形状或其它物理参数影响迁移率例如电泳迁移率或细胞通透性；或(v)提供俘获模块，以调控配体亲和力、抗体/抗原结合、或离子络合。短语"药学可接受盐"在用于本文时指ADC的药学可接受的有机或无机盐。例示性的盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯曱酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对曱苯磺酸盐和朴酸盐(即U，-亚曱基-双-(2-羟基-3-萘曱酸盐))。药学可接受盐可能牵涉包含另一种分子，诸如乙酸盐离子、琥珀酸盐离子或其它抗衡离子。抗衡离子可以是稳定化合物电荷的任何有机或无机模块。另外，药学可接受盐可以在其结构中具有超过一种带电荷原子。在多种带电荷原子作为药学可接受盐的组成部分的情况中可以具有多种抗衡离子。因此，药学可接受盐可具有一种或多种带电荷原子和/或一种或多种抗衡离子。"药学可接受溶剂化物"指一个或多个溶剂分子和ADC的结合。形成药学可接受溶剂化物的溶剂的例子包括但不限于水、异丙醇、乙醇、曱醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。"载体"在用于本文时包括药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受的载体是pH緩沖水溶液。生理学可接受载体的例子包括缓沖剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA;糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN⑧、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS⑧。下列缩写在本文中有使用，而且具有所规定的定义Boc指N-(叔丁氧羰基)，cit指瓜氨酸(2-氨基-5-脲基戊酸)，dap指dolaproine,DCC指l,3-二环己基碳二亚胺，DCM指二氯曱烷，DEA指二乙胺，DMSO指二曱亚石风，DTNB指5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，DTPA指二乙烯三胺五乙酸，DTT指二硫苏糖醇，Fmoc指N-(9-芴基曱氧羰基)，gly指甘氨酸，HOBt指l-羟基苯并三唑，HPLC指高压液相层析，Mtr指4-茴香基二苯基曱基(或4-曱氧基三苯曱基)，PAB指对氨基苯曱基氨基曱酰基，PBS指磷酸盐緩冲盐水(pH7),PEG指聚乙二醇，MC指6-马来酰亚氨基己酰基，phe指L-苯丙氨酸，SEC指大小排阻层析，TFA指三氟乙酸，TLC指薄层层析，UV指紫外线，而val指缬氨酸。半胱氨酸改造的抗MUC16抗体本发明的化合物包括半胱氨酸改造的抗MUC16抗体，其中任何形式的野生型或亲本抗MUC16抗体的一个或多个氨基酸被半胱氨酸氨基酸替换。改造的半胱氨酸氨基酸是游离的半胱氨酸，不是链内或链间二硫化物单元的一部分。可以对任何形式的抗MUC16抗体进行如此改造，即突变。例如，可以改造亲本Fab抗体片段以形成半胱氨酸改造的Fab，在本文中称为"ThioFab"。类似地，可以改造亲本单克隆抗体以形成"ThioMab"。应当注意，单位点突变在ThioFab中产生单个改造的半胱氨酸残基，而单位点突变在ThioMab中产生两个改造的半胱氨酸残基(由于IgG抗体的二聚体特性)。本发明的半胱氨酸改造抗MUC16抗体包括单克隆抗体，人源化的或嵌合的单克隆抗体，及抗体的抗原结合片段、融合多肽和类似物，其优先结合细胞结合MUC16多肽(cell-associatedMUC16polypeptide)。半胱氨酸改造的抗MUC16抗体保留它们野生型、亲本抗MUC16抗体对应物的抗原结合能力。如此，半胱氨酸改造的抗MUC16抗体能够结合MUC16抗原，包括受体蛋白0772P(CA125,MUC16，Genbank登录号AF361486),如以下文献中所记载的YinetalJ.(2001)Biol.Chem.276(29):27371-27375);WO2004045553(权利要求14);WO200292836(权利要求6;图12);WO200283866(权利要求15;第116-121页)；US2003124140(实施例16);Gross-references:GI:34501467;AAK74120.3;AF361486—1。半胱氨酸改造的抗MUC16抗体包含一个或多个具有还原的硫氢(硫醇)基的游离的半胱氨酸氨基酸，其中所述半胱氨酸改造的抗MUC16抗体结合MUC16多肽。在一个实施方案中，半胱氨酸改造的抗MUC16抗体是如下方法制备的，其包括用半胱氨酸替换亲本抗MUC16抗体的一个或多个氨基酸残基。可以对具有替换的("改造的")半胱氨酸(Cys)残基的突变体评估新引入的、改造的半胱氨酸硫醇基团的反应性。硫醇反应性值是范围为0到1.0的相对数值术语，而且可以对任何半胱氨酸改造的抗体测量该值。本发明的半胱氨酸改造的抗体的硫醇反应性值可以在0.6到1.0;0.7到1.0;或0.8到1.O的范围内。在一个方面中，本发明涉及一种分离的半胱氨酸改造抗MUC16抗体，其包含由如下核苷酸序列所编码的氨基酸序列，该核香酸序列能与编码下列各项的DNA分子的互补链发生杂交(a)半胱氨酸改造抗体，其具有如本文中所公开的全长氨基酸序列，(b)半胱氨酸改造抗体氨基酸序列，其缺乏如本文中所公开的信号肽，(c)跨膜的半胱氨酸改造抗体蛋白的胞外结构域，其带有或不带有如本文中所公开的信号肽，(d)由任何在本文中所公开的核酸序列所编码的氨基酸序列，或(e)如本文中所公开的全长的半胱氨酸改造抗体氨基酸序列的任何其它明确限定的片段。在一个方面中，本发明提供了一种分离的半胱氨酸改造抗MUC16抗体，其不带有N末端信号序列和/或不带有起始曱硫氨酸，并且是由编码如本文中所描述的氨基酸序列的核苷酸序列所编码的。其产生方法在本文中也有描述，其中那些方法包括在适于表达半胱氨酸改造抗体的条件下培养包含含有合适的编码核酸分子的载体的宿主细胞和从该细胞培养物中回收所述半胱氨酸改造抗体。本发明的另一个方面提供了一种分离的半胱氨酸改造抗MUC16抗体，其或是跨膜结构域删除的或是跨膜结构域失活的。其产生方法在本文中也有描述，其中那些方法包括在适于表达半胱氨酸改造抗体的条件下培养包含含有合适的编码核酸分子的载体的宿主细胞和从该细胞培养物中回收所述半胱氨酸改造抗体。在其它实施方案中，本发明提供了分离的抗MUC16嵌合半胱氨酸改造抗体，其包含与异源(非MUC16)多肽融合的任何本文所述半胱氨酸改造抗体。此类嵌合分子的例子包括与异源多肽(诸如例如表位标签序列或免疫球蛋白Fc区)融合的任何本文所述半胱氨酸改造抗体。半胱氨酸改造抗MUC16抗体可以是单克隆抗体、抗体片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、或竟争性抑制抗MUC16多肽抗体与其相应抗原表位结合的抗体。本发明的抗体可以任选地偶联至生长抑制剂或细胞毒剂，诸如毒素，包括例如auristatin、抗生素、放射性同位素、核溶酶等。本发明的抗体可以任选地在CHO细胞或细菌细胞中产生，且优选地抑制它们所结合的细胞的生长或增殖或诱导与它们所结合的细胞的死亡。为了诊断目的，本发明的抗体可以带上可检测标记物、附着至固体支持物、等等。在本发明的其它实施方案中，本发明提供了包含编码任何本文所述半胱氨酸改造抗MUC16抗体的DNA的载体。还提供了包含任何此类载体的宿主细胞。举例而言，宿主细胞可以是CHO细胞、大肠杆菌细胞或酵母细胞。用于产生任何本文所述多肽的方法有进一步的提供，且包括在适于表达期望多肽的条件下培养宿主细胞和从该细胞培养物中回收所述期望多肽。亲本和半胱氨酸改造的抗MUC16抗体结合MUC16多肽或MUC16多肽变体，其记载于"CompositionsandMethodsfortheDiagnosisandTreatmentofTumor"，WO2007/001851,Dennisetal，美国流水号11/452990，2006年6月14日提交，Genentech,Inc.)且记载为0772P、卵巢癌抗原CA125、或MUC16人类，及记载于Genbank登录号AF361486。交叉引用GI:34501467;AAK74120.3;AF361486一1;Swiss-Prot条目Q8WX17。MUC16多肽变体指与WO2007/001851中披露的MUC16或CA125/0772P多肽序列具有至少约80。/。氨基酸序列同一性的MUC16/CA125/0772P多肽，其为(i)全长天然序列；(ii)缺少信号肽的多肽序列；(iii)有或无信号肽的胞由只代表全长MUC16/CA125/0772P多肽完整编码序列一部分的核酸编码的那些)。此类MUC16多肽变体包括例如如下多肽，其中在全长天然氨基酸序列的N端或C端添加或删除了一个或多个氨基酸残基。通常，MUC16多肽变体会与全长天然序列MUC16多肽序列、缺少信号肽的MUC16多肽序列、有或无信号肽的MUC16多肽胞外结构域、或全长MUC16多肽序列的任何其它具体限定的片段具有至少约80%氨基酸序列同一性，或者至少约81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%，88%,89%，90%，91%，92%,93%，94%,95%,96%,97%，98%,或99%氨基酸序列同一性。通常，MUC16多肽变体的长度为至少约10个氨基酸，或者长度为至少约20,30，40，50,60,70,80,90，100，110，120,130,140,150,160,170，180，190,200,210,220，230，240,250,260,270,280,2卯，300，310，320，330,340,350,360,370,380，390，400,楊，420,430,440,450,460,470,480,490，500,510,520,530，540,550，560,570,580，590,600个氨基酸，或更多。任选地，MUC16变体多肽会具有不超过一处与天然MUC16多肽序列相比的保守氨基酸替代，或者不超过2，3，4，5,6,7,8,9,或10处与天然MUC16多肽序列相比的保守氨基酸替代。MUC16多肽可以通过在以下各项中重组表达来制备(i)大肠杆菌，用pBR322载体；(ii)哺乳动物细胞，诸如人HEK293细胞(ATCCCCL1573)、COS(猿成纤维细胞，SV-40)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，用pRK5载体；(iii)酵母，诸如酵母菌抹AB110;或(iv)杆状病毒感染的昆虫细胞(WO2007/001851)。天然或重组MUC16多肽可通过蛋白质纯化领域中的多种标准技术来纯化。例如，使用对感兴趣MUC16多肽特异性的抗体通过亲和免疫层析来纯化pro-MUC16多肽、成熟MUC16多肽、或pre-MUC16多肽。一4殳而言，通过将抗MUC16多肽抗体共价偶联至活化后的层析树脂来构建免疫亲和柱。MUC16多肽可以作为与异源多肽的融合多肽而重组生产，所述异源多肽可以是在成熟蛋白质或多肽的N-末端具有特定切割位点的信号序列或其它多肽。或者，MUC16多肽可以作为与信号序列和容许纯化MUC16融合多肽的异源多肽序列的融合多肽来生产，此类异源多肽序列的例子有多组氨酸(HiS6或His8)、人IgGFc、FLAG表位(KDYKDDDDK)、和gD表位(KYALADASLKMADPNRFRGKDLPVL)。信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入载体的编码抗MUC16抗体或MUC16多肽的DNA的一部分。信号序列可以是原核信号序列，选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或热稳定的肠毒素II前导序列。为了酵母分泌，信号序列可以是例如酵母转化酶前导序列、a因子前导序列(包括糖酵母和克鲁维酵母的a-因子前导序列(US5,010,182)、或酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡糖淀粉酶前导序列(EP0362179)、或WO90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达中，可以使用哺乳动物信号序列来指导蛋白质的分泌，诸如来自相同或相关物种的分泌型多肽的信号序列，以及病毒分泌前导序列。"表达MUC16的细胞"或在细胞表面上或以分泌形式表达内源或转染的MUC16多肽。"表达MUC16的癌，，包含在细胞表面上存在MUC16多肽或生成和分泌MUC16抗原性多肽的细胞的癌。"表达MUC16的癌"任选在其细胞表面上生成足够水平的MUC16多肽，使得抗MUC16抗体或其抗体药物偶联物可与其结合并可对癌发挥治疗效果。过表达MUC16多肽的癌指与同一组织40类型的非癌性细胞相比，在其细胞表面上具有显著更高水平的MUC16多肽或生成和分泌显著更高水平的MUC16多肽的癌。此类过表达可以是由基因扩增或者是由转录或翻译提高引起的。可在临床设置中通过评估细胞表面上存在的或细胞分泌的MUC16蛋白质水平的升高(例如通过免疫组织化学测定法，使用针对分离的MUC16多肽制备的抗MUC16抗体，所述多肽可使用重组DNA技术从编码MUC16多肽的分离的核酸制备；FACS分析；等)来确定MUC16多肽过表达。或者/另外，可测量细胞中编码MUC16多肽的核酸或mRNA的水平，例如通过焚光原位杂交(FISH)，使用对应于编码MUC16的核酸或其互补链的基于核酸的探针(WO98/45479);Southern印迹；Northern印迹；或聚合酶链式反应(PCR)技术，诸如实时定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)。还可使用基于抗体的测定法，通过测量生物学流体诸如血清中的脱落抗原来检测MUC16多肽过表达(US4，933，294;WO91/05264;US5,401,638;Siasetal.,(1990)J.Immunol.Methods132:73-80)。可涵盖多种其它体内测定法。或者，可将患者身体内的细胞暴露于任选用可检测标记物例如放射性同位素标记的抗体，并且可评估抗体与患者体内细胞的结合，例如通过外部扫描放射性或通过分析取自事先已暴露于所述抗体的患者的活组织检查切片。亲本和半胱氨酸改造的抗MUC16抗体能够结合、优选特异性结合MUC16多肽，如本文中所描述的。MUC16结合寡肽可使用众所周知的技术无需过多实验就得以鉴定。在这点上，注意到用于对寡肽文库筛选能够特异性结合多肽靶物的寡肽的技术是本领域众所周知的(US5556762;US5750373;US4708871;US4833092;US5223409;US5403484;US5571689;US5663143;WO84/03506;WO84/03564;Geysenetal(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:3998-4002;Geysenetal(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:178-182;Geysenetal"于SyntheticPeptidesasAntigens,130-149(1986);Geysenetal.,丄Immunol.Meth.，102:259-274(1987);Schoofsetal.,J.Immunol"140:611-616(1988);Cwirla,S.E.etal.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6378;Lowman,H.B.etal.(1991)Biochemistry,30:10832;Clackson，T.etal.(1991)Nature,352:624;Marks,J.D.etal.(1991)J.Mol.Biol"222:581;Kang，A.S.etal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:8363;及Sm他，G,P.(1991)CurrentOpin.Biotechnol.,2:668)。本发明的亲本和半胱氨酸改造的抗MUC16抗体包括多克隆的、单克隆的、人源化的、人的、双特异性的、或异源偶联的抗体。涵盖各种形式的人源化抗MUC16抗体。例如，人源化抗体可以是抗体片,丈，诸如Fab。或者，人源化抗体可以是完整抗体，诸如完整IgGl抗体。双特异性抗MUC16抗体指对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。例示性的双特异性抗MUC16抗体可结合本文所述MUC16多肽的两种不同表位。其它此类抗体可将MUC16结合位点与针对另一种蛋白质的结合位点组合。或者，可以将抗MUC16臂与结合白细胞上触发分子(诸如T细胞受体分子(例如CD3)或IgG的Fc受体(FcyR)诸如FcYRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRIII(CD16))的臂组合，从而将细胞防御机制聚焦和定位于表达MUC16的细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达MUC16的细胞。这些抗体拥有MUC16结合臂及结合细胞毒剂(例如肥皂草毒蛋白(saporin)、抗干扰素-a、长春花生物碱(vincaalkaloid)、蓖麻毒蛋白A链、曱氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2双特异性抗体)。全长双特异性抗体的传统生成基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millsteinetal(1983)Nature305:537-539)。异源偶联抗MUC16抗体也在本发明的范围内。异源偶联抗体由两种共价连接的抗体构成。此类抗体建议例如用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(US4，676,980)及用于治疗HIV感染(WO91/00360;WO92/200373;EP03089)。可以在体外使用合成蛋白质化学的已知方法来制备抗体，包括那些涉及交耳关剂的方法。本发明的抗MUC16抗体可以是具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体，其可容易地通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达来生成。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体可包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。本文中优选的多价抗体包含(或由其组成)三个至约八个，但优选四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(且优选两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或多个可变域。例如，多肽链可包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc,其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或l。例如，多肽链可包含VH-CHl-柔性接头-VH-CHl-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体优选进一步包含至少两条(且优选四条)轻链可变域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文涵盖的轻链可变域多肽包含轻链可变域，且任选进一步包含CL结构域。可以通过在Fc区中引入一处或多处氨基酸替代来修饰抗MUC16抗体的效应器功能。此类修饰可增强抗MUC16抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖'性细胞毒性(CDC)。如此生成的同二聚体抗体可具有改善的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。参阅Caronetal(1992)J.ExpMed.176:1191-1195及Shopes,B.J.(1992)Immunol.148:2918-2922。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗MUC16抗体还可使用异双功能交联剂来制备，如Wolffetal(1993)CancerResearch53:2560-2565中所记载的。或者，可改造抗体，其具有双重Fc区，并可由此具有增强的补体溶解和ADCC能力(Stevensonetal(1989)Anti-CancerDrugDesign3:219-230)。可以通过掺入补救受体结合表位(例如抗体片段)来调控抗MUC16抗体的血清半衰期(US5,739,277)。在用于本文时，术语"补救受体结合表位"指IgG分子(例如IgG,、IgG2、IgG3、或IgGjFc区中负责提高IgG分子体内血清半衰期的表位。通过标准竟争结合分析和表位作图(WO2007/001851),包括通过经改造而表达MUC16的完整PC3细胞上的直接荧光进行的交叉阻断研究(使用PANDEX筛选以来对荧光定量(Fendly等(1990)CancerResearch50:1550-1558)),确定了结合MUC16表位的单克隆抗体(包括3A5)。通过标准流式细胞术分析测定出单克隆抗体3A5对OVCAR-3、OVCA432和SK-OV-3细胞的结合与这三种具体细胞系每一种中MUC16mRNA的表达水平(通过标准定量PCR分析测定的)平行。更具体的说，根据标准定量PCR分析的测定，OVCAR-3、OVCA-432和SK-OV-3细胞分别表达高、中和低水平的MUC16mRNA。流式细胞术分析显示了单克隆抗MUC16抗体3A5定量地结合那些细胞系且与那些细胞系中MUC16mRNA的相对量平行。图3显示了人源化曲妥单抗(抗HER2)轻链(HuTMAb-LC,SEQIDNO:5)。人源化std(标准，亲本)3A5抗MUC16轻链(Hu3A5-LC，SEQIDNO:2)、和嵌合std(标准，亲本)3A5抗MUC16轻链(Ch3A5-LC,SEQIDNO:4)序列(WO2007/001851，通过述及收入本文)的比对。编号方式遵循连续编号失见则。图4显示了人源化曲妥单抗重链(HuTMAb-HC,SEQIDNO:6)、人源化std3A5抗MUC16重链(Hu3A5-HC,SEQIDNO:7)、和嵌合std3A5抗MUC16重链(Ch3A5-HC,SEQIDNO:8)序歹'KWO2007/001851,通过述及收入本文)的比对。编号方式遵循连续编号M^则。标记连续编号第281位的标签实际上是278(Kabat275;Eu279)。使用3A5单克隆抗体(WO2007/001851;SambrooketalMolecularCloning:ALaboratoryManual,NewYork:ColdSpringHarborPress,1989;Ausubeletal.,CurrentProtocolsofMolecularBiology,Unit3.16,JohnWileyandSons,1997)实施了免疫组织化学分析。单克隆抗体3A5强烈结合20种人子宫内膜样腺癌肺瘤样品中的16种、25种人浆液性卵巢嚢腺癌样品中的24种、和10种人透明细胞卵巢肿瘤样品中的5种。单克隆抗体3A5内在化进入细胞，3A5就结合该细胞表面上的MUC16多肽。具体而言，将OVCAR-3细胞与单克隆抗体3A5和荧光右旋糖苷一起温育18小时，然后用荧光素标记的抗3A5抗体定量检测细胞所结合的3A5。这些分析证明了抗体3A5与右旋糖苷共定位，表明3A5抗体进入所温育细胞的亚细胞组分，包括这些细胞的溶酶体隔室。对抗MUC16抗体的修饰5,364,934所述的保守和非保守突变的任何技术和指导方针。变异可以是编码抗体或多肽的一个或多个密码子的替代、删除或插入，其导致氨基酸序列相对于天然序列抗MUC16抗体的改变。任选的是，变异是通过抗MUC16抗体的一个或多个结构域中至少一个氨基酸为任何其它氨基酸所替代。变异可使用本领域知道的方法来进行，诸如寡核香酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描、及PCR诱变。可对克隆的DNA进行定点诱变(Carteretal(1986)Nucl.AcidsRes,,13:4331;Zolleretal(1987)Nucl.AcidsRes"10:6487)、盒式诱变(Wellsetal(1985)Gene，34:315)、卩艮制性选才奪诱变(restrictionselectionmutagenesis)(Wellsetal(1986)Philos.Trans.R.Soc.LondonSerA,317:415)或其它已知技术以产生抗MUC16抗体变体DNA。氨基酸改变可改变抗MUC16抗体的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置或者改变膜锚定特征。其它修饰包括谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基分别脱酰胺为谷氨酰和天冬氨酰残基，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的oc-氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:StructureandMolecularProperties,(1983)W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco,pp.79-86)，N-末端胺的乙酰化，及任何C-末端羧基的酰胺化。抗MUC6抗例如，在与全长抗MUC16抗体比较时，抗MUC16抗体片段可在N-末端或C-末端截短，或者可缺少内部残基。某些片段缺少对于抗MUC16抗体的期望生物学活性不是至关重要的氨基酸残基。抗MUC16抗体片段可通过多种常规技术中的任一种来制备。期望肽片段可化学合成。一种备选方法牵涉通过酶促消化产生抗体片段，例如通过用已知在由特定氨基酸残基限定的位点处切割蛋白质的酶处理蛋白质，或者通过用合适的限制酶消化DNA，并分离期望片段。还有一种合适的技术涉及分离并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增编码期望抗体或其片段的DNA片段。限定DNA片段期望末端的寡核苷酸在PCRMUC16抗体共享至少一种生物学和/或免疫学活性。特别优选的一类替代变体涉及替代人源化抗体或人抗体的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的抗体将具有改进的生物学特性。产生此类替代变体的一种便利方法涉及使用噬菌体展示进行的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在各个位点产生所有可能的氦基酸替代。如此产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和人MUC16多肽之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本文详述技术进行替代的候选位点。一旦产生此类变体，如本文所述对该组变体进行筛选，可选^^在一种或多种相关测定法中有优良特性的抗体用于进一步的开发。本发明范围内所包括的对抗MUC16抗体的另一类共价修饰包括改变抗体或多肽的天然糖基化样式，即删除一个或多个在天然序列抗MUC16抗体中发现的碳水化合物模块(moiety)(或是通过消除潜在糖基化位点，或是通过以化学和/或酶促手段删除糖基化)，和/或添加一个或多个在天然序列抗MUC16抗体中不存在的糖基化位点。另外，修饰包括天然蛋白质糖基化中的定性改变,牵涉所存在的多种碳水化合物模块的本质和比例的改变。抗体和其它多肽的糖基化通常或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。由此，多肽中这些三肽序列其中任一的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。向抗MUC16抗体中添加糖基化位点通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述三肽序列而4更利地完成(用于N-连接的糖基化位氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。可任选通过DNA水平的变化来改变抗MUC16抗体的氨基酸序列，特别是通过在预先选择的碱基处突变编码抗MUC16抗体的DNA，从而产生将翻译成期望氨基酸的密码子。增加抗MUC16抗体上糖模块的数目的另一种方法是通过使糖苷与多肽化学或酶促偶联。本领域对此类方法有描迷，例如1987年9月11日公开的WO87/05330,和AplinandWriston，CRCCrit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981)。去除抗MUC16抗体上存在的糖模块可通过化学或酶促方法来实现，或者通过编码充当糖基化靶物的氨基酸残基的密码子的突变替代来实现。化学脱糖基化技术是本领域已知的，而且描述于例如Hakimuddinetal.,Arch.Biochem.Biophys.259:52(1987)和Edgeetal.，Anal.Biochem.118:131(1981)。酶促切割糖模块可通过使用多种内切和外切糖苷酶来实现，如Thotakuraetal.,(1987)Meth.E譜mol.138:350所述。对抗MUC16抗体的另一类共价修饰包括，以US4,640,835;US4，496，689;US4,301,144;US4,670,417;US4,791,192或US4，179,337所述方式，将抗体或多肽与多种非蛋白质性质的聚合物之一连接，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化亚烷基(polyoxyalkylene)。抗体或多肽还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶嚢中(例如分别是羟曱基纤维素或明胶微胶嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯)微胶嚢)、在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶嚢)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例^口Remington'sPharmaceuticalSciences,16thedition,Osol,A.Ed.，1980。还可以形成嵌合分子的方式修饰本发明的抗MUC16抗体，所述嵌合分子包含与另一种异源多肽或氨基酸序列融合的抗MUC16抗体。在一个实施方案中，此类嵌合分子包括带有标签多肽的抗MUC16抗体的融合物，所述标签多肽提供了抗标签抗体可选择性结合的表位。表位标签通常位于抗MUC16抗体的氨基或羧基末端。此类表位标记形式的抗MUC16抗体的存在可使用针对所述标签多肽的抗体来检测。而且，表位标签的提供使抗MUC16抗体易于使用抗标签抗体或另一类结合所述表位标签的亲和基质通过亲和纯化来纯化。多种标签多肽及其各自抗体是本领域公知的。例子包括多组氨酸(poly-his)或多-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；流感HA标签多肽及其抗体12CA5(Fieldetal.,(1988)Mol.Cell.Bio.8:2159-2165);c-myc标签及其抗体8F9，3C7,6E10,G4，B7和9E10抗体(Evanetal.,(1985)MolecularandCellularBiology5:3610-3616);及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborskyetal.,(1990)ProteinEngineering3(6):547-553)。其它标签多肽包括Flag肽(Hoppetal.,(1988)BioTechnology6:1204-1210);KT3表位肽(Martinetal.,(1992)Science255:192-194);a-微管蛋白表位肽(Skinneretal.,(1991)J.Biol.Chem.266:15163-15166);及T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuthetal.,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6393-6397)。在一个备选实施方案中，嵌合分子可包括抗MUC16抗体与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的融合物。对于二价形式的嵌合分子(也称为"免疫粘附素，，)，此类融合物可以是与IgG分子Fc区的融合。Ig融合物优选包含用可溶形式(跨膜结构域删除或失活)的抗MUC16抗体置换Ig分子内至少一个可变区的替代。在一个特别优选的实施方案中，免疫球蛋白融合物包含IgGl分子的铰链区、CH2区和CH3区，或者铰链区、CH,区、CH2区和CH3区(US5,428,130)。抗MUC16抗体的制备可通过多种方法制备编码本发明的亲本抗MUC16抗体和半胱氨酸改造抗MUC16抗体的氨基酸序列变体的DNA，包括但不限于自天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况中)、通过定点诱变(或寡核芬酸介导的诱变)(Carter等(1985)NucleicAcidsRes.13:4431-4443;Ho等(1989)Gene(Amst.)77:51-59;Kunkel等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488;Liu等(1998)J.Biol,Chem.273:20252-20260)、PCR诱变(Higuchi，(1990)于PCRProtocols,pp.177-183,AcademicPress;Ito等(1991)Gene102:67-70;Bernhard等(1994)BioconjugateChem,5:126-132;及Vallette等(1989)Nuc.AcidsRes.17:723-733)和对较早制备的编码多肽的DNA的盒式i秀变(Wells等(1985)Gene34:315-323)来制备。诱变方案、试剂盒和试剂可通过商业途径获得，例如QuikChange⑧多重定点诱变试剂盒(Stratagene，LaJolla，CA)。还可以使用双链质粒DNA作为^f莫板通过基于PCR的诱变通过寡核苷酸介导的诱变来生成单一诱变(Sambrook和Russel,(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版;Zoller等(1983)MethodsEnzymol.100:468-500;Zoller,M.J.和Smith，M(1982)Nucl.AcidsRes.10:6487-6500)。还可以通过限制性片段操作或通过使用合成寡核苷酸的交叠延伸PCR构建重组抗体的变体。诱变引物编码半胱氨酸密码子替换物。标准诱变技术可以用于产生编码此类突变型半月先氨酉殳改造4元体的DNA(Sambrook等，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y"1989;及Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYork,N.Y.,1993)。噬菌体展示技术(McCafferty等，(1990)Nature348:552-553)可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变域(V)基因全集生成抗MUC16人抗体和抗体片段。依照这种技术，将抗体可变域基因以符合读码框的方式克隆入丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状噬菌体颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因得到选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性(Johnson等(1993)CurrentOpinioninStructuralBiology3:564-571;Clackson等(1991)Nature,352:624-628;Marks等(1991)J.Mol.Biol.222:581-597;Griffith等(1993)EMBOJ.12:725-734;US5565332;US5573905;US5567610;US5229275)。抗MUC16抗体可以使用已知的寡肽合成方法来化学合成，或者可以使用重组技术来制备和纯化。适宜的氨基酸序列或其部分可以使用固相技术通过直接肽合成来生成(Stewart等，Solid-PhasePeptideSynthesis,(1969)W.H.FreemanCo.,SanFrancisco,CA;Merrifield，(1963)J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2154)。体外蛋白质合成可以使用手动技术或通过自动化来进行。自动化固相合成可以例如采用受t-BOC或Fmoc保护的氨基酸并使用AppliedBiosystems肽合成仪(FosterCity,CA)依照制造商的说明书来进行。抗MUC16联合以生成期望的抗MUC16抗体或MUC16多肽。已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(Morimoto等(1992)JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117;及Brennan等(1985)Science,229:81)，或者直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗MUC16抗体片段都可在大肠杆菌中表达及由大肠杆菌分泌，如此容许容易地生成大量的这些片段。可以从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可以直接从大肠杆菌回收Fab'-SH片段并化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等(1992)Bio/Technology10:163-167),或者，直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab')2片段。抗MUC16抗体可以是单链Fv片段(scFv)(WO93/16185;US5571894;US5587458)。抗MUC16抗体片段还可以是"线性抗体"(US5,641,870)。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。或转染的细胞来生成抗MUC16抗体。编码抗MUC16抗体的DNA可以得自认为具有抗MUC16抗体mRNA且以可检测水平表达之的组织制备的cDNA文库。因而，人抗MUC16抗体或MUC16多肽DNA可以方便地得自自人组织制备的cDNA文库。抗MUC16抗体编码基因还可以得自基因组文库或已知的合成规程(例如自动化核酸合成)。可以用设计用于鉴定目的基因或由其编码的蛋白质的探针(诸如至少约20-80个碱基的寡核苷酸)筛选文库。用选定探针筛选cDNA或基因组文库可寸吏用才示)隹；危禾呈进4亍，i者长口Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,NewYork,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989,斤述。分离编石马抗MUC16抗体或MUC16多肽的基因的一种备选方法是PCR方法学(Sambrook等，见上文；Dieffenbach等，PCRPrimer:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995)。49将宿主细胞用本文所述用于抗MUC16抗体或MUC16多肽生成的表达或克隆载体转染或转化，并在为了诱导启动子、选择转化子、或扩增编码期望序列的基因而恰当调整的常规营养培养基中培养。培养条件，诸如培养基、温度、pH等等，可以由本领域技术人员无需过多实验就选择。通常，用于使细胞培养物生产力最大化的原理、方案和实用技术可参见MammalianCellBiotechnology:aPracticalApproach,M.Butler,ed"IRLPress,1991和Sambrook等，见上文。适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括原核生物、酵母、或高等真核细胞。合适的原核生物包括但不限于真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如大肠杆菌。多种大肠杆菌菌抹是公众可获得的，诸如大肠杆菌K1Z菌抹MM294(ATCC31，446);大肠杆菌Xl776(ATCC31,537);大肠杆菌菌4朱W3110(ATCC27,325)和K5772(ATCC53,635)。其它合适的原核生物宿主细胞包括肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(^C/76TZ'C/^)例如大肠埃希氏菌(大肠杆菌)(￡.co//)、肠杆菌属(五"fera6acter)、欧文氏菌属(五nWm'a)、克雷伯氏菌属(尺/e&zW/a)、变形菌属(尸rafe^)、沙门氏菌属(Sfl/mowe〃a)例如鼠伤寒沙门氏菌(Sa/,wo"e〃a(V//2z'wmWww)、沙雷氏菌属(Serra"a)例如粘质沙雷氏菌()、和志贺氏菌属(幼/ge〃a),以及芽孢杆菌属(Sa"7//)诸如枯草芽孢杆菌(及和地衣芽孢杆菌U./,c/zew/o腦^)(例如1989年4月12日出版的DD266，710中公开的地衣芽孢杆菌41P)、々支单胞菌属(尸化z^omo"w)诸如铜绿假单胞菌(Paerwg/"osa)、和链霉菌属(5^eptom7cM)。这些例子是例示性的而非限制性的。菌抹W3110是用于重组DNA产物发酵的例示性宿主菌抹。优选的是，宿主细胞分泌最小量的蛋白水解酶。例如，菌抹W3110可以修饰，在编码对宿主而言内源的蛋白质的基因中产生遗传突变，此类宿主的例子包括大肠杆菌W3110菌抹1A2，其具有完整基因型to"A大肠杆菌W3110菌抹9E4，其具有完整基因型to"J;^r;大肠杆菌W3110菌抹27C7(ATCC55,244),其具有完整基因型to"Jp/wJ￡/5^rgf/ac^^ow/r^"";大肠杆菌W3110菌抹37D6，其具有完整基因型to"^p&3p/2a4￡75rgF-/ac」7(59ow;7V&7z7vG&"大肠牙干菌W3110菌抹40B4,它是具有非卡那霉素抗性&g尸删除突变的菌4朱37D6;及具有突变型周质蛋白酶(US4,946,783)的大肠杆菌菌抹。或者，体外克隆方法，例如PCR或其它核酸聚合酶反应也是合适的。全长抗体、抗体片段及抗体融合物蛋白质可在细菌中制备，特别是在不需要糖基化和FC效应器功能时，诸如当治疗用抗体与细胞毒剂(例如毒素)偶联且免疫偶联物自身显示出肿瘤细胞破坏的效力时。全长抗体在循环中具有较长半衰期。使用例如抗体片段和多肽在细菌中的表达及用于优化表达和分泌的翻译起始区(TIR)和信号序列(US5,648,237;US5,789,199;和US5,840,523),大肠杆菌中的制备可以更快且更加省钱。表达后，从大肠杆菌细胞糊在可溶性级分中分离抗体，并且可例如才艮据同种型通过蛋白A或G柱来纯化。最终的纯化可以与用于纯化例如在CHO细胞中表达的抗体的方法类似地进行。除了原核生物以外，真核微生物，诸如丝状真菌或酵母也是编码抗MUC16抗体或MUC16多肽的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母)是常用的低等真核宿主微生物。其它的包括粟酒裂殖糖酵母(5b/2z'zoacc/aramyces尸om6e)(Beach和Nurse,(1981)Nature290:140;EP139,383);克鲁维酵母属(尺/甲e薩戸s)宿主(US4,943,529;Fleer等，(l"l)Bio/Technology9:968-975)诸如例如乳酸克鲁维酵母(I/ac/^)(MW98-8C,CBS683，CBS4574;Louvencourt等，(1983)J.Bacteriol.154(2):737-742)、脆壁克鲁维酵母(K/rag/fc)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(尺.k/gfln'c""(ATCC16,045)、威克克鲁维酵母(Kw/cfera脂7)(ATCC24,178)、Kwa/ft7(ATCC56,500)、果蝇克鲁维酵母(Kdmsc^fe'/aram)(ATCC36,906;VandenBerg等，(1990)Bio/Technology8:135)、耐热克鲁维酵母(Kf/zwmoto/erara)、和马克思克鲁维酵母(Kmarx/a"^);亚罗酵母属(Kwrow/a)(EP402,226);巴斯德毕赤酵母(户Zc/n'a/xwto"^)(EP183,070;Sreekrishna等，(1988)J.BasicMicrobiol.28:265-278);假丝酵母属();瑞氏木霉(7Wc/zocfem2areesZa)(EP244,234);粗4造月永孑包菌(A^Mms;oracra"a)(Case等，(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:5259-5263);许旺酵母属(&/7丽朋/。/^，")诸如许旺酵母(5"c/2丽朋/ow少cesocc油虚/k)(EP394,538);和丝状真菌诸如例如脉孢菌属(7Vewms:;ora)、青霉属(Pe"/"7/z'w/w)、弯颈霉属(ro(y/oc/aAwm)(WO91/00357)、和曲霉属(A/^^〃w)宿主诸^口4勾巢曲霉(爿."/dw/am1)(Balance等,(1983)Biochem.Biophys.Res.Commun.112:284-289;Tilburn等，(1983)Gene26:205-221;Yelton等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470-1474)和黑曲霉(Am'ger)(Kelly和Hynes,(1985)EMBOJ.4:475-479)。曱基营养型酵母(Methylotropicyeast)适于本发明，包括但不限于能够在曱醇上生长的、选自以下属的酵母汉逊氏酵母属(//a""肌/a)、假丝酵母属(Ca"&Wa)、克勒克氏酵母属(尺/oecfera)、毕赤氏酵母属(尸/c/7/a)、糖酵母属OSacc/^rawyce力、球拟酵母属(rora/o戸&)、和红酵母属(i/z。(iofc)rw/(3)。适用于表达糖基化抗MUC16抗体或MUC16多肽的宿主细胞还可衍生自多细胞生物体。无脊推动物细胞的例子包括昆虫细胞诸如果蝇S2和夜蛾Sf9,以及植物细胞诸如棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、烟草的细胞培养物。。已经鉴定了许多杆状病毒抹和变体及相应的允许的昆虫宿主细胞，它寸门来自i者^口草i也夜蛾65poJop&ra(毛虫)、》矣及4尹虫iL4etfes(虫文子)、白纟丈4尹虫i^4e(ies<3/6o//cfz^(虫丈子)、黑腹果虫U3rasop/n7ame/a"ogaWer(果蜆)、和家蚕Bom^;xmon'等宿主。公众可获得多种病毒抹用于转染，例如苜蓿尺虫芰(爿wtograp/zaca//orm.ca」NPV的L-1变体和家蚕C6om6yxNPV的Bm-5抹，而且此类病毒可依照本发明用作本文的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细月包。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7,ATCCCRL1651);人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham等,(1977)J.GenVirol.36:59);幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL10);中国仓鼠卵巢细胞ADHFR(CHO，Urlaub等，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216);小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4，Mather,(1980)Biol.Reprod.23:243-251);猴肾细胞(CV1,ATCCCCL70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL2);犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL34);牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL3A,ATCCCRL1442);人肺细胞(W138，ATCCCCL75);人肝细胞(HepG2，HB8065);小鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCCCCL51);TRI细胞(Mather等，(1982)AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68);MRC5细胞;FS4细月包;和人肝瘤系(HepG2)。用上述用于抗MUC16抗体生成的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子、或扩增编码期望序列的基因而恰当调整的常规营养培养基中培养。可以将编码抗MUC16抗体或MUC16多肽的核酸(例如cDNA或基因组DNA)插入复制型载体用于克隆(DNA扩增)或表达。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒颗粒、或噬菌体的形式。可以通过多种规程将适宜的核酸序列插入载体中。在体外或在体内对胂瘤细胞的生长抑制可以以本领域已知的多种方式来测定，诸如与未处理的肿瘤细胞相比，在体外或在体内将表达MUC16的肿瘤细胞的细胞增殖抑制约25-100%,或约30-100°/。，或约50-100%或70-100%。可通过本领域已知的方法例如使用内源性或在用MUC16基因转染后表达MUC16多肽的细胞，来评估抗MUC16抗体的体外生长抑制效果。例如，可将适宜的肺瘤细胞系和MUC16转染细胞用不同浓度的抗MUC16单克隆抗体处理几天(例如2-7天)，并用结晶紫或MTT染色，或者通过一些其它比色测定法来分析。降低的信号指示生长抑制。或者，可测量细胞存活力，即用抗MUC16抗体或药物偶联物处理细胞几天，然后将细胞与测定细胞数目(与ATP含量成比例的，例如通过使用诸如CellTiterGlo(Promega,Madison，WT)等试剂进行的发光测定法)的试剂一起温育。测量增殖的另一种方法是通过比较在存在或缺乏抗MUC16抗体时所处理细胞的SH-胸苷摄取。处理后，收获细胞并在闪烁计数器中对掺入DNA的放射性的量定量。对增殖的抑制会通过放射性的降低来证明。为了选择诱导细胞死亡的抗MUC16抗体，可以相对于对照评估膜完整性的丧失，例如通过碘化丙啶(PI)、台盼蓝或7AAD摄取所指示的。适宜的阳性对照包括用已知抑制所选细胞系生长的生长抑制性抗体处理该细胞系。可在细胞培养物中在抗体浓度为约0.005-30)ag/ml或约0.03nM至200nM时测量生长抑制，其中在使肿瘤细胞暴露于抗体后1-10天测量生长抑制。如果以约lpg/kg至约100mg/kg体重施用抗MUC16抗体导致在自首次施用抗体起约5天至3个月内、优选约5至30天内肿瘤体积缩小或肿瘤细胞增殖降低，那么该抗体是体内生长抑制性的。半胱氨酸改造抗MUC16抗体的制备本发明的设计、选择和制备方法能够得到具有亲电子官能度(functionality)反应性的半胱氨酸改造抗MUC16抗体。这些方法进一步能够获得抗体偶联物化合物，诸如在指定的、设计的、选择性的位点上具有药物分子的抗体-药物偶联物(ADC)化合物。抗体表面上的反应性半胱氨酸残基容许通过硫醇反应性基团，诸如马来酰亚胺或由代乙酰基特异性地偶联药物模块。Cys残基的硫醇官能度与马来酰亚胺基团的亲核反应性高于蛋白质中任何其它氨基酸官能度，诸如赖氨酸残基的氨基或N-末端氨基约1000倍。硤乙酰基和马来酰亚胺试剂中的硫醇特异性官能度可以与胺基团反应，但需要更高的pH09.0)和更长的反应时间(Garman,1997，Non-RadioactiveLabelling:APracticalApproach,AcademicPress,London)。可以通过才示),Ellman观'J定'法来估计蛋白质中游离硫醇的量。免疫球蛋白M为二硫化物连接的五聚体的例子，而免疫球蛋白G为内部二硫桥将各亚基键合在一起的蛋白质的例子。在诸如这种蛋白质中，用诸如二硫苏糖醇(DTT)或硒醇还原二硫键(Singh等(2002)Anal.Biochem.304:147-156)是产生反应性游离硫醇所需的。这种方法可以导致抗体的三级结构和抗原结合特异性丧失。PHESELECTOR(用于选择反应性硫醇的噬菌体ELISA)测定法容许以ELISA噬菌体形式检测抗体-Fab中反应性半胱氨酸基团，由此辅助半胱氨酸改造抗体的设计(US2007/0092940)。在孔表面上包被半胱氨酸改造抗体与之结合的抗原，随后与展示半胱氨酸改造的Fab的噬菌体颗粒一起温育，添加HRP标记的二抗，并才全测吸光度。可以以快速、有力和高流通量方式筛选噬菌体上展示的突变蛋白。可以使用与从抗体或其它蛋白质的随机蛋白质-噬菌体文库鉴定游离Cys掺入的适当反应性位点相同的方法生成半胱氨酸改造抗体的文库并且进行结合选择。这项技术包括使噬菌体上展示的半胱氨酸突变蛋白与也为硫醇反应性的亲和试剂或报告基团反应。鉴定trastuzsumab-Fab中的重链A114CKabat编号方式(A121C连续编号方式)变体是例示性的。可以高效地搜索整个Fab分子以鉴定更多的带有反应性硫醇基团的ThioFab变体。采用参数，表面可及分数(fractionalsurfaceaccessibility)来鉴定和量化溶剂对多肽中氨基酸残基的可及性。将表面可及性表述为可以由溶剂分子，例如水接触的表面积(A2)。水占据的空间近似为1.4A半径球体。软件为自由可获得的或可许可的(SecretarytoCCP4,DaresburyLaboratory,Warrington,WA44AD,UnitedKingdom,Fax:(+44)1925603825,或通过因特网www.ccp4.ac.uk/dist/h加l/INDEX.html)，如使用计算具有已知X射线晶体学衍生坐标的蛋白质的每个氨基酸的表面可及性的算法的晶体学程序CCP4Suite("TheCCP4Suite:ProgramsforProteinCrystallography"(1994)Acta.Cryst.D50:760-763)。执行表面可及性计算的两种例示性软件模块为"AREAIMOL，，和"SURFACE"，其基于B丄ee和F.M.Richards(1971)J.Mol.Biol.55:379-400的算法。AREAIMOL将蛋白质的溶剂可及表面定义为探针球(probesphere)(代表溶剂分子)在蛋白质的VanderWaals表面上翻转时其中心的位置。AREAIMOL如下计算溶剂可及表面积，即在关于每个原子的扩充球体上产生表面点(距原子中心的距离等于原子和探针半径的总和)，并且消除那些位于与相邻原子相关的等同球体内的点。AREAIMOL找到了PDB坐标文件中原子的溶剂可及面积并概括了残基、链和整个分子的可及面积。可以将各原子的可及面积(或面积差)存储成假拟-PDB输出文件。AREAIMOL假设了每个成分的单一半径并仅识别有限数量的不同成分。AREAIMOL和SURFACE报导了绝对可及性，即平方埃(A)数。通过参比多肽内氨基酸相关标准状态来计算表面可及分数。参比状态为三肽Gly-X-Gly,其中X为感兴趣的氨基酸，且参比状态应为"扩展的"构象，即像那些在P链中的构象。扩展的构象使X的可及性达到最大值。用计算的可及面积除以Gly-X-Gly三肽参比状态中的可及面积并报告商数，其为可及性分数。可及性百分比为可及性分数乘以IOO。计算表面可及性的另一种例示性算法基于程序xsae的SOLV模块(Broger,C.,F.Hoffman-LaRoche，Basel),它基于多肽的X射线坐标计算氨基酸残基对水球体的可及性分数。可以使用可得到的晶体结构信息来计算抗体中每个氨基酸的表面可及性分数(Eigenbrot等(1993)JMolBiol.229:969-995)。编码半胱氨酸改造抗体的DNA易于使用常规规程来分离和测序(例如通过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞充当此类DNA的来源。一旦分离，可以将DNA置入表达载体，然后转染入原本不生成抗体蛋白质的宿主细胞，诸如大肠杆菌细月包、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或其它哺乳动物宿主细胞，诸如骨髓瘤细胞(US5807715;US2005/0048572;US2004/0229310),以获得单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。鉴定了不干扰抗体效应器功能的位点，并用半胱氨酸残基替代它们以进行位点特异性标记。抗体Fab的恒定区(CL和CH!)是对于此目的理想定位的，因为此结构域在抗原结合中或在Fc-效应器功能中没有明显作用(Jefferis,R."Structure-functionrelationshipsoftheIgGsubclasses,"inTheHumanIgGSubclasses.PergamonPress,,Oxford;1990)。使用基于PHESELECTOR噬菌体55展示的方法来筛选Fab表面上的反应性半胱氨酸，鉴定了变体LC-V110C(Kabat编号方式)和HC-A114C(Kabat编号方式，相当于Eu编号方式中的A118C和连续编号方式中的A117C，对于抗MUC16抗体而言)，以及其它变体是适合于抗体-Fab的位点特异性标记的(Junutula,J.R.etal.(2008)"Rapididentificationofreactivecysteineresiduesforsite-specificlabelingofantibody-Fabs，，JImmunolMethods332:4-52)。在设计和选择后，可如下生成具有改造的、高度反应性的未配对的Cys残基的半胱氨酸改造抗体，例如ThioFab:(i)在细菌例如大肠杆菌系统(Skerra等(1993)Curr.OpinioninImmunol.5:256-262;Pliickthun(1992)Immunol.Revs.130:151-188)或哺乳动物细胞培养物系统(WO01/00245)例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达；和(ii)使用常用的蛋白质纯化技术纯化(Lowman等(1991)J.Biol.Chem.266(17):10982-10988)。改造的Cys硫醇基团与亲电子的接头试剂和药物-接头中间体起反应而形成半胱氨酸改造抗体-药物偶联物和其它经标记的半胱氨酸改造抗体。半胱氨酸改造抗体的和存在于亲本抗体中的、配对并形成链间和链内二石克键的Cys残基不具有任何反应性硫醇基团(除非用还原剂处理)且不与亲电子的接头试剂或药物-接头中间体起反应。新近改造的Cys残基可以保持不配对，而且能够与亲电子的接头试剂或药物-接头中间体(诸如药物-马来酰亚胺)起反应(即偶联)。例示性的药物-接头中岡体包括MC-MMAE、MC-MMAF、MC-vc-PAB-MMAE、和MC-vc-PAB-MMAF。重链和轻链中经改造的Cys残基的结构位置依照连续编号系统来编号。此连续编号系统与自N末端起始的Kabat编号系统(Kabat等(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5片反，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD)有关，与Kabat编号方案(底行)的区别在于标示为a、b、c的插入。使用Kabat编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含减少的或添加的氨基酸，对应于可变域FR或CDR中的缩短或插入。经半胱氨酸改造的重^1变体位点通过连续编号方式和Kabat编号方案来标示。在一个实施方案中，通过包括下列步骤的方法制备半胱氨酸改造的抗MUC16抗体(a)用半胱氨酸替代亲代抗MUC16抗体的一个或多个氨基酸残基；和(b)通过使半胱氨酸改造的抗MUC16抗体与巯基-反应试剂反应测定半胱氨酸改造的抗体的巯基反应性(thiolreactivity)。半胱氨酸改造的抗体可以比亲代抗体更具与巯基-反应试剂的反应性。游离半胱氨酸氨基酸残基可以位于重链或轻链中或恒定域或可变域(区)中。还可以通过用一个或多个半胱氨酸氨基酸替代抗体片段的氨基酸来改造抗体片段，例如Fab,以便形成半胱氨酸改造的抗体片段。本发明的另一个实施方案提供了制备半胱氨酸改造的抗MUC16抗体的方法，包4舌(a)将一个或多个半胱氨酸氨基酸引入亲代抗MUC16抗体以便生成半胱氨酸改造的抗MUC16抗体；和(b)测定半胱氨酸改造的抗体与巯基-反应试剂的巯基反应性；其中半胱氨酸改造的抗体比亲代抗体更具与巯基-反应试剂的反应性。制备半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(a)可以包含(i)诱变编码半胱氨酸改造的抗体的核酸序列；(ii)表达半胱氨酸改造的抗体；和(iii)分离和纯化半胱氨酸改造的抗体。制备半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(b)可以包含表达选自噬菌体或噬菌粒颗粒的病毒颗粒上的半胱氨酸改造的抗体。制备半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(b)还可以包含(i)使半胱氨酸改造的抗体与巯基-反应性亲和试剂反应而生成亲和标记的半胱氨酸改造的抗体；和(ii)测定亲和标记的半胱氨酸改造的抗体与俘获介质的结合。本发明的另一个实施方案为筛选带有高反应性的未配对的半胱氨酸氨基酸的半胱氨酸改造的抗体的巯基反应性的方法，包含(a)将一个或多个半胱氨酸氨基酸导入亲代抗体以便产生半胱氨酸改造的抗体；(b)使半胱氨酸改造的抗体与巯基-反应性亲和试剂反应而生成亲和标记的半胱氨酸改造的抗体；和(c)测定亲和标记的半胱氨酸改造的抗体与俘获介质的结合；和(d)测定半胱氨酸改造的抗体与巯基-反应试剂的巯基反应性。筛选半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(a)可以包含(i)诱变编码半胱氨酸改造的抗体的核酸序列；(ii)表达半胱氨酸改造的抗体；和(iii)分离和纯化半胱氨酸改造的抗体。筛选半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(b)可以包含表达选自噬菌体或噬菌粒颗粒的病毒颗粒上的半胱氨酸改造的抗体。筛选半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(b)还可以包含(i)使半胱氨酸改造的抗体与巯基-反应性亲和试剂反应而生成亲和标记的半胱氨酸改造的抗体；和(ii)测定亲和标记的半胱氨酸改造的抗体与俘获介质的结合。3A5IgG变体的半胱氨酸改造通过本文所述半胱氨酸工程改造方法，在重链117(抗MUC163A5抗体的连续编号方式)位点处将半胱氨酸导入全长、人源化和嵌合亲本单克隆抗MUC163A5抗体，以给出A117Cthiohu抗MUC163A5人源化变体(其具有重链序列SEQIDNO:l和轻链序列SEQIDNO:2，图1)和A117Cthioch抗MUC163A5嵌合变体(其具有重链序列SEQIDNO:3和轻链序列SEQIDNO:4，图2)。通过含lmM半胱氨酸的培养基中的瞬时发酵，在CHO(中国仓鼠卵巢)细胞中表达这些半胱氨酸改造的单克隆抗体。通过流式细胞术在OVCAR-3细胞(其表达内源MUC16)上比较人源化thio抗MUC16半胱氨酸改造的抗体和标准3A5IgG的亲和力，连续稀释抗体直至观察到降低的变化(areducedshift);选择结合条件使得在整个滴定中抗体相对于细胞结合位点过量。使用焚光抗人Fc二抗检测所结合的抗体。流式细胞术直方图显示了在饱和(400ng/mL)和亚饱和(25ng/mL)浓度发生的结合。在所分析的所有抗体浓度，这两种抗MUC16变体，即标准和thio,给出等同的结合，提示等同的对抗原的亲和力。在所测试的每个浓度，thio抗MUC16抗体像标准(亲本)抗MUC16抗体一样有效地结合OVCAR-3细胞。使用MUC16胞外结构域(ECD)—部分进行的表面等离振子共振分析也证实了thio3A5抗MUC16抗体对此抗原的高亲和力(KD=116pM)。比较有高或低/无MUC16表达(根据RT-PCR研究)的细胞，thio抗MUC16抗体结合表达MUC16的细胞，但不结合MUC16阴性细胞系。因此，HC-A118处的替代不影响抗原结合。依照一个实施方案，人源化3A5半胱氨酸改造的抗MUC16抗体包含一个或多个具有游离半胱氨酸氨基酸的如下可变区重链序列(SEQIDNO:9-17,表l)。<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>依照一个实施方案，嵌合3A5半胱氨酸改造的抗MUC16抗体包含一个或多个具有游离半胱氨酸氨基酸的如下重链可变区序列(SEQIDNO:18-26,表2)。表2:预测ch3A5半胱氨酸改造的抗MUC16抗体变体的连续、Kabat和Eu编号方式的重链比4交<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>依照一个实施方案，人源化3A5半胱氨酸改造的抗MUC16抗体包含一个或多个具有游离半胱氨酸氨基酸的如下轻链可变区序列(SEQIDNO:27-33,表3)。表3:hu3A5半胱氨酸改造的抗MUC16抗体变体的连续和Kabat编号方式的轻链比较序列连续编号Kabat编号SEQIDNO:SLSAS^GDRVTV15CVI5C27EIKRTGAAPSVV110CV110C28TVAAPGVFIFPS114CS114C29FIFPPGDEQLKS121CS121C30DEQLK￡GTASVS127CS127C31VTEQDGKDSTYS168CS168C32GLSSPGTKSFNV205CV205C33依照一个实施方案，嵌合3A5半胱氨酸改造的抗MUC16抗体包含一个或多个具有游离半胱氨酸氨基酸的如下轻链可变区序列(SEQIDNO:34-40,表4)。表4:ch3A5半胱氨酸改造的抗MUC16抗体变体的连续和Kabat编号方式的轻链比较序列连续编号Kabat编号SEQIDNO:FLSVS^GGRVTL15CL15C34EIKRTQAAPSVV110CV110C35TVAAPGVFIFPS114CS114C36FIFPPGDEQLKS121CS121C37DEQLK^GTASVS127CS127C38VTEQDGKDSTYS168CS168C39GLSSP^TKSFNV205CV205C40经过标记的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体半胱氨酸改造的抗MUC16抗体可以位点特异性地和有效地与硫醇反应性试剂偶联。硫醇反应性试剂可以是多官能接头试剂(multifimctionallinkerreagent);捕捉(即亲和、标记)试剂(例如生物素4妄头试剂)；检测标记物(例如荧光团试剂)；固相固定化试剂(例如SEPHAROSEtm、聚苯乙烯、或玻璃)；或药物-接头中间体。硫醇反应性试剂的一个例子是N-乙基马来酰亚胺(NEM)。在一个例示性的实施方案中，ThioFab与生物素-接头试剂反应得到生物素化的ThioFab,通过这种方式可以;险测和测量改造的半胱氨酸残基的存在和反应性。ThioFab与多官能接头试剂反应得到带有可以与药物模块试剂或其它标记物进一步反应的官能化接头的ThioFab。ThioFab与药物-接头中间体反应得到ThioFab药物偶联物。本文所述例示性方法一般可应用于鉴定和生产抗体，并且更一般地通过应用本文所述的设计和筛选步骤用于其它蛋白质。此类办法可应用于偶联其它硫醇反应性试剂，其中反应性基团是例如马来酰亚胺、碘乙酰胺、吡。定基二碌i/f匕物、或其它石克醇反应性偶联配偶体(Haugland,2003,MolecularProbesHandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals,MolecularProbes,Inc.;Brinkley,1992,BioconjugateChem.3:2;Garman,1997,Non-RadioactiveLabelling:APracticalApproach,AcademicPress,London;Means(1990)BioconjugateChem.1:2;Hermanson,G.inBioconjugateTechniques(1996)AcademicPress,SanDiego,pp.40-55,643-671)。硫醇反应性试剂可以是药物模块；荧光团，诸如荧光染料，像荧光素或若丹明；用于成像的螯合剂或放射性治疗金属；肽基或非肽基标记物或检测标记；或清除改性剂(clearance-modifyingagent)，诸如聚乙二醇的各种异构体；结合第三种成分的肽或另一种碳水化合物或亲脂性试剂。半胱氨酸改造的抗MUC16抗体的用途半胱氨酸改造的抗MUC16抗体及其抗体-药物偶if关物和标记的偶联物可用作治疗和/或诊断试剂。本发明进一步提供了预防、管理、治疗或改善与MUC16相关病症有关的一种或多种症状的方法。具体而言，本发明提供了预防、管理、治疗、或改善与细胞增殖性病症有关的一种或多种症状的方法，诸如例如印巢癌、宫颈癌、子宫癌、胰腺癌(包括胰腺的腺癌)、肺癌和乳腺癌。本发明还进一步提供了诊断MUC16相关病症或发生此类病症的素因的方法，以及鉴定优先结合细胞结合(cell-associated)MUC16多肽的抗体和抗体的抗原结合片段的方法。本发明的另一个实施方案致力于半胱氨酸改造的抗MUC16抗体用于制备药物的用途，所述药物在MUC16相关病症的治疗中是有用的。61半胱氨酸改造的抗MUC16抗体-药物偶联物通过在限定的位点处附着药物模块及近乎均一的化学计量(药物/抗体比，p值)，半胱氨酸改造的抗MUC16抗体解决了抗体-药物偶联物异质性的问题。另外，偶联条件导致对所有天然免疫球蛋白二石克键的保留。本发明的一个方面是抗体-药物偶联物化合物，其包含半胱氨酸改造的抗MUC16抗体(Ab)和auristatin药物模块(D)，其中半胱氨酸改造的抗体经由一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸通过接头模块(L)附着至D;该化合物具有式I:Ab-(L-D)pI其中p为l,2,3,或4;且其中所述半胱氨酸改造的抗体是通过如下方法制备的，即包括用一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸替换亲本抗MUC16抗体的一个或多个氨基酸残基。在将单个半胱氨酸突变改造入抗MUC16亲本抗体以形成半胱氨酸改造的抗MUC16抗体时，由于重链和轻链的对称本质，导致两个游离的半胱氨酸氨基酸。图5显示了半胱氨酸改造的抗MUC16抗体药物偶联物(ADC)的实施方案，其中auristatin药物模块附着至轻链(LC-ADC)、重链(HC-ADC)、和Fc区(Fc-ADC)中的改造的半胱氨酸基团。常规的抗体-药物偶联策略产生对靶细胞有活性但可能也产生系统毒性的偶联物的异质混合物。半胱氨酸改造的抗MUC16抗体药物偶耳关物的潜在优点包括安全性改善(治疗指数更大)、PK参数改善、稳定性更大和结合的保留(由于抗体链间二硫键的保留)、药物偶联位点确定、和更近乎均一的产物混合物。事实上，与标准抗MUC16ADC相比，thio抗MUC16ADC在临床前动物模型中展现出更大的治疗窗(大约四倍)。在比较匹配的IgG抗体(mg/kg)剂量水平时，我们的数据显示了thio和标准MUC16ADC在小鼠异种移植物中有等同的功效，然而在大鼠中，68.6mg/kg(2820吗/m2MMAE)剂量的thioADC产生与16.6mg/kg(1500吗/m2MMAE)剂量的标准ADC相似的毒性。在比较细胞毒性药物剂量(吗/m2)时，与标准ADC相比，thioADC既更加安全又更加有效。thioADC胜过标准ADC的所得益处会是在有效(mg/kg)剂量的ADC降低MMAE暴露。继而，改善的对thioADC的耐受性能容许更高的剂量水平(以mg/kg抗体计)及为患有更具挑战性的恶性肿瘤(例62疗益处。药物模块式I的抗体-药物偶联物(ADC)的Auristatin药物模块包括多拉司他汀、auristatins(US5635483;US5780588;US5767237;US6124431)、及其类似物和衍生物。已经证实多拉司他汀和auristatins干扰微管动力学、GTP水解、及核和细胞分裂(Woyke等(2001)Antimicrob.AgentsandChemother.45(12):3580-3584)并且具有抗癌(US5663149)和抗真菌活性(Pettit等(1998)Antimicrob.AgentsChemother.42:2961-2965)。多拉司j也汀或auristatin药物才莫块的不同形式可以通过肽药物模块的N(氨基)末端或C(羧基)末端共价附着至抗体(WO02/088172;Doronina等(2003)NatureBiotechnology21(7):778-784;Francisco等(2003)Blood102(4):1458-1465)。例示性的auristatin实施方案包才舌N-末端连接的monomethylauristatin药物模块DE和DF,其4皮露在下列文献中WO2005/081711;Senter等，ProceedingsoftheAmericanAssociationforCancerResearch,Volume45,AbstractNumber623，2004年3月28日提交，明确将这些文献各自全部披露的内容引入本文作为参考。例示性的auristatin药物模块包括MMAE和MMAF。式I的抗体-药物偶联物(ADC)的auristatin药物模块(D)包括monomethylauristatin药物模块MMAE和MMAF。MMAE或MMAF药物模块的N-末端经接头共价附着至抗体的改造的半胱氨酸。MMAEMMAF其它例示性的auristatin药物模块包括在五肽auristatin药物模块的C末端具有苯丙氨酸羧基修饰的单曱基缬氨酸化合物(WO2007/008848)和在五肽auristatin药物模块的C末端具有苯丙氨酸侧链修饰的单曱基缬氨酸化合物(WO2007/008603)。典型地，可以通过在两个或多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键制备基于肽的药物模块。例如，可以按照肽化学领域众所周知的液相合成法制备这类肽4定(参见E.Schr6der和K.Liibke,"ThePeptides",volume1,pp76-136,1965AcademicPress)。接头"接头"、"接头单元"、或"连接"指包含使抗体共价附着于药物模块的共价键或原子链的化学模块。在各个实施方案中，接头以L表示。"接头，，(L)为可用于连接一个或多个药物模块(D)和抗体单元(Ab)而形成通式I的抗体-药物偶联物(ADC)的双功能或多功能模块。可以使用具有供结合药物和抗体用的反应性官能度的接头而便利地制备抗体-药物偶联物(ADC)。半胱氨酸改造抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇可以与接头试剂、药物模块或药物-接头中间体的亲电子官能团形成键。一方面，接头具有反应性位点，该位点具有与存在于抗体上的亲核半胱氨酸具有反应性的亲电子基团。抗体的半胱氨酸硫醇与接头上的亲电子基团具有反应性并且与接头形成共价键。有用的亲电子基团包括但不限于马来酰亚胺和卣代乙酰胺基团。接头包括二价基，诸如亚烃基(alkyldiyl)、亚芳基、亚杂芳基；模块，诸如-(012、0(012)。-、烷氧基重复单元(例如聚亚乙基氧基(polyethylenoxy)、PEG、聚亚曱基氧基(polymethyleneoxy))和烷氨基(例如聚乙烯氨基，Jeffamine);及二酸酯和酰胺，包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺。半胱氨酸改造抗体与接头试剂或药物-接头中间体，与亲电子官能团诸如马来酰亚胺或a-卣代羰基依照Klussman等(2004)Bio—ugateChemistry15(4):765-773，766页上的偶联方法和依照实施例3的方案起反应。接头可以由一种或多种接头构件构成。例示性的接头构件包括6-马来酰亚氨基己酰基("MC，，)、马来酰亚氨基丙酰基("MP")、缬氨酸-瓜氨酸("val-cit"或"vc")、丙氨酸-苯丙氨酸("ala-phe"或"af，)、对氨基千氧羰基("PAB")、N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯("SPP")、N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来^L亚氨基曱基)环己烷-l羧酸酯("SMCC")、和N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯曱酸酯("SIAB")、亚乙基氧基-CH2CH20-作为一个或多个重复单元("EO，，或"PEO")。本领域知道別的接头构件，本文中也描述了一些。在一个实施方案中，ADC的接头L具有通式64—A「Ww—Yy—其中-A-为共价附着于抗体(Ab)半胱氨酸硫醇的延伸物(stretcher)单元；a为0或l;每个-W-独立为氨基酸单元；w独立为0-12的整^t;-Y-为共价附着于药物模块的间隔物(spacer)单元；且y为0、l或2。延伸物单元当存在时，延伸物单元(-A-)能够连接抗体单元与氨基酸单元(-W-)。在这方面，抗体(Ab)具有能与延伸物单元的亲电子官能团形成键的游离半胱氨酸硫醇基团。式n和III描绘了式I中的例示性延伸物单元，其中Ab-、-W-、-Y-、-D、w和y如上文所定义且R"为选自下列的二价基(CH2》、C3-Cs碳环基、-(CH2》、亚芳基、(CH2)广亚芳基、-亚芳基-(CH2)「、(CH2)「(C3-Cs碳环基)、(C3-Cs碳环基)-(CH2)r、CVC8杂环基、(CH2)r-(C3-Q杂环基)、-(C3-Q杂环基)-(CH2)「、-(CH2)rC(0)NRb(CH2)r-、-(CH2CH20)r-、-(CH2CH20)「CH2-、-(CH2)rC(0)NRb(CH2CH20)r-、_(CH2)rC(0)NRb(CH2CH20)r-CH2_、-(CH2CH20)rC(0)NRb(CH2CH20)r-、-(CH2CH20)rC(0)NRb(CH2CH20)r-CH2-和-(CH2CH20)rC(0)NRb(CH2》-；其中Rb为H、C广C6烃基(烷基)、苯基或苄基；且r独立地为范围l-10的整数。亚芳基包括通过从芳族环体系中除去两个氢原子而衍生的6-20个碳原子的二价芳族烃基。典型的亚芳基包括但不限于衍生自苯、取代的苯、萘、蒽、联苯等的基团。杂环基包括一个或多个环原子为杂原子(例如氮、氧和硫)的环体系。杂环基包含1-20个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子。杂环可以为具有3-7个环成员的单环(2-6个碳原子和l-3个选自N、O、P和S的杂原子)或具有7-10个环成员的双环(4-9个碳原子和l-3个选自N、O、P和S的杂原子)，例如双环[4,5],[5,5]，[5，6]或[6,6]体系。杂环记载于Paquette,LeoA.;"PrinciplesofModernHeterocyclicChemistry",W.A.Benjamin,NewYork,1968,特別是l,3,4,6,7，和9章；"TheChemistryofHeterocyclicCompound,AseriesofMonographs",JohnWiley&Sons,NewYork，1950至今，4争别是巻13，14,16，19,和28;及J.Am.Chem.Soc.(1960)82:5566。举例而言而非限制，杂环的例子包括吡咬基、二氬吡。定基、四氬吡。定基(哌啶基)、5塞唑基、四氢噻吩基(tetrahydrothiophenyl)、硫氧化的四氪谨>分基、嘧啶基、呋喃基、漆吩基(thienyl)、p比咯基、p比峻基、咪唑基、四唑基、苯并吹喃基、硫杂萘基(thianaphthalenyl)、卩引咮基、indolenyl、唾啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、吡p各淋基、四氬咬喃基、双-四氮吹喃基(bis-tetrahydrofuranyl)、四氪吡喃基、双-四氢吡喃基(bis-tetrahydr叩yranyl)、四氮p奎啉基、四氢异p奎淋基、十氢会啉基、八氢喹啉基、吖辛因基(azocinyl)、三嗪基、6H-l，2,5-噻二嗪基、2H,6H-l,5,2-二噻。秦基、噻吩基、噻蒽基、吡喃基、异苯并呋喃基、色烯基、a占吨基、酚卩恶噻基(phenoxathinyl)、2H-吡咯基、异p塞唑基、异0恶唑基、吡,基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹。秦基、酞。秦基、萘。定基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、4Ah-^唑基、口卡唑基、P-啼啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、呋咱基、吩0恶嗪基、异色满基、色满基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌。秦基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、奎宁环基、吗啉基、a恶唑烷基、笨并三唑基、苯并异D恶唑基、羟吲哚基、苯并D恶唑啉基和靛红酰基(isatinoyl)。碳环基包括具有3-7个碳原子(作为单环)或7-12个碳原子(作为双环)的饱和或不饱和环。单环碳环具有3-6个环原子，更通常地为5或6个环原子。双环碳环具有7-12个环原子，例如排列成双环[4，5]，[5,5],[5,6]或[6,6]体系，或者9或10个环原子，排列成双环[5,6]或[6,6]体系。单环碳环的例子包括环丙基、环丁基、环戊基、l-环戊-l-烯基、l-环戊-2-烯基、l-环戊-3-烯基、环己基、l-环己-l-烯基、1-环己-2-烯基、l-环己-3-烯基、环庚基和环辛基。才艮据式IADC的所有例示性实施方案诸如n-VI应当理解，即使在未明确表述的情况中，有l-4个药物模块与抗体连接(p=1-4),这取决于改造的半胱氨酸残基的数目。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage66</formula>一种例示性式II延伸物单元衍生自马来酰亚氨基-己酰基(MC),其中R<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>一种例示性式n延伸物单元衍生自马来酰亚氨基-丙酰基(mp),其中r'7<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>另一种例示性式II延伸物单元，其中R"为-(CH2CH20)r-CH2-且r为2:〇另种例示性式II延伸物单元，其中R17为-(CH2)rC(0)NRb(CH2CH20)r—CH2—,其中Rb为H且每个r为2:O<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>另一种例示性式III延伸物单元，其中R17为-(CH2)5O在另一个实施方案中，延伸物单元通过抗体的改造半胱氨酸的硫原子与延伸物单元的石克原子之间的二石克4建与半胱氨酸改造抗MUC16抗体连接。该实施方案的代表性延伸物单元以式IV描绘，其中R17、Ab-、-W-、-Y-、-D、w和y》。上文所定义。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage68</formula>在又一个实施方案中，延伸物的反应性基团含有能与抗体的游离半胱氨酸硫醇形成键的硫醇反应性官能团。硫醇反应性官能团的例子包括但不限于马来酰亚胺；a-卣代乙酰基；活化的酯类，诸如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯；酸酐类；酸性氯化物或酰基氯类(acidchloride);磺酰氯类；异氰酸酯类和异硫氰酸酯类。该实施方案的代表性延伸物单元以式Va和Vb描绘，其中-R17-、Ab-、-W-、-Y-、-D、w和y如上文所定义。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage68</formula>在另一个实施方案中，接头可以为树状类型接头(dendritictypelinker),其用于通过分支的多功能接头模块将超过一个药物模块共价附着于抗体(Sim等(2002)Bioorganic&MedicinalChemistryLetters12:2213-2215;Sun等(2003)Bioorganic&MedicinalChemistry11:1761-1768;King(2002)TetrahedronLetters43:1987-1990)。树状接头能增加药物与抗体的摩尔比，即载荷，它与ADC的效能相关。如此，如果半胱氨酸改造抗体仅携带一个反应性半胱氨酸硫醇基团，那么可以通过树状接头附着众多药物模块。氨基酸单元接头可以包含氨基酸残基。如果存在，那么氨基酸单元(-Ww-)使本发明的半胱氨酸改造抗体-药物偶联物(ADC)的抗体(Ab)与药物模块(D)连接。-Ww-为二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。包含氨基酸单元的氨基酸残基包括那些天然存在的以及次要的氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。各个-W-单元独立地具有如下所示的方括号内的通式，且w为范围0-12的整数其中1119为氢、曱基、异丙基、异丁基、仲丁基、千基、对羟基千基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(=NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(=NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡咬基曱基-、3-吡咬基曱基-、4-。比。定基曱基-、苯基、环己基、H当R"不为氢时，R"所附着的碳原子为手性的。1119所附着的各个碳原子独立地以(S)或(R)构型或外消旋混合物附着。氨基酸单元如此可以为对映体方面纯的、外消旋的或非对映异构体的。例示性的-Ww-氨基酸单元包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性的二肽包括缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。例示性的三肽包括甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。构成氨基酸接头构件的氨基酸残基包括天然存在的氨基酸，以及次要氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。可以用一种或多种酶(包括肿瘤相关蛋白酶)酶促切割氨基酸单元，以释放药物模块(-D),其在一个实施方案中在体内释放时被质子化以提供药物69(D)。可以在特定酶(例如肺瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D,或纤溶酶蛋白酶)的酶促切割的逸择性方面设计和优化氨基酸接头构件。间隔物单元在氨基酸单元存在时(w=1-12),间隔物单元(-Yy-)(在存在时，y=l或2)使氨基酸单元(-Ww-)与药物模块(D)连接。或者，在氨基酸单元不存在时，间隔物单元使延伸物单元与药物才莫块连接。在氨基酸单元和延伸物单元都不存在时(w,y二O),间隔物单元还4吏药物模块与抗体单元连接。间隔物单元有两大类自我牺牲的(self-immolative)和非自我牺牲的。非自我牺牲的间隔物单元为部分或所有间隔物单元在从抗体-药物偶联物或药物模块-接头切割(特别是酶促切割)氨基酸单元后保持与药物模块结合的间隔物单元。当含有甘氨酸-甘氨酸间隔物单元或甘氨酸间隔物单元的ADC通过肿瘤细胞相关蛋白酶、癌细胞相关蛋白酶或淋巴细胞相关蛋白酶进行酶促切割时，甘氨酸-甘氨酸-药物模块或甘氨酸-药物模块从Ab-Aa-Ww-上切割下来。在一个实施方案中，在靶细胞内发生独立的水解反应，其切割甘氨酸-药物模块的键并孝奪力丈药物。在另一个实施方案中，-Yy-为对氨基苄基氨基甲酰基(PAB)单元，其亚苯基部分被Qm取代，其中Q为-C，-Cs烃基(烷基，alkyl)、-0-(C,-C8烃基(烷基，alkyl))、-卤素、-硝基或-氰基；且m为范围0-4的整数。'非自我牺牲的间隔物单元(-Y-)的例示性实施方案为:-Gly-Gly-;-Gly-;-Ala-Phe-;-Val-Cit-。在一个实施方案中，提供了药物模块-接头或ADC或其药学可接受的盐或溶剂化物，其中间隔物单元不存在(y二O)。或者，含有自我牺牲的间隔物单元的ADC能释放-D。在一个实施方案中，-Y-为通过PAB基团的氨基氮原子连接至-Ww-,且通过碳酸酯、氨基曱酸酯或醚基团直接连接至-D的PAB基团，其中ADC具有如下例示性结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage70</formula>其中Q为-C,-Cs烃基(烷基，alkyl)、-0-(C,-C8烃基(烷基,alkyl))、-卤素、一硝基或-氰基；m为范围0-4的整数；且p范围为l-4。自我牺牲的l'曰—团似的芳族化合物，诸如2-氨基咪唑-5-曱醇衍生物(Hay等(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237)、杂环PAB类似物(US2005/0256030)、卩-葡糖苦酸(WO2007/011968)、和邻位或对位氨基千基乙缩醛。可以使用在酰胺键水解时进行环化的间隔物，诸如取代和未取代的4-氨基丁酸酰胺类(Rodrigues等(1995)ChemistryBiology2:223)、适当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环体系(Storm等(1972)J.Amer.Chem.Soc.94:5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺类(Amsberry等(1990)J.Org.Chem.55:5867)。消去在甘氨酸上取代的含胺药物(Kingsbury等(1984)J.Med.Chem.27:1447)也是可用于ADC的自我牺牲的间隔物的例子。例示性的间隔物单元(-Yy-)以式X-XII表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage71</formula>树状接头在另一个实施方案中，接头L可以为树状类型接头(dendritictypelinker),其用于通过分支的多功能接头模块将超过一个药物模块共价附着于抗体(Sun等(2002)Bioorganic&MedicinalChemistryLetters12:2213-2215;Sun等(2003)Bioorganic&MedicinalChemistry11:1761-1768)。树状接头能增加药物与抗体的摩尔比，即载荷，它与ADC的效能相关。如此，如果半胱氨酸改造抗体仅携带一个反应性半胱氨酸硫醇基团，那么可以通过树状接头附着众多药物模块。分支的树状接头的例示性实施方案包括2,6-双(羟甲基)-对甲酚和2,4，6-三(羟曱基)-酚树状聚物单元(dendrimerunit)(WO2004/01993;Szalai等(2003)J.Amer.Chem.Soc.125:15688-15689;Shamis等(2004)J.Amer.Chem.Soc.126:1726-1731;Amir等(2003)Angew.Chem.Int.Ed.42:4494-4499)。在一个实施方案中，间隔物单元为分支的双(羟曱基)苯乙烯(BHMS),它可以用于掺入和释放众多药物，其具有如下结构CH2(OC)n——D其包含2-(4-氨基亚千基)丙烷-l，3-二醇树状聚物单元(WO2004/043493;deGroot等(2003)Angew.Chem,Int.Ed.42:4490-4494),其中Q为-C,-C8烃基(烷基，alkyl),-O-(C,匿Q烃基(烷基,alkyl))、-卣素、-硝基或-氰基;m为范围0-4的整数;n为0或l;且p范围为l-4。式I抗体-药物偶联物化合物的例示性实施方案包括XIIIa(MC)、XIIIb(val-cit)、XIIIc(MC-val-cit)、和XIIId(MC-val-cit-PAB):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage72</formula>式Ia抗体-药物偶联物化合物的其它例示性实施方案包括XIVa-e:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage72</formula>其中R独立为H或C广C6烃基(烷基，alkyl);且n为l-12。在另一个实施方案中，接头具有反应性官能团，该反应性官能团具有与存在于抗体上的亲电子基团具有反应性的亲核基团。抗体上有用的亲电子基团包括但不限于醛和酮羰基。接头的亲核基团的杂原子能与抗体上的亲电子基团反应并且与抗体单元形成共价键。接头上有用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲(thiosemicarbazone)、肼羧酸酯和芳基酰肼。抗体上的亲电子基团提供了用于附着接头的便利位点。典型地，可以通过在两个或更多氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备73XIVbXIVcXIVdXIVe一(CH2CH20)n—肽类型的接头。例如，可以按照肽化学领域众所周知的液相合成法(E.Schr6der和K.Liibke(1965)"ThePeptides",巻l,pp76-136,AcademicPress)来制备此类肽键。可以通过包括间隔物、延伸物和氨基酸单元的反应的任意组合或顺序来装配接头中间体。间隔物、延伸物和氨基酸单元可以采用本质上为亲电子、亲核或游离基的反应性官能团。反应性官能团包括但不限于羧基、羟基、对硝基苯基碳酸根、异硫氰酸根和离去基团，诸如O-曱磺酰基、O-曱苯磺酰基、-Cl、-Br、-I;或马来酰亚胺。在另一个实施方案中，接头可以用调节溶解性或反应性的基团取代。例如，带电荷的取代基，诸如磺酸根(-S(V)或铵可以增加试剂的水溶性并且有利于接头试剂与抗体或药物模块的偶联反应，或有利于Ab-L(抗体-接头中间体)与D的偶联反应或D-L(药物-接头中间体)与Ab的偶联反应，这取决于用于制备ADC的合成途径。4妻头试剂可以使用多种双功能接头试剂来制备包含抗体和auristatin的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP),琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基曱基)环己烷-l-羧酸酯(SMCC),亚氨基^Ut(IT),亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二曱酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯曱酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯曱酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如曱苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如l，5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。对本发明的抗体药物偶联物有用的接头试剂包括但不限于BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo醫KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、及SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)笨曱酸酯)；并且包括双马来酰亚胺试剂DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、1,8-双-马来酰亚氨基二甘醇(BM(PEO)2)和l,ll-双-马来酰亚氨基三甘醇(BM(PEO)3),它们可购自PierceBiotechnology,Inc.、ThermoScientific(Rockford,IL)、及其它试剂供应商。双马来酰亚胺试剂容许将抗体的半胱氨酸残基的游离硫醇基团按照依次或同时的方式附着至含硫醇药物模块、标记物或接头中间体。除马来酰亚胺外的其它与抗体、奈莫柔74比星(nemorubicin)代谢物和类似物药物模块、或接头中间体的硫醇基团具有反应性的官能团包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡咬基二硫化物、异氰酸根和异硫氰酸根。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage75</formula>还可以通过其它商业来源获得或按照下列文献中所述的规程合成有用的接头试剂Toki等(2002)J.Org.Chem.67:1866-1872;Walker,M.A.(1995)丄Org.Chem.60:5352-5355;Frisch等(1996)BioconjugateChem,7:180-186;US6214345;WO02/088172;US2003130189;US2003096743;WO03/026577;WO03/043583;和WO04/032828。具有马来酰亚胺延伸物和对氨基苄基氨基曱酰基(PAB)自我牺牲间隔物的例示性缬氨酸-瓜氨酸(val-cit或vc)二肽接头试剂具有如下结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage75</formula>具有马来酰亚胺延伸物单元和PAB自我牺牲间隔物单元的例示性phe-lys(Mtr，单-4-曱氧基三苯曱基)二肽接头试剂可以按照Dubowchik等(l"7)TetrahedronLetters,38:5257-60所述制备且具有如下结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage75</formula>例示性的药物-接头中间体包括:MC-val-cit匿PAB-MMAFMC-val-cit-PAB-MMAEMC-MMAEMC-MMAF本发明的例示性抗体-药物偶4关物化合物包括oAb-MC-vc-PAB-MMAFAb-MC-MMAEAb-MC画MMAF其中Val为缬氨酸；Cit为瓜氨酸；p为l、2、3或4;且Ab为半胱氨酸改造抗MUC16抗体。半胱氨酸改造抗MUC16抗体-药物偶联物的制备可以通过数种途径，采用本领域技术人员公知的有机化学反应、条件和试剂来制备式I的ADC,包括(1)使半胱氨酸改造抗体的半胱氨酸基团与接头试剂反应，从而通过共价键形成抗体-接头中间体Ab-L，随后与活化的药物模块D反应；和(2)使药物模块的亲核基团与接头试剂反应，从而通过共价键形成药物-接头中间体D-L，随后与半胱氨酸改造抗体的半胱氨酸基团反应。偶联方法(1)和(2)可以与各种半胱氨酸改造抗体、药物模块和接头一起使用以制备式I的抗体-药物偶联物。抗体半胱氨酸硫醇基团为亲核性的并且能够与接头试剂和药物-接头中间体上的亲电子基团反应而形成共价键，所述亲电子基团包括(i)活性酯类，诸如NHS酯类、HOBt酯类、卣代曱酸酯类和酸性氯化物类；(ii)烃基和千基卣化物，诸如卤代乙酰胺类；(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团；和(iv)通过碌^化物交换的二硫化物，包括吡啶基二硫化物。药物模块上的亲核基团包括但不限于胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼基团，它们能够与接头模块和接头试剂上的亲电子基团反应而形成共价一建。可以如下使半胱氨酸改造抗体变成反应性的以便偶联接头试剂，即用还原剂，诸如DTT(Cleland氏试剂，二硫苏糖醇)或TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)处理(Getz等(1999)Anal.Biochem.273:73-80;SoltecVentures,Beverly,MA)，接着再氧化以再形成链间和链内二硫键(实施例2)。例如，在37。C用约50倍过量的TCEP将在CHO细胞中表达的全长半胱氨酸改造的单克隆抗体(ThioMab)还原3小日于以还原半胱氨酸和谷胱甘肽加合物中的二硫键，其可以在新引入的半胱氨酸残基与存在于培基中的半胱氨酸之间形成。此部分还原破坏链间二硫键但不破坏链内二硫键，接着可进行渗滤。用10mM乙酸钠，pH5稀释还原后的ThioMab并且加载至10mM乙酸钠，pH5中的HiTrapS柱上并且用含有0.3M氯化钠的PBS洗脱。在室温用稀(200nM)石危酸铜(CuS04)水溶液重新建立亲本Mab中存在的半胱氨酸残基之间的二石克键过夜。或者，脱氢抗坏血酸(DHAA)是有效的氧化剂，用于在半胱氨酸加合物的还原性切割之后重新建立半胱氨酸改造抗体的链内二硫化物基团，如SDS-PAGE分析所证明的。可以使用本领域公知的其它氧化剂，即氧化性试剂和氧化性条件。环境空气氧化也是有效的。这种温和的部分再氧化步骤有效地高保真度地形成链内二硫键并保护新引入的半胱氨酸残基的硫醇基团。加入相对于抗体约3倍过量的(相对于新引入的半胱氨酸残基约1.5倍过量的)药物-接头中间体，例如MC-vc-PAB-MMAE，混合并且在室温;改置约l小时，以进行偶3关并形成3A5抗MUC16抗体-药物偶联物。将偶联混合物进行凝胶过滤、加载和通过HiTrapS柱洗脱以除去过量的药物-接头中间体和其它杂质。附图6a显示了制备由细胞培养物表达的用于偶联的半胱氨酸改造抗体的一般方法。当细胞培养基含有半胱氨酸时，可以在新引入的半胱氨酸氨基酸和培养基中的谷胱甘肽或半胱氨酸之间形成二硫化物加合物。必须将半胱氨酸加合物(描绘为图6a中的例示性ThioMab(左)中的环)还原以生成具有偶联反应性的半胱氨酸改造抗体。将半胱氨酸加合物，可能还有多个链间二硫键用还原剂诸如TCEP还原性切割以产生还原形式的抗体。在部分氧化条件下，用硫酸铜、DHAA、或暴露于环境氧而重新形成配对半胱氨酸残基之间的链间二硫键。新引入的、改造的和未配对的半胱氨酸残基仍然可用于与接头试剂或药物-接头中间体反应而形成本发明的抗体偶联物。哺乳动物细胞系中表达的ThioMabs通过-S-S-键形成产生外部偶联至改造的Cys的Cys加合物。因此，纯化的ThioMabs如实施例2所述通过还原和再氧化规程处理以产生反应性ThioMabs。这些ThioMabs用于偶联含有马来酰亚胺的细胞毒性药物、荧光团和其它标记物。图6b显示了还原的抗体的再氧化的时间过程。将曲妥单抗还原并在阳离子交换柱上于pH5.5纯化。顶图a显示了还原的抗体在时间为O分钟时的反相图语。保留时间7分钟处的三个峰(从左到右)为轻链(LC),重链(HC)和少量未完全还原的HC+LC。容许纯化的、还原的抗体在pH7再氧化，并采集等分试样，作为时间的函数。中图b显示了在90分钟内大部分轻链和重链被78再氧化以形成含有2条LC和2条HC的完整抗体(大约保留时间10分钟峰)。在180分钟反应时间点没有看到另外的完整抗体形成(底图c)。对半胱氨酸改造的抗体药物偶联物反应的分析显示了相对于通过还原链间或链内二硫键，接着(标准ADC)与硫醇反应性药物接头中间体偶联而制备的抗体药物偶联物降低的异质性。图7a显示了标准嵌合3A5与MC-vc-PAB-MMAE的偶联产物的HIC(疏水相互作用层析)分析(顶)。HIC分析基于每个抗体的药物数目将ADC分开。得到了每个抗体的药物数目不同的多组ADC的分布，其中ADC携带O个(12%)、l个(3%)、2个(43%)、3个(3%)、4个(32%)、6个(6%)和8个(1%)个MMAE每个3A5抗体。在每个组内存在假定的別的异质性，即MMAE在八个链间二硫键的任一个处连接至3A5。这些种类中的一些可通过质谱来检测，但是无法通过HIC层析来解析。比较而言，图7a还显示了半胱氨酸改造的嵌合3A5与MC-vc-PAB-MMAE的偶联产物的HIC分析(底)。得到了异质性较低的产物(ADC混合物)分布和较低的平均药物负荷值(p,平均药物/抗体)。产物混合物主要是单一种类，即2个MMAE每个3A5(60%)，其中药物附着于重链中的每一A117C半胱氨酸突变位点。不完全的反应导致约32%的一个MMAE每个抗体和7。/。的为偶联抗体。检测不到负荷更高的ADC。图7b显示了图7a中分析条件下大规模thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE偶联反应的的HIC(疏水相互作用层析)层析图，其中平均药物负荷值为1.9个MMAE每个thioch3A5。图8a显示了还原和去甲基化后标准(亲本)嵌合3A5与MC-vc-PAB-MMAE的偶联产物的质谱分析，显示了结合至重链(HC)和轻链(LC)的药物的相对量(顶)。大约一半的轻链偶联有一个药物。重链具有O个、l个、2个、和3个药物的分布。在每个可检测质量内存在^Jt的别的异质性，即MMAE在链间二硫键的任一个处连接至3A5。比较而言，图8a还显示了半胱氨酸改造的嵌合3A5与MC-vc-PAB-MMAE的偶联产物的质谱分析(底)。如预期的，轻链不携带MMAE。大多数重链偶联有一个MMAE,其经由A117C半胱氨酸突变位点，如图8b和8c中所描绘的。标准和thioADC在LC/MS分析前去糖基化和还原。标准ADC的解巻积质谱(顶，图8a)展示了轻链上零个或一个药物的种类及重链上零个、一个、两个、或三个药物的种类，而thioADC只展示了重链上一个药物的种类，指示thioADC的更多同质性，正如预79期的。抗体中用于细胞毒性药物附着至TDC-Fab的区域的定位作图。顶图(a)显示了MC-vc-PAB-MMAE-偶联Fab的还原的、变性的轻链和重链部分的280nm吸光谱。中图(b)部分中轻链和底图(c)部分中重链的解巻积质量与只在重链上标记的药物一致。在(c)中观察到的质量24189源自MMAE-C02的损失(减去762道尔顿)，这是该药物的特征性碎裂。图8c显示了肽图-TDC-Fab中含有细胞毒性药物的肽的筌定。未偶联的(顶图a)和已偶联的(中图b)Thio-3A5和TDC的肽图是自马来酰亚氨基化的纯化的Fab的胰蛋白酶消化物生成的。用MC-vc-PAB-MMAE标记的肽具有升高的疏水性，而且预期在层析图中较晚洗脱。四种药物偶联肽(用*标记的)在梯度结束时洗脱。它们还能通过在所有含有MC-vc-PAB-MMAE的质谱中观察到的特征性内部来源的石卒裂离子(in-sourcefragmentationion)(m/z718.5)而被鉴定为含有细胞毒性药物的肽。底图(c)显示了自未偶联的和已偶联的消化物提取的离子层析图的覆盖图。最强的峰与偶联物消化物的晚洗脱峰一致。所有四个峰被鉴定为位于Fab-HC中第1M位中突变的半胱氨酸附近的完全或部分胰蛋白酶切割片段。29.05分钟处主峰中的m/z离子解巻积而得出质量3962道尔顿，这是肽1^099-120+l药物的预期质量。含有药物的肽质没有定位至该蛋白质的任何其它区域。顶图(a)中用箭头标记的峰是马来酰亚胺标记的肽HC99-120。造的)ADC。由于链间二硫键的损失，标准ADC显示出多个种类，如图9a中所描绘的。图9b比4交了通过标准Hu3A5-VC-MMAE和两种ThioHu3A5-VC-MMAE制备物的串联液相层析和质谱(LC-MS)检测到的主要种类。在层析分析前，将样品或是用DTT处理(用以还原性切割二硫键)或是保持完整。用常规方法制备的Hu3A5-VC-MMAE产生广泛的种类分布，反映了偶联过程的异质性和链间二硫键的损失。比较而言，ThioHu3A5-VC-MMAE的两种制备物都近乎同质得多，而且检测到的种类代表或是完整的未偶联抗体(携带所有正常二硫键)或是在改造的半胱氨酸处(没有在其它位点)与接头-药物偶联的抗体。筛选方法
技术领域：
：本发明的又一个实施方案致力于测定怀疑含有MUC16/CA125/0772P多肽的样品中MUC16/CA125/0772P多肽的存在的方法，其中该方法包括使所述样品暴露于结合MUCi6/CA125/0772P多肽的半胱氨酸改造抗MUC16抗体或其抗体-药物偶联物，并测定半胱氨酸改造抗MUC16抗体或其抗体-药物偶联物与样品中MUC16/CA125/0772P多肽的结合，其中存在有所述结合表明样品中存在MUC16/CA125/0772P多肽。任选地，所述样品可包含怀疑表达MUC16/CA125/0772P多肽的细胞(其可以是癌细胞)。所述方法中所采用的半胱氨酸改造抗MUC16抗体或其抗体-药物偶联物可任选地可纟企测地标记、附着至固体支持物、等等。本发明的另一个实施方案致力于诊断哺乳动物中肿瘤的存在的方法，其中该方法包括(a)使包含得自哺乳动物的组织细胞的测试样品接触结合CA125/0772P多肽的半胱氨酸改造抗MUC16抗体或其抗体-药物偶联物，并(b)检测半胱氨酸改造抗MUC16抗体或其抗体-药物偶联物与测试样品中的CA125/0772P多肽之间复合物的形成，其中形成了复合物表明哺乳动物中存在肿瘤。任选地，半胱氨酸改造抗MUC16抗体或其抗体-药物偶联物是可检测地标记的、附着至固体支持物的、等等，和/或组织细胞的测试样品得自怀疑具有癌性肿瘤的个体。体外细胞增殖测定法本发明的一个实施方案致力于抑制表达MUC16多肽的细胞生长的方法，其中该方法包括使细胞接触针对MUC16多肽的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体或其抗体药物偶联物，引起对表达MUC16的细胞生长的抑制。所述细胞可以是癌细胞，而且半胱氨酸改造的抗体或其抗体药物偶联物对MUC16多肽的结合引起表达MUC16多肽的细胞死亡或抑制表达MUC16多肽的细胞的增殖。一般而言，通过下列步骤测定抗体-药物偶联物(ADC)的细胞毒性或细胞生长抑制活性使表达MUC16多肽的哺乳动物细胞在细胞培养基中暴露于ADC;将细胞培养约6小时-约5天的时间；和测定细胞存活率。对于细胞增殖测定法有用的哺乳动物细胞包括(1)表达MUC16多肽的细胞系OVCAR-3;(2)改造成在其细胞表面上稳定表达MUC16多肽一部分的PC3衍生的细胞系多肽的亲本PC3细胞系；和(4)不表达MUC16多肽但携带用于驱动外源MUC16表达的载体的PC3细胞系(PC3/neo)。基于细胞的体外试验用于测定存活率(增殖)、细胞毒性和本发明ADC的程序性细胞死亡诱导(胱天蛋白酶活化)。通过细胞增殖试验测定抗体-药物偶联物的体外功效(附图lO和ll,实施Madison,WI)基于鞘翅目(Co/eop,era)焚光素酶(US5583024;US5674713;US5700670)的重组表达的同质性试验方法(homogeneousassaymethod)(Mendozaetal(2002)CancerRes.62:5485-5488)。该细胞增殖试验基于对存在的ATP进行定量测定了培养物中存活细胞的数量，其中存在的ATP为代谢活性细胞的指示剂(Crouch等(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88;US6602677)。来自体外细胞增殖测定法的结杲显示于图lO和ll，并证明了每一种半胱氨酸改造的抗MUC16抗体药物偶联物在OVCAR-3和PC3/MUC16细胞(即在细胞表面上表达MUC16多肽的细胞)中引起显著水平的细胞死亡，而在亲本PC3和PC3/neo细胞(在细胞表面上不表达MUC16多肽)中没有^见察到任何抗体的显著细胞杀伤。这些数据证明了所测试的偶联物能够结合在细胞表面上表达的MUC16多肽并在体外引起那些细胞的死亡。药动学-血清清除和稳定性通过单个静脉内推注剂量注射入Sprague-Dawley大鼠后测量抗体和药物偶联物的血清浓度，分析了抗MUC16抗体-药物偶联物的体内部署。携带至少一个细胞毒性药物的抗体-药物偶联物的浓度以ELISA测量，其使用MUC16胞外结构域(ECD)蛋白进行捕捉及使用抗MMAE和辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗小鼠Fc抗体进行检测。血清中的总Ch3A5和ThioCh3A5浓度以ELISA测量，其使用MUC16ECD进行捕捉及使用抗人FcHRP进行检测。此测定法测量任何抗MUC16抗体，有和无偶联的MMAE均可。这些测定法具有定量下限0.78ng/mL,最低稀释度1:10。这些测定法具有定量下限0.78ng/mL,最低稀释度1:10。使用具有IV推注输入、一阶消除(firstorderelimination).和宏观速率常数(macro-rateconstant)的两隔室片莫型(Model8,WinNonlinProv.5.0.1,PharsightCorporation,MountainView,CA)分析了来自82每只动物的血清浓度时间数据。拟合的整体优度基于预测估值、预测的标准误差、和主要和次要参数的变异系数的百分比，以及对观察的和预测的浓度-时间数据之间的参差图的审查。个别主要PK参数包含分別与CX和P阶段有关的零-时间截距(A和B),及微-速率常数(micro-rateconstants)(cx和(3)。使用了以下建模选项使用WinNonlin来确定初始估值；通过预测浓度平方的倒数(l/f)来对浓度加权；使用Nelder-Mead最小化算法。在大鼠中进行的28天药动学分析的结果显示于图12。给大鼠服用0.5mg/kg体重的thioch3A5-VC-MMAE或ch3A5-VC-MMAE。在服药后5分钟、l小时、6小时、24小时、及2,3，4,8，11,15,21,和28天自大鼠收集血清。就总抗体而言或就药物-抗体偶联物而言，thioch3A5-VC-MMAE显示出体内清除的较慢动力学。此行为对于改善治疗恶性肿瘤或其它病症的过程中对治疗剂的暴露，同时降低细胞毒性药物经由快速清除途径(包括代^t)清除的潜在有害效应可能是有利的。在急性毒性大鼠模型中评估半胱氨酸改造的抗MUC16抗体-药物偶联物的安全性。通过用ADC处理雌性Sprague-Dawley大鼠并随后4企查和分析对各种器官的影响来调查ADC的毒性。基于总体观察(体重)、临床病理学参数(血清化学和血液学)和组织病理学，可观察、表征、和测量ADC的毒性。发现在等同的剂量水平，与半胱氨酸改造的抗MUC16抗体-药物偶联物相关的急性毒性比相应的标准抗体-药物偶联物少。通过在第l天单次注射stdch3A5-VC-MMAE(24.19mg/kg=1934mg/m2),thioch3A5-VC-MMAE(49.99mg/kg=1934mg/m2),和乂t照J某介物，在青年雌性大鼠(100-125g)中进行了12天急性毒性研究。stdch3A5指称作3A5的亲本嵌合抗MUC16抗体，而thioch3A5指半胱氨酸改造的嵌合抗MUC163A5抗体。每天测量体重。在第5天和第12天进行临床化学、血清酶和血液学分析；以带组织学评估的完全尸检结束。毒性信号包括体重减轻的临床观察。通过血清中升高的肝酶来测量肝毒性，包括天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、和g-谷氨酰转移酶(GGT)。通过白细胞(主要是粒细胞(嗜中性粒细胞))和/或血小板的消减及淋巴样器官累及(即萎缩或凋亡活性)动物毒性83来观察血液淋巴毒性。发现，与用i某介物处理的动物相比，半胱氨酸改造的抗MUC16抗体-药物偶联物不引起血清AST水平或循环血小板或嗜中性粒细胞水平的可检测变化。这些发现呈现于图13。相反，标准抗MUC16抗体-药物偶联物在相同的细胞毒性药物剂量和在抗体剂量的一半引起瞬时AST升高及循环嗜中性粒细胞和血小板消减(在第5天观察到)。还观察到血清AST和GGT的升高。半胱氨酸改造的抗体偶联技术表现出改善抗体-药物偶联物在啮齿类模型中的安全性。在大鼠中，单剂16.6mg/kg标准抗MUC16ADC(等同于1500吗/1112药物暴露)在第5天引起循环嗜中性粒细月包和其它白血球的明显消减(服药后四天；图13)，接着在第12天发生补偿性反弹。此标准ADC剂量还导致肝酶天冬氨酸转氨酶血清水平的轻度升高(AST;图13)和瞬时体重减轻(图14)。当剂量增加50%时(24.5mg/kgADC;2250吗/m2MMAE)，AST水平受到更加深刻的影响。在该剂量，六只大鼠中有三只未能存活至研究结束(第12天)。相反，36.4mg/kg的thio抗MUC16ADC(等同于1500(iig/m2药物暴露)没有产生不利效果，所有参数与用i^某介物处理的动物本质上相同。一剂68.6mg/kg的thio抗MUC16ADC(2820吗/1112药物)产生与使用四分之一该剂量的标准抗MUC16抗体-药物偶联物观察到的毒性几乎等同的毒性。重要的是，虽然最高的thio抗MUC16ADC剂量(100.8mg/kg;4150吗/1112药物)确实产生了明显的效果，但是不利效果的总体情况与在较高的标准抗MUC16ADC剂量(24.5mg/kgADC;2250吗/m2MMAE)所观察到的相当类似。在使用嵌合偶联物进行的预备研究中观察到相同的趋势。认为相对于只服用媒介物的动物服用ADC后动物的体重减轻或体重变化是全身或局部毒性的总体和一般指标。图14显示了12天里的体重(克)变化。接受半胱氨酸改造的偶联物的大鼠的体重以与用々某介物处理的动物相同的速率增加，而接受标准抗体-药物偶联物的大鼠经历瞬时体重减轻或体重增加延迟。还在猕猴中评估标准和thio抗MUC16抗体-药物偶联物的安全性。虽然大鼠和猴类都表达受到3A5抗体识别的MUC16,但是猕^f吳抗原在一级序列方面与人抗原更加相似。在竟争性结合测定法中，单抗3A5对CA125的结合受到相似浓度的人和猴MUC16ECD蛋白质的抑制(IC50分别为0.76nM和1.89nM),但是来自大鼠MUC16ECD的竟争效率低得多(IC50为13.5nM)。大鼠和猕猴都对抗体-MMAE偶联物敏感。在猕猴中进行的初步研究本质上回应了大鼠中的发现。在服用标准和thio抗MUC16-MC-vc-PAB-MMAEADC的灵长类动物中最显著的不利事件是可逆的嗜中性粒细胞降低。虽然标准抗MUC16-MC-vc-PAB-MMAEADC在1200昭/1112药物(5.9mg/kg抗体)的药物暴露诱导了明显降低，但是thioADC在1200吗/n^药物(12.8mg/kg抗体)没有产生明显的不利事件，嗜中性粒细胞计数紧紧跟踪假处理的动物(图17)。动物在第l天和第22天服药。第22天的嗜中性粒细胞水平在第二剂之前(pre-seconddose)。将剂量倍增至25.6mg/kg;2400吗/1112药物导致嗜中性粒细胞计数降低，其是完全可逆的。甚至更高剂量的thio抗MUC16ADC(38.4mg/kg;3600吗/1112药物)没有产生嗜中性粒细胞减少之外的明显影响，嗜中性粒细胞减少比在中等剂量水平更加明显但仍然是可逆的。重要的是，在已知表达MUC16的器官(包括角膜、肺、输印管、和子宫)中没有观察到毒性。在服用TDC的猴中唯一值得注意的组织病理学发现是最低限度至轻度的骨髓髓细胞生成增加和最低限度至轻度的胸腺淋巴消减，这与嗜中性粒细胞降低一致且指示再生应答。这些结果证明了在临床前模型中，thioADC比标准ADC更安全，即使在细胞毒性药物剂量(及等同(ig/m"的基础上比较时。体内活性测定法通过将癌细胞的同种异体移植物或异种移植物植入啮齿类动物中并用ADC处理肺瘤，在体内测量了半胱氨酸改造的抗MUC16抗体-药物偶联物的功效。预期会有各种结果，这取决于细胞系、ADC对癌细胞上存在的受体的抗体结合的特异性、剂量给药方案、和其它因素。使用表达中等水平MUC16的转基因外植体小鼠模型测量ADC的体内功效。将受试者用ADC处理一次并监观'J3-6周以测量肿瘤倍增时间、细胞杀伤对数、和肿瘤缩小。进行跟踪剂量-响应和多剂量实马全。图15和16显示了与标准偶联物相比，半胱氨酸改造的抗MUC16药物偶联物针对移植入雌性SCID小鼠乳房脂肪垫中的OVCAR-3肿瘤细胞的活性。建立肿瘤，并容许其生长至150-200mr^体积(使用测径器测量)，之后在第0天进行单次处理。使用测径器依照公式V(mm3)=0.5AXB^则量肿瘤体积，其中A和B分别是长的和短的直径。在肿瘤体积达到3000mrr^之前或者在肿瘤显示出即将形成溃疡的征候时，对小鼠施以安乐死。自每个实验组(每组IO只小鼠)收集的数据表述为均值+SE。图15显示了6mg/kg剂量的stdhu3A5-VC-MMAE(328mg/m2药物剂量)和thiohu3A5-VC-MMAE(150mg/m2药物剂量)的相当的活性。图16比较了嵌合偶联物，施加1.5、3、和6mg/kg的剂量；半胱氨酸改造的和标准的偶联物在每个剂量水平展现出相当的活性。数据以表的形式总结如下。图15的表PR媒介物(PBS)0stdhu3A5-VC-PAB-MMAE8ThioHu3A5-VC-PAB-MMAE8*stdhu3A5指称作3A5的亲本嵌合抗MUC16抗体，而ThioHu3A5指半胱氨酸改造的嵌合抗MUC163A5抗体。图16的表PRCR媒介物(PBS)00ADC缓冲液00stdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE10stdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE26stdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE46thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE11thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE43thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE37*stdch3A5指称作3A5的亲本嵌合抗MUC16抗体，而thioch3A5指半胱氨酸改造的嵌合抗MUC163A5抗体。在每个IgG剂量水平，针对卯巢癌的移植物异种移植模型，thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE至少像stdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE—才羊有活性，在1.5mg/kg(thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE的MMAE剂量为35pg/m2，而stdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE的MMAE剂量为71[ig/m2)4是供部分功效，而在3mg/kg(69比141j_ig/m2MMAE)和6mg/kg(139比283吗/m2MMAE)近乎完全消除钟瘤。就MMAE剂量而言，thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE的效力大约两倍于stdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE。在任何剂量水平都没有观察到任一偶联物的不利效果。治疗方法CRmg/kg|ig/m2药物/抗体0———063283.5061501.6mg/kgfig/m2药物/抗体1.5713.■1141.162833,.11.5351,.53691,561391586本发明的另一个实施方案致力于治疗性处理具有癌性肿瘤(其包含表达MUC16/CA125/0772P多肽的细胞)的哺乳动物的方法，其中该方法包括对哺乳动物施用治疗有效量的结合MUC16/CA125/0772P多肽的半胱氨酸改造的抗体或其抗体药物偶联物，由此导致对肿瘤的有效治疗性处理。本发明的另一个实施方案致力于治疗或预防与改变的、优选升高的MUC16/CA125/0772P多肽表达或活性有关的细胞增殖性病症的方法，该方法包括对需要此类治疗的受试者施用有效量的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体或其抗体药物偶联物。一种例示性的细胞增殖性病症是癌症。对细胞增殖性病症的优选治疗或预防可以是用半胱氨酸改造的抗MUC16抗体或其抗体药物偶联物直接杀死表达MUC16/CA125/0772P多肽的细胞或抑制表达MUC16/CA125/0772P多肽的细胞生长或拮抗MUC16/CA125/0772P多肽的细胞生长增强活性的结果。本发明的又一个实施方案致力于使半胱氨酸改造的抗MUC16抗体或其抗体药物偶联物结合表达MUC16/CA125/0772P多肽的细胞的方法，其中该方法包括在适合半胱氨酸改造的抗MUC16抗体或其抗体药物偶if关物结合所细胞与所述半胱氨酸改造的抗MUC16抗体或其抗体药物偶联物接触并容许它们之间的结合。在优选的实施方案中，半胱氨酸改造的抗MUC16抗体或其抗体药物偶联物是用对于定性和/或定量测定半胱氨酸改造的抗MUC16抗体或其抗体药物偶联物结合细胞的位置和/或量而言有用的分子或化合物标记的。本发明的其它实施方案致力于半胱氨酸改造的抗MUC16抗体或其抗体药物偶联物在制备药物中的用途，所迷药物可用于(i)癌症或肿瘤的治疗性处理或诊断性检测，或(ii)细胞增殖性病症的治疗性处理或预防。本发明的另一个实施方案致力于抑制癌细胞生长的方法，其中所述癌细CA125/0772P多肽可以由癌细胞自身表达，或者由生成对癌细胞具有生长增强效应的多肽的细胞表达)，其中该方法包括使MUC16/CA125/0772P多肽与半胱氨酸改造的抗MUC16抗体或其抗体药物偶联物接触，由此拮抗MUC16/CA125/0772P多肽的生长增强效应，并继而抑制癌细胞的生长，由此癌细胞的生长得到抑制。87本发明的另一个实施方案致力于治疗性处理哺乳动物中的肿瘤的方法，效应，其中该方法包括对哺乳动物施用治疗有效量的结合MUC16/CA125/0772P多肽的抗MUC16半胱氨酸改造的抗体或其抗体药物偶联物，由此拮抗所述MUC16/CA125/0772P多肽的生长增强效应并导致对肿瘤的有效治疗性处理。抗体、其抗体片段、和其偶联物识别释放入胞外流体中的质膜MUC16蛋白的胞外表位。本发明进一步提供了使用抗体、抗体片段和偶联物检测、监测和治疗恶性肿瘤(诸如乳腺癌或卵巢癌)的方法。本发明的抗体-药物偶联物(ADC)可用于治疗各种疾病或病症，例如特征为MUC16肿瘤抗原过表达的。例示性的疾患或过度增殖性病症包括良性或恶性肿瘤；白血病和淋巴样恶性肿瘤。其它包括神经元的、神经胶质的、星形胶质细胞的、下丘脑的、腺体的、巨噬细胞的、上皮的、基质的、囊胚腔的、炎性的、血管发生性的和免疫学的(包括自身免疫性的)病症。可以在具有肿瘤的高级灵长类和人体临床试验中进一步测试在动物模型和基于细胞的试验中鉴定的ADC化合物。可以设计临床试验以便评价ADC与已知治疗方案的组合的功效，所述的已知治疗方案诸如包括已知化疗剂和/或细胞毒性剂的放疗和/或化疗。一4殳而言，所治疗的疾病或病症为过度增殖性疾病，诸如癌症。癌症的实例包括，但不局限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或'淋巴样恶性肿瘤。更具体地说，这类癌症包括卵巢癌；鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)；肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌；腹膜癌；肝细胞癌；胃癌，包括胃肠癌；胰腺腺癌、成胶质细胞瘤；宫颈癌；肝癌(livercancer);膀胱癌；肝细胞癌(hepatoma);乳腺癌；结肠癌；直肠癌；结直肠癌；子宫内膜癌或子宫癌；唾液腺癌；肾癌；前列腺癌、外阴癌；曱状腺癌；肝癌(hepaticcarcinoma);肚门癌；阴茎癌和头颈部癌。为了预防或治疗疾病，ADC的适当剂量取决于如上述定义的所治疗的疾病类型、疾病的严重程度和时程、给予所述分子是为了预防还是为了治疗目的、先前的治疗、患者的临床病史和对抗体的反应以及主治医师的判定。将所述的分子适当对患者给予一次或在一系列治疗过程中给予。根据疾病类型和严重程度的不同，对患者给药的分子的初始候选剂量约为l(ig/kg-1588mg/kg(例如O.1-20mg/kg)，例如，无论是通过一次或多次分开的给药，还是通过连续输注。典型的每日剂量可以在约lpg/kg-100mg/kg或更大的范围，这取决于上述因素。对患者给予的典型的ADC的剂量在约O.l-约10mg/kg患者体重的范围。为了在几天或几天以上时程中反复给药，根据病情的不同，将治疗持续至对疾病症状的所需抑制发生为止。典型的给药方案包含给予约4mg/kg的起始负荷剂量，随后给予约2mg/kg抗MUC16抗体的每周维持剂量。其它剂量方案也是有用的。该疗法的进展易于通过常规技术和测定法(包括超声成像)监测。抗体-药物偶联物的给药可以通过适合于所治疗疾病的任意途径给予本发明的抗体-药物偶联物(ADC)。一般通过肠胃外途径给予ADC,即输注、皮下、腹膜内、肌肉内、静脉内、真皮内、鞘内和硬膜外。药物配制剂本发明的治疗性抗体-药物偶联物(ADC)通常与药学上可接受的肠胃外媒介物一起配制成单位剂量无菌可注射形式的药物配制剂供肠胃外施用，即快速灌注(bolus)、静脉内注射、肿瘤内注射。任选将具有所需纯度的抗体-药物偶联物(ADC)与药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂或稳定剂混合(Remington'sPharmaceuticalSciences(1980)16thedition,Osol,A.Ed.)成冻干剂型或水溶液形式。可接受的稀释剂、载体、赋形剂和稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，并且包括緩沖剂，诸如磷酸盐、拧檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和曱硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二曱基苄基铵；氯己双铵；苯扎氯铵、千索氯铵；苯、丁醇或千醇；对羟基苯曱酸烷基酯，诸如对羟基笨曱酸曱酯或对羟基苯曱酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间曱酚)；低分子量(低于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖类、二糖类和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA;糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN1^、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。活性药物成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶嚢中(例如分别是羟曱基纤维素或明胶微胶嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯)微胶嚢)、在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶嚢)、或在粗滴乳状液中。此类技术7>开于Remington'sPharmaceuticalSciences,16thedition,Osol,A.Ed.(1980)。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有ADC的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-曱基丙烯酸酉旨)或聚(乙烯醇))、聚交酯(US3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸y-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D—(—)_3—羟基丁酸。制剂包括某些适合于上述给药途径的制剂。可以便利地将制剂制成单位剂型(unitdosageform)并且可以通过制药领域众所周知的任意方法制备。药物制备的各种才支术和圉己制一4殳在iem/"gto"SP/7arwace""ca/5We"c&s(MackPublishingCo.,Easton，PA)中找到。这类方法包括使活性组分与构成一种或多种辅助组分的载体混合的步骤。一般而言，通过均匀和紧密混合活性组分与液体载体或细粉固体载体或它们两者，且然后，如果必要，使产物成形来制备产品。本发明的含水混悬液含有活性物质与适合于制备含水混悬液的赋形剂的混合。这类赋形剂包括悬浮剂，诸如羧曱基纤维素钠、交联羧甲纤维素、聚維酮、曱基纤维素、羟丙基曱基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯胶；和分散剂或湿润剂，诸如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)、烯化氧与脂肪酸(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)的缩合产物、环氧乙烷与长链脂族醇(例如十七碳乙烯氧基鯨蜡醇)的缩合产物、环氧乙烷与来源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)。含水混悬液还可以含有一种或多种防腐剂，诸如对羟基苯曱酸乙酯或对羟基苯曱酸丙酯；一种或多种着色剂；一种或多种矫味剂；和一种或多种增甜剂，诸如蔗ADC的药物组合物可以为无菌可注射制剂形式，诸如无菌可注射含水或油混悬液。可以按照本领域公知的方法，使用上述那些合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制混悬液。无菌可注射制剂还可以为在无毒性非肠道可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬液，诸如在1,3-丁-二醇中的溶液或制备成冻干纷。在可以使用的可接受的媒介物和溶剂中有水、林格液和等渗氯化钠溶液。此外，可以便利地将无菌非挥发油(fixedoil)用作溶剂或悬浮介质。为了这一目的，可以使用任意温和的固定油(blandfixedoil),包括合成的单酸甘油酯或二脂酰甘油酯类。此外，诸如油酸这类脂肪酸同样可以用于制备可注射制剂。可以与载体物质合并而产生单剂型(singledosageform)的活性组分的量将根据所治疗宿主和特定给药方式的不同而改变。例如，指定用于静脉内输注的水溶液可以含有约3-500吗的活性组分/毫升溶液，以便可以以约30mL/'J、时的速率输注适当的体积。适合于非肠道给药的制剂包括含水和非水无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、緩冲剂、抑菌剂和赋予制剂与接受者的血液等渗的溶质；和含水和非水无菌混悬液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。尽管因在肠中水解或变性而不赞成使用蛋白质治疗剂的口服给药，但是可以将适合于口服给药的ADC制剂制备成分散单位，诸如含有预定量ADC的胶嚢、扁嚢剂或片剂。可以将制剂包装在单剂或多剂容器内，例如密封的安瓿和小瓶内，并且可以将其在冷冻干燥(冻干)条件下贮存，在使用前仅需要即刻添加无菌液体载体，例如水以便注射。由上述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备临时注射的溶液和混悬液。优选的单位剂型为那些含有如上所述每日剂量或单位每曰亚剂量或其合适的部分的活性组分的剂型。本发明的组合物还可配制成脂质体；即由各种类型脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的，可用于对哺乳动物递送药物的小嚢泡。与生物膜的脂质排列相似，脂质体的成分通常排列成双层形式。含有抗体的脂质体可通过本领域已知方法来制备，诸如Epstein等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688;Hwang等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4030;美国专利No.4,485,045;4,544,545;5，013，556;WO97/38731中所迷。可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和91与脂质体偶联(Martin等(1982)J.Biol.Chem.257:286-288)。任选在脂质体中包含化疗剂(Gabizon等(1989)J.NationalCancerInst.81(19):1484)。联合疗法可以将本发明的抗体-药物偶联物(ADC)与第二种具有抗癌特性的化合物在药物组合配制剂中联合或作为联合疗法以给药方案联合。所述药物组合配制剂或给药方案中的第二种化合物优选具有对组合中的ADC的补充活性，使得它们彼此不会产生不利影响。所述第二种化合物可以为化疗剂、细胞毒剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂和/或心脏保护剂。此类分子以对指定目的有效的量适当地联合存在。含有本发明ADC的药物组合物还可以具有治疗有效量的化疗剂，诸如微管蛋白形成抑制剂、拓朴异构酶抑制剂、DNA插入剂、或DNA结合剂。可以将其它治疗方案与依照本发明所鉴定的抗癌药施用联合。联合疗法可以作为同时或序贯方案施用。当序贯施用时，可以以两次或更多次施用来施用所述组合。联合施用包括使用分开的配制剂或单一药物配制剂的共施用，和任意次序的序贯施用，其中优选有一段时间所有活性剂同时发挥其生物学活性。在一个实施方案中，使用ADC的治疗牵涉联合施用半胱氨酸改造的抗MUC16抗体或其抗体-药物偶联物和一种或多种化疗剂、治疗性生物制品、或生长抑制剂，包括共施用不同化疗剂鸡尾酒样混合物。化疗剂包括但不限于紫杉烷类(诸如帕利他赛(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel)(TAXOTERE⑧))、含铂化合物(诸如卡铂)、EGFR抑制剂(诸如erlotinib和gefitinib)、酪氨酸激酶抑制剂(诸如imatinib)、和蒽环类抗生素(诸如多柔比星或doxil)。要与半胱氨酸改造的抗MUC16抗体或其抗体-药物偶联物组合4吏用的治疗性生物制品药剂包括bevacizumab(Avastin⑧)或pertuzumab(Omnitarg,GenentechInc)。熟练从业人员可以按照制造商的说明书或凭经验确定地使用此类化疗剂的制备和剂量给药方案。此类化疗剂的制备和剂量给药方案还记载于"ChemotherapyService",(1992)M.C.Perry编，Williams&Wilkins,Baltimore,Md。可以将ADC与如下抗激素化合物联用；例如抗雌激素化合物，诸如他莫昔芬(tamoxifen);抗孕酮药，诸如奥那司酮(onapristone)(EP616812);或抗雄激素药，诸如氟他胺(flutamide),使用的剂量为这类分子的已知剂量。如果所治疗的癌症为激素非依赖性的癌症时，患者可能预先进行过抗激素疗法，并且在癌症变成激素非依赖性后，可以对患者给予ADC(和任选本文所述的其它活性剂)。有益的是还对患者共同给予心脏保护剂(以便预防或减轻与所述疗法相关的心肌机能障碍)或一种或多种细胞因子。除上述治疗方案外，还可以对患者进行癌细胞的手术除去细胞和/或放疗的治疗。任何上述共施用的药剂的合适剂量就是那些当前使用的剂量，而且可以由于新鉴定的药剂和其它化疗剂或治疗的联合作用(协同作用)而降低。联合疗法可以提供"协同作用"并且证实是"协同性，，的，即当一起使当活性组分为如下情况时可以获得协同效应(1)共同配制和施用或在合并的单位剂量配制剂中同时投递；(2)作为分开的配制剂交替或平行投递；或(3)通过一些其它方案。当在交替疗法中投递时，在序贯施用或投递所述化合物时，例如通过不同注射器中的不同注射，可以获得协同效应。一般而言，在交替疗法中，序贯地，即依序地施用每种活性组分的有效剂量，而在联合疗法中，一起施用两种或更多活性组分的有效剂量。抗体-药物偶联物的代谢物此类产物相对于现有技术是新颖的且非显而易见的而言。此类产物可源自例如所施用化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、酯化、酶^3刀割、诸如此类。因而，本发明包括由如下方法生成的新颖的且非显而易见的化合物，所述方法包括使本发明的化合物接触哺乳动物一段时间，该时间足以产生本发明化合物的代谢产物。代谢产物典型地是如下制备的，即制备放射性标记的(例如"C或SH)ADC，以可检测剂量(例如大于大约0.5mg/kg)将其胃肠外施用于哺乳动物，诸如大鼠、小鼠、豚鼠、猴或人，容许足够时间让代谢发生(典型的是大约30秒至30小时)，并自尿液、血液或其它生物学样品分离它的转化产物。这93些产物是易于分离的，因为它们是带标记物的(其它的通过使用能够结合代谢物中幸存的结合表位的抗体来分离)。代谢物结构以常规方式来测定，例如通过MS、LC/MS或NMR分析。一般而言，代谢物的分析是以与本领域4支术人员公知的常规药物代谢研究相同的方式进行的。转化产物在用于本发明ADC化合物的治疗性剂量给药的诊断测定法中是有用的，只要没有在体内在其它情况中找到它们。制品在本发明的另一个实施方案中，提供了含有用于治疗上述病症的物质的制品或"试剂盒'，。所述的制品包含容器和在容器上或与其相连的标签或包装说明书。包装插页可以指通常包括在治疗用产品商品化包装中的说明书，它包含有关此类治疗用产品使用的适应症、用法、剂量、施用、禁忌和/或警告信息。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、泡罩包等，容器可以由各种材料，诸如玻璃或塑料形成。在一个实施方案中，制品包括容器和装在该容器内的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体或其抗体-药物偶联物的配制剂。所述制品可进一步任选地包含贴在容器上的标签或包括在容器内的包装插页，其指出所述组合物用于肺瘤的治疗性处理或诊断性检测的用途。装有配制剂的容器有效存储和投递治疗剂，而且可以容纳有效治疗疾病的抗体-药物偶:f关物(ADC)组合物并且可以具有无菌存取口(例如容器可以为静脉用溶液袋或具有可刺入皮下注射针头的塞的小瓶)。标签或包装说明书表示配制剂用于治疗选择的疾病，诸如癌症。或者或另外，所述制品可以进一步含有第二(或第三)容器，该容器包含药学上可接受的緩冲剂，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸緩沖盐水、林格液和葡萄糖溶液。它可以进一步包括从商业和使用者角度而言需要的其它物质，包括其它緩冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。提供以下实施例仅用于例示目的，而非意图以任何方式限制本发明的范围。通过述及将本说明书中引用的所有专利和参考文献完整收入本文。实施例除非另有说明，实施例中提及的商品化试剂依照制造商的说明书使用。下文实施例和整篇说明书中以ATCC编号所鉴别的那些细胞的来源是美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Manassas,VA)。实施例l:抗MUC163A5抗体的制备人源化和嵌合3A5抗Muc163A5抗体(图3和4)是依照WO2007/001851制备的，通过述及收录其序列和抗体。轻链氨基酸是依照Kabat(Kabatetal"S叫uencesofproteinsofimmunologicalinterest,(1991)5thEd.,USDeptofHealthandHumanService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD)编号的。重链氨基酸是依照Eu编号系统(Edelmanetal(1969)Proc.Natl.AcadofSciences63(1):78-85)编号的，除了注释为Kabat系统的地方。使用单字母氨基酸缩写。表达并纯化人源化(thiohu)和嵌合(thioch)半胱氨酸改造的抗MUC163A5单克隆抗体(为A117C变体)，包括两个实施方案。thiohu抗MUC16HCA117C3A5:MW=144834.84;pl=8.28;pi(氧化的C)二8.79;长度=1320;消光系数(280)=1.61。重链446aa;MW:48952.23,pl:8.55,pl(氧化的c):9.12,消光系数(280):1.70;潜在信号序列(MGWSCIILFLVATATGVHS)在计算前裁剪掉。长度=19;DNA起始位置987,DNA纟冬止位置2324,图l,SEQIDNO:l。轻链214aa;MW:23483.20,pl:6.71,pl(氧化的c):6.72,消光系数(280):1.43;潜在信号序列(MGWSCIILFLVATATGVHS)在计算前裁剪掉。长度=19;DNA起始位置7103,DNA终止位置7744，图l，SEQIDNO:2。thioch抗MUC16HCA117C:MW二145118.9;pl=7.99;pI(氧化的C)二8.44;长度=1320;消光系数(280)=1.59。重链446aa;MW:49236.50,pl:8.29，pl(氧化的c):8.85，消光系数(280):1.66;潜在信号序列(MGWSCIILFLVATATGAYA)在计算前裁剪掉。长度=19;DNA起始位置987，DNA会冬止位置2324,图2,SEQIDNO:3。轻《连214aa;MW:23340.96,pl:6.71,pl(氧化的c):6.72，消光系数(280):1.44;潜在信号序列(MGWSCIILFLVATATGVHS)在计算前裁剪掉。长度=19;DNA起始位置7103,DNA终止位置7744,图2，SEQIDNO:4。实施例2:半胱氨酸改造的抗MUC16抗体的制备，供通过还原和再氧化进行的偶联用由于细胞培养条件，在CHO细胞中表达的全长半胱氨酸改造的抗MUC16单克隆抗体(ThioMab)在改造的半胱氨酸上携带半胱氨酸加合物(胱氨酸)或谷胱甘酰化(glutathionylated)。为了解放改造的半胱氨酸的反应性硫醇基团，将ThioMab溶解在约pH8.0的500mM硼酸钠和500mM氯化钠中并用约50-100倍过量的lmMTCEP(盐酸三(2-羧乙基)膦；Getzetal(1999)Anal.Biochem.Vol273:73-80;SoltecVentures,Beverly,MA)于37。C还原约l-2小时。或者，可使用DTT作为还原剂。通过非还原SDS-PAGE或通过变性反相HPLCPLRP柱层析监测链间二碌"建的形成。将还原的ThioMab(图6a)稀释并加载到10mM乙酸钠pH5中的HiTrapS柱上，并用含0.3M氯化钠的PBS洗脱。将洗脱的还原的ThioMab用pH7的2mM脱氢抗坏血酸(dhAA)处理3小时，或用2mM硫酸铜(CuS04)水溶液于室温处理过夜。环境空气氧化也可以是有效的。通过SephadexG25树脂上的洗脱来更换緩冲液，并用含lmMDTPA的PBS洗脱。根据溶液在280nm的吸光度来测定还原的抗体浓度，通过与DTNB(Aldrich,Milwaukee,Wl)反应并测定412nm的吸光度来测定硫醇浓度，由此检查硫醇/抗体值。标准3A5抗体的三种主要糖型的理论质量为147407，147568和147731Da。标准3A5抗体的解巻积质谱中的观察质量为147410，14乃69和147734Da.,与预期的理论质量极好地吻合。thio3A5抗体的三种主要糖型的理论质量为147469,147631和147793Da。thio-3A5抗体在解巻积质谱中的观察质量(异质的且溶解不佳的)为大约147774,147904和148061。异质性是由于在两个新引入的半胱氨酸上存在加帽基团(通常是半胱氨酸或谷胱甘肽)的混合物。在具有延伸的质量范围的TSQ量子三联四极质语仪(ThermoElectron,SanJoseCalifornia)上实施了液相层析/质谱分析。将样品在加热至75。C的PRLP-S，1000A,微孔柱(50mmx2.1mm,PolymerLaboratories,Shropshire,UK)上层析。使用30-40。/oB的线性梯度(溶剂A:含0.05。/。TFA的水，溶剂B:含0.04%TFA的乙腈)，并使用电喷射源直接将洗脱液离子化。通过Xcalibur数据系统收集数据，并使用ProMass(Novatia，LLC,NewJersey)实施解巻积。在LC/MS分析前，抗体或药物偶联物(50吗)用PNGaseF(2U/ml;PROzyme,SanLeandro,CA)于37。C处理2小时以除去N-连接的碳水化合物。96将疏水相互作用层析(HIC)样品注射到ButylHICNPR柱(2.5pm,4.6mmx3.5cm)(TosohBioscience)上，并用0至70%B的线性梯度以0,8ml/min洗脱(A:含1.5M硫酸铵的50mM磷酸钾pH7，B:50mM磷酸钾pH7，20%异丙醇)。使用配备有多波长检测仪和Chemstation软件的Agilent1100系列HPLC系统来解析和定量具有不同药物/抗体比率的抗体种类。实施例3:半胱氨酸改造的抗MUC16抗体与药物4头中间体的偶联在实施例2的还原和再氧化规程后，将半胱氨酸改造的抗MUC16抗体溶解在PBS(磷酸盐緩冲盐水)緩沖液中，并在冰上冷却。将相对于每个抗体的改造的半胱氨酸约1.5个摩尔当量的带有硫醇反应性官能团(诸如马来酰亚胺基)的auristatin药物接头中间体(诸如MC-MMAE(马来酰亚胺己酰基-单曱基auristatinE)、MC-MMAF、MC-val-cit-PAB-MMAE、或MC-va-cit-PAB-MMAF)溶解在DMSO中，在乙腈和水中稀释，并添加至冷却的PBS中的还原的、再氧化的抗体。约一小时后，添加过量的马来酰亚胺以淬灭反应并给任何未反应的抗体石克醇基团加帽。通过离心超滤浓缩反应混合物，并将半胱氨酸改造的抗MUC16抗体药物偶联物通过穿过PBS中G25树脂的洗脱来纯化和脱盐，在无菌条件下穿过0.2pm滤器过滤，并冷冻储存。通过上述规程，制备了以下半胱氨酸改造的抗MUC16抗体药物偶联物thiohu3A5-MC-MMAF，通过偶联A117Cthiohu3A5与MC-MMAF;thiohu3A5-MC-val-cit-PAB-MMAE,通过偶联A117Cthiohu3A5与MC-val-cit-PAB-MMAE;thioch3A5-MC-MMAF,通过偶联A117Cthioch3A5与MC-MMAF;和thioch3A5-MC-val-cit-PAB-MMAE,通过偶联A117Cthioch3A5与MC-val-cit-PAB-MMAE。实施例4:体外细胞增殖测定法通过细胞增殖试验测定抗体-药物偶联物的体外功效(附图10和11)。CellTiter-GloLuminescentCellViabilityAssay为商购的(PromegaCorp,,Madison,WI)基于鞘翅目(Co/eopfera)荧光素酶的重组表达的同质性试验方法(homogeneousassaymethod)(US5583024;US5674713;US5700670)。该细胞增殖试验基于对存在的ATP进行定量测定了培养物中存活细胞的数量，其97中存在的ATP为代谢活性细胞的指示剂(Crouch等(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88;US6602677)。在96孔板中进行CellTiter-Gk)⑧Assay,使得它易于进行自动化高流通量筛选(HTS)(Cree等(1995)AnticancerDrugs6:398-404)。同质性试验操作步骤包括将单一试剂(CellTiter-GloReagent)直接加入到在血清补充的培养基中培养的细胞中。同质性"添加-混合-测定"方式导致细胞裂解并且产生与存在的ATP量成比例的发光信号。底物曱虫荧光素被重组焚火虫荧光素酶氧化脱羧化，而同时ATP转化成AMP并且产生光子。以相对发光单位(RLU)反映出存活细胞。通过发光计或CCD照相机成像装置记录数据。将发光输出表示为在一段时间内测定的RLU。或者，可以在有闪烁剂存在下在闪烁计数器中对来自发光的光子进行计数。然后可以将光单位表示为CPS-每秒计数。通过使用下列方案的细胞增殖试验测定ADC功效(改编自CellTiterGloLuminescentCellViabilityAssay,PromegaCorp.TechnicalBulletinTB288及Mendoza等(2002)CancerRes.62:5485-5488):1.使在培养基中含有约1000个(PC3)或3000个(OVCAR-3)细胞的50lal细胞培养物等份沉积在96孔不透明壁的平板的各孔中，所述细胞为(1)表达MUC16多肽的细胞系OVCAR-3;(2)改造成在其细胞表面上稳定表达MUC16多肽的PC3衍生的细胞系(PC3/MUC16);和(3)不表达MUC16多肽的PC3细胞系(PC3/neo)。2.将ADC(50ml)添加至一式三份的实验孔至终浓度9000、3000、1000、333、111、37、12.4、4.1、或1.4ng/ml,"无ADC"对照孔只接受培养基，并温育3天(PC3)或5天(OVCAR-3)。3.使平板平衡至室温约30分钟。4.添加CellTiter-Glo试剂(100ml)。5.将内含物在定轨振荡器上混合2分钟以便诱导细胞裂解。6.将平板于室温温育10分钟以便稳定发光信号。7.记录发光并作为RLU=相对发光单位在图中报告。来自与不含ADC的培养基一起温育的细胞的数据于0.46ng/ml绘图。培养基PC3/neo和PC3/MUC16生长在DMEM+Ham氏F012/10。/。FBS/谷氨酰胺/250pg/mLG-418中，OVCAR-3生长在RPMI/2()o/。FBS/谷氨酰胺中。实施例5:药动学-血清清除和稳定性通过单个静脉内推注剂量注射入Sprague-Dawley大鼠后测量抗体或药物偶联物的血清浓度，分析了抗MUC16抗体-药物偶联物的体内部署。携带至少一个细胞毒性药物的抗体-药物偶联物的浓度以ELISA测量，其使用MUC16胞外结构域(ECD)蛋白进行捕捉及使用抗MMAE和辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗小鼠Fc抗体进行检测。血清中的总Ch3A5和ThioCh3A5浓度以ELISA测量，其使用MUC16ECD进行捕捉及使用抗人FcHRP进行^r测。此测定法测量任何抗MUC16抗体，有和无偶联的MMAE均可。这些测定法具有定量下限0.78ng/mL,最低稀释度1:10。这些测定法具有定量下限0.78ng/mL,最低稀释度1:10。使用具有IV推注输入、一阶消除、和宏观速率常数的两隔室模型(Model8,WinNonlinProv.5.0.1,PharsightCorporation,MountainView,CA)分析了来自每只动物的血清浓度时间数据。CL(mL/天/kg)T〃2卩(天)ADC总抗体16.1±3.510.3±2,1药物偶联的抗体41.6士4.86.0±0.9TDC总"元体9.5±2.97.9±2.1药物偶联的抗体14.1±3.05.5±1.0实施例6:动物毒性通过在第l天单次注射标准ch3A5-VC-MMAE(24.19mg/kg=1934mg/m2),thioch3A5-VC-MMAE(49.99mg/kg=1934mg/m2)，和对照媒介物，在青年雌性大鼠(100-125g)中进行了12天急性毒性研究。测试项目的注射采取静脉内推注的形式。每天测量体重。在第5天和第12天进行临床化学、血清酶和血液学分析。毒性信号包括体重減轻的临床观察。降低猕猴中的嗜中性粒细胞计数要求较高剂量的thioADC。在两项分开的研究中，在第1天和第22天给雌性中国猕猴服用标准人源化抗MUC16ADC(5.9mg/kgIgG=1200pg/m2MMAE);thioADC(12.8mg/kgIgG=1200pg/m2MMAE);thioADC(25.6mg/kgIgG=2400ng/m2MMAE);或thioADC(38.4mg/kgIgG=3600吗/m2MMAE)。在第8天、第22天、第32天、和第43天为血液学和血清化学采集血液(第22天的值来自第二剂之前)。将平均循环嗜中性粒细胞计数相对于来自在同一研究的给定时间点用媒介物处理的大约一周，接着在三周内恢复至正常水平。实施例7:肿瘤生长抑制，体内功效小鼠模型使用雌性C.B-17SCID米色小鼠(CharlesRiverLaboratories)实施了功效研究。所有研究依照实验动物护理和使用指南(GuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals)(InstituteofLaboratoryAnimalResources,"GuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals",(NIHPublication#85-23).Washington(DC):NationalAcademyPress;1996)进行。采用Chenetal.(2007)CancerRes67:4924-4932中记载的OVCAR-3乳房脂肪垫移植物功效4莫型，评估单次静脉内给药后的肿瘤体积。OVCAR-3乳房脂肪垫移植物模型是如下建立的，自携带腹膜内肿瘤的小鼠切出肿瘤，然后连续传代入接受者小鼠的乳房脂肪垫中。当肿瘤达到约150-200mn^的体积时，将小鼠分成五组，每组十只，并如所述的那样服药。使用测径器依照公式V(mm3)=0.5AX82测量肿瘤体积，其中A和B分别是长的和短的直径。在胂瘤体积达到3000mn^之前或者在肿瘤显示出即将形成溃病的征候时，对小鼠施以安乐死。自每个实验组收集的数据表述为均值+SE。为了测试半胱氨酸改造的抗MUC16抗体药物偶联物的体内功效，将2x1(f个OVCAR-3细胞每只SCID小鼠(共110只小鼠)一次接种入乳房脂肪垫中，并容许在注射后生长14-21天。当肿瘤体积达到150-200mn^时(通常是接种后第14天至第21天)，将小鼠分成8个不同的组，每组9-10只小鼠，并测定每种小鼠中的肿瘤体积，如下组样品剂量A媒介物(PBS)BADC緩冲液Cstdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE1.5mg/kgDstdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE3.0mg/kgEstdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE6.0mg/kgFthioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE1.5mg/kgGthioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE3.0mg/kgHthioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE6.0mg/kg实施例8:流式细胞术或体外研究将OVCAR-3细胞(每份样品30，000个细胞)与人源化标准或thio抗MUC16MAb—起在1mL总体积中在冰上温育75分钟。抗体以PBS+1%FBS+2mMEDTA中25，50,100,200,和400ng/mL应用。此温育后，清洗细胞，然后与藻红蛋白标记的山羊抗人Fc二抗一起温育(水上一'卜时)。然后清洗细胞，并通过流式细胞术分析。3x1(^个OVCAR-3细胞表达大约lx101()个供抗MUC16抗体3A5结合的位点。即使是最低的测试抗体浓度(25ng或大约lx10"个抗体)也提供相对于结合位点摩尔过量的抗体。因此，结合得到降低(通过流式细胞术来检测)的浓度反映了抗体对MUC16的亲和力。使用常规规程，通过表面等离振子共振和通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定了抗MUC16变体的结合亲和力。权利要求1.一种半胱氨酸改造的抗MUC16抗体，其结合MUC16多肽且包含一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸和选自SEQIDNO9-40的序列。2.权利要求1的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体，其是通过包括用半胱氨酸替换亲本抗MUC16抗体的一个或多个氨基酸残基的过程制备的。3.权利要求1的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体，其中所述一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸残基位于轻链中。4.权利要求3的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体，其包含选自下组的一种或多种序列EVQLCESGGGLRLSCCASGYS固SLRCEDTAVTLVTVCSASTKVTVSSCSTKGPVSAASCKGPSVWYVDGCEVHNAKGFVPCDIAVEPPVLDCGDSFFSEQIDNO:9SEQIDNO:10SEQIDNO:11SEQIDNO:12SEQIDNO:13SEQIDNO:14SEQIDNO:15SEQIDNO:16SEQIDNO:17。5.权利要求3的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体:多种序列DVQLCESGPGLSLTCCVTGYSLNSVTCEDTATTLVTVCSASTKVTVSSCSTKGPVSAASCKGPSVWYVDGCEVHNAKGFVPCDIAVEPPVLDCDGSFFSEQIDNO:18SEQIDNO:19SEQIDNO:20SEQIDNO:21SEQIDNO:22SEQIDNO:23SEQIDNO:24SEQIDNO:25SEQIDNO:26其包含选自下组的一种或6.权利要求1的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体，其中所述一个或多个游离SLSASCGDRVTEIKRTCAAPSVTVAAPCVFIFPFIFPPCDEQLKDEQLKCGTASVVTEQDCKDSTYGLSSPCTKSFN的半胱氨酸氨基酸残基位于重链中。7.权利要求6的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体，其包含选自下组的一种或多种序列SEQIDNO:27SEQIDNO:28SEQIDNO:29SEQIDNO:30SEQIDNO:31SEQIDNO:32SEQIDNO:338权利要求6的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体，其包含选自下组的一种或多种序列FLSVSCGGRVTSEQIDNO:34SEQIDNO:35SEQIDNO:36SEQIDNO:37SEQIDNO:38SEQIDNO:39SEQIDNO:409.权利要求1的半胱氨酸改造的人抗MUC16抗体，其包含重链序列，该重链序列包含EIKRTCAAPSVTVAAPCVFIFPFIFPPCDEQLKDEQLKCGTASVVTEQDCKDSTYGLSSPCTKSFNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQIDNO:l10.权利要求1的半胱氨酸改造的人抗MUC16抗体，其包含轻链序列，该轻链序列包含VYACEVTHQGLSSPVTKSF做GECSEQIDNO:211.权利要求1的半胱氨酸改造的嵌合抗MUC16抗体，其包含重链序列，该重链序列包含VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQIDNO:312.权利要求1的半胱氨酸改造的嵌合抗MUC16抗体，其包含轻链序列，该轻链序列包含VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSEQIDNO:413.权利要求1的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体，其中所述亲本抗MUC16抗体选自单克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、人抗体、和人源化抗体。14.权利要求1的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体，其是Fab片段。15.权利要求1的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体，其是在细菌中生成的。16.权利要求1的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体，其是在CHO细胞中生成的。17.—种测定怀疑含有MUC16蛋白的样品中测定所述蛋白质的存在的方法，所述方法包括以下步骤将所述样品暴露于具有一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸和选自SEQIDNO:9-40的序列的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体；并测定所述抗体对所述样品中所述MUC16蛋白的结合，其中所述抗体对所述蛋白质的结合指示所述样品中存在所述蛋白质。18.权利要求17的方法，其中所述细胞是卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、或胰腺癌细胞。19.权利要求17的方法，其中所述抗体是共价附着至选自下组的标记物的荧光染料、放射性同位素、生物素、或金属络合配体。20.权利要求1的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体，其中所述抗体是共价附着至auristatin药物模块的，由此抗体-药物偶联物得以形成。21.—种药物配制剂，其包含结合MUC16多肽且包含一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸和选自SEQIDNO:9-40的序列的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体及药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂。22.—种抗体-药物偶联物，其包含结合MUC16多肽且包含一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸、选自SEQIDNO:9-40的序列、和auristatin药物模块(D)的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体(Ab)，其中所述半胱氨酸改造的抗MUC16抗体是经由一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸通过接头模块(L)附着至D的；所述化合物具有式I:Ab-(L-D)pI其中p为l、2、3、或4。23.权利要求22的抗体-药物偶联物化合物，其中p为2。24.权利要求22的抗体-药物偶联物化合物，其中L具有式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中A为延伸物单元，其共价附着至所述半胱氨酸改造的抗体(Ab)的半胱氨酸石克醇；a为0或l;每个W独立地为氨基酸单元；w为范围为0-12的整数；Y为间隔物单元，其共价附着至所述药物;溪块；且y为O、l或2。25.权利要求24的抗体-药物偶联物化合物，其具有式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中PAB为对-氨基千基氨甲酰基，且R口为选自下组的二价基(CH2)r，C3-Cs碳环基，O-(CH2)r，亚芳基，(CH2》-亚芳基，-亚芳基-(CH2)「，(CH2)r-(C3-C8碳环基)，(C3-C8碳环基)-(CH2)r，C3-C8杂环基，(CH2)「(C3-C8杂环基)，-(C3-C8杂环基)—(CH2)r-,—(CH2)rC(0)NRb(CH2)r-,—(CH2CH20)r—，-(CH2CH20)r—CH2-,-(CH2)rC(0)NRb(CH2CH20)r-，-(CH2)rC(0)NRb(CH2CH20)r-CH2-,-(CH2CH20)rC(0)NRb(CH2CH20)r-,-(CH2CH20)rC(0)NRb(CH2CH20)r-CH2-，和—(CH2CH20)rC(0)NRb(CH2)r—;其中Rb为H,C广匸6烃基，苯基，或苄基;且r独立地为范围为l-10的整数。26.权利要求24的抗体-药物偶联物化合物，其中Ww为缬氨酸-瓜氨酸。27.权利要求24的抗体-药物偶联物化合物,其中R"为(CH2)5或(CH2)2。28.权利要求24的抗体-药物偶联物化合物，其具有式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>29.权利要求28的抗体-药物偶联物化合物，其中R"为(CH2)5或(CH2):30.权利要求24的抗体-药物偶联物化合物，其具有式Ab一S'OOAdo0人NH231.权利要求22的抗体药物偶联物，其中L为MC-val-cit-PAB或MC。32.权利要求22的抗体-药物偶联物化合物，其中L为由接头试剂SMCC、BM(PEO)2或BM(PEO)3形成的接头。33.权利要求22的抗体-药物偶联物化合物，其中D为MMAE,其具有结构:其中波形线指示所述接头L的附着位点。34.权利要求22的抗体-药物偶联物化合物，其中D为MMAF，其具有结构:其中波形线指示所述接头L的附着位点。35.权利要求22的抗体-药物偶联物化合物，其中所述半胱氨酸改造的抗MUC16抗体选自单克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、人抗体、和人源化抗体。36.权利要求22的抗体-药物偶联物化合物，其中所述半胱氨酸改造的抗MUC16抗体是Fab片段。37.—种抗体-药物偶联物化合物，其选自结构Ab—S■0OOVal-Ci卜NHAb-MC-vc-PAB-MMAFAb-MC-vc隱PAB-MMAEAb-MC-MMAF其中Val为缬氨酸；Cit为瓜氨酸；p为l、2、3、或4;且Ab为结合MUC16多肽且包含一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸和选自SEQIDNO:9-40的序列的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体。38.权利要求37的抗体药物偶联物，其中Ab包含SEQIDNO:l。39.权利要求37的抗体药物偶联物，其中Ab包含SEQIDNO:2。40.权利要求37的抗体药物偶联物，其中Ab包含SEQIDNO:3。41.权利要求37的抗体药物偶联物，其中Ab包含SEQIDNO:4。42.权利要求37的抗体药物偶联物，其中Ab包含SEQIDNO:l和SEQIDNO:2。43.权利要求42的抗体药物偶联物，其中Ab包含SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。44.一种抗体-药物偶联物化合物的混合物，所述抗体-药物偶联物化合物包含结合MUC16多肽且包含一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸、选自SEQIDNO:9-40的序列、和auristatin药物模块(D)的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体(Ab)，其中所述半胱氨酸改造的抗MUC16抗体是经由一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸通过接头模块(L)附着至D的；所述化合物具有式I:Ab-(L-D)pI其中p为l、2、3、或4,且平均药物载荷为l-2。45.—种包含抗体-药物偶联物及药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物配制剂，所述抗体-药物偶联物包含结合MUC16多肽且包含一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸和选自SEQIDNO:9-40的序列的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体，且其中所述半胱氨酸改造的抗MUC16抗体是共价附着至auristatin药物模块的。46.权利要求45的药物配制剂，其进一步包含治疗有效量的选自下组的化疗齐寸来曲唑、奥沙利辆、多西他塞、5-FU、lapatinib、卡培他滨、亚叶酸、erlotinib、pertuzumab、贝4戈单抗、和吉西他滨。47.—种治疗癌症的方法，包括给患者施用包含抗体-药物偶联物及药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物配制剂，所述抗体-药物偶联物包含结合MUC16多肽且具有一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸和选自SEQIDNO:9-40的序列的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体，且其中所述半胱氨酸改造的抗MUC16抗体是共价附着至auristatin药物模块的。48.权利要求47的方法，其中所述癌症选自下组卵巢癌、前列腺癌、尿道癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、和结肠癌。49.权利要求47的方法，其中给所述患者施用与所述抗体-药物偶联物化合物组合的化疗剂，其中所述化疗剂选自下组来曲唑、顺铂、卡铂、紫杉醇、帕利他塞、奥沙利铂、多西他塞、5-FU、亚叶酸、erlotinib、pertuzumab、贝伐单抗、lapatinib、和吉西他滨。50.—种制品，其包括包含抗体-药物偶联物及药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物配制剂，所述抗体-药物偶if关物包含结合MUC16多肽且具有一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸和选自SEQIDNO:9-40的序列的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体，且其中所述半胱氨酸改造的抗MUC16抗体是共价附着至auristatin药物才莫块的；答器；和包装插页或标签，其指明所述化合物可用于治疗以MUC16多肽过表达为特征的癌症。51.权利要求50的制品，其中所述癌症是卵巢癌、前列腺癌、尿道癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、或结肠癌。52.—种制备抗体药物偶联物化合物的方法，所述抗体药物偶联物化合物包含结合MUC16多肽且具有一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸和选自SEQIDNO:9-40的序列的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体(Ab)和auristatin药物模块(D)，其中所述半胱氨酸改造的抗体是经由一个或多个改造的半胱氨酸氨基酸通过接头模块(L)附着至D的；所述化合物具有式r.Ab-(L画D)pI其中p为l、2、3、或4;所述方法包括以下步骤(a)使所述半胱氨酸改造的抗体的改造的半胱氨酸基团与接头试剂反应以形成抗体-接头中间体Ab-L;并(b)使Ab-L与活化的药物模块D反应；由此所述抗体-药物偶联物化合物得以形成；或者包括以下步骤(c)使药物模块的亲核基团与接头试剂反应以形成药物-接头中间体D-L;并(d)使D-L与所述半胱氨酸改造的抗体的改造的半胱氨酸基团反应；由此所述抗体-药物偶联物化合物得以形成。53.权利要求52的方法，其进一步包括在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达所述半胱氨酸改造的抗体的步骤。54.权利要求53的方法，其进一步包括用还原剂处理所表达的半胱氨酸改造的抗体的步骤。55.权利要求54的方法，其中所述还原剂选自TCEP和DTT。56.权利要求55的方法，其进一步包括在用所述还原剂处理后用氧化剂处理所表达的半胱氨酸改造的抗体的步骤。57.权利要求56的方法，其中所述氧化剂选自硫酸铜、脱氢抗坏血酸、和空全文摘要半胱氨酸改造的抗MUC16抗体是通过用非交联的反应性半胱氨酸氨基酸替换亲本抗MUC16抗体的一个或多个氨基酸而改造的。提供了设计、制备、筛选、和选择半胱氨酸改造的抗MUC16抗体的方法。经由接头(L)给半胱氨酸改造的抗MUC16抗体(Ab)偶联一个或多个药物模块(D)以形成具有式I的半胱氨酸改造的抗MUC16抗体-药物偶联物Ab-(L-D)p，其中p为1-4。公开了半胱氨酸改造的抗体药物化合物和组合物的诊断和治疗用途。文档编号A61P35/00GK101687037SQ200880023024公开日2010年3月31日申请日期2008年5月7日优先权日2007年5月8日发明者威廉·马利特,杰加思·R·朱纳图拉申请人:健泰科生物技术公司