合成吗啉代低聚物的方法

专利名称：合成吗啉代低聚物的方法
技术领域：
本发明涉及通过吗啉代亚基单体的偶联来合成连接磷酰二胺的吗啉代低聚物的 方法，具体地涉及用于在每个偶联步骤中使受保护的吗啉代环氮脱保护的改进的方法，并 涉及在鸟嘌呤碱基的N2和06/m基团上均具有保护的鸟嘌呤吗啉代(MoG)亚基的用途。与 使用单保护的鸟嘌呤亚基和/或常规的环氮脱保护方法合成的吗啉代低聚物相比，使用这 些改良合成的吗啉代低聚物的纯度和收率更高。参考文献Albert,A. ,Physical Methods in Heterocyclic Chemistry (l^i^Uf 巾白勺 ), Vol. I, A. R. Katritzky, Ed. , Academic Press, pp 44(1963).Fisher, A.，Galloway, W. J.，and Vaughan, J.，J. Chem. Soc. 3591 (1964).Garrison, A. W. and Boozer, C. E.，J. Am. Chem. Soc. 90 (13) :3486_3494 (1968) ·Gough et al. (1979) Nucleic Acids Research (核酸研究)7 :1955_1964.Hata et al. (1983)Tetrahedron Lett. 24 :2775_2778.Jones et al. (1982A)Tetrahedron Lett. 23 :2253_2256.Jones et al. (1982B)Tetrahedron Lett. 23 :2257_2260.Mitsunobu, 0. (1981) Synthesis ( ) 1 :1"28.Ravikumar, V. et al，第 5，510，476 号美国专利。Reese et al. (1981)Tetrahedron Lett. 22 :4755-4758.Reese et al. (1984) J. Chem. Soc. , Perkin Trans. 1 1263—1270.Rogne, 0.，J. Chem. Soc. 727 (1970).Summerton, J. E. and Weller, D. D. (1993)第 5，185，444 号美国专利。Summerton, J. Ε. and ffeller, D. D. , Antisense Nuc 1. Acid Drug Dev. 7 (3) 187-195(1997).Summerton, J. E. and ffeller, D. D.，第 5，185，444 号美国专利(1993)。SS连接磷酰二胺的吗啉代低聚物或PMO是核酸类似物，其与互补RNA紧密结合并具 有特定的序列，并且用于调节蛋白合成并由此调节基因表达。这些低聚物是由通过吗啉代 主链体系支持的碱基配对识别部分(杂环碱基)组成的。能够很容易地由相应的核糖核苷 来制备用于合成这样的低聚物的吗啉代亚基，该核糖核苷容易购买并且是便宜的前体(参 见例如 Summerton and Weller，1993，1997)。在这样的合成中，与常规的寡核苷酸合成相同，通常将杂环碱基上的官能团掩蔽 以防止合成转化中的干扰。例如，N-三苯甲基化吗啉代单体(la-f ；

图1)的活化需要使 5’_羟基与合适的二氯磷酰胺反应以形成活化的亚基2a-f。在大型(50-100加仑反应器) 中，粗活化亚基通常被高水平的副产物污染。色谱分离纯化之后 ，将活化亚基以约50%的收 率分离成A、C、I、T、U和它们的受保护形式，而仅以5%的收率分离成活化的单独保护的G 亚基，这被认为是由于未受保护的06氧的存在。
06-未受保护的鸟嘌呤亚基在低聚物阶段也发生副反应。例如，在偶联步骤中06 氧能够与活化的亚基反应形成06-磷酸化化合物或衍生化合物，并且在用氨最终裂解碱基 保护基的过程中，氨能够在C6上反应以取代这些化合物，得到二氨基嘌呤衍生物。这样的 杂质难以通过色谱法除去，并造成收率的大量损失。在本领域中，已经提出了各种保护方案以减少常规的寡核苷酸合成中的未受保护 的鸟嘌呤06位的副反应(参见例如Gough et al. 1979 ；Reese et al. 1981，1984 Jones et al. 1982A，1982B)。然而，这些方案在应用于PMO合成中时大多是不成功的。因此，在PMO 合成中，特别是在采用G吗啉代亚基的PMO合成中寻求改进的方法以增加收率和纯度。在使用之前，通常还用三苯甲基或取代的三苯甲基化合物对吗啉代亚基的吗啉代氮进行保护。在低聚物合成过程中，该基团在每个周期中必须被除去以引入下一个亚基。无 法完全除去保护基团造成污染期望的低聚物产物的N-I缺失序列的形成。通常用酸来除去三苯甲基，并且传统上用于PMO合成的脱保护试剂为羧酸 (Summerton et al. 1993，1997)。然而，磷酰二胺基团也易受到酸的影响，并且如图1所示， 用于脱三苯甲基化的羧酸也能够促进与酰胺化合物键合的磷酰二胺键的水解，可能具有更 大量的主链降解。例如，包含氰基乙酸的20%乙腈/DCM是有效的脱保护试剂，但是发现其 导致PMO产物中磷酰二胺键的大量水解(5-10% )。在偶联反应之前，还必须将羧酸从合成载体树脂中完全除去；否则，形成由含有 3’ _酰化化合物的截断的低聚物组成的副产物。基于这些原因，在PMO合成中需要改进的试剂用于吗啉代氮脱保护。MM在一方面，本发明提供了包含结构I的吗啉代化合物 其中R1选自低级烷基、二(低级烷基)氨基和苯基；R2选自低级烷基、单环芳基甲基和单环(芳氧基)甲基；R3选自三芳基甲基和氢；并且Y选自受保护或未受保护的羟基或氨基、氯氨基磷酸酯基团和与另外的吗啉代化 合物或吗啉代低聚物的环氮键合的磷酰二胺键。在所选择的实施方案中，Y选自受保护或未受保护的羟基和氯氨基磷酸酯基团，例 如-ο-Ρ( = ο)-N(CH3)2Cl形式的氯氨基磷酸酯基团。当Y为受保护的羟基时，其优选为三烷基甲硅烷基保护的羟基。优选地，基团R3选自三苯甲基(三苯基甲基)、4_甲氧基三苯甲基、4-甲基三苯甲基、4，4’ - 二甲基三苯甲基和4，4’，4”_三甲基三苯甲基。基团R1优选为低级烷基，特别 是C1-C4烷基，并且最特别为-C (CH3) 3 (叔丁基)。基团R2优选选自苄基和-CH (CH3) 2 (异丙基)。在相关的方面中，本发明提供了合成吗啉代低聚物的改进方法，该方法包括(a)使具有未受保护的环氮的固相支持的吗啉代亚基与碱基保护的吗啉代亚基单 体反应，所述吗啉代亚基单体具有三芳基甲基保护的环氮和5’ -环外碳上的活化的氨基磷
酸酯基团，由此形成5’ -环外碳与未受保护的环氮之间的磷酰二胺键；(b)将受保护的环氮脱保护以形成未受保护的环氮；以及(c)用另外的碱基保护的吗啉代亚基单体将步骤(a)和(b)重复一次或多次；其中至少一种的碱基保护的吗啉代亚基单体为具有结构I的双重保护的鸟嘌呤 吗啉代化合物 其中R1选自低级烷基、二(低级烷基)氨基和苯基；R2选自低级烷基、单环芳基甲基和单环(芳氧基)甲基；R3选自三芳基甲基和氢；并且Y为氯氨基磷酸酯基团。上述结构中表示的变量的所选择的实施方案包括上文描述的那些实施方案。在另外的方面中，本发明提供了合成吗啉代低聚物的改进的方法，该方法包括(a)使具有未受保护的环氮的固相支持的吗啉代亚基与碱基保护的吗啉代亚基单 体反应，所述吗啉代亚基单体具有三芳基甲基保护的环氮和5’ -环外碳上的活化的氨基磷 酸酯基团，由此形成5’ -环外碳与未受保护的环氮之间的磷酰二胺键；(b)将受保护的环氮脱保护以形成未受保护的环氮；以及(c)用另外的碱基保护的吗啉代亚基单体将步骤(a)和(b)重复一次或多次；其中所述脱保护包括在含有三氟乙醇的溶剂中，使三芳基甲基保护的环氮与包含 杂环胺盐的试剂溶液接触，所述盐为杂环胺与选自磺酸、三氟乙酸和盐酸的酸的盐，所述杂环胺的质子化形式的PKa为1-4。优选地，杂环胺选自吸电子基取代的吡啶、噻唑、哒嗪、吡唑、三唑以及吸电子基取 代的这些化合物的取代衍生物。这样的吸电子基(EWG)包括卤素、氰基、醛、酮、羧酸酯和甲酰胺。优选地，杂 环胺为吸电子基取代的吡唳，例如氯取代的吡啶或氰基取代的吡啶。优 选地，胺盐为诸如烷基磺酸盐、(氟烷基)磺酸盐或对甲苯磺酸盐的磺酸的盐或者三氟乙酸 盐。在所选择的实施方案中，该盐选自3-氯吡啶鐺甲磺酸盐(CPM)和4-氰基吡啶鐺三氟 乙酸盐(CYTFA)。优选地，含有TFE的溶剂包含体积比为约90 10至25 75的二氯甲烷和三氟 乙醇，并且更优选地，其体积比为约80 20DCM TFE。三芳基甲基保护基团选自三苯甲基(三苯基甲基)、4_甲氧基三苯甲基、4-甲基三 苯甲基、4，4，- 二甲基三苯甲基和4，4，，4”_三甲基三苯甲基。可以将本文所描述的改良和改进组合，从而进行上述步骤(a)-(c)，其中(i)至少一种的碱基保护的吗啉代亚基单体为具有如上文所述的结构I的双重保 护的鸟嘌呤吗啉代化合物，以及(ii)受保护的环氮的脱保护包括在含有三氟乙醇的溶剂中，使三芳基甲基保护的 环氮与包含杂环胺盐的试剂溶液接触，所述盐为杂环胺与选自磺酸、三氟乙酸和盐酸的酸 的盐，所述杂环胺的质子化形式的PKa为1-4。通常，合成还包括按照标准方法将吗啉代低聚物从固相中裂解并将碱基脱保护。当结合附图来阅读下文的发明详述时，本发明的这些和其它目的和特征将变得更 加完全明显。附图简述图1显示活化的吗啉代亚基的形成。图2显示双重保护的吗啉代G亚基(DPG)衍生物的形成路线，其中将N2位苯乙酰 化并用4-硝基苯乙基(NPE)来保护06位。图3显示双重保护的吗啉代G亚基(DPG)衍生物的可选的形成路线，其中将N2位 苯乙酰化并采用4-硝基苯乙基(NPE)来保护06位。图4显示DPG衍生物的形成，其中将N2位苯乙酰化并采用苯基磺酰基乙基(PSE) 或甲基磺酰基乙基(MSE)来保护06位。图5显示DPG衍生物的形成，其中将N2位苯乙酰化并采用三甲基甲硅烷基乙基 (TMSE)来保护06位。图6显示DPG衍生物的形成，其中将N2位苯乙酰化并采用一系列芳基衍生物来保 护06位。图7显示DPG衍生物的形成，其中将N2位苯乙酰化并采用一系列氨基甲酰基衍生 物来保护06位。图8显示DPG衍生物的形成，其中将N2位苯乙酰化并采用4_(新戊酰氧基)苄氧 基(POB)来保护06位。图9显示在用羧酸处理磷酰二胺键合的吗啉代低聚物(PMO)时能够发生的副反应 中，磷酰二胺(PDA)键向氨基磷酸酯(酰胺化物)键的转化。
图10显示二硫化物锚的制备，其用在合成树脂的改性中，通过用硫醇处理使低聚 物轻易地释放，该合成树脂用于吗啉代低聚物的逐步制备。图11显示含有三甘醇的部分(“尾部”)的制备，该部分增加合成的反义低聚物的 水溶性。图12显示用于固相合成吗啉代低聚物的树脂的制备。发明详述I.定义除非另有说明，本文所用的以下术语具有下述含义“吗啉代低聚物”是指具有主链的聚合物分子，所述主链支持能够与通常的多核苷 酸形成氢键的碱基，其中该聚合物缺少戊糖主链部分，并且更具体地来说缺少通过磷酸二 酯键连接的核糖主链，该核糖主链为典型的核苷酸和核苷，但是相反地该聚合物含有环氮， 通过该环氮进行偶联。如以下所示，优选的吗啉代低聚物由“吗啉代亚基”结构组成，其中 优选地，通过(硫代)磷酰二胺键将该低聚物连接在一起，将一个亚基的吗啉代氮连接至相 邻亚基的5’环外碳。每个亚基包括嘌呤或嘧啶碱基配对部分Pi，其通过碱基特异性氢键有 效地与多核苷酸中的碱基结合。 例如在共有的美国专利5, 698, 685,5, 217, 866,5, 142, 047,5, 034, 506, 5，166，315,5, 185，444,5, 521，063和5，506，337中详细描述了吗啉代低聚物，所有这些专 利通过引用明确地并入本文。“磷酰二胺”基团包含具有两个结合的氧原子和两个结合的氮原子的磷，并且在本 文中还可以指具有一个结合的氧原子和三个结合的氮原子的磷。如以下通式II所示，在本 文所述的低聚物的亚基间的键中，一个氮通常悬挂在主链上，并且第二个氮为吗啉代环结 构中的环氮。或者或此外，如以下通式III和IV所示，氮可以存在于5’ -环外碳上。 在硫代磷酰二胺键中，一个氧原子，通常为悬挂在本文所述低聚物的主链上的氧， 被硫代替。“固相支持的吗啉代亚基”能够是第一个或任意随后的吗啉代亚基单体，其通过本 文所述的固相逐步合成被引入吗啉代低聚物中。该亚基通过其5’环外碳结合至固体载体 或固体载体上的生长的低聚物链。“碱基保护”是指采用保护基团对吗啉代亚基上的诸如嘌 呤或嘧啶碱基的碱基配对基团进行的保护，该保护基团适于避免逐步低聚物合成过程中碱基配对基团的反应或干扰。“活化的氨基磷酸酯基团”通常为氯氨基磷酸酯基团，其在低聚物中的最终的氨基 磷酸酯键中所期望的氮处具有取代。实例为(二甲基氨基)氯氨基磷酸酯，即-0-P( = 0) (NMe2) Cl。本文所使用的术语“带电荷的”、“不带电荷的”、“阳离子的”和“阴离子的”是指处 于诸如约6至8的接近中性pH值的化学部分的主导状态。优选地，该术语是指处于生理pH 值即约7. 4的化学部分的主导状态。“低级烷基”是指1至6个碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基、 异戊基、正戊基和异戊基。在所选择的实施方案中，“低级烷基”基团具有1至4个碳原子， 或者1至2个碳原子；即甲基或乙基。类似地，“低级烯基”是指2至6个，优选3或4个碳 原子的烯基，例如烯丙基和丁烯基。“不干扰的”取代基为对本文所述的反义低聚物结合至其预期的靶的能力没有不 利影响的取代基。这样的取代基包括小的基团并优选为非极性基团，例如甲基、乙基、甲氧 基、Zi氧基、轻基或氟。II. PMO合成中的碱基保护由于吗啉代化学的具体挑战，碱基保护基团必须满足若干要求。该保护基团应当 容易被引至杂环部分上并且在此之后对亚基活化和纯化条件以及固相合成是稳定的。该保 护基团应当不与生长链的吗啉代胺部分反应，而应当使活化的吗啉代亚基与生长的低聚物 链完全偶联。该保护基团应当优选被氨裂解，而不引入新的杂质。最后，为了避免在活化之 前色谱纯化的需求，其应当导致结晶亚基衍生物的生成。如下文和比较例中所描述的，如用于核酸合成的在双重保护的鸟苷的文献中报导 的保护基团不够满足这些标准。因此，对于吗啉代G亚基需要新的保护策略。如下文所述， 发现06位的4-(新戊酰氧基)苄氧基的使用满足所有上述标准。A. 06保护基团比较数据Al. 4-硝基苯乙基醚(NPE)如图2(Mitsunobu 1981)或图 3 (Jones et al. 1982B)所示制备了该衍生物。虽 然能够以合理的收率来制备粗06保护的亚基，但该化合物不容易结晶并且仅能够通过硅 胶色谱来进行足够的纯化，这对于大规模生产是不期望的。在对大范围的重新打浆和/或 重结晶条件进行测试之后，发现含有丁氧基乙醇的溶剂组合使材料结晶有一些困难。然而， 由于化合物可能作为溶剂合物结晶，因此不能将过量的丁氧基乙醇从最终产物中除去。在 活化反应中，存在过多的醇溶剂会是不可接受的。通过β -消除机理用强碱将NPE基团裂解。这些条件倾向于产生反应性副产物 4-硝基苯乙烯，其能够随后与低聚物上的反应活性部位反应。虽然将各种清除剂(例如硫 醇和1，3_ 二羰基化合物)加入脱保护混合物中以试图阻止低聚物对副产物的捕获，但均没 有完全成功地消除这个内部回转问题。甚至在纯化之后，用这种亚基制备的低聚物仍具有 黄色的色调。Α2.苯基磺酰基乙基(PSEI)和甲基磺酰基乙基(MSE)
如图4所示，通过相应的2-硫代乙醇衍生物将这些基团引入(Joneset al. 1982A， 1982B)。然而，对于最终的亚基，未能发现成功的结晶方法。
像以上的NPE基团一样，通过β-消除机理将这些基团裂解。加入低聚物中之后， 这些衍生物产生了与采用NPE基团出现的相同问题；即脱保护的过程中形成的反应性烯烃 副产物的内部回转。
A3.三甲基甲硅烷基乙基醚如Jones (Jones et al. 1982B)所报导的，按照图5所示制备了 06-TMSE-改性的 吗啉代鸟嘌呤亚基，但是其在低聚物合成中是不稳定的。用这种亚基制备的低聚物显示出 与由06-未受报护的G亚基制备的低聚物相似的一系列副产物。A4.苯基醚 按照Reese et al. (1981,1984)的方法制备了具有06-苯基取代的吗啉代鸟嘌呤 亚基(图6)。衍生物包括未取代的苯基、2，5-二氯苯基、五氟苯基和3-氟苯基。这样的亚 基能够被引入PMO中，但是不能使采用常见试剂的脱保护进行完全而没有低聚物的降解， 该常见的试剂例如2-硝基苯甲醛肟和强碱。A5.氨基甲酸酯按照Hata et al. 1983的方法合成了若干06-氨基甲酸酯衍生物(图7)。取决于 所使用的衍生物，在低聚物合成中这些衍生物的使用给出了变化的结果。对于诸如二苯基 氨基甲酰基类似物的较不稳定的化合物来说，在固相合成的偶联步骤中保护基团向生长链 的3’ -氮的转移是显著的，结果生成含有3’ - 二苯基氨基甲酰基部分的截断的低聚物。此 夕卜，06-氨基甲酸酯具有两个可能与氨反应的部位。虽然诸如二苯基氨基甲酰基的更有活 性的部分在羰基上产生相对选择性的攻击，但更稳定的二甲基氨基甲酸酯和吡咯烷基氨基 甲酸酯显示出明显的转化成二氨基嘌呤的竞争的C6位的氨的反应。B. 4-(新戊酰氧基)苄氧基保护基团通过有效的、高收率的合成将4_(新戊酰氧基)苄氧基醇(4a，图8)引入吗啉代 鸟嘌呤亚基中。活化之前能够大规模地合成并且可重现地分离该亚基(图1和8中的化合 物If)而无需色谱纯化，并且能够使其从多种溶剂(例如THF/水、THF/庚烷、乙腈、各种酯 /烃混合物)中结晶。以50-200加仑的规模(批次大小8-27kg的化合物Ic)制备的十个 批次的这种亚基获得了平均收率为65%的产物，其纯度(通过HPLC)为97.6%至99.2%。与单保护的G相比，该亚基更完全地转化成活化的亚基(即转化成5’ _氯氨基磷 酸酯化合物)，并且其能够更容易通过硅胶色谱法纯化。在规模上，从化合物If至化合物 2f (图1)的总体收率为约50%。可以采用POB保护基团以及用于N2和吗啉代环氮的保护基团的其它组合。合适 的N2保护基团包括苯乙酰基(如图8所示)以及乙酰基、丙酰基、异丁酰基和苯氧乙酰基。 适合用于偶联步骤之间的吗啉代环氮保护的三苯甲基化合物包括未取代的三苯甲基、4-甲 基-三苯甲基、4，4’_ 二甲基-三苯甲基和4，4’，4”_三甲基三苯甲基，以及4-甲氧基三苯 甲基。还能够使用其它酰基保护基团来代替POB基团的苯酚部分的新戊酰基。合适的选 择包括N，N-二甲基氨基甲酰基和苯甲酰基。在PMO合成过程中，没有看见其中新戊酰基已经变成结合至完全长度的PMO的较 小片段的3’ _末端的产物，即上文讨论的06-氨基甲酸酯常见的副反应。检测到的唯一显 著的副产物为含有酚残余物的ΡΜ0，其由与脱保护副产物醌甲基化物的反应产生。然而，通过含氨的脱保护溶液的足够稀释能够使该副产物减少至痕量水平。此外，通过酚残余物与 用于强阴离子交换色谱法的聚合物树脂的牢固结合，很容易除去该副产物。通常，如表1所 示，纯化的PMO的总体收率大幅提高。在PMO固相合成之后的纯化中，其中除去二氨基嘌呤和相关副产物的困难能够导 致强的阴离子交换(SAX)色谱过程中的严重损耗，由POB保护的鸟嘌呤基团促进的PMO产 量的提高是最显著的。例如， 用CPM和MPG(单保护的鸟嘌呤亚基，2c)制备的AVI-4126的 粗纯度为68 %至73 %，其计算出的PMO的粗收率为约58 %。在结合三苯甲基和脱三苯甲基 的纯化过程中，损耗大量的材料以获得纯净产物，并且色谱法的总体回收率为52%。对于用 CYTFA和DPG(双重保护的鸟嘌呤亚基)制备的AVI-4126来说，其粗纯度为70%至75%，具 有通过质谱法测量的相当高的N-I水平(表明CYTFA和CPM试剂的脱三苯甲基化效率是大 约相等的)和约61%的粗收率。然而，应用常见的纯化方法从粗混合物中回收80%的ΡΜ0。表1 按照在共有的美国申请11/801，885中所描述的方法，使用该表中所示的改性进 行了合成；参见以下的实施例3-6。所有的PMO具有5’- “尾部”并且在3’-末端是未取代的。1CAA =含11%氰基乙酸(w/w)的20 %的乙腈/DCM (ν/ν)混合物；CPM=含2% 3-氯吡啶鐺甲磺酸盐(w/v)和0.9%乙醇(ν/ν)的20%三氟乙醇/DCM(ν/ν) ；CYTFA =含 2% 3-氰基吡啶鐺三氟乙酸盐(w/v)和0.9%乙醇(ν/ν)的20%三氟乙醇/DCM (ν/ν)。2规模为起始树脂的重量克数。树脂的填充量为480-520微摩尔/克34X12g和lX8g运行的组合产量。42X12g运行的组合产量。54X12g运行的组合产量。6用在吗啉代氮上具有4-甲氧基三苯甲基保护的活化的吗啉代C亚基进行了最后 的C亚基的添加。因此，使用本发明的双重保护的MoG单体提供了合成吗啉代低聚物的方法，相对 于现有技术方法来说，特别是与当采用单保护的MoG单体或其它非本发明的受保护的MoG 单体时所观察到的纯化收率相比，该方法提高了纯化收率。尤其是，与使用非本发明的MoG 单体会获得的二氨基嘌呤化合物相比，该方法优选产生降低的二氨基嘌呤化合物水平。III.双重保护的鸟嘌呤吗啉代亚基本发明的双重保护的鸟嘌呤(DPG)吗啉代亚基具有以下结构 其中R1选自低级烷基、二(低级烷基)氨基和苯基；R2选自低级烷基、单环芳基甲基和单环(芳氧基)甲基；R3选自三芳基甲基和氢；并且Y选自受保护的或未受保护的羟基或氨基、氯氨基磷酸酯基团和与另外的吗啉代 化合物或吗啉代低聚物的环氮键合的磷酰二胺键。在所选择的实施方案中，Y为受保护的或未受保护的羟基(如在预活化的单体中 的那样)或者氯氨基磷酸酯基团(如在活化的单体中的那样)。羟基的优选保护基团包括 三烷基甲硅烷基，例如叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)。其中Y为与另外的吗啉代化合物的环氮键合的磷酰二胺键或者与另外的吗啉代 低聚物的环氮键合的磷酰二胺键的实施方案是指碱基脱保护之前，在合成吗啉代低聚物的 过程中形成的化合物。如下文讨论的那样，(活化的单体中的)氯氨基磷酸酯基团上的取代基能够根据所期望的具体的磷酰二胺键而变化。相应地，本发明还提供了合成吗啉代低聚物的方法，该方法包括(a)使具有未受保护的环氮的固相支持的吗啉代亚基与碱基保护的吗啉代亚基单 体反应，所述吗啉代亚基单体具有三芳基甲基保护的环氮和5’ -环外碳上的活化的氨基磷
酸酯基团，由此形成所述5’ -环外碳与所述未受保护的环氮之间的磷酰二胺键；(b)将所述受保护的环氮脱保护以形成未受保护的环氮；以及 (c)用另外的碱基保护的吗啉代亚基单体将步骤(a)和(b)重复一次或多次；其中至少一种的所述碱基保护的吗啉代亚基单体为具有以下结构的双重保护的 鸟嘌呤吗啉代化合物 其中R1选自低级烷基、二(低级烷基)氨基和苯基；R2选自低级烷基、单环芳基甲基和单环(芳氧基)甲基；R3选自三芳基甲基和氢；并且Y为氯氨基磷酸酯基团。对于吗啉代环氮(R3)，优选的三芳基甲基保护基团包括三苯甲基(三苯基甲基)、 4-甲氧基三苯甲基、4-甲基三苯甲基、4，4，-二甲基三苯甲基和4，4，，4”_三甲基三苯甲基。如在4_(新戊酰氧基)苄氧基(POB)中的那样，06保护基团上的R1取代基优选 SC1-C4烷基，特别是-C (CH3) 3(叔丁基)。然而，R1也能够为诸如二甲基氨基的二(低级烷
基)氨基或苯基。如上所述，在“活化的”单体中氯氨基磷酸酯基团Y的取代根据所期望的磷酰二胺 键而变化。对于“标准的”不带电荷的PMO键5’ -O-P( = 0) (-N(CH3)2)-3'(如上文的通式 II所示，其中R为甲基)的制备，氯氨基磷酸酯基团Y为5’ -O-P ( = 0)C1-NR2 (参见例如 化合物2f，图8)。如2007年5月10日提交的具有USSN 11/801，885的共有申请所描述的那样，该 申请通过引用并入本文，能够通过制备具有阳离子亚基间的键和中性亚基间的键的PMO来 获得有利的性质。在这样的低聚物中，两个连续的吗啉代环结构之间的至少一个亚基间的 键含有阳离子侧基。该侧基具有远端氮原子，该氮原子在中性或接近中性的PH值(例如生理pH值)下能够具有正电荷。对于制备这样的键，本发明的亚基单体中的氯氨基磷酸酯基团Y可具有以下结构 之一 其中，R为低级烷基，例如甲基或乙基；X = -R4-NHC( = 0)Rf，其中R4为二价烷基或寡PEG，并且Rf为完全或部分氟化的 甲基、乙基或异丙基；并且Z=如上文定义的X或低级烷基，注意含Z的基团导致形成含5’ -胺的键。术语“寡PEG”是指诸如-(CH2-CH2_0)n-CH2-CH2-的基团，其中n通常为1至3，并 且“二价烷基”通常为c2-c8烷基。如在共有的申请USSN 11/801,885中描述的那样，用具有这样的活化氯氨基磷酸 酯基团的单体制备低聚物之后，将C( = 0)Rf保护基团从末端氮原子中除去，该氮原子可以 被进一步改性以形成例如末端胍基。IV. # PM0 ☆成洲〒_木代遍白句隨牛户白句鄉■件如上所述，在PM0合成中，通常由诸如三苯甲基的三芳基甲基保护的吗啉代环氮 的脱保护在每一步骤中必须完全足以将N-1缺失化合物降至最少。然而，支持本发明的研 究显示，在现有技术中为了这一目的所用的试剂导致不期望量的主链水解(参见图1)和降 解。因此，寻求同时将这样的水解降至最低的有效的脱保护试剂。使用简单的检测测试了各种试剂在N-保护的吗啉代亚基的脱保护(通常为脱三 苯甲基化)中的效力。将如下所示的模型化合物三苯甲基化的moCBz(即苯甲酰基保护的 胞嘧啶吗啉代)亚基溶解在待研究的脱三苯甲基化溶液中。在不同的时间点(例如1、2、 4min)，将等分试样猝灭并通过TLC或HPLC分析吗啉代氮脱保护的完成。通常，为了在固相 PM0合成中预测有效的脱三苯甲基化，室温下该模型反应应当在约2分钟内完成。 采用该检测和另外的实验，确定了三氟乙醇(TFE)和二氯甲烷(DCM)的混合物中 的强酸的各种吡啶鐺盐为用于在固相PM0合成中将诸如三苯甲基的三芳基甲基保护基团 从吗啉代氮中除去的优异的催化剂。对于合理的反应速率和吡啶鐺盐的增溶，最少量的TFE (约10 % v/v或更多)是优选的。由于单独的TFE不使无保护的聚苯乙烯膨胀，因此与DCM(二氯甲烷)的混合物是优 选的，特别是在PM0合成的早期的周期中。优选的溶剂组合物包含10%至75%的TFE。通过针对PDA裂解和脱三苯甲基化的不同机理，相信TFE溶剂的使用提高了超过 如上所述的酰胺化物的形成(水解)和磷酰二胺(PDA)的裂解的脱三苯甲基化反应的选择 性。TFE是强效的氢键溶剂并降低溶液中亲核试剂的反应能力；因此，相信其减慢P-N键裂 解所必需的磷上的攻击。TFE还促进sm型溶剂分解反应。脱三苯甲基化反应混合物的黄 色和脱甲氧基三苯甲基化反应混合物的带橙色的颜色证明了使用TFE的胺脱三苯甲基化 反应的溶剂分解特性。因此，相信增加TFE浓度既抑制了 PDA键上的亲核攻击又促进了脱 三苯甲基化。对于最佳的脱保护，未取代的吡啶鐺盐没有足够的酸性，但是含有吸电子基(EWG) (例如卤素、羰基、氰基)的吡啶鐺化合物的使用使得保护基团迅速裂解。对于快速脱三苯 甲基化，在TFE DCM溶剂中，通常至少2% (w/v)的这样的盐是足够的。优选地，吡啶鐺盐 的水平为2%至10% (w/v) 0用于形成吡啶鐺盐的酸包括诸如甲磺酸、三氟甲磺酸和对甲苯磺酸的磺酸，三氟 乙酸和盐酸。尽管如果存在羧酸三氟乙酸的话，其在偶联反应过程中不将生长的PM0链覆 盖，并且其羧酸酯没有足够的亲核性以促进酰胺化物的形成。特别优选的是三氟乙酸，尤其 是甲磺酸。用于形成吡啶鐺盐的吡啶包括卤素取代的吡啶，特别是廉价的氯吡啶，其中3-氯 吡啶是优选的，和氰基吡啶，其中4-氰基吡啶是优选的。3-氰基吡啶和4-氰基吡啶是容易 购买、廉价的散装化学品。通常，盐的效力与吡啶鐺化合物的pKa反向相关。具有吸电子基 的吡啶的 pKa 为 1 至 4(Fisher et al. 1964，Rogne 1970)。也可以使用烟酸衍生物(即诸如烟酸乙酯的酯和烟酰胺)及它们的酮和醛的同源 物。然而，这些试剂的效力通常比氰基吡啶鐺盐差。应当理解，除吡啶外的杂环的盐能够在所描述的条件下起选择性脱三苯甲基化试 剂的作用，其条件为该杂环的质子化形式的PKa与本发明的取代吡啶的pKa相似。在文献 (例如Albert 1963)中发现的许多杂环的pKa的表中可以找到实例。实例包括噻唑(pKa 2. 53)、哒嗪(pKa2. 33)、吡唑(pKa 2. 47)、三唑(pKa 2. 30)和其取代的衍生物，特别是被如 上所述的EWG取代的衍生物。两种特别优选的盐为3-氯吡啶鐺甲磺酸盐(CPM)和4-氰基吡啶鐺三氟乙酸盐 (CYTFA)，并且脱三苯甲基化试剂的特别优选的实施方案包括2% (w/v)的CPM或CYTFA的 含0.9%乙醇(v/v)的20%三氟乙醇/DCM(v/v)的溶液。如上文表1所示，与常规的氰基 乙酸试剂相比，使用这些试剂导致收率明显增加。发现酸性更强的CYTFA比CPM稍稍更有效。然而，如在共有的并同时提交的题为 “用双重保护的鸟嘌呤吗啉代亚基改进合成吗啉代低聚物”的临时申请中所公开的那样，表 中CPM和CYTFA试剂之间的收率的大部分增加能够归功于双重保护的鸟嘌呤单体(DPG)的 使用，其中用4-(新戊酰氧基)苄氧基保护06位。通常，DPG单体的使用减少了含有二氨基 嘌呤的副产物的量，同时，改进的脱三苯甲基化试剂减少了主链水解或截断的副产物的量。因此，该改良提供了合成吗啉代低聚物的方法，相对于现有技术方法，该方法减少 了主链中磷酰二胺键的水解，并且N-1缺失化合物的水平优选降低或相等。在另一方面中，本发明提供了在合成吗啉代低聚物过程中将三芳基甲基保护的吗啉代环氮脱保护的方法， 相对于将氰基乙酸用作脱保护剂时所观察到的情况，该方法减少了吗啉代低聚物主链中的 磷酰二胺键的水解。优选地，与将氰基乙酸用作脱保护剂时会观察到的情况相比，该方法还 提供了降低的或相等的N-1缺失化合物水平。可用的另外的改良是使用诸如硫醇的三苯甲基捕获剂以将反应平衡转向产物。已 经采用硫醇捕获剂用于合成核酸(Ravikumar et al.，U. S. Patent No. 5，510，476)。疏基 乙醇是用于该目的的容易购买的廉价试剂。对于捕获，羟基的存在不是关键性的，这是由于 诸如苄硫醇的简单硫醇同样表现良好。诸如乙醇和丁醇的醇类以及甚至水也充当三苯甲基 阳离子的捕获剂。实施例实施例1 :N2-PhAc、06_P0B双重保护的吗啉代G(DPG)亚基的合成(参见图8)3的制备(从35kg的lc开始)向100G反应器中加入lc (35kg ;1. Oeq)、咪唑 (5. 0kg ；1. 3eq)和二氯甲烷(279kg)。将该批次冷却至3°C。将50G反应器冷却至3°C并 加入叔丁基氯二甲基甲硅烷(10. lkg ；1. 2eq)和二氯甲烷(93kg)。将50G反应器中的溶液 转移至100G反应器中并调节该批次至20°C。一旦反应完成(1-3小时)，将甲醇(1.8kg; 1. Oeq)加入100G反应器中。30分钟后，将100G反应器中的溶液加入含有pH值为3的柠 檬酸盐缓冲液(用固体NaOH将376kg的1M柠檬酸调节至pH值为3)的200G反应器中。 将该批次搅拌30分钟，并分离层。将下层有机层用pH值为3的柠檬酸盐缓冲液再一次洗 涤，并用盐水溶液(287kg的2. 5% NaCl/水(w w))洗涤一次。将所得到的有机溶液在 < 35°C下蒸馏直至该批次的Karl Fischer分析显示水< 0. 05%。在100G反应器中将该 溶液冷却至3°C并直接用于制备化合物4。4的制备向含有化合物3的溶液的100G反应器中加入三乙胺(6.8kg;1.2eq)、 4_ 二甲基氨基吡啶(0. 68kg ；0. leq)和三异丙基苯磺酰氯(18. 6kg ；1. leq)。将该批次加热 至20°C。一旦反应完成(3-9小时)，将该溶液加入含有pH值为4. 5的磷酸盐缓冲液(228kg 的1M KH2P04)的200G反应器中。将该批次搅拌30分钟，并分离层。用盐水(212kg的2. 5% NaCl/水(w w))洗涤下层有机层。将所得到的有机溶液在<35°C下蒸馏直至该批次的 Karl Fischer分析显示水< 0. 01%。在100G反应器中将该溶液冷却至3°C并直接用于制 备化合物5。4a的制备(从60kg的4_羟基苯甲醛开始)向750G反应器中加入4_羟基苯甲 醛(60kg ；1. Oeq)、甲苯(260kg)和1_甲基咪唑(8. lkg ；0. 2eq)。向该溶液中加入碳酸氢钾 (100kg ；2. Oeq)的水(400kg)溶液，随后加入三甲基乙酰氯(83kg ；1. 4eq)。在20°C下搅拌 该两相混合物。一旦反应完成(1-5小时)，将甲醇(15. 7kg ;1. Oeq)加入该批次中。将该 批次在20°C下搅拌1小时。分离层。向上层有机层中加入水(200kg)。将该批次搅拌30 分钟，并分离层。向上层有机层中加入PH值为4. 5的磷酸盐缓冲液(242kg水中16. 5kg的 KH2P04)。将该批次搅拌30分钟，并分离层。向上层有机层中加入水(200kg)。将该批次搅 拌30分钟，并分离层。在真空下将上层有机层在<30°C下蒸馏以获得200L的批体积。将 THF(70kg)加入该批次中并将该批次转移至含有Pd/C(9. 6kg ；0. 004eq ；5% Pd/C,50% wet Johnson Matthey Type A405028-5或A570129-5)的500G反应器中。最初将该反应器加 压至5psi H2并将搅拌设置为50rpm。随着反应的进行，将压力和搅拌速率缓慢增加至最大值25psi H2和90rpm。一旦反应完成(8_48小时)，通过硅藻土垫和随后的0. 1微米的内 联过滤器将该批次过滤。用甲苯(20kg)冲洗该硅藻土。将pH值为6. 5的磷酸盐缓冲溶液 (2. 7kg的KH2P04和2. 3kg的磷酸氢二钾三水合物的水(200kg)溶液)加入该批次中。将该 批次搅拌30分钟，并分离层。在真空下将上层有机层在< 30°C下蒸馏以获得140L的批体 积。将甲苯(126kg)加入该批次中，并在真空下将该批次在<30°C下蒸馏以获得140L的批 体积。将该批次调整至20°C，并转移至含有保持在0°C的正庚烷(821kg)和化合物4a的晶 种(100克)的500G反应器中。该批次在0°C下保持1-2小时。加入第二部分的晶种(100 克)，并将该批次在0°C下保持1-2小时。通过过滤将化合物4a分离。源于4-羟基苯甲醛 的收率=70% -80%。在与4a相似的条件下制备该衍生物，其中将苯酚部分作为其N，N_ 二甲基氨基甲 酸酯而不是三甲基乙酸酯保护。为了促进4-羟基苯甲醛与二甲基氨基甲酰氯之间的反应 的完成，在N-甲基咪唑作为碱以及0. 2eq的DMAP作为催化剂的存在下，在回流二氯甲烷中 进行该反应。5的制备向含有化合物4的溶液的100G反应器中加入N-甲基吡咯烷(9. 5kg ； 2. Oeq溶解在23kg的二氯甲烷中)。10分钟后，加入化合物4a (14. 0kg ；1. 2eq)，随后加入 1，8-二氮杂双环[5. 4. 0] -i^一碳-7-烯(10. 2kg ；在23kg 二氯甲烷中1. 2eq)。将该批次加 热至20°C。一旦反应完成(1-9小时)，用327kg的二氯甲烷将溶液稀释并加入含有pH值为 4. 5的磷酸盐缓冲液(334kg的1M KH2P04)的200G反应器中。将该批次搅拌30分钟，并分 离层。将下层有机层采用pH值为4. 5的磷酸盐缓冲液(111kg的1M KH2P04)再一次洗涤， 然后用盐水(212kg的2. 5% NaCl/水(w w))洗涤一次。将所得到的有机溶液在< 35°C 下蒸馏直至该批次的Karl Fischer分析显示水<0.05%。将该溶液直接用于制备化合物 If。If的制备向含有化合物5的溶液的100G反应器中加入三乙胺三氢氟酸盐 (18. 0kg ；2. Oeq)。将该批次在20°C下搅拌。一旦反应完成(4_20小时)，将该批次加入200G 反应器中。向该200G反应器中加入NaHC03溶液(230kg的5% (w w)溶液)。将该批次 搅拌30分钟，并分离层。将下层有机层用NaHC03溶液(230kg的5% (w w)溶液)再一 次洗涤，然后用PH值为6. 5的磷酸盐缓冲液(含9. 3kg KH2P04和14. 0kg K2HP04的215kg 水)洗涤一次。所得到的有机溶液经历将溶剂调换成THF(以获得在该批次中< 重量比 的DCM)。将溶液用THF (124kg)稀释并加热至60°C。将水(基于L0E分析，8kg水/kg含化 合物If的溶液；预热至60°C)缓慢加入THF溶液中。将该溶液缓慢冷却至3°C并保持>4 小时。通过过滤分离粗化合物If。将粗材料再次溶解在THF(342kg)中并加热至60°C。将 水(315kg;预热至60°C)缓慢加入THF溶液中。将该溶液冷却至;TC并保持> 4小时。通 过过滤分离化合物If。如果需要的话，能够进行第二次重结晶以进一步纯化化合物If。源 于lc的产率=53% -73%。2f的制备(从12虹的If开始)向50G反应器中加入化合物If (12kg; 1. Oeq)、二 氯甲烷(159kg)、2，6-二甲基吡啶(2. 5kg;1.6eq)和 1_ 甲。基咪唑(0. 36kg ；0. 3eq)。将该 溶液蒸馏以获得69L的批体积。并冷却至5°C。将N，N-二甲基二氯磷酰胺(3.8kg;1.6eq) 加入该批次中。将该批次调节至20°C。一旦反应完成(6-16小时)，将甲苯(78kg)加入该 批次中。将所得到的混合物在25°C下蒸馏以获得126L的批体积(该批次的GC分析必须显示30% -45%重量比的DCM)，并转移至含有pH值为3的柠檬酸盐缓冲液(15. 4kg柠檬酸 一水合物、1.4kg Na0H、80kg水)的100G反应器中。将该批次搅拌10分钟，并分离层。将 下层水层送至废料。将上层有机层转移至含有硫酸钠(8.0kg)的50G反应器中。将该批次 搅拌30分钟，并通过过滤除去硫酸钠废料饼状物。用二氯甲烷(16kg)冲洗硫酸钠饼状物。 在50G反应器中将所得到的产物溶液蒸馏以获得53L的批体积(该批次的GC分析必须显 示11%-15%重量比的DCM)。向100G反应器加入庚烷(238kg)。在2小时期间，将50G反 应器中的批次转移至100G反应器中。在转移结束时，将该批次在20°C下保持4-16小时。 通过过滤收集粗化合物6。将粗材料加入100G反应器中。将甲苯(16kg)与庚烷(50kg)的 溶液加入粗固体中。将该混合物搅拌3小时并过滤。将重新打浆重复一次或多次。源于If 的粗2f的收率=80%。通过硅胶饩谱纯化化合物2f (从约6. 5kg的粗化合物2f开始)通过将粗材料的 重量校正成HPLC纯度和挥发物来计算粗化合物2f的“强度”。对于该纯化步骤，在50cm 的色谱柱上每次注射使用5. 75kg的材料(校正成强度)。向50cm的色谱柱填充庚烷/硅 胶(51. 8kg的硅胶)的浆液。将粗材料作为二氯甲烷/2，6-二甲基吡啶(15kg 二氯甲烷、 0. 16kg 2，6-二甲基吡啶)的溶液加载至柱上。用4-甲基-2-戊酮(1081()/庚烷/2，6-二甲 基吡啶的两步梯度(第一步为含有0.06%的2，6_二甲基吡啶(w w)的827 L 39 61的 MIBK 庚烷(w w)；第二步为含有0. 06%的2，6-二甲基吡啶(w w)的1343 L 73 27 的MIBK 庚烷(w w))来洗脱产物。通过薄膜蒸发将经确认的合并流分浓缩至150g/L 的浓度。将浓缩的合并物沉淀至6体积的庚烷上。通过过滤分离纯化的2f。源于If 的纯 化的2f的收率=50% ；源于粗2f的纯化的2f的收率=65%。实施例2. CYTFA吡啶鎰盐脱三苯甲基化溶液的制备将三氟乙酸(10. 5g ；1. Oeq)加入4_氰基吡啶(10. lg ；1. 055eq)的二氯甲 烷(790mL)溶液中，随后加入2，2，2_三氟乙醇(198mL)和乙醇(10mL)，并将溶液搅拌 10-30mino实施例3 二硫化物锚的制备(参见图10)N-三苯甲基哌嗪琥珀酸盐(NTP)的制备将三苯基甲基(三苯甲基)氯(l.Oeq) 的甲苯(5mL/g三苯甲基氯)溶液缓慢加入哌嗪(10eq)的甲苯/甲醇(5 1甲苯/甲醇 (v v) ；5mL/g哌嗪)的凉溶液中。一旦反应完成(1-2小时)，将该溶液用水洗涤四次。 将琥珀酸水溶液(1. leq;13mL水/g琥珀酸)加入所得到的有机溶液中。将该混合物搅拌 90分钟，并通过过滤收集固体产物。通过在丙酮中进行两次重新打浆来纯化粗NTP。收率 =70%。对称的二硫化物7的制备将1，1，-羰基二咪唑(CDI) (12. 402g;2. 2eq.)悬浮 在二氯甲烷(5.25mL/g)中并在冰浴上冷却。将羟基乙基二硫化物6(5.36g;leq.)溶解 在二氯甲烷(10mL/g)和四氢呋喃(lmL/g)中。为了使反应持续进行，将二醇溶液缓慢加 入⑶I中从而使混合物的温度停留在4°C以下。一旦反应完成(一旦完成添加)，加入去 离子水(93.8iiL，0. 15eq.)使反应猝灭。将N_三苯甲基哌嗪琥珀酸盐(NTP) (32. 59g ； 2. leq.)独立地溶解在甲苯(8mL/g NTP)、二氯甲烷(2mL/g NTP)和甲醇(2mL/g NTP)中。 将K2C03(22 . 09g ；4. 6eq.)溶解在去离子水中(10mL/g)。将K2C03溶液加入NTP的溶液中； 将混合物搅拌然后分离成两层。将混浊的有机层蒸馏以除去90克；将所得到的水滴分离并将丙酮(8mL/g的NTP)加入有机层中。将CDI活化的二硫化二醇溶液加入游离碱的溶液 中并浓缩至225mL。加入丙酮(10mL/g NTP)并将混合物浓缩至225mL。将混合物加热至回 流，并且固体开始从溶液中结晶。一旦完成，将反应混合物冷却并通过过滤分离固体(7)。 收率27. 92g ；93. 1 % (基于以重量为基础的分析)。二硫化物醇8的制备将7 (36. 00g ；32. 1讓ol ； leq.)悬浮在丙酮(2. 8mL/g 7)中。 加入羟基乙基二硫化物(78. 51mL ；20eq.)，随后加入丙酮(1. 7mL/g 7)。加入5%的NaOH/ 甲醇(2. 85mL ；0. leq.)；由pH试纸得到混合物的pH值为10。加入三苯基膦(8. 42g ；leq.)， 随后加入丙酮(1. lmL/g 7)。将所有的固体放入溶液中然后产物开始结晶出来。16hr后， 用乙酸(2.4g ；0. 2eq.)中和反应混合物。通过过滤分离粗产物。对粗固体8进行两次回流 的丙酮重新打浆(5mL/g 7)。过滤后，将粗产物悬浮在二氯甲烷(7. 25mL/g 7)中。将混合物加热直至形成澄清 溶液(35°C )。用等体积的去离子水将溶液萃取五次并将最终的有机层浓缩至155mL。加入 二氯甲烷(4. 3mL/g 7)，并将溶液再次浓缩至155mL。加入CDI (9. 17g ；1. leq.)并将混合物 在室温下搅拌。一旦反应完成(约20min)，将反应混合物用等体积的去离子水洗涤两次，然 后加入乙苯(2. lmL/g 7)。将溶液浓缩至65. 2g，将溶液中的二氯甲烷减少至0. 17%，并在 冰浴上搅拌以结晶出产物。通过过滤分离产物9。收率44%。实施例4 三甘醇尾部(参见图11)三苯甲基哌嗪苯基氨基甲酸酯10的制备将碳酸钾(3. 2eq)的水溶液(4mL/g碳 酸钾)加入NTP的二氯甲烷(6mL/g NTP)凉悬浮液中。将苯基氯甲酸酯(1. 03eq)的二氯 甲烷(2g/g苯基氯甲酸酯)溶液缓慢加入该两相混合物中。将反应混合物加热至20°C。一 旦反应完成(l_2hr)，分离层。将有机层用水洗涤并用无水碳酸钾干燥。通过从乙腈中结晶 来分离产物10。收率=80%。氨基甲酸酯醇11的制备将氢化钠(1. 2eq)悬浮在1_甲基_2_吡咯烷酮(32mL/ g的氢化钠)中。将三甘醇(lO.Oeq)和化合物10(1. Oeq)加入该悬浮液中。将所得到的 浆液加热至95°C。一旦反应完成(l_2hr)时，将该混合物冷却至20°C。将30%二氯甲烷/ 甲基叔丁基醚(v v)和水加入该混合物中。将含有产物的有机层先后用NaOH水溶液、琥 珀酸水溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤。通过从二氯甲烷/甲基叔丁基醚/庚烷中结晶来分 离产物11。收率=90%。尾部酸12的制备将琥珀酸酐(2. Oeq)和DMAP(0. 5eq)加入化合物11的四氢呋 喃(7mL/g 11)溶液中。将混合物加热至50°C。一旦反应完成(5hr)，将混合物冷却至20°C 并用NaHC03水溶液调节至pH值为8.5。加入甲基叔丁基醚，并将产物萃取进入水层。加入 二氯甲烷，并用柠檬酸将混合物调节至pH值为3。用pH = 3的柠檬酸盐缓冲液与饱和氯化 钠水溶液的混合物来洗涤含有产物的有机层。将没有分离的12的DCM溶液用于制备化合 物13。13的制备将N-羟基-5-降冰片烯-2，3- 二酰亚胺(H0NB) (1. 02eq)、4_ 二甲基氨 基吡啶(DMAP) (0. 34eq)加入化合物12的溶液中，然后加入1_(3_ 二甲基氨基丙基)_N’_乙 基碳二亚胺盐酸盐(EDC) (1. leq)。将混合物加热至55°C。一旦反应完成(4_5hr)，将混合 物冷却至20°C并先后用1 1 0.2M柠檬酸/盐水和盐水洗涤。二氯甲烷溶液经历将溶剂 调换成丙酮然后调换成N，N-二甲基甲酰胺，并且通过从丙酮/N，N-二甲基甲酰胺中沉淀进入饱和氯化钠水溶液中来分离产物。将粗产物在水中重新打浆数次以除去残余的N，N-二 甲基甲酰胺和盐。源于化合物11的13的收率=70%。通过用于固相合成过程中添加亚基 的步骤在NMP中向二硫化物锚-树脂上引入活化的“尾部”。_仿丨丨5身☆成顺代傭__謝本_1 棚列5a顏聊縣訟)希-二献_馳狐在具有粗孔隙率(40-60 μ m)玻璃粉、顶置式搅拌器和三通聚四氟乙烯活塞的硅 烷化的夹套式肽管(jacketed peptide vessel)(定制于ChemGlass，NJ，USA)中进行该步 骤，通过玻璃粉或真空萃取使N2冒出。通过循环水浴实现反应容器中的温度控制。以下步骤中的树脂处理/洗涤步骤由两个基本操作组成树脂流化和溶剂/溶液 萃取。对于树脂流化，调整活塞位置使N2向上流动通过玻璃粉，并将规定的树脂处理/洗 涤液加入反应器中并将树脂浸透和完全润湿。然后开始混合并将树脂浆液混合至规定的时 间。对于溶剂/溶液萃取，停止混合和N2流，并启动真空泵，然后调整活塞位置使树脂处理 /洗涤液排出至废料。除非另有说明，树脂处理/洗涤液的体积为15mL/g树脂。向硅烷化的夹套式肽管中的氨基甲基聚苯乙烯树脂(100-200目；约l.Ommol/ g N2 取代；75g，leq，Polymer Labs, UK, part #1464_X799)中加入 1_ 甲基 _2_ 吡咯烧酮 (NMP;20ml/g树脂)，并使树脂膨胀同时混合l-2hr。排空膨胀的溶剂之后，用二氯甲烷 (2Xl-2min)、含有5%二异丙基乙胺的25%异丙醇/ 二氯甲烷(2X3-4min)和二氯甲烷 (2Xl-2min)洗涤树脂。排空最后的洗涤液之后，用二硫化物锚9的1-甲基_2_吡咯烷 酮(0. 17M;15mL/g树脂，约2. 5eq)溶液使树脂流化，并在45°C下将树脂/试剂混合物加 热60hr。反应一完成，终止加热并排空锚溶液，并且用1-甲基-2-吡咯烷酮(4X3-4min) 和二氯甲烷(6Xl-2min)洗涤树脂。用10% (ν/ν)的重碳酸二乙酯的二氯甲烷(16mL/g ； 2X5-6min)溶液处理树脂，然后用二氯甲烷(6Xl-2min)洗涤。将树脂14在N2流下干燥 l_3hr，然后在真空下干燥至恒定重量(士2% )。收率初始树脂重量的110% -150%。实施例5b 氨基甲基聚苯乙烯_ 二硫化物树脂的填充量的确定通过光谱检测每克树脂中三苯基甲基(三苯甲基)的数目，来确定树脂的填充量 (潜在可用的反应位点的数目)。将已知重量的干燥树脂(25士3mg)转移至硅烷化的25ml容量瓶中，并加入约5mL 的含有2% (ν/ν)三氟乙酸的二氯甲烷。通过轻轻涡旋将所含物混合然后静置30min。添 加含有2% (ν/ν)三氟乙酸的二氯甲烷使体积达到25mL，并且将所含物彻底混合。使用正 压分注滴管，将一份等分的含有三苯甲基的溶液(500 μ L)转移至IOmL容量瓶中，并用甲磺 酸使体积达到10mL。通过在431. 7nm的UV吸收测量最终溶液中的三苯甲基阳离子含量，并用合适的体 积、稀释液、消光系数(CMlymor1cnT1)和树脂重量以每克树脂中的三苯甲基(ymol/g) 来计算树脂填充量。将该检测进行三次并计算平均填充量。本实施例中的树脂填充方法会提供具有约500 μ mol/g的填充量的树脂。如果在 室温下将二硫化物锚合并步骤进行24hr，可获得300-400 μ mol/g的填充量。实施例5c 尾部加载(参见图12)使用与用于制备氨基甲基聚苯乙烯_ 二硫化物树脂相同的方案和体积，能够将尾 部引入分子中。对于偶联步骤，使用13(0.2M)的NMP溶液来代替二硫化物锚溶液，该NMP含有4-乙基吗啉(ΝΕΜ，0. 4M)。在45°C下进行2hr后，将树脂15用含有5%二异丙基乙胺 的25%异丙醇/ 二氯甲烷洗涤两次，并用DCM洗涤一次。将苯酸酐(0.4M)与NEM(0.4M)的 溶液加入树脂中。25min之后，将反应器夹套冷却至室温，并将树脂用含有5%二异丙基乙 胺的25%异丙醇/ 二氯甲烷洗涤两次，并且用DCM洗涤八次。将树脂15过滤并在高真空下 干燥。将树脂15的填充量规定为在尾部加载中所用的初始氨基甲基聚苯乙烯_ 二硫化物 树脂14的填充量。实施例6 吗啉代低聚物的合成实施例6a 固相合成 以IOg的规模(起始树脂重量)，在氨基甲基聚苯乙烯_ 二硫化物树脂(约 500ymol/g的填充量)上通过固相低聚物合成人工制备受保护的低聚物。所使用的溶液如 下 脱三苯甲基化溶液CAA =含11 %氰基乙酸(w/w)的20%乙腈/DCM(ν/ν)的混合 物；CPM =含有2% 3-氯吡啶鐺甲磺酸盐(w/v)和0. 9%乙醇(ν/ν)的20%三氟乙醇 /DCM(ν/ν)；CYTFA =含有2% 3_氰基吡啶鐺三氟乙酸盐(w/v)和0. 9%乙醇(ν/ν)的20%三 氟乙醇/DCM (ν/ν)。中和溶液含有5%二异丙基乙胺的25%异丙醇/ 二氯甲烷；偶联溶液含有0. 165Μ (对于2f(DPG)、2c和2d或其它T亚基)或者0. 18M (对于 2a和2b或其它A/C亚基)的活化的吗啉代亚基和0. 4M N-乙基吗啉的1，3-二甲基咪唑烷 酮(DMI)。按照Summerton et al. (1993)中的描述来制备活化的MPG (2c)。在将树脂转移至合成反应器之后及开始合成周期之前，加入1-甲基-2-吡咯烷酮 (NMP，20mL/g树脂)并静置l_2hrs。用二氯甲烷(10mL/g树脂)洗涤两次后，采用下述的 合成周期，在每个周期加入合适的偶联溶液以获得合适的序列，该偶联溶液为期望碱基和 期望键型的活化的吗啉代亚基的偶联溶液。
t墚加洗液的体积以补馇树賴的膨胀；彝每个周斯,祙积为10mL/g实际的树脂体积 **偶躲的体积美以保持良好的混合并将其增加以补偿树脂的膨胀引入最终的亚基之后，用含有0. 32M 4-甲氧基三苯基甲基氯化物和0.4M N-乙基 吗啉的DMI进行最后的周期(甲氧基三苯甲基化)。甲氧基三苯甲基化之后，将树脂用NMP 洗涤八次，然后用由0. IM 1，4-二硫苏糖醇(DTT)和0.73M三乙胺的NMP(27mL/g起始树 月旨)溶液组成的裂解溶液处理30min。将受保护的低聚物溶液收集之后，用另外两份裂解溶 液(13mL/g起始树脂，并每次保持15min)洗涤树脂(体积明显降低)，并将洗涤液与主体溶 液合并。向在具有聚四氟乙烯活塞(AceGlasS，NJ，USA)的适当大小的耐压瓶中的受保护的 低聚物溶液中加入浓氨水(106mL/g起始树脂，预先冷却至-20°C)。将瓶密封，并通过涡旋 将所含物混合。将瓶放置在45°C炉中保持16-20hr以除去碱基和主链保护基团。氨解之后，将粗低聚物溶液冷却至室温，然后用PLBC 3kd再生纤维素膜 (Millipore)将其对0. 28%氨水渗滤以在进行离子交换色谱法之前除去溶剂和小分子。实施例6b 通过阴离子交换饩谱纯化吗啉代低聚物将从渗滤获得的粗低聚物溶液调整至pH值为11-11. 5并加载至ToyoPearl Super-Q 650S阴离子交换树脂(Tosoh Bioscience)的柱上。用5%-35% B的梯度通过 17个柱体积(缓冲液A IOmM氢氧化钠；缓冲液B 含有IM氯化钠的IOmM氢氧化钠)来洗 脱甲氧基三苯甲基化的低聚物，并合并具有可接受纯度的流分(阴离子交换HPLC和质谱)。实施例6c 吗啉代低聚物的脱甲氧基三苯甲基化将乙腈(10%体积比)加入来自阴离子交换色谱的合并的流分中，随后加入2M H3PO4以调节pH值至3。将溶液混合45min，然后用浓氨水中和至pH值为7。用PLBC 3kd 再生纤维素膜(Millipore)将低聚物溶液对20mM乙酸钠渗滤以在阳离子交换色谱之前交换缓冲液。
实施例6d 通过阳离子交换饩谱纯化吗啉代低聚物用乙酸调节低聚物溶液的pH值至4. 5，并加载至Source 30S阳离子交换树脂(GE Healthcare)的柱上。用0% -35% B的梯度通过17个柱体积(缓冲液A :20mM乙酸钠、 25%乙腈，pH 4. 5 ；缓冲液B :0. 5M氯化钠、20mM乙酸钠、25%乙腈，pH 4. 5)来洗脱低聚物， 并合并具有可接受纯度的流分(阳离子交换HPLC和质谱)。
权利要求
吗啉代化合物，其包含以下结构其中R1选自低级烷基、二(低级烷基)氨基和苯基；R2选自低级烷基、单环芳基甲基和单环(芳氧基)甲基；R3选自三芳基甲基和氢；并且Y选自受保护或未受保护的羟基或氨基、氯氨基磷酸酯基团和与另外的吗啉代化合物或吗啉代低聚物的环氮键合的磷酰二胺键。FPA00001138208000011.tif
2.如权利要求1所述的化合物，其中Y选自受保护或未受保护的羟基和氯氨基磷酸酯基团。
3.如权利要求2所述的化合物，其中Y为三烷基甲硅烷基保护的羟基或未受保护的羟基。
4.如权利要求2所述的化合物，其中Y为-0-P(= 0)-N(CH3)2Cl形式的氯氨基磷酸酯基团。
5.如权利要求1所述的化合物，其中R3选自三苯甲基(三苯基甲基)、4_甲氧基三苯 甲基、4-甲基三苯甲基、4，4，-二甲基三苯甲基和4，4，，4”_三甲基三苯甲基。
6.如权利要求1所述的化合物，其中R1为低级烷基。
7.如权利要求6所述的化合物，其中R1为_C(CH3)3(叔丁基)。
8.如权利要求1所述的化合物，其中R2为苄基或_CH(CH3)2。
9.合成吗啉代低聚物的方法，所述方法包括(a)使具有未受保护的环氮的固相支持的吗啉代亚基与碱基保护的吗啉代亚基单体反 应，所述吗啉代亚基单体具有三芳基甲基保护的环氮和5’ -环外碳上的活化的氨基磷酸酯 基团，由此形成所述5’ -环外碳与所述未受保护的环氮之间的磷酰二胺键；(b)将所述受保护的环氮脱保护以形成未受保护的环氮；以及(c)用另外的碱基保护的吗啉代亚基单体将步骤(a)和(b)重复一次或多次； 其中至少一种的所述碱基保护的吗啉代亚基单体为具有以下结构的双重保护的鸟嘌呤吗啉代化合物 其中R1选自低级烷基、二(低级烷基)氨基和苯基； R2选自低级烷基、单环芳基甲基和单环(芳氧基)甲基； R3选自三芳基甲基和氢；并且 Y为氯氨基磷酸酯基团。
10.如权利要求9所述的方法，其中Y为-0-P(= 0)-N(CH3)2Cl形式的氯氨基磷酸酯基团。
11.如权利要求9所述的方法，其中R3选自三苯甲基(三苯基甲基)、4_甲氧基三苯甲 基、4-甲基三苯甲基、4，4，-二甲基三苯甲基和4，4，，4”_三甲基三苯甲基。
12.如权利要求9所述的方法，其中R1为低级烷基。
13.如权利要求12所述的方法，其中R1为_C(CH3)3(叔丁基)。
14.如权利要求9所述的方法，其中R2为苄基或_CH(CH3)2。
15.如权利要求9所述的方法，其中步骤(b)的所述脱保护包括在含有三氟乙醇的溶剂 中，使所述三芳基甲基保护的环氮与包含杂环胺盐的试剂溶液接触，所述盐为杂环胺与选 自磺酸、三氟乙酸和盐酸的酸的盐，所述杂环胺的质子化形式的pKa为1-4。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述盐选自3-氯吡啶鐺甲磺酸盐(CPM)和4-氰 基吡啶鐺三氟乙酸盐(CYTFA)。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述溶剂包含体积比为约90 10至25 75的 二氯甲烷和三氟乙醇。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述体积比为约80 20。
19.合成吗啉代低聚物的方法，所述方法包括(a)使具有未受保护的环氮的固相支持的吗啉代亚基与碱基保护的吗啉代亚基单体反 应，所述吗啉代亚基单体具有三芳基甲基保护的环氮和5’ -环外碳上的活化的氨基磷酸酯 基团，由此形成所述5’ -环外碳与所述未受保护的环氮之间的磷酰二胺键；(b)将所述受保护的环氮脱保护以形成未受保护的环氮；以及(c)用另外的碱基保护的吗啉代亚基单体将步骤(a)和(b)重复一次或多次；其中所述脱保护包括在含有三氟乙醇的溶剂中，将所述三芳基甲基保护的环氮与包含 杂环胺盐的试剂溶液接触，所述盐为杂环胺与选自磺酸、三氟乙酸和盐酸的酸的盐，所述杂 环胺的质子化形式的PKa为1-4。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述杂环胺选自吸电子基取代的吡啶、噻唑、哒 嗪、吡唑、三唑以及吸电子基取代的这些化合物的取代衍生物。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述杂环胺为吸电子基取代的吡啶。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述吸电子基选自卤素、氰基、醛、酮、羧酸酯和甲酰胺。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述杂环胺为氯取代的吡啶或氰基取代的吡啶。
24.如权利要求19所述的方法，其中所述盐为选自烷基磺酸盐、(氟烷基)磺酸盐和对 甲苯磺酸盐的磺酸的盐，或者三氟乙酸盐。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述盐选自3-氯吡啶鐺甲磺酸盐(CPM)和4-氰 基吡啶鐺三氟乙酸盐(CYTFA)。
26.如权利要求19所述的方法，其中所述溶剂包含体积比为约90 10至25 75的 二氯甲烷和三氟乙醇。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述体积比为约80 20。
28.如权利要求19所述的方法，其中所述三芳基甲基选自三苯甲基(三苯基甲基)、 4-甲氧基三苯甲基、4-甲基三苯甲基、4，4，-二甲基三苯甲基和4，4，，4”_三甲基三苯甲 基。
全文摘要
本发明提供了具有结构(I)的吗啉代化合物其中R1选自低级烷基、二(低级烷基)氨基和苯基；R2选自低级烷基、单环芳基甲基和单环(芳氧基)甲基；R3选自三芳基甲基和氢；并且Y选自受保护或未受保护的羟基或氨基、氯氨基磷酸酯基团和与另外的吗啉代化合物或吗啉代低聚物的环氮键合的磷酰二胺键。这样的化合物包括双重保护的吗啉代鸟嘌呤(MoG)单体。本发明还描述了它们在合成吗啉代低聚物中的用途，以及用于合成吗啉代低聚物的进一步的改进方法，其涉及在每个单体偶联步骤中，受保护的吗啉代环氮的脱保护。
文档编号A61K31/70GK101861318SQ200880116219
公开日2010年10月13日 申请日期2008年11月14日 优先权日2007年11月15日
发明者克里斯蒂娜·玛丽·约瑟芬·福克斯, 德怀特·D·怀勒, 李永福, 马修·代尔·里乌斯 申请人:Avi生物制药公司