猪浮肿病疫苗的制作方法

专利名称：猪浮肿病疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于生产猪浮肿病疫苗的DNA构建物、含有从该DNA构建物转化的转 化体的猪浮肿病疫苗、以及用该猪浮肿病疫苗防除猪浮肿病的方法。
背景技术：
已知猪浮肿病是具有Stx2e毒素的大肠杆菌(浮肿病菌)在上部肠管内急剧增 殖、毒素吸收到血中而发病的细菌病，高发生于断乳后1 2周的仔猪。浮肿病菌的感染引 起的致死率极高，为50 90%。现在，浮肿病的防除使用多种抗生素，但又存在出现耐性菌 等的问题，其使用受限制。在这样的背景中，为了提供有效预防猪浮肿病的方法，人们进行了关于猪浮肿病 疫苗的研究。例如，报告有如下例子，使用无毒化的浮肿毒素蛋白质使猪免疫，预防浮肿病 菌的感染引起的死亡(非专利文献1)。这其中，使用重组大肠杆菌生产无毒化的浮肿毒素 蛋白质，将此物质接种于猪。然而，由重组大肠杆菌得到的无毒化的浮肿毒素蛋白质的生产 量并不充分，而且这样的疫苗接种需要通过蛋白质的直接注射或经鼻喷雾等进行，会花费 人的劳动力等，从猪浮肿病疫苗的实用化的观点来看，存在不能实现低成本化的问题。另一方面，近年来进行着使用转基因技术使植物生产有用的物质的研究。如，报告 有使莴苣生产大肠杆菌易热性毒素(LT)蛋白质的B亚基的例子(非专利文献2)。该研究 中，使用植物高表达启动子花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(CaMV35S)和增强子Kozak序 列，在莴苣内表达改变了密码子的的LT蛋白质的B亚基的基因。结果，报告有LT蛋白质的 B亚基积蓄了莴苣的总可溶性蛋白质的约2.0质量％。但是，这种程度的蛋白质的积蓄量对 利用转基因植物有效防除细菌病来说是不充分的。即，需要使目的蛋白质的基因高表达，在 植物细胞内有效生产、积蓄目的蛋白质。另一方面，已知来源于烟草的醇脱氢酶基因的5，-非翻译区(NtADH5，UTR)的碱 基序列是在拟南芥或水稻发挥作用的增强子(专利文献1、非专利文献3)。然而，尚未报告 使用该NtADH5，UTR的碱基序列来表达编码细菌毒素蛋白质的基因的例子。非专禾lj文献 1 :Makino et al. , Microbial Pathogenesis, Volume 31, Number 1, July 2001，pp. 1-8(08)非专利文献2 :Kim et al. , Protein Expression and Purification,Volume 51, Number 1, Jan2006, pp. 22-27(06)专利文献1 日本专利特开2003-79372公报非专利文献 3 :Satoh et al. , The 5，-untranslated region of the tobacco alcoholdehydrogenase gene functions as an effective translational enhancer in plant. J. Biosci. Bioeng. (2004)98，1-8

发明内容
本发明的课题在于开发一种低成本地且高效率地生产猪浮肿病疫苗的技术。此外，具体地说课题在于，在植物细胞高效表达猪浮肿病的毒素蛋白质(Stx2e蛋白质)的基 因、以低成本生产猪浮肿病的植物疫苗。本发明人发现，通过使用来源于植物的醇脱氢酶基因的5’-非翻译区(ADH5’UTR) 使在氨基末端附加有来源于植物的分泌信号肽的Stx2e蛋白质表达，使Stx2e蛋白质被莴 苣等的植物高效生产，在植物体内高浓度地积蓄，完成了本发明。即，本发明如下所述。第一发明是，一种DNA构建物(以下也称作“本发明的DNA构建物”)，含有来源于 植物的醇脱氢酶基因的5’ -非翻译区、以及在该区域以可表达地连接的编码Stx2e蛋白质 的DNA，所述Stx2e蛋白质在氨基末端附加有来源于植物的分泌信号肽。所述醇脱氢酶基因的5’ -非翻译区优选来源于烟草。此外，所述分泌信号肽优选 来源于烟草。此外，所述Stx2e蛋白质优选是Stx2e蛋白质的B亚基。此外，在所述Stx2e蛋白质的羧基末端优选附加有内质网滞留信号肽或液泡运输 信号肽，内质网滞留信号肽优选在羧基末端含有KDEL序列或HDEL序列，液泡运输信号肽优 选来源于烟草。此外，本发明的DNA构建物优选具有序列编号12、23、24、75、77、78、86的任意一个
表示的碱基序列。第二发明是，一种含有本发明的DNA构建物的重组载体(以下也称作“本发明的重 组载体”)。第三发明是，用本发明的重组载体转化的转化体(以下也称作“本发明的转化 体，，)。本发明的转化体优选转化植物细胞或转化植物。此外，所述植物优选莴苣。第四发明是，从所述转化植物细胞或转化植物得到的种子(以下也称作“本发明 的种子”)。第五发明是，含有本发明的转化体的猪浮肿病疫苗(以下也称作“本发明的猪浮 肿病疫苗”)。第六发明是，一种猪浮肿病的防除方法(以下也称作“本发明的猪浮肿病的防除 方法”)，其特征在于，将本发明的猪浮肿病疫苗向猪投与。


图1是显示GFP报告表达载体的构成的图。图中，一表示翻译起始点，▽表示翻译 后被切断的部位。图2是表示Stx2eB表达载体的构成的图。图中，一表示翻译起始点，▽表示翻译后 被切断的部位。图 3 是用 CLUSTALW(http://align, genome, jp/)比较已设计的 mStx2eB 1-4 的碱 基序列的图。图4是显示利用PCR的mStx2eB的合成的概念的图。图5是显示将PCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶中展开、用溴化乙锭染色后用UV照射 确认DNA条带的结果的图(照片)。图6是显示将直接PCR的溶液在1. 5%琼脂糖凝胶中展开、用溴化乙锭染色后用 UV照射确认DNA条带的结果的图(照片)。
图7是显示Stx2eA表达载体的构成的图。图中，一表示翻译起始点，▽表示翻译后 被切断的部位。图8是显示莴苣原生质体中的GFP报告的表达的状态的图(照片)。图9是显示在使用了附加有各信号肽的Stx2eB表达载体的转化莴苣原生质体中 的Stx2e B的积蓄量的图(照片)。图10是显示使用了附加有内质网滞留信号肽的改变密码子的Stx2eB表达载体的 转化莴苣原生质体中的Stx2eB的积蓄量的图(照片)。图11是显示使用了附加有内质网滞留信号肽的改变密码子的Stx2eB表达载体的 转化莴苣原生质体中的Stx2eB的积蓄量的图(照片)。图12是显示使用了附加有内质网滞留信号肽的Stx2eA表达载体的转化莴苣原生 质体中的Stx2eA的积蓄量的图(照片)。图13是显示Stx2eB_GST融合蛋白质的SDS-PAGE分析的结果的图(照片)。M 标 准物、1 :Stx2eB 8M尿素溶液、2 重折叠Stx2eB_GST溶液(注入样品)、3 非结合成分(非 結合画分)、4 清洗第1次溶出成分、5 清洗第2次溶出成分、6 溶出样品(结合成分)图14是显示使用了抗VT2抗体的蛋白质印迹分析的结果的图(照片)。图15是显示Stx2eB_GST融合蛋白质小鼠经鼻投与的抗体效价测定的结果的图。图16是显示使用了附加有内质网滞留信号肽的Stx2eB表达载体的转化烟草BY2 培养细胞中的Stx2eB的积蓄量的图(照片)。图 17 是用 CLUSTALff(http://align, genome, jp/)比较了已设计的 mStx2eB 5 的 碱基序列的图。图18是显示使用了附加有内质网滞留信号肽的改变密码子的Stx2eB表达载体的 转化烟草BY2培养细胞中的Stx2eB的积蓄量的图(照片)。图19是显示使用了附加有内质网滞留信号肽的改变密码子的Stx2eB表达载体的 转化烟草BY2培养细胞中的Stx2eB的积蓄量的图(照片)。图20是显示在强制投与浮肿病菌的第0天采取的粪便中的Stx特异性IgA的抗 体效价的图。图21是显示在强制投与浮肿病菌的第0天采取的血液中的Stx特异性IgG的抗 体效价的图。图22是显示在强制投与浮肿病菌的第3天日采取的粪便中的浮肿病菌数的图。图23是显示整个期间的饲料需求率的图。图24是显示饲料需求率的推移的图。图25是显示每头仔猪的平均临床症状评分的推移的图。图26是显示每头仔猪的整个期间的合计临床症状评分的平均的图。图27是未投与浮肿病疫苗组的仔猪和投与浮肿病疫苗组的仔猪的浮肿病菌投与 第11天的照片。
具体实施例方式本发明的DNA构建物的特征在于，含有来源于植物的醇脱氢酶基因的5’ -非翻译 区以及在该区域可表达地连接的编码Stx2e蛋白质的DNA，所述Stx2e蛋白质在氨基末端附加有来源于植物的分泌信号肽。醇脱氢酶基因的5’ _非翻译区是指，包含从编码醇脱氢酶的基因的转录起始 点到翻译起始点(ATG、蛋氨酸)之前为止的碱基序列的区域。该区域具有翻译量增大 功能。“翻译量增大功能”是指被结构基因编码的信息转录后，被翻译而产生蛋白质时， 使通过翻译产生的蛋白质量增大的功能。所述区域只要来源于植物即可，优选属于茄科 (Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、菊科(Asteraceae)的植物，进一步优选属于烟 草属(Nicotiana)、拟南芥属(Arabidopsis)、莴苣属(Lactuca)等的植物，更优选来源于烟 草(Nicotianatabacum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、莴苣(Lactuca sativa)等。作为所述醇脱氢酶基因的5’ _非翻译区，尤其优选例如由来源于烟草 (Nicotianatabacum)的醇脱氢酶基因的5’ -非翻译区的碱基序列的序列编号1表示的碱 基序列构成的区域。来源于植物的醇脱氢酶基因的5’ _非翻译区可以从高表达醇脱氢酶的植物培养 细胞的醇脱氢酶基因离析(参考日本专利特开2003-79372号公报)。此外，对烟草的醇脱 氢酶基因的5’ -非翻译区等、其碱基序列确定的物质，可以通过化学合成、或将该区域的 5’以及3’末端的碱基序列作为引物、将基因组DNA作为模板通过PCR等合成。此外，也可 以通过碱基序列确定的所述区域的一部分作为探针使用，探出其它植物的醇脱氢酶基因的 5’ -非翻译区，将此离析。此外，以序列编号1的碱基序列表示的所述醇脱氢酶基因的5’ -非翻译区只要保 持着翻译量增大功能，也可以取代、缺失、插入或附加一个或多个碱基。所述“多个”优选 2 10个，更优选2 5个，特别优选2 3个。此外，也可以使用具有与所述醇脱氢酶基因的5’ -非翻译区优选85%以上、特别 优选90%以上的同一性、并且保持翻译量增大功能的DNA。对所述区域是否具有作为目的的翻译量增大功能，可以通过如在烟草培养细 胞中将GUS(0-葡糖醛酸苷酶)基因或荧光素酶基因作为报告基因的瞬间表达分析 (transientassay)、重组染色体的转化细胞的分析等来确认。在所述来源于植物的醇脱氢酶基因的5’-非翻译区可表达地连接有编码Stx2e蛋 白质的DNA，所述Stx2e蛋白质在氨基末端附加有来源于植物的分泌信号肽。这里，“可表 达”指本发明的DNA被插入到含有适当的启动子的载体中，将该载体导入到适当的宿主细胞 时，在宿主细胞内生产所述Stx2e蛋白质。此外，“连接”是既包括2个DNA直接结合的情 况、也包括通过其它碱基序列结合的情况的概念。Stx2e蛋白质是浮肿病菌的毒素蛋白质，由毒素主体的1个A亚基和与侵入肠粘膜 有关的5个B亚基构成。A亚基用序列编号2的氨基酸序列表示，B亚基用序列编号3的氨 基酸序列表示。编码本发明的DNA构建物中所包含的Stx2e蛋白质的DNA既可以是编码含有A亚 基和B亚基两者的Stx2e蛋白质的DNA，也可以是仅编码A亚基或B亚基的DNA。但是，含 有编码A亚基的DNA时，优选改变DNA的碱基序列后使用，以便被生产的A亚基为无毒。本发明的DNA构建物中，编码Stx2e蛋白质的DNA优选仅编码B亚基的DNA。在本发明的DNA构建物中被编码的Stx2e蛋白质只要能够投与猪后引起免疫应 答，Stx2e蛋白质的氨基酸序列(序列编号2和/或序列编号3)中的一个或多个氨基酸也
6可以被取代、缺失、插入或附加。作为所述“多个”，例如在A亚基中优选2 30个，进一步 优选2 20个，更优选2 10个，在B亚基中优选2 10个，进一步优选2 5个，更优 选2 3个。此外，也可以是具有与Stx2e蛋白质的氨基酸序列(序列编号2和/或序列编号 3)优选85%以上、更优选90%以上、特别优选95%以上的同一性、并且投与猪后能引起免 疫应答的蛋白质。编码Stx2e蛋白质的DNA可以根据例如序列编号4以及/或序列编号5的碱基序 列通过一般的基因工程学的手法容易地得到。具体地说，可以通过从生产Stx2e蛋白质的 浮肿病菌按照常用方法调制cDNA文库，使用根据上述碱基序列制作的探针从该文库选择 期望的克隆，由此得到编码Stx2e蛋白质的DNA。此外，也可以通过将上述碱基序列作为基 础进行化学合成、将上述碱基序列的5’以及3’末端的碱基序列作为引物、将基因组DNA作 为模板的PCR等来合成。此外，可以用于本发明的DNA构建物的制作的、编码Stx2e蛋白质的DNA的碱基序 列优选，根据生产该蛋白质的宿主细胞适当改变表示构成Stx2e蛋白质的氨基酸残基的密 码子，以使Stx2e蛋白质的翻译量增大。作为改变密码子的方法，可以参考例如Kang等(2004)的方法(实施例中详述)。 此外，举例有选择在宿主细胞中使用频率高的密码子、或GC含量高的密码子、或选择在宿 主细胞的看家基因中使用频率高的密码子的方法。例如，作为对序列编号5所表示的碱基序列改变密码子的碱基序列举例有序列编 号6 9、79所表示的碱基序列。在本发明的DNA构建物的制作中，优选使用具有序列编号 6、8、9、79所表示的碱基序列的DNA。此外，也可以使用在严格的条件下与具有序列编号4及/或序列编号5 9的任 一个的碱基序列的DNA杂交的DNA。“严格的条件”是指形成所谓特异性杂交体、未形成非 特异性杂交体的条件。例如，举例有如下条件，即同一性高的两个DNA、优选具有80%以上、 更优选具有90%以上、特别优选具有95%以上的同一性的两个DNA杂交，但比这个同一性 低的2个DNA不杂交。例如，举例有2XSSC(330mMNaCl、30mM柠檬酸)、42°C。编码所述Stx2e蛋白质的DNA与来源于植物的编码分泌信号肽的DNA连接，以使 Stx2e蛋白质的氨基末端附加有来源于植物的分泌信号肽。这里，“附加”是既包括所述分 泌信号肽直接结合在Stx2e蛋白质的氨基末端的情况、也包括通过其它肽结合的情况的概 念。此外，在编码Stx2e蛋白质的DNA编码包含A亚基以及B亚基两者的Stx2e蛋白质时， 在使A亚基以及B亚基作为融合蛋白表达时，编码Stx2e蛋白质的DNA只要与编码所述分 泌信号肽的DNA连接即可，以使在融合蛋白质的氨基末端附加所述分泌信号肽，在使A亚基 以及B亚基各自表达时，编码Stx2e蛋白质的DNA只要与编码所述分泌信号肽的DNA连接 即可，以使在A亚基以及B亚基两者的氨基末端附加所述分泌信号肽。分泌信号肽优选来源于属于茄科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、菊 科(Asteraceae)的植物，进一步优选属于烟草属(Nicotiana)、拟南芥属(Arabidopsis)、 莴苣属(Lactuca)等的植物，更优选来源于烟草(Nicotiana tabacum)、拟南芥 (Arabidopsisthaliana) >(Lactuca sativa)等。此外，优选来源于烟草的0 -D葡聚糖外水解酶(0 -D葡聚糖外水解酶)、烟草的
738kDa 过氧化物酶(GenBank Accession D42064)。作为所述分泌信号肽，例如举例有来源于烟草的0 -D葡聚糖外水解酶的、具有序 列编号10所表示的氨基酸序列的分泌信号肽。此外，编码该分泌信号肽的DNA的碱基序列 例如以序列编号11表示。编码所述分泌信号肽的DNA也可以从各种植物探索、离析，也可以根据所述序列 编号11的碱基序列制作探针，从各种植物的cDNA得到，也可以根据同一碱基序列通过化学 合成或PCR等的手法得到。作为本发明的DNA构建物，优选举例有由序列编号1的碱基序列构成的DNA、由序 列编号11的碱基序列构成的DNA以及由序列编号5 9的任一个碱基序列构成的DNA连 接而成的DNA构建物。作为这样的本发明的DNA构建物，举例有如具有序列编号12的碱基 序列的DNA构建物。还有，编码所述Stx2e蛋白质的DNA优选与编码内质网滞留信号肽或液泡运输信 号肽的DNA连接，以便在Stx2e蛋白质的羧基末端附加内质网滞留信号肽或液泡运输信号 肽。这里，“附加”是既包括所述内质网滞留信号肽或液泡运输信号肽直接结合在Stx2e蛋 白质的羧基末端的情况、也包括通过其它肽结合的情况的概念。此外，在编码Stx2e蛋白质 的DNA编码包含A亚基以及B亚基两者的Stx2e蛋白质时，在使A亚基以及B亚基作为融 合蛋白表达时，编码Stx2e蛋白质的DNA只要与编码所述内质网滞留信号肽或液泡运输信 号肽的DNA连接即可，以使在融合蛋白质的羧基末端附加所述分泌信号肽，在使A亚基以及 B亚基各自表达时，编码Stx2e蛋白质的DNA只要与编码所述内质网滞留信号肽或液泡运输 信号肽的DNA连接即可，以使在A亚基以及B亚基的至少一个羧基末端上附加所述内质网 滞留信号肽或液泡运输信号肽。作为内质网滞留信号肽，举例有含有KDEL序列(序列编号13)、HDEL序列(序列 编号14)、KDEF序列(序列编号15)或HDEF序列(序列编号16)的内质网滞留信号肽。例 如，作为含有HDEL序列的内质网滞留信号肽优选使用序列编号17的氨基酸序列所表示的 内质网滞留信号肽等。还有，编码该内质网滞留信号肽的DNA的碱基序列如用序列编号18表不。作为液泡运输信号肽，优选来源于属于茄科(Solanaceae)、十字花科 (Brassicaceae)、菊科(Asteraceae)的植物，进一步优选属于烟草属(Nicotiana)、拟 南芥属(Arabidopsis)、辣根属(Armoracia)等的植物，更优选来源于烟草(Nicotiana tabacum)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、辣根(Armoracia rusticana)等。此夕卜，优选来 源于甲壳质酶。来源于烟草甲壳质酶的液泡运输信号肽的氨基酸序列以序列编号19表示。 此外，编码来源于烟草甲壳质酶的液泡运输信号肽的DNA的碱基序列例如用序列编号20表
7J\ o此外，优选来源于辣根过氧化物酶Cla同工酶。来源于辣根过氧化物酶Cla同工 酶的液泡运输信号肽的氨基酸序列用序列编号21表示。此外，编码来源于辣根过氧化物酶 Cla同工酶的液泡运输信号肽的DNA的碱基序列例如用序列编号22表示。作为本发明的DNA构建物，优选举例有由来源于植物的醇脱氢酶基因的5’ -非翻 译区、以及编码Stx2e蛋白质的DNA构成的DNA构建物，所述5’-非翻译区由序列编号1的 碱基序列构成的DNA、由序列编号11的碱基序列构成的DNA以及由序列编号5 9的任一个碱基序列构成的DNA、以及由序列编号18或序列编号20的碱基序列构成的DNA所连接， 所述编码Stx2e蛋白质的DNA在其氨基末端附加有来源于植物的分泌信号肽、在羧基末端 附加有内质网滞留信号肽或液泡运输信号肽。作为附加有内质网滞留信号肽的本发明的 DNA构建物，例如举例有具有序列编号23、75、77、78、86的任一个碱基序列的DNA构建物。 作为附加有液泡运输信号肽的本发明的DNA构建物，例如举例有序列编号24表示的DNA构 建物。本发明的DNA构建物可以通过一般的基因工程学手法制作，也可以将含有来源 于植物的醇脱氢酶基因的5’ -非翻译区、编码来源于植物的分泌信号肽的DNA、以及编码 Stx2e蛋白质的DNA、含有任意编码内质网滞留信号肽或液泡运输信号肽的DNA的DNA分别 用适当的限制酶切断，用适当的连接酶连接来进行。本发明的重组载体，其特征在于含有本发明的DNA构建物。本发明的重组载体只 要插入到载体即可，以使编码在N末端附加有来源于植物的分泌信号肽的Stx2e蛋白质 的DNA能够在导入载体的宿主细胞中表达。载体只要是在宿主细胞中能够复制的载体则 无特别限制，例如举例有质粒DNA、病毒DNA等。此外，载体优选含有耐药基因等的选择标 记。质粒DNA可以从大肠杆菌或土壤杆菌通过碱提取法(Birnboim，H. C. &Doly, J. (1979) Nucleic acid Res 7:1513)或其变法等来调制。此外，作为市售的质粒，也可以使用如 pBI221、pBI121、pBIlOl、pIG121Hm 等。作为病毒 DNA 可以使用如 pTB2 (Donson etal.， 1991)等(参照 Donson J. , Kerney CM. , Hilf ME. , Dawson W0. Systemic expression of abacterial gene by a tobacco mosaic virus-based vector. Proc. Natl. Acad.Sci. (1991)88:7204-7208。)载体内使用的启动子可以根据载体被导入的宿主细胞适当选择。如，优选使用花 椰菜花叶病毒35S启动子(Odell et al. ,1985 Nature 313 :810)、水稻的肌动蛋白启动子 (Zhang etal.，1991 Plant Cell 3 :1115)、玉米泛素启动子(Cornejo et al.，1993 Plant Mol. Biol. 23567)等。此外，载体内使用的终止子也可以同样根据载体被导入的宿主细胞 适当选择。如，优选使用胭脂碱合成酶基因转录终止子、花椰菜花叶病毒35S终止子等。
本发明的重组载体如可以如下述所述地制作。首先，用适当的限制酶切断本发明的DNA构建物或通过PCR附加限制酶位点，插入 到载体的限制酶位点或多克隆位点中。本发明的转化体，其特征在于，用本发明的重组载体转化。用于转化的宿主细胞可 以是真核细胞以及原核细胞的任一个。作为真核细胞，优选使用植物细胞，尤其优选使用属于菊科(Asteraceae)、茄科、 十字花科、藜科的植物的细胞。进一步，优选使用属于莴苣(Lactuca)属的植物的细胞、尤 其是莴苣(Lactuca sativa)细胞。作为宿主细胞使用莴苣细胞时，载体可以使用花椰菜花 叶病毒35S RNA启动子等。作为原核细胞，使用大肠杆菌(Escherichia coli)、根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)等。本发明的转化体可以通过使用一般的基因工程学手法，将本发明的载体导入到宿 主细胞来制作。例如，可以使用利用土壤杆菌的导入方法(Hood，et al. ,1993,Transgenic, Res. 2 218, Hiei, et al.，1994 Plant J. 6 271)、电击转化法(Tada, et al.，1990，Theor.Appl. Genet，80 :475)、聚乙二醇法(Lazzeri, et al. , 1991, Theor. Appl. Genet,81 :437)、 基因枪法(Sanford, et al.，1987，J. Part. Sci. tech. 5 :27)、聚阳离子法(Ohtsuki)等的方法。将本发明的载体导入宿主细胞之后，可以根据选择标记的表现型来筛选本发明的 转化体。此外，可通过培养筛选的转化体来生产所述Stx2e蛋白质。培养使用的培养基以 及条件可以根据转化体的种类适当选择。此外，当宿主细胞为植物细胞时，可以根据常法培养已筛选的植物细胞，由此使植 物细胞再生，可以在植物细胞内或植物细胞的细胞膜外使所述Stx2e蛋白质积蓄。例如，根 据植物细胞的种类而不同，如果是马铃薯的话，举例有Visser等(Theor. Appl. Genet，78 594(1989))的方法，如果是烟草的话，举例有Nagata与Takebe(Planta 99:12(1971))的方法。莴苣的话，可以在含有0. lmg/1的NAA(萘乙酸)、0.05mg/l的BA(苯甲基腺嘌呤) 以及0. 5g/l的聚乙烯基吡咯烷酮的MS培养基中使新枝(shoot)再生，可以通过将再生的 新枝在含有0. 5g/l的聚乙烯基吡咯烷酮的1/2MS培养基中培养来发根。此外，本发明的种子可以从如上所述地再生的植物体中采取种子来得到。本发明 的种子通过用适当的方法播种、栽培，可以作为生产Stx2e蛋白质的植物体，这样的植物体 也包含在本发明的转化体。 本发明的猪浮肿病疫苗，其特征在于含有本发明的转化体。本发明的猪浮肿病疫 苗可以包含含有Stx2e蛋白质的本发明的全部转化体，也可以包含一部分。此外，可以将转 化体直接使用，也可以干燥、粉碎等来使用。此外，本发明的猪浮肿病疫苗中也可以混合提 高Stx2e蛋白质的免疫原性的佐剂。通常，考虑到安全性而使用氢氧化铝作为佐剂。另一 方面，Stx2e蛋白质的B亚基本身显示出佐剂活性，因此当本发明的DNA构建物含有编码B 亚基的DNA时，即使进一步混合佐剂，也能得到较高的免疫原性。本发明的猪浮肿病的防除方法，其特征在于，将本发明的猪浮肿病疫苗向猪投与。 用本发明的猪浮肿病疫苗进行的免疫优选对浮肿病的发生率较高的仔猪进行。作为免疫方 法，举例有将本发明的猪浮肿病疫苗投与母猪，将母猪产生的抗体通过乳汁授给仔猪的方 法、将本发明的猪浮肿病疫苗投与仔猪，使仔猪直接免疫的方法等。作为投与本发明的猪浮肿病疫苗的方法，举例有在猪饲料中混合本发明的猪浮肿 病疫苗而给猪的方法、给猪鼻腔投与的方法等。此时的投与量，以Stx2e蛋白质的质量，优 选每天4mg以上，进一步优选16mg以上。猪浮肿病疫苗优选以一定的间隔投与多次。例如， 举例有每隔4 7天总计投与2 3次的方法。实施例(1) GFP表达载体的构建为了对莴苣细胞的蛋白质的定位控制进行研究，将含有编码附加有各信号肽的绿 色荧光蛋白质(GFP)的DNA的表达载体如下地制作(图1)。以ADH_221(Sato et. Al.，2004)为模板，通过使用了 ADH Xbal-F引物(序列编号 25)以及ADH Nsil-R引物(序列编号26)的PCR来扩增烟草醇脱氢酶基因的5’ -非翻译 区(NtADH 5，UTR、序列编号1)。以烟草基因组DNA为模板，使用0D NsiI_F引物(序列编 号27)以及0D EcoRI-R引物(序列编号28)来扩增编码0 _D葡聚糖外水解酶(GenBank
10ACCESSION AB017502)的信号肽(序列编号11)的DNA区域。用Nsil (T0Y0B0公司制造)处 理已得到的NtADH 5，UTR以及信号肽的各DNA片断，使用高效连接试剂盒(ligation high) (T0Y0B0公司)连接之后，使末端平滑化，在pBluescrip II SK(Stratagene公司制造)的 EcoRV间隙中克隆(质粒1)。用Nsil处理质粒1，用T4DNA聚合酶(T0Y0B0公司制造)将末端平滑化之后进行自 身连接，融合为NtADH的起始密码子(atg)与3-D葡聚糖外水解酶的起始密码子一致(质 粒2)。通过EcoRI位点将编码在C末端具有液泡输送信号(序列编号19)的GFP(pSGFP5T， Di Sansebastiano et al.，1998)的 DNA 插入到质粒 2 中(液泡型 GFP)。以pSGFP5T为模板，使用GFP-F引物(序列编号29)以及GFP-R引物(序列编号 30)进行PCR。将得到的DNA片断的末端平滑化之后，在pBluescript II SK的EcoRV间隙 克隆(质粒3)。使用EcoRI和Xhol从质粒3切出GFP片断，插入到质粒2的EcoRI_XhoI 间隙中(质外体型GFP)。用Nsil和Xhol从质粒3切出GFP片断，插入到质粒1的Nsil-EcoRI间隙中(细 胞质型GFP)。以pSGFP5为模板，使用GFP-F引物以及GFP HDEL-R引物(序列编号31)进行PCR。 将得到的DNA片断的末端平滑化之后，在pBluescript II SK的EcoRV间隙克隆(质粒4)。 使用EcoRI和Xhol从质粒4切出GFP片断，插入到质粒2的EcoRI-XhoI间隙(内质网型 GFP)。以莴苣叶cDNA为模板，使用TP Nsil-F引物(序列编号32)以及TP EcoRI-R 引物(序列编号33)通过PCR来扩增编码来源于莴苣Rbcs(rubisco small subunit) (GenBankACCESSION D14001)的叶绿体运输信号肽(转运肽、T. P.序列编号45)的DNA片 断。用Nsil和EcoRI处理已得到的片断，连接到质粒1的Nsil-EcoRI间隙(质粒5)。用 Nsil处理质粒5，用T4DNA聚合酶(T0Y0B0公司制造)将末端平滑化之后进行自身连接，融 合为使NtADH的起始密码子与Rbcs的起始密码子一致(质粒6)。使用EcoRI和Xhol从质 粒3切出GFP片断，插入到质粒6的EcoRI-XhoI间隙(叶绿体型GFP)。还有，在构建这些GFP表达载体时，可以参考下述文献。Di Sansebastiano et al. , Specific accumulation of GFP in a non-acidic vacuolarcompartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. (1998)15,449-457Satoh et al. , The 5' -untranslated region of the tobacco alcohol dehydrogenase genefunctions as an effective translational enhance in plant J. Biosci. Bioeng. (2004)98，1-8将上述各定位型GFP插入到如下进行的植物细胞中的瞬时表达用载体、 PBI221 (Clontech公司)的多克隆位点(MCS)。为了在MCS导入Sail、Kpnl以及Smal位点，将SalKpnSma-F(序列编号34)和 SalKpnSma-R(序列编号35)退火之后，使用T4多聚核苷酸激酶(T4PNK) (TaKaRa公司)磷 酸化，插入到PBI221的SacI间隙(质粒7)。使用Xbal和Kpnl将各定位型GFP插入到质 粒7中，配置在花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(35S pro.)和胭脂碱合成酶基因转录终止 子(N0S-T)之间，制作GFP表达载体。
(2) Stx2eB表达载体的构建如下制作附加有各信号肽的、含有编码Stx2e蛋白质的B亚基(Stx2eB)的DNA (序 列编号5)的本发明的DNA构建物。使用Kozak-Stx2eb-F引物(序列编号36)和stx2eb_R引物(序列编号37)进行 PCR，扩增编码Stx2eB的成熟区域(除了往周质的分泌信号肽，Alal9 Asn87)的DNA片 断。在pBluescript II SK的EcoRV间隙克隆所得到的DNA片断。用Hindlll切断已得到 的质粒，用T4DNA聚合酶处理之后进行自身连接，将Hindlll位点改换为Nhel位点(质粒 8)。用Xbal和Kpnl从质粒8切出Kozak_Stx2eB片断，插入到质粒7的Xbal-Kpnl间 隙中，制作Kozak连接细胞质型Stx2eB表达载体(Kozak-Cytosol-Stx2eB)(质粒9)。使用ADH Xbal-F和ADH BamHI-R引物(序列编号38)扩增NtDH 5，UTR片断。用 Xbal和BamHI处理得到的DNA片断，插入到质粒9的XbaI_BamHI间隙，制作NtADH5，-UTR 连接细胞质型Stx2eB表达载体(ADH-Cytosol_Stx2eB)(质粒10)。为了扩增分泌信号肽，以质粒2为模板，使用PD-Kozak-F引物(序列编号39)和 3 DBamHI-R引物(序列编号40)进行PCR。用Xbal和BamHI处理得到的DNA片断，插入到 质粒 9 的 Xbal-BamHI 间隙(质粒 11) (Kozak-Apoplast_Stx2eB)。为了附加内质网残留信号，使HDEL-F引物(序列编号41)和HDEL-R引物(序列 编号42)退火，用T4 PNK磷酸化，插入到用碱性磷酸酶(AP) (TaKaRa公司)脱磷酸化处理 的质粒11的Bglll间隙，制作Kozak连接内质网型Stx2eB表达载体(Kozak_ER-Stx2eB) (质粒12)。为了制作NtADH 5，UTR和分泌信号肽融合的DNA片断，以质粒2为模板，使 用ADHXbal-F引物和3D BamHI-R引物进行PCR。用Xbal和BamHI处理得到的DNA片 断，插入到质粒9的Xbal-BamHI间隙，制作NtADH 5，连接质外体型Stx2eB表达载体 (ADH-Apoplast-Stx2eB)(质粒 I3)。为了附加内质网残留信号，使HDEL-F引物和HDEL-R引物退火，用T4PNK磷酸化， 插入到用AP脱磷酸化处理的质粒13的Bglll间隙，制作NtADH 5，_UTR连接内质网型 Stx2eB 表达载体(ADH-ER-Stx2eB)(质粒 14)。为了附加液泡输送信号，使VSD-F引物(序列编号43)和VSD-R引物(序列编 号44)退火，用T4PNK磷酸化，插入到用AP脱磷酸化处理的质粒13的Bglll间隙，制作 NtADH5，-UTR 连接液泡型 Stx2eB 表达载体(ADH-Vacuole_Stx2eB)(质粒 15)。为了附加叶绿体运输信号肽(序列编号45)，以质粒6为模板，使用ADH Xbal-F 引物和TP BamHI-R引物(序列编号46)进行PCR。用Xbal和BamHI处理得到的DNA片 断，插入到质粒9的Xbal-BamHI间隙，制作NtADH 5，-UTR连接叶绿体型Stx2eB表达载体 (ADH-Chloroplast Stx2eB)(质粒 I6)。此外，作为用于检测Stx2eB的肽标签，融合了 HA标签。为了附加HA标签，使HA_F 引物(序列编号47)和HA-R引物(序列编号48)退火，用T4PNK磷酸化。将得到的磷酸化 HA片断插入到质粒9、10、12、13、14、15 以及 16 的BamHI 间隙，制作Kozak-Cytosol_Stx2eB、 ADH-Cytosol-Stx2eB、Kozak_ER_Stx2eB、ADH_Apoplast_Stx2eB、ADH_ER_Stx2eB、 ADH-Vacuole-Stx2eB、ADH-Chloroplast_Stx2eB 的各 Stx2eB 表达载体，用于以下的表达试验(图2)。(3)密码子改变Stx2eB表达载体的构建将编码序列编号5所示的Stx2eB的DNA的碱基序列的密码子改变，通过以下方法 制作附加有NtADH 5，UTR的、内质网型密码子改变Stx2eB。(a)密码子改变Stx2eB的设计作为密码子改变Stx2eB，设计了 4种，1)根据Kang et al. (2004)的方法的序列、 2)选择了在莴苣中使用频率高的密码子的序列、3)在GC含量高的密码子中，选择了在莴苣 中使用频率高的密码子的序列、4)选择了在看家基因(肌动蛋白基因、微管蛋白基因) 中使用频率高的密码子的序列。1)根据Kang et al. (2004)的方法的序列以在该文献中显示的改变前后的LTB基因序列和烟草的密码子使用频率表为 基础，制作密码子的改变流程图，以该流程图以及莴苣的密码子使用频率表为基础，进行 Stx2eB的密码子改变。将制作的密码子改变Stx2eB作为mStX2eBl (序列编号6)。莴苣的 密码子使用频率表利用了 芒DNA研究所的数据库(http://WWW. kazusa. or. jp/codon/ index, html)上的莴苣的密码子使用(codon usage)(以下相同)。2)选择了在莴苣中使用频率高的密码子的序列以莴苣的密码子使用频率表为基础，仅使用使用频率最高的密码子，进行密码子 改变。例如，Ala的密码子中，使用频率最高的密码子是GCA，因此Stx2eB中的Ala的密码 子全部统一为GCA。将制作的密码子改变Stx2eB作为mStX2eB2 (序列编号7)。3)在GC含量高的密码子中，选择了在莴苣中使用频率高的密码子的序列以莴苣的密码子使用频率表为基础，选择GC含量多、且使用频率高的密码子，进 行密码子改变。例如，Ala的密码子中，GC含量最高的密码子是GCC和GCG，而且使用频率 高的密码子是GCC，因此Stx2eB中的Ala全部改换为GCC。将制作的密码子改变Stx2eB作 为mStx2eB3(序列编号8)。4)选择了在看家基因(肌动蛋白基因、微管蛋白基因)中使用频率高的密码 子的序列选择在莴苣的看家基因中高频率使用的密码子，进行密码子改变。作为看家基因， 选择了肌动蛋白基因、微管蛋白1，2，3。两个基因的碱基序列使用了 NCBI(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/)。在表1以及表2总结了在两个基因中使用的密码子以及密码子使用 频率。其中，选择使用频率最高的密码子来进行密码子改变。将制作的密码子改变Stx2eB 作为mStx2eB4 (序列编号9)。[表1] 将设计好的mStx2eBl-4 的碱基序列用 CLUSTALW(http://align, genome, jb/)比
较(图3)。在表3显示密码子改变前后的Stx2eB的序列XXG/C(X为任意碱基)比和GC比。
mStx2eB2以外的XXG/C比高于Stx2eB，在mStx2eB3中为100 %。GC比也同样地，在mStx2eB2
以外高于Stx2eB，最高的mStx2eB3为61. 4% [表 3] (b)密码子改变Stx2eB的制作以mStx2eBl-4的碱基序列为基础，分别制作了具有6种碱基序列的引物。1)根据Kang et al. (2004)的方法的序列A 序列编号49B 序列编号50C:序列编号51
D 序列编号52E 序列编号53F:序列编号54 2)选择了在莴苣中使用频率高的密码子的序列A 序列编号55B:序列编号56C:序列编号57D 序列编号58E 序列编号59F:序列编号603)在GC含量高的密码子中，选择了在莴苣中使用频率高的密码子的序列A 序列编号61B:序列编号62C:序列编号63D 序列编号64E 序列编号65F:序列编号664)选择了在看家基因中使用频率高的密码子的序列A 序列编号67B:序列编号68C:序列编号69D 序列编号70E 序列编号71F:序列编号72使用上述合成的低聚物，根据Kang et al. (2004)的方法用以下的条件进行第1 次PCR，合成4种密码子改变Stx2eB。S卩，以引物A与B、C与D、E与F的组合进行PCR，分 别合成87bp (A+B)、78bp (C+D)、69bp (E+F)的基因片断。然后，以A+B与C+D的组合进行第 2次PCR，合成153bp (A+B+C+D)的基因片断。最后，以A+B+C+D与E+F的组合进行第3次 PCR，最终合成210bp的基因(参考图4)。反应条件是，添加IOpmol寡核苷酸、0. 2mM dNTP、 Pfu DNA聚合酶缓冲液、0. 3U DNA聚合酶，使最终容量为25 μ 1，在94°C、5分钟加热之后，将 94°C、1分钟；56°C或60°C、1分钟；72°C、1分钟的加热处理进行25个或30个循环，最后在 72°C下加热5分钟。在第2次PCR、第3次PCR中，使用第1次PCR、第2次PCR后的反应液 1 μ 1作为模板。在第1次PCR和第2次PCR扩增目的DNA，但在第3次PCR，目的大小的DNA 没有扩增。但是，将第3次PCR产物作为模板进行利用Ex Taq的PCR时，在210bp附近确 认扩增产物(图5)。将扩增产物TA克隆之后，用Direct PCR确认有无插入(图6)，关于 确认插入，通过测序确认序列。结果，确认了得到作为目的的mStx2eBl-4。(c)密码子改变Stx2eB表达载体的构建为了评价密码子改变Stx2eBl_4的翻译量，构建了瞬时表达载体。用限制酶切 断附加了上述花椰菜花叶病毒35S启动子、来源于烟草的醇脱氢酶基因的5’非翻译区、信号肽、内质网残留信号以及HA标签的载体pBI221后，用DNA连接试剂盒(Mighty Mix) (TaKaRa)将目的DNA片断连接，制作了附加有NtADH5，UTR的、内质网型密码子改变Stx2eB 表达载体(ADH-ER-mStx2eBl-4)。(4) Stx2eA表达载体的构建按照以下方法制作编码附加有内质网运输信号肽的、Stx2e蛋白质的A亚基的成 熟区域(除了往周质的分泌信号肽区域，Gln23 Glu319) (Stx2eA)的DNA(序列编号4)。使用Stx2eA BamHI-F引物(序列编号73)和Stx2eA BglII-R引物(序列编号74) 进行PCR。将得到的DNA片断用BamHI和Bglll处理后，分别插入到上述Kozak_ER-Stx2eB 以及 ADH-ER-Stx2eB 的表达载体 BamHI-Bglll 间隙中，制作了 Kozak_ER-Stx2eA 或 ADH-ER-Stx2eA (图 7)。(5)使用莴苣原生质体的瞬时表达实验用手术刀以0. 5cm四角形程度切碎约lg的种植的莴苣(Lactuca sativa) (green wave)的叶子，制作叶盘(leaf disc)。将叶盘浸渍在500mM甘露醇中，振荡1小时。将叶盘浸 渍在50ml的原生质体化酶溶液(1.0%纤维素RS( ^ ”卜义本社)、0. 25%离析酶R-10( ^ 夕卜 >本社)、400mM甘露醇、8mM CaCl2和5mM Mes_K0H，pH5. 6)，室温下振荡2小时。将原 生质体悬浊液通过lOOiim以及40iim的网眼，除去了叶盘。将原生质体悬浊液用60g离 心5分钟，使原生质体沉淀。将原生质体重悬浊在含有167mM甘露醇以及133mM CaCl2的 水溶液中，用40g离心5分钟。将原生质体重悬浊在含有333mM甘露醇以及66. 7mM CaCl2 的水溶液中，用40g离心5分钟。将原生质体悬浊在W5溶液(150mMNaCl、125mM CaCl2、5mM KCl、2mM Mes-KOH、pH5. 6)，在冰上静置1小时。将原生质体悬浊液用40g离心5分钟，悬 浊在MaMg溶液(400mM甘露醇、15mM MgCl2和4mMMes_K0H，pH5. 6)，以使原生质体浓度成为 2X106 个/ml。将上述制作的GFP报告表达载体、Stx2eB表达载体、改变的Stx2eB表达载体以及 Stx2eA表达载体分别与120 ill的原生质体悬浊液之后，加入140 yl的PEG溶液(400mM甘 露醇、lOOmM Ca(N03)2和40% PEG)平稳地混合，培养7分钟。耗时约20分钟将lmlW5溶液 添加到原生质体悬浊液。将以4 1的比例混合了 400mM甘露醇和W5溶液的溶液1ml添 加到通过离心沉淀的原生质体中。将含有蔗糖、400mM甘露醇和0. 3mM羧苄青霉素的LS 培养基1ml添加到通过离心沉淀的原生质体中，在暗处25°C下培养24小时。(6) Western 分析通过离心回收的原生质体中加入30iU的SDS-样品缓冲液(4% (w/v) SDS.20% (w/v)甘油、0.05% (w/v)溴酚蓝、300mM 巯基乙醇、125mM Tris_HCl，pH6. 8)，95°C下热 变性2分钟，作为试样。使用15%丙烯酰胺凝胶分离蛋白质之后，使用电子传递装置在PVDF 膜(Hybond-P ；Amersham 公司)上转印蛋白质。用抗 HA 抗体(No. 11867423001，Roche)，检 测 Stx2eB 以及 Stx2eA。(a)GFP表达载体的表达将(1)中制作的各GFP表达载体导入到莴苣的原生质体中，瞬时表达报告基因。为 了分析GFP报告基因的表达量，使用共聚焦激光显微镜进行GFP荧光观察(图8)。表达细胞质型GFP时，在被认为是叶绿体周边的细胞质的区域和核内检测出荧光 信号。还有，报告称，即使没有核运输信号肽，GFP等低分子量的蛋白质也能够通过核膜孔。
然后，对输送信号到膜泡运输路经进行研究。表达质外体型、内质网型、液泡型的 任意型的GFP时，在原生质体培养初期，在认为是内质网的区域确认了荧光。随着原生质 体的培养时间，质外体型中变得看不到荧光信号(认为分泌到细胞外)，在液泡型，在占据 大部分细胞体积的大液泡检测出信号。另一方面，在内质网型中，内质网中荧光呈停留的状 态。此外，还研究了叶绿体型运输信号肽。表达叶绿体型GFP时，在发出红色自体荧光 的叶绿体区域检测出绿色信号。从以上结果可知，在莴苣细胞中，通过附加信号肽，可以控制重组蛋白质的定位。(b)在Stx2eB生产中的定位化信号以及翻译增强子的效果将(2)中制作的Stx2eB表达载体导入到莴苣的原生质体中，瞬时表达Stx2eB，通 过使用了抗HA抗体的Western分析评价Stx2eB积蓄量。结果示于图9。使用Kozak序列表达细胞质型Stx2eB时，完全没有检测出Stx2eB，但表达内质 网型Stx2eB时，检测出S. P.没有被切断的Stx2eB前驱体(约12kDa、pre-mature)以及 Stx2eB(约 8kDa>mature)。使用NtADH5，UTR表达细胞质型Stx2eB时，完全没有检测出Stx2eB，但表达内质 网型Stx2eB以及液泡型Stx2eB时，检测出S. P.没有被切断的Stx2eB前驱体以及Stx2eB。 此外，表达质外体型Stx2eB时，检测出Stx2eB。此外，表达叶绿体型Stx2eB时，检测出 Stx2eB。从观察Kozak-ER(内质网型)和NtADH_ER(内质网型)的泳道的条带，可判断，通 过使用NtADH5，UTR, Stx2eB的表达量与使用了 Kozak序列时相比极大增高。此外，判断，通过向膜泡运输路经运输Stx2eB，提高了在植物细胞中的Stx2eB的 积蓄量。还有，由膜泡输送经路输送的3个区域(内质网、质外体、液泡)不同引起的Stx2eB 的积蓄量之差较小。(c)Stx2eB的密码子改变对影响表达的效果将各密码子改变Stx2eB表达载体导入到莴苣的原生质体中，瞬时表达密码子改 变Stx2eB，通过使用了抗HA抗体的Western分析评价Stx2eB积蓄量。结果示于图10以及 11。在泳道0 (ADH-ER-Stx2eB)、泳道 1 (ADH_ER-mStx2eB 1)、泳道 2 (ADH-ER-mStx2eB2)、泳道 3 (ADH_ER-mStx2eB3)、泳道 4 (ADH_ER-mStx2eB4)，都检测出 S. P.没有被切断的Stx2eB前驱体(约12kDa、预成熟(pre-mature))以及Stx2eB (约8kDa、 成熟(mature))，在泳道2检测量极微。由此判断，在使用了分别具有序列编号75、77、78的碱基序列的 ADH-ER-mStx2eBl、ADH-ER-mStx2eB3、ADH-ER-mStx2eB4 时，Stx2eB 蛋白质的积蓄量特别增大。(d)在Stx2eA生产中的翻译增强子的效果将各Stx2eA表达载体导入到莴苣的原生质体中，瞬时表达Stx2eA，通过使用了抗 HA抗体的Western分析评价Stx2eA积蓄量。结果示于图12。表达NtADH-ER_Stx2eA(内质网型)时，分别在约34kDa、约38kDa的位置检测出2 条带。另一方面，表达KoZak-ER-StX2eA时，Stx2eA的表达量在检测界限以下。
由此判断，通过使用NtADH5，UTR, Stx2eA的表达量与使用了 Kozak序列时相比极 大增高。(8)Stx2eB有效生产量的设定以及性能评价(a) Stx2eB-GST融合蛋白质的精制为了制作Stx2eB亚基和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白质，在大肠杆菌蛋 白质表达用载体PGEX-6P-1的GST3’侧合并框架，亚克隆Stx2eB之后，转化到大肠杆菌。通 过常用方法添加异丙基0-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，诱导重组(r) Stx2eB-GST融 合蛋白质的表达，使用谷胱甘肽琼脂糖4B柱(column)如下进行精制。在大肠杆菌内表达Stx2eB_GST融合蛋白质之后，在水溶性的缓冲液悬浊菌体，进 行超声波处理之后，由于在上清中该融合蛋白质存在较少，因此可知该融合蛋白质存在于 不溶性成分中。所以，用8M尿素使该融合蛋白质可溶化，用柱精制之后，进行重折叠。(b)蛋白质的小鼠经鼻投与实验(抗体效价的确认)对溶出的Stx2eB_GST融合蛋白质，使用对Stx2e的抗体(抗VT2抗体)进行蛋白 质印迹分析(Western blotting)。结果，检测出与Stx2eB_GST融合蛋白质以及Stx2eB的 分子量一致的特异性的2个条带，确认了该融合蛋白质保持着抗原性(图14)。接着，每隔一周3次给小鼠经鼻接种已精制的Stx2eB_GST融合蛋白质10、20、 50ugo在第0、1、2、3周进行采血，以该融合蛋白质为抗原进行ELISA，测定IgG抗体效价。 结果，可知，该融合蛋白质50 y g投与区在投与后第1周可见到抗体效价的上升，但第2周 即使在10、20y g投与区，也确认了抗体效价的上升，经过第3周抗体效价经时地上升(图 15)。(9)Stx2eB 的生产(a) Stx2eB表达双元载体的构建为使用植物的稳定转化体进行Stx2eB的生产，将ADH-ER-Stx2eB在转化用载体进 行了亚克隆。即，使用Xbal以及SacI将ADH_ER_Stx2eB插入到pBI121 (Clontech公司)， 配置在花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(35S pro.)和胭脂碱基因转录终止子(N0S-T)之 间，制作了 Stx2eB表达双元载体。(b)转化土壤杆菌的制作Agrobacterium tumefacience EHA105(Hood EE, Gelvin SB, Melchers LS, HoekemaA(1993)New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Transgenic Res. 2 208-218)的单菌落接种到5ml的YEB培养基(细菌蛋白胨5g/l、牛肉 浸膏5g/l、酵母提取物lg/1、蔗糖5g/l、MaS04 7H20 0. 5g/l)，在28°C下振荡培养1晚。 将该培养液接种到500ml的YEP培养基，在28°C下振荡培养至600nm中的浊度成为0. 5为 止。通过离心分离(5000rpm、10分钟、4°C;BECKMAN JLA-10，500转头)收集培养液，丢弃上 清，为清洗菌体加入500ml的灭菌水令其悬浊，再次通过离心分离(5000rpm、10分钟、4°C ； BECKMAN JLA-10，500转头)集菌，丢弃上清。将该操作重复2次之后，在沉淀中加入20ml 的冷却的灭菌10%甘油进行悬浊。移到NALGENE管，通过离心分离(5000rpm、10分钟、4°C； BECKMAN JLA-10，500转头)集菌，丢弃上清。在沉淀中加入3ml的冷却的灭菌10%甘油进 行悬浊，在每个1. 5ml微小离心管分注40 iU，用液氮冻结后，保存于-80°C。在冰中将感受态细胞解冻，加入1 2 ill的上述双元载体溶液，移到冰冷却过的2mm小试管。通过电转化仪(BIO RAD、Gene Pulser)给予电脉冲(2. 5KV、25 ii F、400 Q )，导 入载体。加入1ml的S0C培养基，28°C下振荡培养1晚后，短暂离心，除去大部分上清，得到 菌体，在剩余的培养基中悬浊菌体，铺在含有适当的抗生素的LB琼脂培养基，30°C下培养2 晚。(c)转化烟草的制作烟草BY2 培养细胞的转化按照 An (An G (1985) High efficiency transformation of culturedtobacco cells. Plant Physiol. 79 :568_570)的方法进行。将按照上述(b) 的方法得到的转化土壤杆菌的菌体在含有卡那霉素100mg/l的5ml的LB培养基中28V、 培养2晚的土壤杆菌培养液100 u 1和培养第4天的烟草BY2培养细胞悬浊液5 10ml 放入皮氏培养皿中充分混勻，25°C、2晚、暗处静置，共存培养。为了除去土壤杆菌，将皮 氏培养皿中的培养液移到15ml离心管中离心(1000rpm、5分钟、4°C ；BECKMAN GS-6KR centrifuge)，除去上清。加入新的改变LS培养基，离心分离(1000rpm、5分钟、4°C ;BECKMAN GS-eKRcentrifuge)，清洗细胞。重复该操作4次后，除去土壤杆菌后，将烟草BY2培养细胞 铺在加入了卡那霉素100mg/l的改变LS琼脂培养基，25°C、暗黑下静置培养。约2_3周后 将愈伤组织(callus)化的细胞移植到新的培养板中，筛选增殖的克隆。移到加入了卡那霉 素100mg/l的改变LS培养基30ml中，进行继代培养。(d) Western 分析通过和上述一样使用抗HA抗体的Western分析，评价上述制作的转化烟草BY2培 养细胞中的Stx2eB的积蓄量。结果示于图16。图16的各泳道的数字各自表示独立的系 统。“空载体”表示仅导入不含“ADH-ER-Stx2eB”的载体pBI121的试样。(10)Stx2eB 的生产(a)密码子改变Stx2eB的设计作为密码子改变Stx2eB，设计了在GC含量高的密码子中选择在莴苣中使用频率 低的密码子的序列。将制作的密码子改变Stx2eB作为mStX2eB5 (序列编号79)。用CLUSTALW(http://align, genome, jp/)比较已设计好的 mStx2eB5 的碱基序列 (图17)。密码子改变前后的Stx2eB的序列XXG/C(X为任意碱基)比为100%，GC比为 62. 4%。(b)密码子改变Stx2eB的制作以设计好的mStx2eB5的碱基序列为基础，制作了具有6种碱基序列的引物。使用 这些引物，用与上述(3)中的密码子改变Stx2eB的制作相同的方法得到mStx2eB5。引物A 序列编号80B 序列编号81C 序列编号82D 序列编号83E 序列编号84F 序列编号85(c)密码子改变Stx2eB表达载体的构建为使用植物的稳定转化体进行密码子改变Stx2eB的生产，使用上述(3)制作的
20mStx2eBl 4 以及(b)制作的 mStx2eB5,将 ADH-ER-mStx2eBl_5 (序列编号 75 78,86) 在转化用载体进行了亚克隆。即，分别使用Xbal以及SacI将ADH-ER-mStX2eBl-5插入到 PBI121 (Clontech公司)，配置在花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(35S pro.)和胭脂碱基 因转录终止子(N0S-T)之间，制作了 mStx2eBl-5表达双元载体。(d)转化土壤杆菌的制作将(c)中制作的mStx2eBl-5表达双元载体，用上述(9) (b)所示的方法相同地导 入于根癌土壤杆菌EHA105，得到转化土壤杆菌。(e)转化烟草的制作使用(b)中得到的转化土壤杆菌，用上述(9)(c)所示的方法相同地，将 mStx2eBl-5表达双元载体分别导入烟草BY2培养细胞，制作转化烟草。(d) Western 分析通过和上述一样使用抗HA抗体的Western分析，评价上述制作的转化烟草BY2培 养细胞中的Stx2eB蛋白质的积蓄量。结果示于图18以及19。图18中，一并显示mRNA水 平的测定结果。如图18 所示，在泳道 0 (ADH-ER_Stx2eB)、泳道 1 (ADH_ER-mStx2eBl)、泳 道 2 (ADH-ER-mStx2eB2)、泳道 3 (ADH_ER-mStx2eB3)、泳道 4 (ADH_ER-mStx2eB4)、泳道 5 (ADH-ER-mStx2eB5)，都检测出 S. P.没有被切断的 Stx2eB 前驱体(约 12kDa、pre_mature) 以及Stx2eB (约8kDa、mature)，但在泳道2未检测出。在图19中，密码子1 5分别表示mStx2eBl-5。此外，各泳道的数字分别表示独 立的系统。在mStx2eBl、mStx2eB3、mStx2eB4、mStx2eB5，在几个系统中检测出蛋白质，但在 mStx2eB2的所有的系统中都未检测出蛋白质。在检测出蛋白质的系统中比较其检测量的 话，尤其在mStx2eB3以及mStx2eB5较多。即，可知，不管在莴苣中的使用频率如何，通过设 计GC含量高的密码子，翻译量增大。(11)猪浮肿病疫苗投与试验(a)猪浮肿病疫苗的制造将在上述(8) (a)中精制的Stx2eB_GST融合蛋白质以8mg/ml的浓度在PBS悬浊， 作为猪浮肿病疫苗，(b)浮肿病菌胶囊的制作[菌种]来源于猪的产vero细胞毒素大肠杆菌(VTEC)No. 1362-1 (来源于40天死亡的猪)血液型0139、fedA,+毒素:Stx2e, + ；ST, + ；LT,-[制作]将上述No. 1362-1菌株在TS肉汤中37°C培养4小时。培养后，进行离心分离，将 沉淀装入脂溶性胶囊中。(c)疫苗及浮肿病菌的投与将养猪场中饲养的健康的哺乳期仔猪从每3头母猪处各选6头，合计选择18头， 如表4所示地分为5组。此时，分组时令来自不同母猪的仔猪包含在各组内，且雌雄都包含 在各组内。2 4组的仔猪中，以6、12、18天龄，将表4所示的规定量(每次)的猪浮肿病疫苗用吸液管鼻腔投与，在21天大为止在养猪场中和母猪一起进行饲养。1、5组的仔猪中 用同样的方法鼻腔投与PBSO. 5ml。仔猪成为21天大时，将仔猪从母猪分离，每组收容在用 保温灯进行温度管理的水泥地板制、铺设木屑的仔猪房中饲养。饲料使用SDSNo. 1(日本配 合饲养株式会社制造)，使猪自由摄取饲料及水。还有，在饲养期间中，记录了饲料摄取量 (质量)以及体重。从收容经过4天后，向1 4组的仔猪1天1次、3天(25 27天大之 间)强制经口投与浮肿肿病菌胶囊。将生理盐水放入肠溶性胶囊中向5组强制投与。[表 4] 从强制投与浮肿病菌的第0天开始到第11天为止每天进行临床观察。对作为浮 肿病的临床症状已知的、眼周围浮肿、神经症状、运动机能、姿势、粪便性状、食欲、呼吸状态 的项目进行观察，根据以下基准，临床症状评分。眼周围浮肿(0 无，1 轻度，2 中度，3 重度)神经症状(0 无，1 轻度，2 中度，3 重度)运动机能(0 正常，1 减退，2 消失)姿势(0 正常，1 (犬坐姿)，2 俯卧 横卧)粪便性状(0 正常，1 软便，2 泥状便，3 水样 粘血便)食欲(0 正常，1 稍不振，2 不振，3 不食)呼吸状态(0 正常，1 稍快，2 快)此外，在强制投与浮肿病菌的第0、3、7以及第11天采取粪便，在强制投与浮肿病 菌的第0及第11天采取血液。(d)试验结果(i)抗体效价的测定用ELISA测定在强制投与浮肿病菌的第0天采取的粪便中的Stx特异性IgA的抗 体效价。还有，粪便用9倍量的PBS稀释后，悬浊、离心分离，回收上清，作为测定试样。结 果示于图20。此外，用ELISA测定在强制投与浮肿病菌的第0天采取的血液中的Stx特异 性IgG的抗体效价。结果示于图21。抗体效价的个体差大，在组之间没有显著差异，但在投 与了浮肿病疫苗的组中可见到显示高值的个体。(ii)浮肿病菌的检测对在强制投与浮肿病菌的第3天采取的粪便中的浮肿病菌基因进行定量，求出浮肿病菌数。即，用QUICK GENE(富士 7 O ^ )提取粪便中的DNA，使用实时定量PCR(根据 Tsukahara et al. (2007))对浮肿病菌基因定量，求出浮肿病菌数。结果示于图22。对投 与了浮肿病菌的1 4组的个体，确认感染了浮肿病菌。(iii)饲料需求率的算出从饲料摄取量以及体重的测定结果求出强制投与浮肿病菌前4 1天 (d-4 -1)、强制投与浮肿病菌的第0 3天(d0 3)、4 7天(d4 7)、8 11天(d8 11)的饲料需求率。此外，求出上述整个期间(d-4 11)的饲料需求率。还有，饲料需求率 用一定期间中增加1kg所需的饲料摄取量表示。饲料需求率=饲料摄取量/所增体重将整个期间的饲料需求率示于图23、将饲料需求率的推移示于图24。整个期间的 饲料需求率是，没有投与浮肿病疫苗而感染了浮肿病菌的1组最大，以4mg/头投与了浮肿 病疫苗的3组最小。此外，1组在投与浮肿病菌第0 3天显示出极大的饲料需求率。这是 由于浮肿病菌感染而引起腹泻，未见到体重随饲料摄取量而增加，饲料需求率变高。(iv)临床观察对各项目，从得到的临床症状评分，算出每天各组的每头猪的平均临床症状评分。 将平均临床症状评分的推移示于图25。此外，还算出了每头仔猪在整个期间(投与浮肿病 菌第0 11天)的平均合计临床症状评分。将此示于图26。在无投与浮肿病疫苗的1组 仔猪中，在投与浮肿病菌第1 3天出现浮肿病的临床症状，恶化，到第11天为止可观察到 同样的临床症状。在投与了 lmg浮肿病疫苗的2组仔猪中，在投与浮肿病菌第1 4天出 现浮肿病的临床症状，恶化，到第11天为止可观察到同样的临床症状。另一方面，在投与了 4mg浮肿病疫苗的3组仔猪及投与了 16mg浮肿病疫苗的4组仔猪、非感染浮肿病菌的5组 仔猪中，整个期间几乎没有观察到浮肿病的临床症状。尤其，在这些组中，完全未观察到浮 肿病特征性的眼周围浮肿。将未投与浮肿病疫苗的1组仔猪、及投与了 16mg浮肿病疫苗的 4组仔猪的第11天的照片示于图27。未投浮肿病疫苗的1组仔猪可见到眼周围有重度浮 肿，引起水样腹泻。另一方面，投与了 16mg浮肿病疫苗的4组仔猪眼周围未见到浮肿，也没 有引起腹泻。此外，从整个期间的合计临床症状评分知道了通过投与浮肿病疫苗，可以缓和或 抑制浮肿病的临床症状。尤其，在3次投与中，通过每次投与4mg以上浮肿病疫苗，可以有 效地抑制浮肿病的临床症状。产业上的利用可能性通过使用本发明的DNA构建物，通过转化植物等，可以有效地得到生产Stx2e蛋白 质的转化体。若使用本发明的DNA构建物，可以使用莴苣等的栽培成本低的植物有效制造 猪浮肿病疫苗。此外，若使用本发明的猪浮肿病疫苗，可以简便且有效防除猪浮肿病。
权利要求
一种DNA构建物，含有来源于植物的醇脱氢酶基因的5’-非翻译区以及在该区域可表达地连接的编码Stx2e蛋白质的DNA，所述Stx2e蛋白质在氨基末端附加有来源于植物的分泌信号肽。
2.如权利要求1记载的DNA构建物，所述醇脱氢酶基因的5’-非翻译区来源于烟草。
3.如权利要求1或2记载的DNA构建物，所述分泌信号肽来源于烟草。
4.如权利要求1 3的任一项记载的DNA构建物，所述Stx2e蛋白质是Stx2e蛋白质 的B亚基。
5.如权利要求1 4的任一项记载的DNA构建物，所述Stx2e蛋白质在羧基末端附加 有内质网滞留信号肽或液泡运输信号肽。
6.如权利要求5记载的DNA构建物，内质网滞留信号肽在羧基末端含有KDEL序列或 HDEL序列。
7.如权利要求5记载的DNA构建物，液泡运输信号肽来源于烟草。
8.如权利要求1 7的任一项记载的DNA构建物，具有序列编号12所表示的碱基序列。
9.如权利要求5记载的DNA构建物，具有序列编号23、24、75、77、78、86的任意一个表示的碱基序列。
10.一种重组载体，含有如权利要求1 9的任一项记载的DNA构建物。
11.一种转化体，用权利要求10记载的重组载体转化。
12.如权利要求11记载的转化体，转化体是转化植物细胞或转化植物。
13.如权利要求12记载的转化体，所述植物是莴苣(Lactucasativa)。
14.一种种子，从权利要求12或13记载的转化体得到。
15.一种猪浮肿病疫苗，含有权利要求11 13的任一项记载的转化体。
16.一种猪浮肿病的防除方法，其特征在于，将权利要求15记载的猪浮肿病疫苗向猪 投与。
全文摘要
开发低成本且高效率生产猪浮肿病疫苗的技术。具体地，在植物细胞效率良好地表达猪浮肿病的毒素蛋白质(Stx2e蛋白质)的基因，低成本地生产猪浮肿病的植物疫苗。使用来源于植物的醇脱氢酶基因的5’-非翻译区(ADH5’UTR)，在莴苣等的植物细胞表达在氨基末端附加有来源于植物的分泌信号肽的Stx2e蛋白质。
文档编号A61P39/02GK101868540SQ200880023029
公开日2010年10月20日 申请日期2008年3月25日 优先权日2007年7月3日
发明者吉田和哉, 川本惠子, 松井健史, 泽田和敏, 牧野壮一 申请人:出光兴产株式会社;国立大学法人奈良先端科学技术大学院大学;国立大学法人带广畜产大学