专利名称：能够特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及可特异性地结合A β寡聚体的抗体及其应用。
背景技术：
多种证据已显示，记忆的衰退起因于由可溶性Αβ寡聚体触发的突触功能障碍 (参见非专利文献1和2)。A β寡聚体的过量积聚与沉着可触发一系列病理学级联反应，导 致阿尔茨海默氏病(AD)。因此，靶向Αβ寡聚体的治疗介入对阻断这些级联反应可能是有 效的。然而，对于该淀粉状蛋白级联的假说中，导致神经退行性变，特别是由Αβ寡聚体介 导的神经变性的核心分子，其实验证据最早来自体外实验(参见非专利文献3)。该神经变 性未在体内得到直接证实。之前报道的体内实验最大的缺陷在于，它们无法证明内源Αβ 寡聚体的突触毒性。这是由于缺乏对构象具有特异性的分子工具(参见非专利文献4)。在 阿尔茨海默氏病小鼠模型中亦难以解决的问题，还没有办法在人类脑内解决。因而，内源 Αβ的体内神经毒性往往受到忽视。为何在人类内嗅皮质中的NFT形成与神经细胞丧失发 生于老年斑形成之前，以及A β如何涉及该机制，人们都尚不知晓。涉及现行发明的现有技术信息如下所示[非专利文献 1]Klein WL, Trends Neurosci. 24 :219_224，2001[非专利文献 2] Selkoe DJ, Science 298 :789_791，2002[非专利文献 3]Hass C et al. =Nature Review 8 101-12，2007[非专利文献 4] Lee EB, et al. :J. Biol. Chem. 281 =4292-4299, 2006本发明的公开[本发明需解决的问题]本发明是鉴于上述情况完成的。本发明的一个目的为提供可特异性地结合Αβ寡 聚体的抗体及其应用。更加具体而言，本发明提供了可特异性地结合Αβ寡聚体的抗体，以 及使用该抗体检测Αβ寡聚体的方法，使用该抗体诊断阿尔茨海默氏病的方法，以及包含 该抗体的药剂。[解决该问题的手段]本发明人产生了这样的单克隆抗体，它们仅对可溶性淀粉样蛋白β (Αβ)寡聚体 具有特异性，而不识别属于生理性分子的可溶性A β单体，此外，本发明人确证了所述抗体 具有下列功能(1)抗神经毒性活性；(2)阻抑A β淀粉样蛋白原纤维形成的活性；(3)仅识别A β寡聚体的特异性；(4)在AD脑中捕获Αβ寡聚体的能力；以及(5)预防类阿尔茨海默氏病表型(记忆损害，脑部Αβ积聚水平)在APPswe转基 因小鼠(Tg2576)中发展的能力。使用超滤/分子筛方法，在产生的抗体中，确定了单克隆抗体1A9与2C3特异性的
4识别30kDa或更大，主要为IOOkDa或更大的寡聚体，但不识别大约4. 5kDa左右的单体。通 过测量两种抗体在已分化为神经细胞的PC12细胞中针对Αβ 1-42-诱导的神经毒性的中和 作用，确证了它们具有神经毒性中和活性。硫代黄素T测定与电子显微镜观察显示所述抗 体具有阻抑Αβ淀粉样蛋白原纤维形成的活性。通过下述方法确证了 1Α9与2C3在AD脑中 捕获A β寡聚体的能力，即使用这些抗体在具有SDS稳定性的4_，5_，8-以及12-聚体的存 在下进行免疫沉淀反应。进一步，为确定在人脑中的体内神经毒性，对在主要为Braak NFT I到III期的人类内嗅皮质中所述抗体识别的多聚体的量进行了测量。对据报道在动物研 究中具有神经毒性的12-聚体加以特别关注，结果确证了该多聚物的积聚发生于认知机能 障碍出现之前，并随着Braak NFT期的进展而增加。该结果首次显示，所述12-聚体，其被 所述抗体所特异性识别，是一种构象聚合体(conformational assembly)，在人脑中导致体 内神经毒性。本发明人亦发现由所述抗体识别的寡聚构象结构存在于脑脊液(CSF)中，并 在AD患者中增加。本发明人将1A9或2C3与其它神经病症同样地通过静脉内注射进行被动 免疫治疗。经确证Tg2576小鼠通过亚慢性被动免疫治疗而受保护免于罹患记忆缺陷，老年 斑形成，突触障碍与Αβ积聚，且无有害副作用。本发明人获得的该结果首次说明，单克隆 1Α9与2C3很有希望被选择作为在Tg2576小鼠中预防类阿尔茨海默氏病表型的治疗抗体， 其可望通过常规外周静脉内给药显示其效应，从而无需考虑脑内转移(brain transfer)的 问题。本发明人亦确证使用所述1A9与2C3抗体的被动免疫疗法可阻抑老年斑淀粉状蛋 白形成以及肿大变性的神经突形成。进一步，本发明人发现投入血液的1A9与2C3中有一 部分转移入脑部。如上所述，本发明人在本文中公开了单克隆1A9与2C3——它们是特异性结合Αβ 寡聚体的抗体——符合了所有诊断性/治疗性抗体的标准，并且是供诊断/预防阿尔茨海 默氏病的治疗抗体的有望候选。本发明人成功获取了 Ε12，IClO与4D3抗体，它们与所述1Α9与2C3抗体相似，不 识别A β单体，但可特异性地结合A β寡聚体，且发现其中所述Ε12抗体具有阻抑A β淀粉 样蛋白微纤维形成的活性。因此，本发明认为上述Ε12，IClO与4D3亦为供诊断/预防阿尔茨海默氏病的治疗 抗体的有望候选。更加具体而言，本发明提供了下述[1] 一种可结合A β寡聚体的抗体，其中所述抗体不结合A β单体；[2] 一种可结合Αβ寡聚体的抗体，所述Αβ寡聚体可结合包含具有SEQID NO=I 的氨基酸序列的H链与具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列的L链的抗体；[3] 一种可结合A β寡聚体的抗体，所述A β寡聚体可结合包含具有SEQID NO 21 的氨基酸序列的H链与具有SEQ ID NO 23的氨基酸序列的L链的抗体；[4] 一种可结合A β寡聚体的抗体，所述A β寡聚体可结合包含具有SEQID NO 41 的氨基酸序列的H链与具有SEQ ID NO 43的氨基酸序列的L链的抗体；[5]下述(1)到(20)中任一项的抗体(1) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 9的氨基酸序列作为CDRl，SEQ ID NO 11 的氨基酸序列作为⑶R2，以及SEQ ID NO 13的氨基酸序列作为⑶R3的H链；
(2) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 15的氨基酸序列作为CDRl，SEQ ID NO 17 的氨基酸序列作为⑶R2，以及SEQ ID NO 19的氨基酸序列作为⑶R3的L链；(3) 一种抗体，其包含⑴的H链与⑵的L链；(4) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 5的氨基酸序列作为VH的H链；(5) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列作为VL的L链；(6) 一种抗体，其包含⑷的H链与(5)的L链；(7) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 29的氨基酸序列作为CDRl、SEQ ID NO 31 的氨基酸序列作为⑶R2、以及SEQ ID NO 33的氨基酸序列作为⑶R3的H链；(8) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 35的氨基酸序列作为CDRl，SEQ ID NO 37 的氨基酸序列作为⑶R2，以及SEQ ID NO 39的氨基酸序列作为⑶R3的L链；(9) 一种抗体，其包含(7)的H链与(8)的L链；(10) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 25的氨基酸序列作为VH的H链；(11) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 27的氨基酸序列作为VL的L链；(12) 一种抗体，其包含(10)的H链与(11)的L链；(13) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 49的氨基酸序列作为CDRl，SEQ ID NO 51的氨基酸序列作为⑶R2，以及SEQ ID NO 53的氨基酸序列作为⑶R3的H链；(14) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 55的氨基酸序列作为CDRl，SEQ ID NO 57的氨基酸序列作为⑶R2，与SEQ ID NO 59的氨基酸序列作为⑶R3的L链；(15) 一种抗体，其包含(13)的H链与(14)的L链；(16) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 45的氨基酸序列作为VH的H链；(17) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 47的氨基酸序列作为VL的L链；(18) 一种抗体，其包含(16)的H链与(17)的L链；(19) 一种抗体，其是在(1)到(18)中任一项的抗体中替换，缺失，添加和/或插入 一个或多个氨基酸而得到的，并具有与所述(1)到(18)中任一项的抗体等价的活性；以及(20) 一种抗体，其可结合(1)到(18)中任一项的抗体所结合的表位；[6] [5]所述的抗体，其中所述抗体为嵌合抗体或人源化抗体；[7] 一种组合物，其包含[1]到[6]任一项所述的抗体与药用载体；[8] 一种抗认知机能障碍剂，其包含[1]到[6]中任一项所述的抗体或[7]的组合 物作为活性成分；[9] 一种阿尔茨海默氏病治疗剂，其包含[1]到[6]中任一项所述的抗体或[7]的 组合物作为活性成分；[10] 一种阻抑阿尔茨海默氏病进展的药剂，其包含[1]到[6]中任一项所述的抗 体或[7]的组合物作为活性成分；[11] 一种阻抑老年斑形成的药剂，其包含[1]到[6]中任一项所述的抗体或[7] 的组合物作为活性成分；[12] 一种阻抑Αβ积聚的药剂，其包含[1]到[6]中任一项所述的抗体或[7]的 组合物作为活性成分；[13] 一种抗神经毒性剂，其包含[1]到[6]中任一项所述的抗体或[7]的组合物 作为活性成分；
6
[14] 一种抑制Αβ淀粉样蛋白原纤维形成的试剂，其包含[1]到[6]中任一项所 述的抗体或[7]的组合物作为活性成分；[15] 一种抗突触毒性剂，其包含[1]到[6]中任一项所述的抗体或[7]的组合物 作为活性成分；[16] 一种预防和/或治疗认知机能障碍的方法，其包括将[1]到[6]中任一项所 述的抗体或[7]的组合物作为活性成分施用的步骤；[17] 一种预防和/或治疗阿尔茨海默氏病的方法，其包括将[1]到[6]中任一项 所述的抗体或[7]的组合物作为活性成分施用的步骤；[18] 一种阻抑阿尔茨海默氏病进展的方法，其包括将[1]到[6]中任一项所述的 抗体或[7]的组合物作为活性成分施用的步骤；[19] 一种阻抑老年斑形成的方法，其包括将[1]到[6]中任一项所述的抗体或 [7]的组合物作为活性成分施用的步骤；[20] 一种阻抑Αβ积聚的方法，其包括将[1]到[6]中任一项所述的抗体或[7] 的组合物作为活性成分施用的步骤；[21] 一种中和神经毒性的方法，其包括将[1]到[6]中任一项所述的抗体或[7] 的组合物作为活性成分施用的步骤；[22] 一种抑制Αβ淀粉样蛋白原纤维形成的方法，其包括将[1]到[6]中任一项 所述的抗体或[7]的组合物作为活性成分施用的步骤；[23] 一种中和突触毒性的方法，其包括将[1]到[6]中任一项所述的抗体或[7] 的组合物作为活性成分施用的步骤；[24] 一种检测Αβ寡聚体的方法，其包括使用[1]到[6]中任一项所述的抗体检 测自受试者收集的试样中所含的Αβ寡聚体的步骤；[25] 一种诊断受试者是否可能为阿尔茨海默氏病患者的方法，其包括使用[1]到 [6]中任一项所述的抗体在收集自受试者的试样中检测Αβ寡聚体；[26] 一种诊断受试者是否可能为阿尔茨海默氏病患者的方法，其包括下述步骤(a)使收集自受试者的试样与[1]到[6]中任一项所述的抗体接触；以及(b)测定所述试样中Αβ寡聚体的量，其中当步骤(b)中测得的量高于健康个体的量时，确定所述受试者可能为阿尔茨 海默氏病患者；[27] 一种诊断受试者是否可能为阿尔茨海默氏病患者的方法，其包括下述步骤(a)使收集自受试者的试样与[1]到[6]中任一项所述的抗体以及可结合Aβ单 体的抗体接触；以及(b)测定所述试样中A β寡聚体对A β单体的比例，其中当步骤(b)中测得的比例高于健康个体的比例时，确定所述受试者可能为阿 尔茨海默氏病患者；[28] [24]到[27]中任一项所述的方法，其中所述试样为血液或脑脊液；[29] 一种用于[24]到[27]中任一项所述的方法的药剂；以及[30] 一种用于[24]到[27]中任一项所述的方法的试剂盒。进一步，本发明提供了下述
7
[31] [1]到[6]中任一项所述的抗体或[7]的组合物在制备抗认知机能障碍剂中 的应用；[32] [1]到[6]中任一项所述的抗体或[7]的组合物在制备阿尔茨海默氏病的治 疗剂中的应用；[33] [1]到[6]中任一项所述的抗体或[7]的组合物在制备阻抑阿尔茨海默氏病 的进展的药剂中的应用；[34] [1]到[6]中任一项所述的抗体或[7]的组合物在制备阻抑老年斑形成的药 剂中的应用；[35] [1]到[6]中任一项所述的抗体或[7]的组合物在制备阻抑Αβ积聚的药剂 中的应用；[36] [1]到[6]中任一项所述的抗体或[7]的组合物在制备中和(阻抑)神经毒 性的药剂中的应用；[37] [1]到[6]中任一项所述的抗体或[7]的组合物在制备抑制Αβ淀粉样蛋白 原纤维形成的药剂中的应用；[38] [1]到[6]中任一项所述的抗体或[7]的组合物在制备中和(阻抑)突触毒 性的药剂中的应用；[39] [1]至丨 能障碍；[40] [1]至I
海默氏病；[41][1]到 进展；[42] [1]至[43] [1]至[44] [1]至 性；[45] [1]至丨 纤维形成；[46] [1]至 性；本发明的效果由本发明提供的抗体预期将对以引起阿尔茨海默氏病病理状态的责任分子为对 象的选择性预防/治疗方法的建立，以及阿尔茨海默氏病早期诊断标志的建立产生很大的 贡献。本发明的发明人获得的证据显示，即使在靶向脑内病理状态的抗体疗法中，外周的静 脉内施药已经足够，无需考虑脑内转移。从而，本发明预期将大大加快针对阿尔茨海默氏病 的抗体药物的进展。附图简述
图1的照片与图片显示对寡聚体特异性的抗体的生成和特征确定的结果。A 免疫 原的电泳。无Αβ 1-42单体污染的Αβ 1-42四聚体(红色箭头)使用SDS-PAGE分离。泳道
J [6]中任一项所述的抗体或[7]的组合物，用于预防和/或治疗认知机
J [6]中任一项所述的抗体或[7]的组合物，用于预防和/或治疗阿尔茨
J [6]中任一项所述的抗体或[7]的组合物，用于阻抑阿尔茨海默氏病的
IJ [6]中任一项所述的抗体或[7]的组合物，用于阻抑老年斑形成； IJ [6]中任一项所述的抗体或[7]的组合物，用于阻抑A β积聚； IJ [6]中任一项所述的抗体或[7]的组合物，用于中和(阻抑)神经毒
J [6]中任一项所述的抗体或[7]的组合物，用于抑制Αβ淀粉样蛋白原
IJ [6]中任一项所述的抗体或[7]的组合物，用于中和(阻抑)神经毒
8
1 溶解于IOmM磷酸缓冲液中的Αβ 1-42 ；泳道2 溶解于去离子蒸馏水中的Aβ 1-420B =Aβ 淀粉样蛋白，其不溶于缓冲液，但可使用甲酸自阿尔茨海默氏病患者的脑中提取出来，使用 阳性杂交瘤细胞培养物的上清液对其进行免疫沉淀，并使用蛋白-G琼脂糖(Amersham)选 择性地分离其免疫复合物。测试了九个克隆；泳道2 (红色星号)为1A9而泳道6(红色双 星号)为2C3。C: 一个条件化培养基SEC的洗脱曲线(profile)。在所述24个经SEC收集 的级分中，对级分8，13与16进行1A9免疫沉淀。Αβ免疫反应性使用4G8检测。红色箭头 指示三聚体，而空心箭头指示二聚体。星号Γ)指示抗小鼠IgG轻链。图2的照片与图片显示1Α9与2C3的抗毒性活性。A到F 经NGF处理的 PC12(PC12N)细胞的代表性图像，这些细胞在37°C下在所述抗体存在或不存在的情况下暴 露于无聚合种(seed-free)的Αβ1_42 48小时(每个小图的左半部分)。钙黄绿素ΑΜ/ΡΙ 染色的代表图，其中活细胞染为绿色而死细胞染为红色(每个小图的右半部分)。G:与下 列抗体一起暴露于无聚合种的A β 1-42 (25 μ Μ)的细胞的存活率非特异性IgG2b(实心方 块)；4G8(空心三角)；1A9(空心方块)；以及2C3(实心圆)。图3的照片与图片显示由认9与203所靶向的毒性六0聚集聚合体的大小与形态 特征。A:对Αβ 1-42(25μΜ)的540000x g上清使用多个超滤膜进行连续的分子筛过程，超 滤膜的分子量截留值为3，10，30与IOOkDa(Microcon)。由此被分级的四种类型的滤液如 下命名级分 1 ( < 3kDa)，级分 2 (3 到 IOkDa)，级分 3 (10 到 30kDa)，级分 4 (30 到 IOOkDa)； 以及最后保留的级分5( > IOOkDa)。在上述每个级分中Αβ 1-42的存在均用4G8免疫印 迹法加以检测。B 用所述五个级分在37°C下处理48小时的经NGF处理的PC12 (PC12N)细 胞的代表性图像。每个级分的毒性如上面图2所述的方法衡量。C 经Αβ 1-42的540000Χ g上清液以及五个级分(级分1到5)处理的细胞的活力。两次独立实验得到相似的结果。 其值以相对对照的百分比(平均值士SD)表示。D 所述五个级分(级分1到5)的点印迹 分析。使印迹与A11、1A9，2C3和4G8反应。E :5个级分的AFM图。在具有最强毒性的级分 5 (Fr. 5)中，除了粒状分子外，还发现了环形与珠形结构。图4的照片与图片显示1A9与2C3阻抑Αβ淀粉样蛋白原纤维形成的活性。A 通 过ThT分析法在37°C下监视A β 1-42在多种浓度下(10 μ M (空心方块)，25 μ M (实心菱形) 与50μΜ(空心圆))的淀粉样蛋白原纤维形成直至72小时。8:对于203(空心圆)，观察 到了针对Αβ 1-42淀粉样蛋白原纤维形成的共存抗体依赖性抑制(coexsisting antibody dose-dependent inhibition)。与之相对，1A9 (空心方块)，4G8 (实心三角)与非特异性 IgG (实心方块)抗体并不抑制无种子的A β 1-42的原纤维形成性组装(ThT阴性540000Χ g 上清)。C 对于2C3 (空心圆)，观察到了针对A β 1-42原纤维形成性组装的共存抗体依赖性 抑制，且1Α9(空心方块)于3μ M亦见到近乎完全的抑制。D 预培育24小时以供A β 1-42 淀粉样蛋白原纤维形成，此后添加的所有测试抗体均无法使Αβ 1-42淀粉样蛋白纤维溶解 或解聚。E到G :Α β 1-42在不存在2C3与1Α9 (小图Ε)、或存在2C3 (小图F)、或存在1Α9 (小 图G)情况下的EM图像。图5的照片与图片为关于与毒性相关的Αβ 1-42寡聚体。A 点印迹分析法(小 图A的上半部分)Αβ 1-42单体(25 μ Μ)在37°C下培育特定时间(0到72小时)，并固化 于硝酸纤维素膜上，并对其用All，1A9，2C3或4G8进行点印迹分析。对每个抗体测试了免 疫反应性阳性结构的出现。免疫反应性强度分析(小图A的下边部分)点印迹分析的结果使用Multi Gauge ν 3. 0软件(Fuji Film, Tokyo)进行半定量的分析。为将所述寡聚 体形成与淀粉样蛋白原纤维形成相关联，在同一个时间轴上叠加了 ThT荧光值(右边的Y 轴)。B 在37°C下培育0，2，4与24小时后的A β 1-42聚合体，以及所述A β 1-42聚合体 在进一步培育48小时后的变化。所述A β 1-42聚合体通过4G8免疫印迹法检测。C 上述 多种Aβ 1-42聚合体的毒性活性。神经细胞的活力通过图2中所述LIVE/DEAD分析法确 定。D 使用多种A β 1-42聚合体(在37°C下0与2小时形成的A β 1-42聚合体(“Oh”与 “2h”)；以及在540000X g下超速离心两小时后收集的ThT阳性上清(“2h sup”))，测量 1A9与2C3的抗神经毒性活性。在所述抗体存在或不存在情况下暴露于多种Aβ 1-42聚合 体的PC12N细胞的代表性的图像示于小图D的左半部分(a:“0h”；b :“2h”;c :"2hsup";d "2h sup，，+IgG2b ;e :‘‘2h sup，，+lA9 ;f :“2h sup，，+2C3)。在所述抗体存在或不存在情况下 暴露于多种Αβ 1-42聚合体的细胞的活力以相对于对照的百分比(平均值士SD)表示，并 示于小图D的右半部分。较之“0h”Ai3 1-42聚合体，“2h”Ai3 1-42聚合体降低了神经毒性。 "2h sup”使神经毒性恢复到类似于“0h”Ai3 1-42聚合体的程度。非特异性的IgG2b无法 阻断“2h sup”Ai3 1-42聚合体的神经毒性诱导。单克隆1A9完全抑制了 “2h sup”诱导的 神经毒性，而2C3抑制该毒性的能力略为低下。在使用所述两种单克隆抗体(mAb)的实验 中，在mAb Αβ比例为1 < 25到50时观察到了所述mAb的抗毒性活性。这表明结构 上不同的寡聚性1Α9或2C3聚合体以相对低的浓度存在。图6的照片和图显示可溶性1Α9或2C3寡聚体存在于人类脑中。针对A β寡聚体 的抗体只有在用蛋白酶K预处理后方可在AD脑中检出老年斑与血管淀粉样蛋白。A 1Α9染 色；B :2C3染色；以及C =All染色。D 用4G8对经1A9或2C3免疫沉淀的Aβ在可溶于缓 冲液的AD脑中(泳道1，2，4与5)与健康对照脑中(泳道3与6)进行免疫印迹分析。1Α9 与2C3的代表性结果分别示于所述小图的左边与右边部分。E与F 在自健康老年人群的 50个尸体剖检病例中获取的人内嗅皮质中，可溶性1Α9免疫反应性12-聚体(小图Ε)与可 溶性2C3-免疫反应性12-聚体(小图F)的半定量分析(BraakNFT I期或II期m = 35 ； Braak NFT III 期或 IV 期n = 13 ；以及 Braak NFT > IV 期，AD 病例n = 2)。图7-1的图片显示可溶性1A9或2C3寡聚体存在于人类CSF中。用汇集的全脑 脊液(CSF) (AD = 10,NC = 10)(小图A与B)与汇集的无脂蛋白(lipoprotein-d印leted) CSF(AD = 10，NC = 10)(小图C与D)进行尺寸排阻色谱(SEC)。在小图A与B中，通过对 收集的级分进行BNT77-BA27与BNT77-BC05 ELISA分析，考察了 A β 40与A β 42单体的分 布。小图C与D显示被1A9/2C3混合抗体捕获的Aβ 40与Aβ 42单体的存在。图7-2为图7-1的继续。在12个AD病例(空心圆)与13个NC病例(实心圆) (小图E与G)中测定了寡聚性1Α9聚合体的量(1A9-BC05与1A9BA27ELISA)或2C3聚合体 的量(2C3-BC05与2C3-BA27 ELISA)。寡聚体/单体比例分别示于小图F(1A9)与H(2C3)。图8的图片显示可通过被动免疫接种治疗来预防Tg2576小鼠记忆障碍的发病。 将13月龄的Tg2576小鼠分为下列三组以实施学习/行为测试PBS施用组n = 10 ； 1A9 施用组n= 13;以及2C3施用组n= 11。所有这些测得的值均示为平均值士SE。(A) Y-迷宫测试。在每个组中测定8分钟期间的Y-迷宫任务中自发改变行为(spontaneous alteration behavior)。单向 ANOVA 的结果如下所述F (1，52) = 3. 09，ρ < 0. 05 广与 施用PBS的Tg2576小鼠相比较ρ < 0. 05。(B)新物体识别测试。保持期(retentionsession)在训练24小时后进行。在10分钟期间的新物体识别测试中测定每组的探查偏好 (exploratorypreference)。双向 ANOVA 的结果如下所述训练 / 保持，F(l，64) = 31. 53,ρ
<0. 01 ；动物组，F (2，64) 7. 49，ρ < 0. 01 ；所述动物组进行的反复训练/记忆，F (2，64) =10. 12，ρ < 0. 01 ；**与对应的非训练小鼠相比较ρ < 0.01ο ##与施用PBS的Tg2576小 鼠相比较ρ < 0. 01。(C)在水迷宫测试中60秒期间内对每个组测量游泳路程长度。双向 ANOVA 的结果如下所述试验，F (9，320) = 20. 46，ρ < 0. 01 ；动物组，F (2，320) = 12. 59， P < 0.01 ；所述动物组进行的反复试验，F (18，320) = 1.78，ρ <0.05 ；ρ < 0. 05广与施用 PBS的Tg2576小鼠相比较ρ < 0. 01。有条件的恐惧学习测试(fear-conditioned learning test)确定了背景依赖性(context dependent) (D)与线索依赖性(clue dependent)僵 直时间(freezingtime)。双向ANOVA结果如下所述背景依赖性测试，F (2，32) = 5. 94，ρ
<0. 01 ；线索依赖性测试，F (2，32) = 7. 33，ρ < 0. 01 ；*与施用PBS的Tg2576小鼠相比较 ρ < 0. 05 ；** 同样比较 ρ < 0. 01。图9的图片与照片显示被动免疫疗法可在Tg2576中预防脑内Αβ积聚。对于三 组13月龄的Tg2576小鼠(PBS施用组n = 10 ； 1A9施用组n = 13 ；以及2C3施用组m =11)，将海马与大脑皮层以三个连续步骤中提取出来，制备可溶于缓冲液的级分、可溶于 SDS的级分、和可用甲酸(FA)抽提的级分。对每个部分进行A β特异性ELISA测定(WAK0 试剂盒对 A β χ-40，ΒΝΤ77-ΒΑ27 ；对 A β χ-42，BNT77-BC05)。发现 A β 40 (SDS 与 FA)与 A β 42 (SDS)的积聚仅在经1Α9处理的组中被显著阻抑。All-阳性寡聚体(4-聚体)的积 聚阻抑作用在来自两个经抗体处理的组中SDS可溶性大脑皮层级分中得到了确证。图10的照片与图片显示在Tg2576的血浆与脑中的Αβ寡聚体。A与B 作为ELISA 分析的结果，在PBS施用组与免疫治疗组间未观察到血浆中Aβ χ-40与Αβ χ-42的量有显 著变化。C:类似地，在经测试的三个组中未观察到A β 40/Α β 42比例的变化。D 作为使用 汇集的脑组织勻浆进行点印迹分析的结果，在三个经测试的组间未观察到可溶于生理盐水 的All阳性寡聚体量有变化。海马(左边小图)与大脑皮层(右边小图)。PBS施用组n =10;1A9施用组n = 13 ；以及2C3施用组n = 11。E 根据使用抗寡聚体抗体All的免 疫印迹分析，在经SDS抽提的大脑皮层级分(右边小图)中Αβ四聚体的免疫反应性在经 施用1Α9与2C3的组中较之施用PBS的组降低。而另一方面，在海马(左边小图)中未观 察到此现象。F:自这些组中每一个收集血液(除去白蛋白的血浆，小图F的上边部分；除 去白蛋白/脂蛋白的血浆，小图F的下边部分)，并对其进行All点印迹分析。其结果，发 现All免疫反应性在经施用1A9与2C3的组中较之PBS施用组增加(小图F)。2C3寡聚体 的以脂蛋白结合形式存在的比例较之1A9寡聚体为高(小图F的下边部分)。进一步，All 免疫印迹法亦显示在大约200kDa处的阳性信号，其免疫反应性在1A9与2C3施用组中较之 PBS施用组明显增加(小图G)。由这些结果可以想到，在所述施用抗体的组中获得了仅靶 向Αβ寡聚体分子的选择性的治疗功效，而没有影响到生理分子。图11的照片与图片显示在Tg2576小鼠脑中通过被动免疫接种治疗阻抑了老年斑 淀粉样蛋白形成(Α :Αβ特异性抗体染色；以及B 硫代黄素-S阳性分析)与肿大变性神经 突形成(C:突触泡蛋白阳性分析)。图12的照片显示用1Α9与2C3的被动免疫接种治疗阻抑了突触退行性变。突触 泡蛋白(左边小图)与脑发育调节蛋白(drebrin)(右边小图)点状外周细胞(dot-like
11peripheral cell)中的免疫染色。上图施用PBS ；中图施用1A9 ；以及下图施用2C3。图13的照片显示所述抗体通过被动免疫接种治疗发生脑内转移。显示了在 Tg2576小鼠脑中施用的抗体的分布。用抗Αβ抗体(左边小图)与IgG(中间小图)染色。 施用1Α9 (A)，施用2C3 (B)，以及施用PBS (C)。图14的照片通过点印迹分析显示，单克隆抗体2C3，E12，IClO (同种型IgM)，以及 4D3特异于寡聚体(3-96h)，但无法识别单体(Oh)。图15的照片通过点印迹分析显示，E12抗体，其类别已通过基因工程从IgM变为 IgG2b，并不识别A β单体(Ohr)，但特异于A β寡聚体(3_96hr)。图16的图显示已通过基因工程从IgM类别变为IgG2b的E12抗体针对Aβ淀粉样 蛋白原纤维形成的阻抑活性。以三种不同浓度将该抗体添加于Αβ 1-42溶液中(12.5μΜ)。 在37°C下培育24小时后，通过ThT荧光强度方法测量A β淀粉样蛋白原纤维形成的水平。 水平轴指示添加的抗体的量，而垂直轴显示由所述抗体添加而得的淀粉样蛋白原纤维形成 水平相对于作为标准的未添加抗体时的淀粉样蛋白原纤维形成水平的值。发明的实施方式本发明将在下面更加详细的加以说明。如上所述，本发明发明人成功的获取下述抗体，其可特异性结合Αβ寡聚体而非 Αβ单体。亦即，本发明提供了可结合Αβ寡聚体而非Αβ单体的抗体。所述抗体优选为分 离的或纯化的。术语“分离的”与“纯化的”的用于本发明的物质(抗体与其它)时，指明该物质 实质上不包含至少一种可能存在于其天然来源中的物质。因此“分离的抗体，，与“提纯的 抗体”指下述抗体，即其实质上不包含该抗体(蛋白质)所来源的细胞或组织来源的细胞材 料，例如烃类，脂肪或其它污染蛋白质。当所述抗体为化学合成时，该术语指下述抗体，即其 实质上不含有化学前体物质或其它化学物质。在优选实施方案中本发明的抗体为分离的或 纯化的。“抗体”指具有相同结构特征的糖蛋白。抗体对特定抗原显示结合特异性。在本文 中“抗原”指下述蛋白，其具有可结合相应抗体的能力，并可在体内诱导抗原-抗体反应。A β蛋白，其为淀粉样蛋白的主要构成成分，为由40到42个氨基酸组成的肽，且 已知其由称为淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的前体蛋白通过蛋白酶的作用产生。除了被收集 于超速离心沉降级分中的淀粉样蛋白原纤维外，自APP产生的淀粉样蛋白分子还包括寡聚 的非纤维性的聚合体(assembly)，以及可溶性单体。本发明中的“Αβ寡聚体”指非纤维性 的聚合体。本发明的“Αβ寡聚体”包括，例如，Aβ 40 (Αβ 1-40)寡聚体与Aβ 42 (Αβ 1-42) 寡聚体。举例而言，本发明的“Α β 42寡聚体”为在SDS-PAGE中显示分子量45到160kDa， 并在Blue Native PAGE中显示分子量22. 5到1035kDa的分子。使用分子筛时，所述分子 主要被收集于> IOOkDa的保留溶液。当在原子力显微镜下观察时，所述分子显示混合的形 态，包括颗粒状、珠形与环形的分子，其高度为1. 5到3. lnm。在凝胶过滤方法中，所述分子 可洗脱于分子量为680kDa或更高的空体积级分8中，和分子量为17到44kDa的级分15中。对在本发明中所用的抗体的来源与形式并无限制，只要其可结合Αβ寡聚体而非 Aβ单体。本发明的“抗体”包括单克隆抗体与多克隆抗体两者。本发明的抗体亦包括任何类型的抗体，例如非人动物抗体，人源化抗体，嵌合抗体，人类抗体，近来描述的迷你抗体 (minibody)，氨基酸序列被修饰的抗体，缀合有其它分子(例如，如聚乙二醇等多聚物)的 修饰抗体，以及糖链被修饰的抗体。在本文中所用的术语“单克隆抗体”指下述抗体，它们是从实质上同质的抗体群体 中获取的。亦即，构成该群体的各个抗体彼此相同，除了可能以痕量存在的天然突变体之 外。单克隆抗体具有非常高的特异性，且识别单一的抗原位点。每个单克隆抗体识别所述 抗原的单一决定簇，这与常规的(多克隆)抗体制备物不同，后者通常含有针对不同抗原决 定簇(表位)的不同抗体。除上面提及的特异性外，单克隆抗体亦具有下述优势，即它们可由未经其它免疫 球蛋白污染的杂交瘤培养物合成。因此“单克隆”指明可得自实质上同质的抗体群体的抗 体的特征。该术语并不表示需要任何特定的抗体生产方法。基本上，单克隆抗体可使用已知技术生产。举例而言，其可通过最先由Kohler and Milstein (Nature 256 :495_7，1975)描述的杂交瘤技术，或由重组 DNA 方法(Cabilly et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 =3273-7,1984)生成，但其方法并不仅限于此。举例而 言，当使用所述杂交瘤方法时，Aβ寡聚体(例如，描述于实施例中的Αβ四聚体)用作致 敏抗原，而免疫接种通过常规的免疫接种方法进行。所得的免疫细胞与已知亲本细胞通过 常规细胞融合方法融合，且可使用常规筛选方法筛选与分离抗体产生细胞。本发明所述的单克隆抗体可如下所述产生。首先，将合成Αβ 1_42(Ρ印tide Institute, Inc.，Osaka)溶解于去离子蒸馏水或IOmM磷酸缓冲液溶液，并在37°C下培育 18小时。随后，用4-12% SDS-PAGE分离该肽，并通过CBB染色显影，而仅切出未经Aβ 1-42 单体污染的A β 1-42四聚体部分。继之，对BALB/c小鼠在其足垫上用2. 5 μ g的以弗氏完 全佐剂乳化的Αβ 1-42四聚体进行免疫接种。随后，进行六次的加强免疫(booster)。利用 鼠蹊部淋巴结，通过使用聚乙二醇1500与Sp/0-Agl4细胞融合产生杂交瘤。在本发明中，用致敏抗原免疫接种的动物并无特别限定，但优选考虑到与供细胞 融合使用的亲本细胞的相容性进行选取。一般而言，使用啮齿类，兔形类或灵长类。啮齿类 包括，例如，小鼠，大鼠与仓鼠。兔形类包括，例如，家兔。灵长类包括，例如，狭鼻(旧大陆) 猴，例如食蟹猴(Macacafascicularis)，猕猴(Macaca mulatta)，阿拉伯狒狒与黑猩猩。动物使用致敏抗原根据抑制方法进行免疫接种。举例而言，作为标准方法，免疫接 种通过腹腔内或皮下对哺乳类注射致敏抗原来进行。亲本细胞与前述免疫细胞融合的一个实例为Sp2/0_Agl4细胞，其描述于下面的 实施例。然而可使用多种其它已知细胞系。前述免疫细胞与骨髓瘤细胞间的细胞融合可基本上根据已知的方法进行，包括 Kohler 与 Milstein 的方法(Kohler G. and Milstein C.，MethodsEnzymol. (1981)73， 3-46)。以此方式获取的杂交瘤通过对其在常规选择培养基中进行培养而进行选择，所述 培养基可以举出HAT培养基为例，其含有次黄嘌呤，氨基蝶呤与胸苷。在上述HAT培养基中 的培养通常持续数日至数周以提供充足时间杀灭除所期望的杂交瘤外的细胞(非融合细 胞)。继之，可进行常规的有限稀释方法以筛选并单独克隆可产生所期望抗体的杂交瘤。在此之后，将所得的杂交瘤移植到小鼠的腹腔，并提取含有所期望单克隆抗体的
13腹水。举例而言，所述抗体可自所述腹水通过常规的蛋白质分离和/或纯化方法进行纯 化，所述方法例如柱层析(包括但不仅限于亲和层析)、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯 酰胺凝胶电泳以及等电聚焦的选择组合(Antibodies =A Laboratory manual, Harlow and David, Lane (edit. ), Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。蛋白A柱与蛋白G柱可用于亲和柱。使用的蛋白A柱的实例包括HyperD，POROS 与 Sepharose F. F. (Pharmacia) 0层析(排除亲和层析)包括离子交换层析，疏水层析，凝胶过滤，反向层析以及吸 Ρ Μ /Τ ( "Strategies for Protein Purification and Characterization ALaboratory Course Manual，，，Daniel R Marshak et al. , Cold Spring HarborLaboratory Press, 1996)。当进行层析时，可使用液相层析方法例如HPLC与FPLC。以该方式制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可于常规的培养基中传代培养，且其可 在液氮中长时间储藏。任何哺乳类均可使用的免疫原进行免疫接种以生产抗体。然而，当通过产生杂交 瘤制备单克隆抗体时，优选考虑与用于细胞融合以供产生杂交瘤的亲本细胞的相容性。一般而言，啮齿类，兔形类或灵长类用于免疫接种。啮齿类包括，例如，小鼠，大鼠 与仓鼠。兔形类包括，例如，家兔。灵长类包括，例如，狭鼻(旧大陆)猴，例如食蟹猴，猕猴， 阿拉伯狒狒与黑猩猩。使用具有人类抗体基因库的转基因动物在本领域是已知的(Ishida I, etal., Cloning and Stem Cells 4 =91-102, 2002) 和其它动物一样，为获取人类单克隆抗体， 对所述转基因动物进行免疫接种，随后自该动物收集抗体产生细胞，并与骨髓瘤细胞融合 以产生杂交瘤，且可自这些杂交瘤产生抗蛋白质的人类抗体(参见国际公布W092/03918， W094/02602, W094/25585, W096/33735 和 W096/34096)。或者，用癌基因永生化的淋巴细胞可用于产生单克隆抗体。举例而言，对于用EB 病毒等感染的人类淋巴细胞在体外用免疫原进行免疫接种。然后，将经免疫接种的淋巴细 胞与源自人类，能够无限分裂的骨髓瘤细胞(U266，等)融合，从而获得产生所期望人类抗 体的杂交瘤(日本公开专利公报(JP-A)昭63-17688)。一旦单克隆抗体可通过任何前述方法获取，所述抗体亦可使用遗传工程方法 (参见，例如 Borrebaeck CAK and Larrick Jff, Therapeutic MonocIonalAntibodies, MacMillan Publishers, UK, 1990)制备。举例而言，重组抗体可通过从抗原产生细胞(如 杂交瘤或经免疫接种的淋巴细胞)克隆出编码期望抗体的DNA，并将所克隆的DNA插入合适 的载体中，再将该载体转染入合适的宿主细胞，来加以制备。上述重组抗体亦包含于本发明 中。本发明的单克隆抗体的实例包括1A9单克隆抗体，2C3单克隆抗体，E12单克隆抗 体，IClO单克隆抗体与4D3单克隆抗体。所述单克隆抗体优选包括下述(i)到(iii)的抗 体(i) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的H链(重链)与具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列的L链(轻链)；(ii) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 21的氨基酸序列的H链(重链)与具有 SEQ ID NO 23的氨基酸序列的L链(轻链)；
(iii) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 41的氨基酸序列的H链(重链)与具有 SEQ ID NO 43的氨基酸序列的L链(轻链)。在一个实施方案中，本发明的抗体包括迷你抗体。迷你抗体包含抗体片段但缺乏 全抗体的一部分，且无特别限制，只要其具有结合抗原的能力。抗体片段的实例包括Fab， Fab，，F(ab，)2 与 Fv。迷你抗体的实例包括 Fab，Fab，，F(ab，)2，Fv，scFv(单链 Fv)，双抗 体(diabody)，以及 sc (Fv) 2 (单链(Fv) 2)。为获取针对本发明蛋白质的多克隆抗体，对经抗原致敏的哺乳动物，在确证所期 望的抗体血清水平上升后，从其取出血液。通过已知方法自血液分离出血清。当使用多克 隆抗体时，可使用含该多克隆抗体的血清。或者，若需要，可自血清分离出含所述单克隆抗 体的级分然后再使用。举例而言，免疫球蛋白G或M可如下制备使用与本发明的蛋白质偶 联的亲和柱获得特异性识别所述蛋白质的级分，然后使用蛋白A或蛋白G柱提纯该级分。在本发明中，可结合A β寡聚体的为结合1A9，2C3，E12，1C10或4D3的抗体。该抗 体优选为下述(A)至(C)中任一项所述的抗体(A) 一种可结合下述Αβ寡聚体的抗体，所述Αβ寡聚体可结合包含具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的H链(重链)与具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列的L链(轻链)的 抗体；(B) 一种可结合下述Αβ寡聚体的抗体，所述Αβ寡聚体可结合包含具有SEQ ID NO 21的氨基酸序列的H链与具有SEQ ID NO 23的氨基酸序列的L链的抗体；(C) 一种可结合下述Αβ寡聚体的抗体，所述Αβ寡聚体可结合包含具有SEQ ID NO 41的氨基酸序列的H链与具有SEQ ID NO 43的氨基酸序列的L链的抗体。进一步，本发明提供了本发明所述抗体与之结合的Αβ寡聚体。所述抗体优选包 括，例如，1Α9单克隆抗体，2C3单克隆抗体，Ε12单克隆抗体，IClO单克隆抗体以及4D3单克 隆抗体。上述Αβ寡聚体可用作供制备抗体或疫苗的抗原。在优选实施方案中，本发明所述抗体包括，例如，下述(1)到(20)中任一项所述的 抗体(1) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 9的氨基酸序列作为CDRl、SEQ ID NO 11 的氨基酸序列作为⑶R2、以及SEQ ID NO 13的氨基酸序列作为⑶R3的H链；(2) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 15的氨基酸序列作为CDRl、SEQ ID NO 17 的氨基酸序列作为⑶R2、以及SEQ ID NO 19的氨基酸序列作为⑶R3的L链；(3) 一种抗体，其包含⑴的H链与⑵的L链；(4) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 5的氨基酸序列作为VH的H链；(5) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列作为VL的L链；(6) 一种抗体，其包含⑷的H链与(5)的L链；(7) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 29的氨基酸序列作为CDRUSEQ ID NO 31 的氨基酸序列作为⑶R2、以及SEQ ID NO 33的氨基酸序列作为⑶R3的H链；(8) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 35的氨基酸序列作为CDRl、SEQ ID NO 37 的氨基酸序列作为⑶R2、以及SEQ ID NO 39的氨基酸序列作为⑶R3的L链；(9) 一种抗体，其包含(7)的H链与(8)的L链；(10) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 25的氨基酸序列作为VH的H链；
15
(11) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO ,21的氨基酸序列作为VL的L链；(12) 一种抗体，其包含(10)的H链与(11)的L链；(13) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 49的氨基酸序列作为CDRl、SEQ ID NO 51的氨基酸序列作为⑶R2、以及SEQ ID NO 53的氨基酸序列作为⑶R3的H链；(14) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 55的氨基酸序列作为CDRl、SEQ ID NO 57的氨基酸序列作为⑶R2、以及SEQ ID NO 59的氨基酸序列作为⑶R3的L链；(15) 一种抗体，其包含(13)的H链与(14)的L链；(16) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 45的氨基酸序列作为VH的H链；(17) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 47的氨基酸序列作为VL的L链；(18) 一种抗体，其包含(16)的H链与(17)的L链；(19) 一种抗体，其是(1)到(18)中任一项的抗体中替换，缺失，添加和/或插入一 个或多个氨基酸而得到的，且具有与所述(1)到(18)中任一项的抗体等价的活性；以及(20) 一种抗体，其可结合(1)到(18)中任一项的抗体所结合的表位。上述(1)中“具有SEQ ID NO 9 (E12抗体H链⑶Rl的序列)的氨基酸序列作为 CDRUSEQ ID NO :11(E12抗体H链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO: 13 (E12抗体H链⑶R3的序列)的氨基酸序列作为⑶R3的H链”中VH的一个实例，是具有 SEQ ID NO 5 (E12抗体VH的序列)的氨基酸序列的VH0上述⑵中“具有SEQ ID NO :15 (E 12抗体L链⑶Rl的序列)的氨基酸序列作 为CDRl、SEQ ID NO 17 (E12抗体L链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO 19 (E12抗体L链⑶R3的序列)的氨基酸序列作为⑶R3的L链”中VL的一个实例，是 具有SEQ ID NO : 7 (El2抗体VL的序列)的氨基酸序列的VL0上述(7)中“具有SEQ ID NO 29 (1C10抗体H链⑶Rl的序列)的氨基酸序列作 为CDR1、SEQ ID NO :31 (1C10抗体H链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO 33 (1C10抗体H链⑶R3的序列)的氨基酸序列作为⑶R3的H链”中VH的一个实例，是 具有SEQ ID NO 25 (1C10抗体VH的序列)的氨基酸序列的VH。上述⑶中“具有SEQ ID NO 35 (1C10抗体L链⑶Rl的序列)的氨基酸序列作 为CDR1、SEQ ID NO :37 (1C10抗体L链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO 39 (1C10抗体L链⑶R3的序列)的氨基酸序列作为⑶R3的L链”中VL的一个实例，是 具有SEQ ID NO 27 (1C10抗体VL的序列)的氨基酸序列的VL。上述(13)中“具有SEQ ID NO 49 (4D3抗体H链⑶Rl的序列)的氨基酸序列作 为CDRl、SEQ ID NO 51 (4D3抗体H链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO 53 (4D3抗体H链⑶R3的序列)的氨基酸序列作为⑶R3的H链”中VH的一个实例，是 具有SEQ ID NO 45 (4D3抗体VH的序列)的氨基酸序列的VH。上述⑵中“具有SEQ ID NO 55 (4D3抗体L链⑶Rl的序列)的氨基酸序列作为 CDR1、SEQ ID NO :57 (4D3抗体L链CDR2的序列)的氨基酸序列作为CDR2、以及SEQ ID NO: 59 (4D3抗体L链⑶R3的序列)的氨基酸序列作为⑶R3的L链”中VL的一个实例，是具有 SEQ ID NO 47 (4D3抗体VL的序列)的氨基酸序列的VL。对本发明所述的E12抗体，其全长H链的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO :1与SEQ ID NO :2 ；其全长L链的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO 3与SEQ ID NO :4;其H链可变区(VH)的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO :5与 SEQ ID NO 6 ；其L链可变区(VL)的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO :7与SEQ ID NO 8 ；其H链CDRl的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO :9与SEQ IDNO 10 ； 其H链⑶R2的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID N0:11与SEQ ID N0:12;其H链 ⑶R3的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQID NO 13与SEQ ID NO :14 ；其L链⑶Rl的 氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID N0:15与SEQ ID NO 16 ；其L链⑶R2的氨基酸 序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO: 17与SEQ ID NO 18 ；而其L链⑶R3的氨基酸序列 与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO 19与SEQ ID NO :20。对本发明所述的IClO抗体，其全长H链的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO 21与SEQ ID NO 22 ；其全长L链的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO 23与SEQ ID N0:24;其H链可变区(VH)的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO 25与SEQ ID N0:26;其L链可变区(VL)的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO 27与SEQID NO 28 ；其H链⑶Rl的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO 29与 SEQ ID NO :30 ；其H链⑶R2的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO :31与SEQ ID NO 32 ；其H链⑶R3的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO :33与SEQ ID NO 34 ； 其L链⑶Rl的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO :35与SEQ ID NO :36 ；其L链 ⑶R2的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID N0:37与SEQ ID NO :38 ；而其L链⑶R3 的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID N0:39与SEQ IDNO 40。对本发明所述的4D3抗体，其全长H链的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO 41与SEQ ID NO 42 ；其全长L链的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO 43与SEQ ID N0:44;其H链可变区(VH)的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO 45与SEQ ID N0:46;其L链可变区(VL)的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO: 47与SEQ IDNO 48 ；其H链⑶Rl的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO 49与 SEQ ID NO 50 ；其H链⑶R2的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQID NO 51与SEQ ID NO 52 ；其H链⑶R3的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO 53与SEQ ID NO 54 ； 其L链⑶Rl的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID NO 55与SEQ ID NO 56 ；其L链 ⑶R2的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID N0:57与SEQ ID NO :58 ；而其L链⑶R3 的氨基酸序列与核苷酸序列分别示于SEQ ID N0:59与SEQ ID NO :60。上面提及的(1)到(20)的抗体并不仅仅包括单价抗体，亦包括具有两个或更多结 合价的多价抗体。本发明的多价抗体包括其抗原结合位点全部相同的多价抗体，以及其抗 原结合位点部分或完全不同的多价抗体。在一个优选实施方案中，上面提及的(19)的抗体是不具备经修饰的CDR的抗体。 举例而言，上面提及的(19)的抗体中所谓“在(1)的抗体中替换，缺失，添加，和/或插入 一个或多个氨基酸而得到的，其具有与(1)的抗体等价的活性的抗体”，优选为“具有与(1) 的抗体等价的活性的，在(1)的抗体中替换、缺失、添加和/或插入一个或多个氨基酸而得 到的，且包括具有SEQ IDNO 9的氨基酸序列作为⑶Rl、SEQ ID NO 11的氨基酸序列作为 ⑶R2，与SEQ ID NO 13的氨基酸序列作为⑶R3的H链的抗体”。另一个上述(19)的抗体 的优选抗体可以类似的方式表述。在本文中“等价的活性”指关注的抗体具有与本发明抗体相似的生物学或生物化
17学活性。本发明所述“活性”的实例包括与Αβ寡聚体但不与Αβ单体特异性结合的活性， 抗神经毒性活性，阻抑A β淀粉样蛋白原纤维形成的活性，抗突触毒性的活性，与抗记忆功 能障碍的活性。本领域技术人员周知的制备具有与某多肽等价的活性的多肽的方法包括在该多 肽中导入突变。举例而言，本领域技术人员可使用定点诱变等方法(Hashimoto-Gotoh，!1. et al. (1995)Gene 152,271-275 ；Zoller, MJ, and Smith, Μ. (1983)Methods Enzymo1. 100， 468-500 ；Kramer,W. et al. (1984)NucleicAcids Res. 12,9441-9456 ；Kramer W,and Fritz HJ (1987)Methods. Enzymo1. 154,350-367 ；Kunkel，TA (1985)Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 82， 488-492 ；Kunkel (1988)Methods Enzymol. 85，2763-2766)将合适的突变导入抗体，来制备 其活性等价于本发明的抗体的活性的抗体。氨基酸突变亦可天然发生。本发明所述的抗体 亦包括下述抗体其包含在本发明抗体的氨基酸序列中发生一个或更多突变而得到的氨基 酸序列，且具有与本发明所述抗体活性等价的活性。在上述突变体中，突变氨基酸的数量通 常可为50个氨基酸或更少，优选30个氨基酸或更少，且更优选十个氨基酸或更少(例如， 五个氨基酸或更少)。氨基酸残基优选突变为保留所述氨基酸侧链性质的其它氨基酸。举例而言，氨基 酸根据其侧链性质进行如下分类疏水氨基酸(A，I，L，M, F，P，W，Y与V)，亲水氨基酸(R， D，N，C，E，Q，G，H，K，S与T)，具有脂肪族侧链的氨基酸(G，A，V，L，I与P)，具有含羟基侧链 的氨基酸(S，T与Y)，具有含硫原子侧链的氨基酸(C与M)，具有含羧酸与含酰胺侧链的氨 基酸(D，N，E与Q)，具有碱性侧链的氨基酸(R，K与H)，以及具有含芳环侧链的氨基酸(H， F，Y与W)(氨基酸在括号中以单字母密码表示)。已知具有在某一氨基酸序列中一个或更多氨基酸残基经修饰(缺失，添加，和/或 替换为其它氨基酸)而得到的氨基酸序列的多肽可保留其原来的生物学活性(功能)。除上面提及的修饰外，本发明的抗体可与其它物质缀合，只要其活性得到保持即 可。所述物质的实例包括肽，脂质，糖与糖链，乙酰基团，以及天然与合成多聚物。可实施这 些修饰以给予所述抗体额外的功能，或使其稳定化。本发明的抗体的氨基酸序列添加数个氨基酸残基而得的抗体包括含有该抗体的 融合蛋白。在该融合蛋白中，该抗体与其它肽或蛋白质融合。产生融合蛋白的方法可通过 将编码本发明的抗体的多核苷酸与编码另一多肽或蛋白质的多核苷酸阅读框一致地连接， 并将其插入表达载体，并将该融合构建体在宿主中表达来进行。本领域技术人员已知的技 术可用于该目的。与本发明的抗体融合的肽或多肽包括，例如，已知的肽，例如FLAG(Hopp， Τ. P. et al.，BioTechnology (1988) 6，1204-1210)，由六个组氨酸(His)残基组成的6x His, IOx His，流感血凝素(HA)，人c-myc片段，VSV-GP片段，pl8HIV片段，T7-标签，HSV-标签， E-标签，SV40T抗原片段，Ick标签，α-微管蛋白片段，B-标签以及蛋白C片段；谷胱甘 肽-S-转移酶(GST)；免疫球蛋白恒定区域；半乳糖苷酶；以及麦芽糖结合蛋白(ΜΒΡ)， 等等。编码这些肽或多肽的可市购的多核苷酸可与编码本发明所述抗体的多核苷酸融合， 且可通过表达如是制备的融合多核苷酸来产生所述融合多肽。本发明所述的抗体可在氨基酸序列，分子量，糖链的存在与否，结构等方面彼此不 同，取决于产生该抗体的细胞或宿主，或者纯化方法。然而，只要所得抗体具有等价于本发 明抗体活性的活性，其即包含于本发明中。
与上述(1)到(18)中任一项的抗体所结合的表位结合的抗体可通过本领域技术 人员已知的方法获取。举例而言，该抗体可通过下述方法获取(i)用常规方法确定该(1)到 (18)中任一项所述的抗体结合的表位，并使用包含该表位中含有的氨基酸序列的多肽作为 免疫原产生该抗体；或(ii)通过常规方法确定所产生的抗体的表位，并选择其表位与(1) 到(18)中任一项所述抗体的表位相同的抗体。上面提及的(1)到(20)的抗体亦包括任何类型的抗体，例如上面提及的迷你抗 体，具有修饰氨基酸序列的抗体，例如人源化抗体与嵌合抗体，非人动物抗体，人抗体，与其 它分子(例如，如聚乙二醇的多聚物)缀合的修饰抗体，以及糖链修饰抗体。在一个优选实施方案中，本发明所述的抗体为修饰抗体，例如嵌合抗体与人源化 抗体。优选抗体的实例包括(i)其可变区源自E12抗体、IClO抗体或4D3抗体，且其恒定区 源自人类免疫球蛋白的嵌合抗体；以及(ii)其CDR源自E12抗体、IClO抗体或4D3抗体， 且其FR源自人类免疫球蛋白，且其恒定区源自人类免疫球蛋白的人源化抗体。这些修饰抗 体可使用已知方法产生。由于在人类体内嵌合抗体或人源化抗体的抗原性减少，这样的抗体可用于为治疗 等目的施用于人类。嵌合抗体通过组合源自不同动物的序列来产生。嵌合抗体的实例包括这样的 抗体，其包含小鼠抗体的重链可变区与轻链可变区，以及人类抗体的重链恒定区和轻 链恒定区。嵌合抗体的产生可使用已知方法进行(参见，例如，Jones et al. , Nature 321 522-5,1986 ；Riechmann et al. , Nature 332:323-7,1988;以 ^SPrestaiCurr. Opin. Struct. Biol. 2 :593-6，1992)。举例而言，首先，自抗体产生细胞的RNA通过聚合 酶链式反应(PCR)等方法(参见，例如，Larrick et al.，“Methods :a Companion to Methods in EnzymologyVol. 2 106,1991 ；Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies，，inMonoclonal Antibodies :Production, Engineering and Clinical Application ；Ritter et al. (eds. ),page 166,Cambridge University Press, 1995,以及 Ward etal. , "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies，，in MonoclonalAntibodies :Principles and Applications ；and Birch et al. (eds·), page 137,ffiley-Liss, Inc. ,1995)制备编码目标抗体可变区或⑶R的基因。将所制备的编码可 变区的基因连接于编码恒定区或框架区的基因。所述编码恒定区或框架区的基因可用类似 于针对CDR编码基因的方式确定，或者，其可基于已知抗体的序列信息制备。编码嵌合产 物与CDR移植产物的DNA序列可完全或部分使用寡聚核苷酸合成技术加以合成。举例而 言，可实施由Jones等(Nature 321 =522-5,1986)描述的寡聚核苷酸合成。进一步，在一些 情况下，可适当地使用定点诱变与聚合酶链式反应。由Verhoeyen et al. (Science 239 1534-6,1988)与 Riechmann et al. (Nature 332:323-7,1988)描述的对已知可变区进行 寡核苷酸特异性诱变的技术可用于修饰所述可变区序列，例如，以增强嵌合抗体的结合能 力。进一步，若需要，可使用T4 DNA聚合酶对有缺口的寡聚核苷酸进行酶促填充，例如，描 述于 Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 10029-33，1989 与 WO 90/07861)。举例而言，CDR-移植技术在本领域为已知的(“Immunoglobulin genes”，Academic Press (London), pp 260-74,1989 ；and Michael A et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 969-73,1994)。使用该技术，将给定抗体的⑶R替换为另一个抗体的⑶R。通过这样的替
19换，前者抗体的结合特异性改变为后者抗体的结合特异性。在这样的嵌合抗体中，其中框架 氨基酸源自人类抗体的称为“人源化抗体(CDR-移植抗体)”。当使用抗体治疗人类时，优 选使用人类抗体或人源化抗体。一般而言，嵌合抗体包括非人哺乳类来源的抗体的可变区与源自人类抗体的恒定 区。另一方面，人源化抗体包括非人哺乳类来源的抗体的互补决定区(CDR)以及源自人类 抗体的框架区与恒定区。在产生所述嵌合抗体或人源化抗体后，可变区(例如，FR)或恒定区中的氨基酸可 替换为其它氨基酸。所述嵌合抗体的可变区或所述人源化抗体的CDR的来源并不特别限定。源自人类抗体的C-区域用于所述嵌合抗体与人源化抗体的C-区域。举例而言， Cyl,Cy2,Cy3,Cy4,Cy,C5,Cal,Ca2%Ce 可用于 H-链的 C-区域，而 C κ 与(入 可用与L-链的C-区域。它们的序列是已知的。进一步，所述人类抗体C区域可经修饰以 改善该抗体的稳定性或其产生。本发明所述抗体针对抗原(Αβ寡聚体)的结合活性可使用例如，吸光度测定方 法、酶联免疫吸附分析(ELISA)方法、酶免疫分析(EIA)方法、放射性免疫分析(RIA)方法 和/或荧光免疫分析方法等方法来测定。在ELISA中，将抗体固化在平板上，且该抗体的抗 原添加至板上，并进行预培育。在洗涤后，将酶底物例如对硝基苯基磷酸添加至板上，并测 定其吸光度以测量所述目标试样的抗原结合能力。所述测量可使用BIAcore (Pharmacia) 来进行。进一步，本发明提供了包括上面提及的本发明的抗体与药用载体的组合物。如下所述，本发明强烈暗示单克隆1A9与2C3抗体为预防类阿尔茨海默氏病表型 的治疗抗体的有望候选。人们已显示记忆衰退与由可溶性Aβ寡聚体引起的突触功能障碍 相关(Klein WL, 2001, Trends Neurosci ；and SelkoeDJ，2002，Science)。A β 寡聚体的过 量积聚与沉着可触发导致阿尔茨海默氏病的复杂下游级联反应。若事实确为如此，则使用 包含本发明抗体与药用载体的组合物的治疗介入可有效阻断所述病理学级联反应，并由此 可使阿尔茨海默氏病的治疗成为可能。本发明所述的“治疗”并不一定针对展示病症或疾病的症候具有完全的治疗或预 防效果，但可具有部分的效果。本发明中的“治疗阿尔茨海默氏病”指缓解至少一种可由阿尔茨海默氏病导致的 症状，其实例包括缓解或阻抑认知机能障碍，缓解或阻抑老年斑形成，缓解或阻抑突触功能 障碍，以及减少或阻抑Αβ在脑组织，血液等处的积聚。在本文中，“认知机能障碍”包括，例 如，记忆障碍，包括长期/短期记忆障碍，物体认知记忆障碍，空间记忆障碍与联想及情绪 记忆障碍。本发明提供了包含含有本发明的抗体与药用载体的组合物作为活性成分的药物 组合物或药剂。在本发明中，短语“包含含有本发明的抗体与药用载体的组合物作为活性成分” 意指包含含有本发明的抗体与药用载体的组合物作为主要活性成分，但并不限定其实际含量。上面体积的药物组合物的实例包括抗认知机能障碍剂，阿尔茨海默氏病治疗剂，
20阿尔茨海默氏病进展阻抑剂，老年斑形成阻抑剂，Αβ积聚阻抑剂，抗神经毒性剂(神经毒 性中和剂)，Αβ淀粉样蛋白纤维抑制剂，以及抗突触毒性剂(突触毒性中和剂)。上面提及的本发明的药物组合物还可表现为，例如，“阻抑阿尔茨海默氏病的方 法”，所述方法包括对受试者(个体)施用包含本发明的抗体与药用载体的组合物。在其它 实施方案中，实例包括阻抑认知机能障碍的方法，阻抑阿尔茨海默氏病进展的方法。阻抑老 年斑形成的方法，阻抑A β积聚的方法，中和(阻抑)神经毒性活性的方法，抑制A β淀粉 样蛋白原纤维形成的方法，以及中和(阻抑)突触毒性的方法。在进一步的实施方案中，实 例包括预防和/或治疗认知障碍的方法，以及预防和/或治疗阿尔茨海默氏病的方法。本发明亦提供了包含本发明的上述抗体与药用载体的组合物在生产上面提及的 药物组合物中的应用。进一步，本发明涉及下述组合物。_ 一种包含上述的本发明抗体与药用载体的组合物，用于预防和/或治疗认知障碍。_ 一种包含上述的本发明抗体与药用载体的组合物，用于预防和/或治疗阿尔茨 海默氏病。-一种包含上述的本发明抗体与药用载体的组合物，用于阻抑阿尔茨海默氏病的进展。-一种包含上述的本发明抗体与药用载体的组合物，用于阻抑老年斑形成。-一种包含上述的本发明抗体与药用载体的组合物，用于阻抑Aβ积聚。-一种包含上述的本发明抗体与药用载体的组合物，用于中和(阻抑)神经毒性活 性。-一种包含上述的本发明抗体与药用载体的组合物，用于阻抑Αβ淀粉样蛋白原 纤维形成。-一种包含上述的本发明抗体与药用载体的组合物，用于中和(阻抑)突触毒性活 性。上面提及的本发明的药剂可施用于人类或其它动物。在本发明中，被施以所述药 剂的非人动物包括小鼠，大鼠，豚鼠，家兔，鸡，猫，狗，绵羊，猪，牛，猴，狒狒与黑猩猩。这些 动物优选展示至少一种选自下组的症状例如，认知机能障碍，老年斑形成、突触功能障碍， 脑组织或血液中的Αβ积聚，等等。包含于本发明的药物组合物中的抗体并不特别限定，只要它们包括于上面提及的 本发明的抗体中，其实例包括本文所描述的抗体。当使用上面提及的本发明的抗体用于药物组合物时，它们可通过本领域技术人员 已知的方法配制。举例而言，视需要，它们可用水或其它药用液体以可注射的无菌溶液或悬 浮液的形式配制，且可用于非肠道施用。举例而言，包含于所述药物组合物中的抗体可与 可接受的载体或介质，尤其是无菌水，生理盐水，植物油，乳化剂，悬浮液，表面活性剂，稳定 剂，调味剂，赋形剂，溶剂，防腐剂，粘合剂等，并混合为通常需用于接受的药物实践的单位 剂量。短语“药用”指该物质是惰性的，并含有通常用作稀释剂或溶媒的物质。合适的赋形 剂与其配制物描述于，例如，Remington，sPharmaceutical Sciences, 16th ed. (1980)Mack Publishing Co. , ed. Oslo et al. 0
生理盐水与其它含有葡萄糖或佐剂(举例而言，D-山梨醇，D-甘露糖，D-甘露醇 与氯化钠)的等渗溶液可用作供注射的水溶液。它们可与合适的增溶剂，例如醇类，更具体 而言，乙醇与多元醇(丙二醇，聚乙二醇等)，以及非离子表面活性剂(Polysorbate 80 , HCO-5O等)一起使用。芝麻油或大豆油可用作油性液，而苯甲酸苄酯或苯甲醇可组合用作增溶剂。缓冲 液(例如，磷酸缓冲液与乙酸钠缓冲液)，镇痛剂(例如，盐酸普鲁卡因)，稳定剂(例如，苯 甲醇与苯酚)，以及抗氧化剂可用于配制剂。制备好的注射液可注入合适的安瓿瓶。给药优选为非肠道给药，具体的例子包括通过注射给药，经鼻给药，经肺给药，以 及经皮给药。通过注射给药的实例包括系统性或局部性的通过静脉内注射，肌肉内注射，腹 膜内注射，皮下注射等给药。所述药物组合物包括药学有效量的活性组分(上面提及的本发明抗体)。“药学有 效量(的化合物)”指所述的量足以治疗和/或预防上述的本发明抗体在其中发挥重要作用 的病症。举例而言，“药用量”可以是当所述化合物施用于个体(患者)时，减少Αβ积聚、 中和Αβ诱导毒性、减少Αβ淀粉样蛋白形成等，由此治疗或预防由阿尔茨海默氏病造成 的病状所需的量。所述减少或中和可为，例如，减少或中和至少大约5%，10%，20%，30%， 40%，50%，75%，80%，90%，95%，99% 或 100%。确定上面提及的本发明的抗体的上述药学有效量的评估可使用标准的临床方法 进行，包括组织病理学诊断。合适的给药方法可取决于患者的年龄与症状选取。含有抗体的药物组合物的剂量 可在，例如，对于每次给药在每千克体重0. OOOlmg到IOOOmg的范围内选择。或者，例如，对 于每个患者所述剂量可在0. 001到IOOOOOmg/体重的范围内选择；然而所述剂量并不一定 限定于这些范围内。尽管剂量与给药方法根据患者的体重，年龄，症状等变动，本领域技术 人员可合适的对它们进行选择。在后面描述的动物实验中，所述剂量是基于免疫球蛋白大 剂量静注疗法(400mg/kg)(该疗法为人类健康保险所涵盖)选取的。进一步，本发明提供了在试样中检测Αβ寡聚体(实例包括Aβ 40 (Αβ 1-40)与 A β 42 (Α β 1-42))的方法。本发明中“试样”的实例包括自受试者收集的试样。具体而言， 本方法包括使用本发明的抗体检测收集自受试者的试样中所含的Αβ寡聚体的步骤。试 样中的Αβ寡聚体的检测可利用，例如，使用化学发光的夹心固相酶免疫测定法(sandwich solid-phase enzymeimmunoassay method)(化学发光ELISA)，使用所得抗体的免疫沉淀方 法、免疫印迹、流式细胞计数、质谱与免疫组织化学分析。当通过上面提及的测量方法在收集自受试者的试样中检测出Αβ寡聚体时，所述 受试者是可能的阿尔茨海默氏病患者。举例而言，当将收集自受试者的试样中Αβ寡聚体 的量与来自健康个体进行比较，且Αβ寡聚体的量在受试者中高于在健康个体中时，该受 试者确定为可能的阿尔茨海默氏病患者。受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者通常由 医师(包括受医师指导的个人，本文下同)诊断。通过本诊断方法获得的收集自受试者以 及健康个体的试样中的Αβ寡聚体的量的数据对医师进行诊断将是有用的。因此，本诊断 方法也可表现为，收集并呈现对医师诊断有用的数据的方法。具体而言，本发明提供了诊断是否受试者为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法， 其中所述方法包括使用本发明的抗体检测自受试者收集的试样中的Αβ寡聚体。
进一步，本发明提供诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法，其包 括下述步骤(a)使自受试者收集的试样与本发明的抗体以及与Αβ单体结合的抗体相接触； 以及(b)测量所述试样中A β寡聚体对A β单体的比例，其中若步骤(b)中测得的比例高于健康个体，则将所述受试者确定为可能的阿尔 茨海默氏病患者。首先，在本方法中，使收集自受试者的试样与本发明的抗体和可结合A β单体的 抗体相接触。在本文中，“接触”可通过，例如，将上面提及的每个抗体添加入收集自受试者 的试样(其置于试管中)来实施。在此情况下，所述抗体以溶液，冷冻干燥所得的固体等形 式适宜添加。当将所述抗体作为水溶液添加时，所述溶液可纯粹包含所述抗体本身，或可包 含，例如，表面活性剂，赋形剂，着色剂，调味剂，防腐剂，稳定剂，缓冲剂，助悬剂，张度剂，粘 合剂，崩解剂，润滑剂，流动性促进剂或矫味剂。所述抗体添加的浓度并非特别限定。举例 而言，如使用人类免疫球蛋白配制物，可适宜使用500-mg，1000-mg与2500_mg等冷冻干燥 的配制物。然后，测量前述试样中Αβ寡聚体对Αβ单体的比例(在本文中，亦称为“0/Μ指 数”)。为测量该比例，适宜地使用下述方法。举例而言，在如下文的实施例中所述，可使用 比较自相同试样获取的所述寡聚体与单体的ELISA值的方法来实施测量。然后，将该比例与健康个体的比例进行比较。当该比例在受试者中较之健康个体 中为高时，确定该受试者为可能的阿尔茨海默氏病患者。 本发明的诊断方法既可在体外又可在体内进行，但其优选在体外进行。优选地，本发明的“试样”并不特别限定，只要其为源自受试者的组织即可。实例 包括受试者的脑(脑实质等)，器官与体液(血液，脑脊液等)。在本发明中，所述试样优选 为血液(更优选血浆)或脑脊液。进一步，本发明提供了用于上面提及的在试样中测量Αβ寡聚体的方法或诊断受 试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法的药剂。在本发明中，包含抗体的药物组合物可包含于产品与试剂盒中，所述产品与试剂 盒包含对治疗受试者的病理状态有用的材料。所述产物可包括任何化合物的带标签容器。 合适的容器包括瓶，小瓶与试管。所述容器可用多种材料制成，例如玻璃与塑料。容器表面 的标签应指明所述组合物用于治疗或预防所述疾病的一种或更多种症候。所述标签亦可载 明给药的描述等。除上面提及的容器外，含包括抗体的药物组合物的试剂盒可任选地包括第二容 器，其储藏药用稀释剂。所述试剂盒可进一步包括其它从商业或用户角度看期望的材料，包 括其它缓冲剂，稀释剂，填充剂，注射针头，注射器，以及载有用途描述的包装插页。若需要，所述药物组合物可于包装或分配装置中提供，所述包装或分配装置包含 一个或更多含有活性成分的单位剂量形式。所述包装可包括金属或塑料箔，或者例如为发 泡包装。所述包装或分配装置可伴有给药说明书。在上面提及的药剂与试剂盒中，除作为活性成分的本发明的抗体外，还可根据需 要混合，例如，灭菌水，生理盐水，植物油，表面活性剂，脂肪，助溶剂，缓冲剂，蛋白稳定剂
23(BSA,明胶等)，防腐剂，封闭溶液，反应溶液，反应淬灭溶液，处理试样的试剂等。所有本文引用的现有技术文献通过引用的方式并于本说明书中。实施例下文中，通过实施例详细描述本发明，但并不应认为本发明受实施例的限定。Tffe制备单克降1A9, 2C3, E12, IClO 与 4D3合成A β 1-42 (Peptide Institute, Inc.，Osaka)溶解于蒸溜水或 IOmM 磷酸缓冲 液，并在37°C下培育18小时。然后，用SDS-PAGE(4-12% NuPAGE Tris-甘油胶)分离肽， 并在用CBB染色显现后，仅切出A β 1-42四聚体而无A β 1-42的污染。然后，对BALB/c小鼠用2. 5 μ g的经弗氏完全佐剂乳化的A β 1-42四聚体在其足 垫进行免疫接种。随后，进行六次的加强免疫接种。使用小鼠蹊部淋巴结，通过与Sp/0-Agl4 细胞使用聚乙二醇1500融合产生杂交瘤。确定抗体同种型纯化的免疫球蛋白的同种型的确定使用Serotec (Oxford，UK)小鼠单克隆抗体同 种型确定试剂盒。1A9与2C3的同种型为IgG2b。点印迹分析(初步筛诜)初始筛选通过点印迹分析使用硝酸纤维素膜进行，所述膜上固化了预培育18小 时的2. 5μ 1的Αβ 1-42(2. 5 μ g/点)。膜上非特异性结合位点用含5%低脂奶粉、BSA 与0. 05% Tween-20的磷酸缓冲液封闭，然后将该膜与培养上清一起培育。培养上清中的 Aβ寡聚体结合抗体通过辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠F(ab’)2(l 3000 ;AmerSham)检 测，并使用增强化学发光(ECL)试剂盒与LAS3000 mini (Fujitsu, Tokyo, Japan)显影。在 400个克隆中，对其中16个在所述点印迹中为阳性的，包括1A9与2C3，进行下述的二次筛 选。免疫沉淀与免疫印迹分析(二次筛选)二次筛选使用富含A β寡聚体的淀粉样蛋白级分(Matsubara E，et al.， Neurobiol Aging, 2004)进行免疫测定实验(Ghiso J，et al.，Biochem J，1993)，以评估 在初步筛选中选出的16个克隆可否在AD脑中捕获Αβ寡聚体。将一个自AD脑制备的、 不溶于缓冲液但可溶于甲酸的级分与组织上清和蛋白G-Siipharose —起培育。将被免疫 沉淀的Aβ寡聚体使用NuPAGE4-12% Bis-Tris-甘氨酸凝胶分离，并使用含10%甲醇的 IOmM 3-环己基氨基-1-丙烷磺酸(pHll)在400mA下经一小时转移到硝酸纤维素膜或 Immobilon P(Milliipore)上。膜上的非特异性结合位点用含5 %低脂奶粉，1 % BSA与 0. 05% Tween-20的磷酸缓冲液在室温下封闭3小时。通过免疫印迹法用4G8 (1 1000) 或6E10(1 1000)单克隆抗体如上所述检测经免疫沉淀的Aβ寡聚体。自所述16个克隆 中选出两个克隆，1Α9与2C3，作为阿尔茨海默氏病治疗抗体的候选。抗体6Ε10 与 4G8 单克隆抗体(Covance Immuno-Technologies, Dedham, MA)分别识别 人类Αβ序列的氨基酸位置1-16与17-24的表位。特异性识别Αβ寡聚体的多克隆抗体 All 购自 Biosource (Camarillo，CA)。Alex Fluor (AF) 488-或 594-缀合的山羊抗小鼠 IgG 与 Alex Fluor (AF) 488-缀合的山羊抗大鼠 IgG 购自 Molecular Probes (Eugene, OR)。抗小鼠 IgG2b 购自 Sigma (St. Louis, M0)。抗突触泡蛋白抗体购自 Santa Cruz (Santa Cruz, CA)，而抗脑发育调节蛋白抗体购自MBL(Nag0ya，Japan)。尺寸排阻层析法(SEC)进行了 SEC以评估1A9与2C3的尺寸特异性。根据之前报道的方法(Matsubara E.，et al. , Neurobiol Aging，25 :833_841，2004)，可选择性地分离 Aβ 单体与 Αβ 寡聚 体，或脂蛋白结合的Αβ与无脂蛋白的Αβ。本发明人使用Microcon 3kDa分子量截留滤器 (Millipore Corp.)将来自过表达APP/PS1的HEK293细胞的培养上清液浓缩约十倍。然 后，将浓缩液使用经磷酸缓冲液预平衡的Superose 12尺寸排阻柱(lcmx30cm ；Pharmacia Biotech.，Uppsala, Sweden ；流速为0. 5ml/min)分为28个1毫升的级分。对每个级分的 一半使用1A9或2C3进行免疫沉淀。使用4G8通过免疫印迹法检测所得免疫沉淀物中所含 的Αβ。对汇集自阿尔茨海默氏病患者或与其年龄匹配的健康个体各十例的脑脊液(CSF) 以及除去脂蛋白的CSF在相同条件下进行了分离。Αβ的收集级分的鉴定通过各个级分的 ELISA来进行。为评估脂质，使用标准试剂盒(Wako，Osaka，Japan)对总胆固醇进行酶学定 量。在本发明人的实验条件下，CSF的脂蛋白在级分7-14中洗脱，而级分15-28包含无胆 固醇的蛋白质。不含种子的A β溶液的制备将合成Αβ 1-42以250μΜ溶解于0.02%氨水中。然后，为制备不含种子的A β溶 液，使用Optima TL超离心机(Beckman，USA)以540000x g超离心3小时以沉淀未溶解的肽 (它们可能充当种子)。收集所得的上清，并将其等分并储藏于-80°C直至使用。试样的制 备是在即将使用前将所述A β储藏溶液解冻，并用Tris缓冲盐水(TBS ； 150mM NaCl与IOmM Tris-HCl (pH7. 4))将其稀释10倍。所得的25 μ M溶液用于下述的实验。合成A β 1-42 (HCL 形式；Peptide Institute, Inc. ，Osaka)帝[J备为 50 μ Μ。A β 培育与 ThT 分析(Yamamoto N, et al.，J Biol Chem, 282 2646~2655, 2007)A β溶液(25 μ Μ)在预定浓度的抗体存在下在37°C下培育2或24小时。所述培 育混合物的ThT荧光强度使用荧光分光光度计(RF-5300PC ；Shimadzu Co.，Kyoto, Japan) 确定。使用Iml含5 μ M ThT与50mM甘氨酸-NaOH(pH8. 5)的反应混合物，在激发与发射波 长为446与490nm的条件下，为Αβ淀粉样蛋白原纤维确定最佳荧光强度。荧光强度在混 合物制备后立即测定。进一步，Ε12抗体用于阻抑Αβ淀粉样蛋白原纤维形成的活性通过下述步骤评价。 将用细胞培养基稀释到12. 5 μ M的A β 1-42溶液在所述Ε12抗体存在或不存在的条件下在 37°C下培育24小时。形成的淀粉样蛋白纤维的量通过上述ThT荧光强度测定法确定。A β 诱导性神经毒性测定(Yamamoto N, et al.，J Biol Chem, 282 2646~2655, 2007)将大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞在含10%热失活的马血清(Invitrogen)与5%胎 ^iiyf (FBS) (Invitrogen)白勺 Dulbecco’ s Modified Eagle Medium(DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA)中培育。为诱导其分化为神经细胞，将PC12细胞以20000个细胞/cm2的密 度铺于经聚-L-赖氨酸(10mg/ml)包被的培养皿中，并在添加有lOOng/ml神经生长因子 (NGF ；Alornone Labs, Jerusalem, Israel)的 DMEM 中培育六天(PC12N)。将 PC12N 在 1A9
25或2C3抗体存在或不存在的条件情况下在4°C下暴露于25 μ M不含种子的A β 1-42或经预 培育的Aβ 1-42中48小时。由Αβ 1-42诱导的神经毒性通过Live/Dead双色荧光测定法 根据供应商的说明(Molecular Probes, Eugene, Oregon)来进行评估。进一步，E12抗体的中和Αβ诱导性神经毒性的活性通过下述方法评价。首先，将 人类神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)在含10% FBS的DMEM中，以150000细胞/孔的密度培 育24小时。然后，将该培养基替换为不含血清、含A β 1-42(12. 5 μ Μ)、且添加或未添加Ε12 抗体的培养基，并将所述细胞另行培养24小时。为确定由Αβ 1-42诱导的细胞毒性，利用 CytoToX96试剂盒(Promega)测定源自死细胞的、释放到所述培养基的LDH的水平。超滤与分子筛为确定神经毒性A β寡聚体在25 μ M的尺寸依赖性特征，使用Micr0n3kDa，IOkDa, 30kDa与IOOkDa截留膜进行连续超滤，制备四种滤出液(< 3kDa，3到IOkDa, 10到30kDa, 30到IOOkDa)以及1种保留溶液(> IOOkDa)。对每个级分进行上述的A β诱导性神经毒 性测定。使PC12N暴露于每个级分，如上所述评价毒性级分。还通过上述点印迹分析鉴定 了由All，1A9，2C3或4G8所识别的三维结构的分布。对各个级分进行原子力显微镜检查来 鉴定神经毒性寡聚体的形态学特征。电子显微镜检杳(EM)与原子力显微镜检杳(AFM)用蒸馏水稀释试样，并将其喷洒在经碳包被的网格上以进行电子显微镜分析。 所述网格用磷酸钨酸负染色，并在Hitachi H-7000电子显微镜(Tokyo，Japan)下 用77kV的加速电压进行观察。AFM评价如近来所报道一般进行。将试样滴于新剥开的 云母上。让所述云母静置30分钟，并然后用水洗涤，并使用Nanoscope IIIa(Digital Instruments, Santa Barbara，CA，USA)设为轻敲(tapping)模式以分析液体试样。使用的 悬臂(cantilever)为 0MCL-TR400PSA(Olympus，Japan)。受试者组织与抽提本研究基于来自东京都老人综合研究所脑银行(Tokyo MetropolitanBrain Bank for Aging Research of the Tokyo Metropolitan Institute ofGerontology) (Itabashi, Tokyo, Japan)的尸体剖检病例(η = 50 ；26位男性与24位女性)进行。本研究计划经东 京大学医学部(the Faculty of Medicine, theUniversity of Tokyo)、东京都老人综合研
K^kff ri^(the TokyoMetropolitan Geriatric Hospital of the Tokyo Metropolitan Institute ofGerontology)(the National
Center of Geriatrics andGerontology)的机构内伦理委员会所批准。已有人报道了受 试者与试样收集的细节(Katsuno T，Neurology，64 :687_692，2005)。然而彼研究分析的是 不溶性脑级分，而在本研究计划中，本发明人分析了可溶性脑级分，其在之前的研究中未经 鉴定(Katsuno T, Neurology,64 =687-692,2005) 0将冻结的组织试样(内嗅皮层的前部) 在九倍体积的含蛋白酶抑制剂鸡尾酒的Tris缓冲盐水(TS)中勻浆。将勻浆在265000X g 下超离心20分钟。对所得上清等分试样的三分之一(0.5ml)进行免疫印迹分析。免疫组织化学Tg2576小鼠的左脑半球使用低温切片机(RM 2145 ；Leica, ffetzlar, Germany)切 为30 μ m厚的矢状切片，并如前所述(Wyss-Coray et al. ,2001)用硫代黄素S进行染色。 利用抗突触泡蛋白抗体(Chemicon，Temecula, CA)进行肿大变性的神经突的形成的观察。通过在40倍放大率下观察来自每个小鼠左半脑的四或五个切片来计数硫代黄素S阳性斑 点数与突触泡蛋白阳性的肿大变性神经突数。为观察Αβ沉着，将连续切片用甲酸或蛋白 酶K短暂地预处理，再用A β免疫染色试剂盒(Sigma，St. Louis, MO)进行染色，使用ABC elite试剂盒(Vector Laboratories)显现免疫阳性的信号。使用与显微镜连接的数字 照相机记录大脑皮层与海马的图像，并用简单的PCI软件(Compixlmaging System, Lake Oswego,OR)进行分析。使用共聚焦激光显微镜(CarlZeiss LSM510)观察抗体的脑内移行 (translocation)。硫代黄素S阳性的菌斑数与突触泡蛋白阳性的肿大变性神经突数以双 盲的方式确定。被动免疫疗法与行为分析三月龄的雌性非转基因(non-Tg)小鼠以及携带并过表达突变体人类APP基因的 Tg2576小鼠购自Taconics (Germantown，NY, USA)，所述突变体基因具有家族性AD的瑞典 型(Swedish-type)双重突变(K670N与M671L)。这些小鼠在本发明人的动物设施中养育直 至13月龄。为确定类阿尔茨海默氏病表型是否受被动免疫预防，将1A9或2C3(0. 4mg/kg/ 周)，或PBS施用于四月龄的Tg2576的尾静脉中，并延续该给药直至13月龄。在第十三个 月，如前人所述(Mouri A,FASEB J，21 :2135_2148，2007)进行记忆功能评估，基于下列四个 行为范式(I)Y-迷宫测试中的短期记忆；(2)新物体识别测试；(3)Morris水迷宫测试；以及(4)附线索的恐惧条件测试(contextual fear conditioning test)在行为测试三日后，将所述小鼠处死以供生化与组织学评估。实验结果通过单向 与双向ANOVA分析。事后(post-hoc)分析使用Fisher检验进行。脂蛋白的分离与移除自12个AD患者与13个NC个体收集CSF。然后，从600 μ 1的每个CSF试样中 通过制备性连续密度梯度超离心方法根据先前报道的规程(Matsubara E，et al.，Ann Neurol,45 =537-541,1999)移除脂蛋白。CSF的密度用KBr调整为1. 25g/ml。将所述CSF 在100000rpm、16°C下使用HitachiRPlOOAT离心机超离心8小时。对漂浮于密度1. 25g/ml 处的脂蛋白与除去了脂蛋白的CSF使用3kDa截留膜(Microcon 3 ；Arnicon, Inc)进行超 滤，然后将其冻结储藏或于4°C下储藏直至使用。亦通过亲和层析法使用PHML-LIP0S0RB(Calbiochem，La Jolla，CA)移除脂蛋白。 每个试样(血浆或脑)与 PHML-LIP0S0RB(Calbiochem，La Jolla, CA)以 1· 5 1 的比例合 并，并混合60秒。随后将混合物在3000rpm下离心10分钟。对所得上清(无脂蛋白的试 样)进行6E10寡聚体ELISA。与PHML-LIP0S0RB结合的脂蛋白结合试样使用20mM脱氧胆 酸钠洗脱。使用琼脂糖凝胶电泳(Beckmarm)，继以用FAST-RED 7B (ffako, Osaka, Japan) 染色，来确证特异性的脂蛋白移除。人类A β的定量通过夹心ELISA 如前人所详述(Matsubara E, et al.，Ann Neurol, 537-541, 1999 ；Matsubara Ε, et al.，Neurobiol Aging, 25 :833_841，2004)特异性地对全血浆与 LPDP Αβ种类进行定量。为分析脑Αβ种类，对溶于ΙΟΟμΙ缓冲液的可溶性Αβ种类直接进行ELISA，而对于以70%甲酸提取物形式存在的不可溶A β试样，在ELISA前用IM Tris-HCKpH 8.0)中和，并稀释1000倍。通过该分析获得的值用脑湿重校正，最终表达为 pmol/g。板之间的标准化通过在所有三个板中包括三个标准血清试样来实现。A β寡聚体特异件ELISA为了特异性的检测寡聚Αβ而非单体Αβ，使用了化学发光ELISA，即利用化学发 光的夹心固相酶免疫测定。将微孔板用单克隆lA9(IgG2b同种型)或2C3(IgG2b同种型)， 或1A9与2C3的混合物包被。添加100 μ 1的不同试样(脑或脑脊液)并在4°C下连续培育 24小时。然后，添加辣根过氧化物酶缀合的BA27 Fab，片段(特异于A β 40的抗A β 1-40 ； Wako pure chemical, Osaka, Japan)或辣根过氧化物酶缀合的BC05 Fab，片段(特异于 Αβ 42 的抗 Αβ 35-43 ；Wako pure chemical，Osaka，Japan)，并在 4°C下培育 24 小时。使用 SuperSignal ELISA Pico Chemi luminescent Substrate (Pierce, Rockford, IL, USA),用 Veritas Microplate Luminometer (Promega)对产生的化学发光定量。为评估用单克隆1A9与2C3外周给药的体内效用，自经给药的小鼠采集血浆与器 官试样，并使用特异于人类寡聚体的HRP标记6E10(SenetekPLC，Napa，CA，USA)通过ELISA 对Αβ寡聚体进行分析。为了提高敏感度，使用上述的化学发光系统进行检测。为避免脂 蛋白结合性Αβ单体的干扰，本发明人使用PHML-LIP0S0RB以与前述相同的方法预处理了 血浆或器官试样。所得的除去了脂蛋白的试样用于所述分析。实施例1制各A β寡聚彳本特异丨牛单克降杭体(1Α9与2C3)Αβ寡聚体与单体在溶液中共存。因而，Αβ单体的移除对于为产生Αβ寡聚体特 异性抗体的抗原制备而言非常关键。如图IA所示，本发明人成功的通过SDS-PAGE分离了 不含A β单体污染的SDS稳定性A β四聚体。在用分离所得的A β四聚体进行体内免疫接 种后，通过先进行点印迹分析再进行免疫沉淀的两步筛选法，选取了阳性杂交瘤克隆。在进 行点印迹分析的400个克隆中，16个克隆被确定为阳性(阳性率=4%)。为评估分离所 得阳性克隆针对寡聚体的特异性，对源自AD脑的不溶于磷酸缓冲液但可溶于甲酸(FA)的 淀粉样蛋白级分(Matsubara E et al. ,Neurobiol Aging, 25 :833_841，2004)，使用所述阳 性杂交瘤的细胞培养上清通过免疫沉淀进行了分析(图1B)。使用抗Αβ单克隆抗体4G8 的免疫印迹分析检出了 Αβ 二聚体、较前者少量的三聚体、以及具有聚集Αβ分子种类的更 高分子量的弥散(smear)。亦检出了非常少量的在SDS存在下解离出的A β单体。为了进 一步确证天然1Α9或2C3三维结构(亦即，寡聚体)的存在，本发明人试图在经突变体PSl cDNA转染的人类胚胎肾(HEK) 293细胞的条件化培养基(CM)中检出所述寡聚体(Nakaya Y et al.，J Biol Chem，280 :19070_19077，2005)。本发明人尝试通过 SEC 对 HEK293 CM 进 行分级分离，并然后鉴定出寡聚体。如之前报道(Matsubara E et al. ,Neurobiol Aging, 25 833-841,2004 ；Yamamoto N, et al. ,JBiol Chem，282 :2646_2655，2007)，该方法可有效 的从单体(级分14到20)中分离出寡聚体(级分8到13)。当使用单克隆1A9进行免疫沉 淀时，分泌入CM的SDS稳定性A β 二聚体在级分8中被沉淀出来(> 680kDa) ；SDS稳定性 Αβ 二聚体与三聚体在级分13中被沉淀出来(17到44kDa)；还有非常少量的二聚体在级分 16中被沉淀出来(图1C)。当使用2C3进行免疫沉淀时获得相似的结果(数据未显示)。 这些数据说明1A9与2C3对Αβ寡聚体具有确切的特异性，而不识别Aβ单体。
实施例2单克降1A9与2C3的抗神经毒件活件为评估单克隆认9或203是否能够预防々0诱导的神经毒性，将NGF-分化的PC12 细胞(PC12N)与25 μ M无种子(seed free)的A β 1-42 (ThT阴性540000x g上清)在所述 单克隆抗体(mAb)存在或不存在的条件下在37°C下培育48小时。神经细胞的生存力通过 LIVE/DEAD分析来确定(图2)。在Αβ 1-42存在时，较之对照测定(图2Α)，以显著的高水 平检出了神经细胞死亡(图2Β与2G)。非特异性IgG2b(图2C与2D)无法在相同条件下 抑制Αβ 1-42诱导的神经毒性。可市购的Αβ特异性单克隆抗体4G8(IgG2b同种型；图2D 与2G)具有增强毒性的倾向。单克隆2C3(IgG2b同种型；图2F与2G)以浓度依赖性方式几 乎完全中和了 Αβ 1-42的神经毒性。因此推测从头形成(de novo-formed)性的神经毒性 2C3三维结构为寡聚体形式。与此同时，lA9(IgG2b同种型；图2E与2G)的抗神经毒性活性 落在2C3与非特异性IgG2b的抗神经毒性活性之间。这表明由1A9三维结构与2C3寡聚体 具有结构上不同的三维结构。实施例3当下，确定神经毒性A β 1-42寡聚体的准确大小与构象是最紧要的课题之一，对 此竞争激烈。本发明人成功的分离出可溶性神经毒性Αβ 1-42分子种类，并通过超滤与分 子筛(UC/MS)将该种类分级分离为下述五个级分(图3Α)级分1，< 3kDa的滤出物(泳道1)；级分2，3到IOkDa的滤出物(泳道2)；级分3，10到30kDa的滤出物(泳道3)；级分4，30到IOOkDa的滤出物(泳道4)；以及级分5，> IOOkDa的保留溶液(泳道5)。使用单克隆4G8的免疫印迹分析(图3A)揭示
级分1不含有A β (泳道1)；级分2含有A β单体(泳道2)；级分3 (泳道3)含有A β单体与少量A β 二聚体；级分4 (泳道4)含有A β单体到五聚体；以及级分5 (泳道5)含有A β单体到五聚体，以及45到160kDa的条带。这些数据表明，2% SDS可将高分子量(HMW)的Αβ寡聚体解聚成Aβ单体与低分 子量(LMW)Aii寡聚体。为评估毒性Αβ 1-42的尺寸分布，本发明人测定了各个级分在37°C 下与PC12N培育48小时后的生物学活性。如图3B与3C所示，说明了 级分1不具毒性，级 分2毒性很弱，表明Αβ单体与二聚体具有毒性的可能性不高。级分3到5具有显著的毒 性(单向ANOVA ；ρ < 0. 0001)，表明神经毒性寡聚体的尺寸理论上相当于三聚体或更高。使 用寡聚体特异性All抗体的点印迹分析也发现，上述三个神经毒性级分(3到5)对All为 阳性的，这为神经毒性分子为寡聚的提供了旁证(图3D)。2C3识别的寡聚体在级分4与5 中检出(图3D)。从而说明2C3实际上与神经毒性A β寡聚体(> 30kDa)反应。进一步， 大部分2C3识别的寡聚体在毒性最高的级分5(> IOOkDa)中检出，因此我们认为具有超过 IOOkDa的分子量的2C3识别的寡聚体显示强神经毒性(图3D)。同时，仅仅极少量的1A9 识别寡聚体分布于最具毒性的级分5中。这与1A9对神经毒性的中和作用不足的结果(图
292E与2G)相符。与之相对的是，不具有抗神经毒性活性的单克隆4G8可检出分布于所有级 分中的Αβ种类(图3D)。这表明在相同的尺寸下寡聚体也可能作为非毒性聚合体共存。为进一步评估毒性_结构之间的相关性，对每个级分进行原子力显微镜(AFM)观 察。只有在三个呈神经毒性的级分中检出了与其级分大小对应的球状颗粒形态的存在。图 3Ε显示非毒性级分2 (Fr. 2)，毒性级分3 (Fr. 3)与4 (Fr. 4)，以及最具毒性的级分5 (Fr. 5) 的原子力显微镜图像。毒性级分中清楚可见许多颗粒多聚物分子的形成。具体而言，可见 级分5除了大小不同的粒状分子外，还包括珠形、环形分子等混在的不均一的毒性分子。实施例41Α9将2C3阳抑A β淀粉样蛋白原纤维形成的活件然后，本发明人评估了 1Α9与2C3是否具有阻抑Αβ淀粉样蛋白原纤维形成的活 性。Αβ 1-42淀粉样蛋白原纤维的形成(在0，10，25与50μΜ下)通过在37°C下测定ThT 荧光度72小时来评估。在本发明人使用的条件下，无种子的Αβ 1-42(通过在540000X g 下获取的ThT阴性上清级分)通过成核依赖性聚合作用聚合为淀粉样蛋白原纤维(图4A)。 为评估1A9与2C3阻抑A β淀粉样蛋白原纤维形成的活性，本发明人将25 μ M无种子的 A β 1-42在所述抗体存在或不存在的条件下在37°C下培育48小时。如图4B所示，ThT荧光 强度以2C3浓度依赖性形式改变，而在单克隆1A9与4G8与非特异性IgG2b存在下均未见 变化。与此同时，当Αβ通过培育两小时进行聚合时，1Α9及2C3都显示几乎完全阻抑所述 原纤维形成的活性(图4C)。由于2C3即使在对Αβ的分子比例低的时候亦检出阻抑Αβ 淀粉样蛋白原纤维形成的活性，暗示2C3具有在Αβ 1-42淀粉样蛋白原纤维形成早期阶段 抑制从头开始形成的聚合核或种子功能(seed function)的能力。通过形态学观察也获得 了相似的结果。如图4Ε(Αβ42自身)与图4F(Ai3 42+2C3，25 3)所示，电子显微镜(EM)观 察说明Αβ淀粉样蛋白纤维的形成在单克隆2C3的存在下受部分抑制，而在1Α9存在下仅 发生微弱的抑制作用(图4G)。与此同时，所述测试抗体对于通过24小时培育预先形成的 A β 1-42淀粉样蛋白原纤维均不显示裂解或解聚作用(图4D)。实施例51Α9与2C3靶向的毒性相关寡聚体为说明Αβ 1-42寡聚化与淀粉样蛋白原纤维形成间的结构与动力学联系，通过使 用Al 1，1Α9，2C3与4G8的点印迹分析了聚合的时间进程。如图5Α所示，大部分Al 1抗体-反 应性寡聚体在聚合作用的时滞(lag time)期(0_8小时)形成，ThT荧光强度相对较弱。在 接下来的纤维延伸期(8到24小时)中，A-Il免疫应答性寡聚体的水平达到平台，并然后 保持恒定(大约为峰值水平的20%)直至72小时(平台期)。有人表明，抗寡聚体All抗 体并不识别淀粉样蛋白原纤维，可使用该抗体特异性地观察Αβ寡聚体形成(Kayed R，et al. ,Science 300，486-489，2003)。因此，现在的结果表明A β寡聚体形成发生于淀粉样蛋 白原纤维形成之前，且存在一个不直接进入淀粉样蛋白原纤维形成通路的寡聚化状态。2C3 识别的寡聚体与All识别的寡聚体在动力学上类似，但1Α9识别的寡聚体的动力学不同。 1A9识别的寡聚体在四个小时后方检出，随后可见1A9的免疫反应性随时间增加到两倍。这 就表明1A9识别的寡聚体形成较慢。与此相对的是，揭示了 2C3识别寡聚体在时滞期(0到 8小时)瞬时出现，然后在8到72小时以非常微量的寡聚状态(少于5%)存在。由本发 明人获取的上述数据表明All-，1A9-与2C3识别寡聚体可能具有结构上和免疫学上不同的三维结构或稳定性，而且2C3识别的寡聚体较之1A9识别的寡聚体而言相对不稳定。为鉴定所述从头合成的毒性聚合状态，将PC12N在37 °C下暴露于无种子的 A β 1-42(0小时)，或经2、4或24小时预培育的A β 1-42 48小时(图5Β)，并检验其神经 毒性活性。如图5Β所示，使用4G8的免疫印迹分析揭示在0小时时点已经存在了单体到三 聚体。所述2或4小时的预培育导致形成除所述单体到五聚体外，还得到了 45到160kDa 的高分子量(HMW)弥散物。在24小时的时点，所述HMW弥散物急骤减少，且形成了两类主 要组分无法进入凝胶而残留于孔中高分子量种类，与少量单体。所述HMW弥散物在进一 步在37°C下培育48小时后消失。如图3A与5C所示，分子筛实验揭示，无种子的A β 1-42 被转化为IOOkDa或更大的分子种类，并显示最强的毒性。在SDS-PAGE上显示，所述毒性 分子除所述单体到五聚体种类外，亦包括呈现45到160kDa的高分子量(HMW)弥散形式的 分子种类，且毒性多聚物在SDS的存在下可轻易的解离为低分子量种类。然而当将无种子 的Αβ 1-42预培育2小时与4小时时，从头开始形成的Aβ寡聚体的神经毒性活性分别减 少了约12. 5%与26% (图5C)。该结果表明在Αβ聚合作用早期阶段从头开始形成的Aβ 寡聚体水平为神经毒性的决定性因素，且所述形成在0-2小时的期间内达到峰值，然后随 着时间推移形成的Αβ寡聚体量减少。或者，也存在这样的可能，即Αβ淀粉样蛋白原纤维 的从头开始聚合的核或淀粉样蛋白原纤维自身具有中和神经毒性的效果。本发明人培育 Αβ 1-42两小时，然后通过在540000Χ g下超离心3小时移除不可溶的A β聚合核与淀粉样 蛋白原纤维。在540000Χ g下超离心所得的上清与沉淀展示相似水平的硫代黄素T信号， 表明540000X g上清中也含有可溶性ThT阳性可溶性A β聚合体(表明ThT结合带来形成 富含β片层的结构变化而非原纤维形成)。当仅将该可溶性聚合体暴露于PC12N时，所述 神经毒性恢复且增强(图5D)。这表明不可溶的Αβ 1-42自身具有抗毒性活性。在上述状 况下，单克隆1Α9完全中和了由富含β片层结构的可溶性Αβ寡聚体诱导的神经毒性，且 该中和活性较之2C3的为高。与此同时，非特异性的IgG2b自身对培养PC12N的生存无影 响。由此，推测神经毒性1A9识别的聚合体本质上为可溶性毒性寡聚体，其由于一些结构变 化略微稳定化，而神经毒性2C3识别的多聚物本质上为短命的寡聚中间体，其由于在聚合 过程早期巨大的结构变化而非常的不稳定。实施例6单克隆1A9与2C3在脑实质中识别A β寡聚体在实证了 1Α9与2C3的特异性与生物学活性之后，本发明人进一步在脑中通过免 疫组织化学检出了 1Α9与2C3聚合体。本发明人实施了常规免疫组织化学方法以通过甲醛 固定，以及甲酸，SDS或微波处理脑切片以增强免疫反应。所有所述增强方法都无法使所述 两个抗体展示任何针对AD脑的免疫反应性。从而，本发明人用蛋白酶K预处理所述切片，该 酶已知可改善免疫染色(ffrzolek MA, et al. ,Am J Pathol, 141 =343-355,1992) 其结果， 许多老年斑被1A9(图6A)，2C3(图6B)与All (图6C)所染色。与从本发明人进行的体外 实验获得的发现，即Αβ淀粉样蛋白原纤维可中和Αβ寡聚体诱导的神经毒性结合起来看， 上述结果表明老年斑充当隔离并储藏Αβ寡聚体的防御性仓库，因此该仓库的内部抗体难 以到达。确实，使用1Α9与2C3的免疫沉淀确认，由老年斑构成的淀粉样蛋白级分中存在由 所述两种抗体识别的Αβ寡聚体。从而，证明了本发明人的假说与体内证据一致(参见图 1Β)。
31
为进一步评估“可溶性” 1A9-与2C3-识别的聚合体在脑内的存在，本发明人使用 所述两种抗体进行了免疫沉淀实验。使用Tris缓冲盐水(TBS)制备脑勻浆以避免在提取可 溶性寡聚体过程中的化学修饰。用1A9从来自AD脑大脑皮层的TBS试样中免疫沉淀出了 具有四聚体，五聚体，八聚体与十二聚体分子量的寡聚体(图6D，泳道2)，而在对照健康脑 中所述寡聚体的水平低于检测限(泳道3)。四聚体，五聚体与八聚体的强度虽在1A9(泳道 2)与单克隆4G8/6E10混合物(泳道1)间相似，1A9似较之4G8/6E10回收了较多量的十二 聚体。用2C3进行的免疫沉淀显示了相似的结果(图6，第4-6道)。然后，本发明人鉴定 了在人类内嗅皮质中导致体内神经毒性的分子。众所周知在一般高龄人群中，该病变中神 经元纤维缠结(NFT)与神经细胞丧失发生于老年斑形成之前。本发明人提出这样的假说， 即针对1A9与2C3识别的聚合体有功能的仓库(例如老年斑)的缺乏对内嗅皮层神经元是 有害的，而且是记忆紊乱的可能原因。通过使用单克隆1A9与2C3的免疫印迹确定了之前 报道的50个尸体剖检病例中可溶于缓冲液的级分中的十二聚体水平。所述50个病例包括 两个AD病例，35个Braak NFT I到II期的病例与13个NFT III到IV期的病例(Katsuno et al.，Neurology，64 :687-692，2005)。如图 6E(1A9)与 6F(2C3)所示，1A9 或 2C3 免疫 反应性十二聚体相对于肌动蛋白的免疫活性在AD患者中较之健康对照组(Braak NFT I到 II期)与轻度认知障碍组(Braak NFT III到IV期)显著为高。有趣的是，所述十二聚体 在健康对照组(Braak NFT I到II期)与轻度认知障碍组(Braak NFT III到IV期)的内 嗅皮质中分别以约40%与60%的水平积聚(在AD比例中该水平为100% )(图6E与6F)。 该结果表明12聚体的积聚发生于认知机能障碍病发之前，且随Braak NFT分期的推进而增 加，暗示1A9与2C3免疫反应性十二聚体是导致体内神经毒性的聚合体。实施例7Ml^M 1A9与2C3在脑脊液中iR另I丨A β寡聚体导致体内神经毒性的A β聚合体(可溶性1Α9与2C3免疫反应性十二聚体)在脑 实质中被发现。据此，本发明人推测，CSF亦含有所述聚合体。为证实这一点，本发明人将自 十个AD患者与作为对照的十个年龄匹配的健康个体汇集的CSF通过SEC进行分级分离，并 通过A β寡聚体特异性夹心ELISA对这些级分进行分析，其中在捕获与检测系统中使用单 克隆BC05或ΒΑ27。BC05/BC05寡聚体ELISA在级分13中检测出可溶性A β 1-42，而ΒΑ27/ BA27ELISA在级分7_14中检测出可溶性A β 1-40 (数据未显示)。然而，在每个ELISA中，吸 光度(45011!11处的0.0.)低至无法敏感地在05 中检测出少量4 0寡聚体。在相同级分中通 过BNT77ELISA检测出Αβ单体，显示结合有脂蛋白的A β单体(级分7到14)与无脂蛋白 的A β单体(级分15到17)在所述级分中与A β寡聚体共存(图7-1Α与7_1B) (Matsubara Ε，et al.，Neurobiol Aging, 25 =833-841,2004) 在 AD 中结合有脂蛋白的 A β 单体的水 平与健康对照相似，而在AD中无脂蛋白的A β -40单体(图7-1Α)与A β 42单体(图7-1Β) 较之年龄匹配的健康对照为低。本发明人亦发现在将ELISA设计为使用HRP标记的BC05 或ΒΑ27作为捕获抗体时，除所述寡聚体外，与脂蛋白结合的Αβ单体亦可被检出。该问题 在现有技术文献中未被注意(Lee EB, et al. ,J Biol Chem，281 :4292_4299，2006)，后者描 述了与本文所述方法相似的分析方法(例如，6E10/6E10 ELISA)。因为所述寡聚体和与脂 蛋白结合的Αβ单体在SEC中洗脱的保留时间相似，无法通过寡聚体ELISA在捕获与检测 中使用相同的抗体对它们进行区分。从而，揭示了在使用Αβ寡聚体-非选择性抗体分析Αβ寡聚体时，含脂蛋白的CSF不适于用作测试试样。为克服这些现有技术方法的缺点，本发明人改进了用于ELISA的检测抗体与试 样。原先CSF中去除脂蛋白，将所得的去除了脂蛋白的CSF(LPD-CSF)用作测定试样。Αβ 寡聚体特异性1Α9与2C3用作ELISA的检测抗体。进一步，建立了化学发光ELISA以增强 敏感度。将汇集的LPD-CSF (图7-1C到D)通过SEC分级分离，且对于每一级分通过化学发 光ELISA分析其Αβ寡聚体分布，其中使用1Α9或2C3作为检测抗体。如图7-1C到D所示， A β寡聚体在SEC级分12到15 (相对较大的A β，其分子量范围为18到108kDa，其对应于 四聚体到二十四聚体的尺寸)。在所有AD患者来源的、其中所述寡聚体可检出的级分中， 1A9与2C3识别的寡聚体水平均变高。为评估所述Αβ寡聚体作为治疗标志的有用性，对来 自AD患者LPD-CSF中与来自年龄匹配健康对照中的Αβ寡聚体水平进行比较，尽管仅分析 了少数病例。如图7-2G所示，由Αβ χ-42组成的2C3识别的寡聚体在AD患者组中较之正 常对照组显著增加(非参数分析；P = 0. 0103)。与之相对，对于由Αβ χ-40组成的2C3识 别的寡聚体，在所述两组间并无显著差异。另一方面，由Αβ χ-42组成的1Α9识别的寡聚体 的水平在AD中较之在对照中为高，尽管该差异在统计上并非显著。对于由Αβ χ-40组成的 1Α9识别的寡聚体，两组之间并无显著差异(图7-2Ε)。自Αβ单体变为寡聚体的结构变化 发生在Αβ聚合过程的最早阶段。Αβ寡聚体与单体间的比例(0/Μ指数)可用作反映AD 病理特征的临床指标。如图7-2F与7-2Η所示，A β 42与A β 40的0/Μ指数在AD患者组中 较之健康对照组均有显著提高(1Α9，对A β 42为ρ = 0. 0137，而对A β 40为ρ = 0. 0429 ； 2C3，对A β 42为ρ = 0. 0012而对A β 4-0为ρ = 0. 0051)。上述结果显示1Α9与2C3阳性 的三维结构不但以Αβ寡聚体的形式存在于LPD-CSF中，且在AD患者中增加。此外，本发 明人获取的结果说明从不带脂蛋白的可溶性Αβ到寡聚中间体的结构转换发生于AD患者 的CSF中，且所述寡聚体可作为有用于诊断散发性AD的生物学标志。实施例8Wm^M 1Α9与2C3 动免鹿m去阳.1卜在Tg2576中记,忆紊乱的发病为评估基于1Α9(η = 13)或2C3 (η = 11)给药的被动免疫疗法的体内预防/治疗 效果，本发明人将1Α9或2C3 (0. 4mg/kg/周)或PBS通过尾静脉在4到13个月龄期间施用 于Tg2576小鼠。对13个月龄时的记忆功能以以下四种类型的学习/行为范式加以评估(1) Y迷宫测试中的短期记忆(图8A)；(2)新物体识别测试中的物体认识记忆(图8B)；(3)水迷宫测试中的空间记忆(图8C)；以及(4)附线索的恐惧条件测试中的联想情感记忆(图8D)。较之施用1A9与2C3的Tg2576小鼠，施用PBS的Tg2576小鼠显示显著的学习与 行为障碍(图8A到8D)。与施用PBS的Tg2576小鼠(n = 10)不同，施用1A9或2C3的 Tg2576小鼠的记忆功能与之前测得的其年龄匹配的未经施用的野生型同龄组小鼠的记忆 功能之间不能区分。由此可见，在施用1A9或2C3的Tg2576小鼠中，本应发生减损的短期 与长期记忆——在施用PBS的组中发生了这样的减损——得以保持。亦即，发明人获得了 支持下述观点的证据，即如果在记忆障碍发病之前进行靶向Αβ寡聚体的被动免疫疗法， 可能预防记忆障碍发病，特别是AD发病。进一步，上述结果代表了首次发现的体内证据，其 直接指明Αβ寡聚体是记忆障碍发病分子。
33
实施例9单克降1A9在Tg2576的脑中阻丨hAP积聚对经施用PBS的Tg2576小鼠(η = 10)与在4到13月龄期间经被动免疫疗法处 理的Tg2576小鼠(1A9给药组，n= 13;2C3给药组，η= 11)在所述学习/行为实验后进行 解剖。积聚于脑中(大脑皮层海马)的Αβ量在下述三个通过连续提取制备的级分(每 个提取物150mg)中测定在含蛋白酶抑制剂的Tris缓冲液中的可溶性级分；2% SDS可溶 性淀粉样蛋白级分；以及2% SDS-不可溶但70%甲酸可溶性淀粉样蛋白级分。我们认为， Tris缓冲液级分中包含非积聚性的生理性A β分子，而2% SDS可溶性A β中包含在淀粉样 蛋白原纤维形成之前的散在老年斑、免疫细胞化学上无法检出的Αβ、以及经过三维结构变 化的、积聚性的可溶性寡聚A β。利用A β 40-与A β 42末端特异性ELISA (特异于A β 40的 ΒΝΤ77/ΒΑ27,特异于A β 42的BNT77/BC05，WAKO试剂盒)分别对A β进行定量。主要组分 为非积聚性生理性Αβ分子的Tris缓冲液级分中的Αβ浓度在这三组之间并无显著差别 (图9Α与9C，A0 χ-40 ；图9B与9 ，Αβ x_42)。在脑中可溶性A β的积聚量(SDS级分)方 面，仅于1Α9给药组中确认了显著的针对Aβ χ-40和Αβ χ-42在大脑皮层中积聚的阻抑作 用(图9Ε，Αβ χ-40 ；图9F，Αβ χ-42)。未在海马中观察到积聚阻抑作用(图9G，Αβ χ_40 ； 图9Η，Αβχ-42)。与此同时，在脑中不可溶Αβ的积聚量(FA级分)方面，仅于1Α9给药 组中观察到了显著的针对Αβχ-40在大脑皮层中积聚的阻抑作用(图91，Αβχ-40 ；图9J， Αβχ-42)。未在海马中观察到积聚阻抑作用(图9Κ，Αβχ-40 ；图9L，Ai3x-42)。对SDS可 溶性级分的All免疫印迹分析显示在所述两个抗体处理组中对大脑皮层中A-Il阳性寡聚 体(四聚体)积聚的阻抑作用(图9M)。实施例10用1A9与2C3的被动免疫疗法增加血浆A β下列三组间在血浆Αβ浓度方面并无显著差异施用PBS的Tg2576小鼠(η = 10)，以及在4到13月龄期间经被动免疫疗法处理的Tg2576小鼠(1A9给药组，η = 13 ；2C3 给药组，η = 11)(图10Α，Αβχ-40 ；图10Β，Αβχ-42)。A β 40/42比例亦无显著差异(图 10C)。为了说明在Tg2576小鼠中使用1A9与2C3的被动免疫疗法针对AD样表型的预 防作用背后隐藏的机理，本发明人在汇集的脑勻浆中评估了可溶于与不可溶于生理盐水的 Αβ寡聚体的存在，以及Αβ寡聚体在外周血与血浆中的存在。在所述处理组之间在汇集 的脑勻浆中可溶于生理盐水的A β寡聚体的量方面并无差异(图10D)，另一方面，不可溶 Aβ寡聚体的量在1Α9与2C3处理组中显示为减少(图10Ε)。进一步，对各处理组内汇集 的血浆(除去白蛋白的血菜，小图F上段；除去白蛋白/脂蛋白的血菜，小图F的下段)通 过All点印迹分析其所含的Αβ寡聚体。其结果显示来自PBS给药Tg2576小鼠的血浆中 存在所述寡聚体(图10F)。在在被动免疫治疗组中，血浆中的Al 1-阳性寡聚体较之PBS给 药组清楚地增加(图10F)。2C3识别的寡聚体以脂蛋白结合形式存在的比例较之1A9识别 的寡聚体为高(小图F的下段)。进一步，通过All免疫沉淀考察血浆Αβ寡聚体。结果 发现，与PBS给药组相比，接受被动免疫治疗的Tg2576小鼠中约200kDa的寡聚体发生了增 加(图10G)。血浆Αβ寡聚体在被动免疫治疗组中的这种增加可视为直接反映了脑内清 除(cerebral clearance)的增加。从而，本发明人获得了下述证据，即静脉内被动免疫疗法的直接靶分子不但存在于脑中，亦存在于血液中，可通过在外周位点的作用增强寡聚体 的选择性脑内清除。亦即，本发明人显示了静脉内被动免疫疗法在临床上的有用性。实施例11#用1A9与2C3 动免鹿m去可阳摘淀粉样蛋白老年斑与肿大剩牛神经突形成在被动免疫疗法组中免疫组织化学A β沉着受阻抑(图11Α)。硫代黄素S染色阳 性老年斑淀粉样蛋白数在大脑皮层与海马中也均显著受阻抑(图11Β，上段)；该减少在组 织学上也是明显的(图11Β，下段)。突触泡蛋白阳性肿大变性神经突形成在被动免疫治疗 组中亦显著的受阻抑(图11C)。实施例12使用抗突触泡蛋白或抗脑发育调节蛋白抗体的免疫染饩分析1Α9与2C3在大脑新皮质中阻抑了前突触与后突触的变性(图12)。实施例13抗体的脑内移行使用共焦聚激光显微镜评估了 A β沉着与脑内小鼠IgG的存在/位置。其结果显 示，在散在老年斑存在的区域中，小鼠IgG存在的位置几乎与沉着Αβ无关。该小鼠IgG仅 见于被动免疫疗法组(1Α9(图13Α)与2C3(图13B))中，但非PBS给药组(图13C)中。由 此可见，施用于血液的抗体中一部分转移到了脑中。该结果显示转移到脑内的抗体直接中 和可溶性A β聚合体毒性的，且进一步可溶性A β聚合体以与所述抗体的复合物的形式被 清除到血中，来发挥预防记忆障碍的效果。因而认为其治疗系基于复合作用机制。实施例14不识别其它A β单体但为寡聚体特异性的抗体(Ε12，IClO与4D3)IClO与4D3是来自在386个含通过对小鼠重新免疫接种所得的杂交瘤的孔中 24个阳性细胞孔的两种强阳性的细胞。自合成A β 1-40 (HCl形式)制备50μΜ无种子的 A β 1-40 (单体)，其可容易地从无规卷曲结构形成β片层结构；将其在37°C下培育0到96 小时以产生寡聚体，并通过点印迹法来检查所述抗体的寡聚体特异性。经确证，如同上述 2C3的结果，E12，IClO与4D3(均为IgM同种型)并不与单体反应，但对寡聚体是特异性的 (图 14)。实施例15同种型变为I甙2b的E12抗体的免疫点印迹分析对E12进行免疫点印迹分析，其同种型通过常规方法变为IgG2b。其结果，发现所 得E12抗体(IgG2b同种型)是不识别A β单体(0小时)，但可特异性地结合A β寡聚体 (图15)的抗体。进一步，确证该抗体的特征并未因同种型变化而改变。实施例16同种型变为IgG2b的E12抗体的Aβ淀粉样蛋白原纤维形成阻抑活件为评估所述Ε12抗体(IgG2b同种型)是否具有阻抑A β淀粉样蛋白原纤维形成 的活性，Αβ淀粉样蛋白原纤维形成通过上述ThT荧光强度分析方法在溶液(培养基)中 检测，溶液组成与用于Αβ诱导神经毒性实验的相同。其结果，观察到Αβ淀粉样蛋白原纤 维形成在1. 5 μ M所述Ε12抗体的存在下受阻抑(图16)。讨论
本发明人所得数据显示单克隆1A9与2C3特异性地识别导致毒性活性与神经纤维 形成活性的可溶性A β的“神经毒性表位”与“聚合作用表位”。因为单克隆1Α9与2C3不 与为生理性分子的可溶性Αβ单体反应，可得出下述结论，即具有由1Α9或2C3识别的表位 的三维结构是可溶性寡聚聚合体特有的。使用超滤与分子筛的实验揭示，1Α9与2C3免疫反 应性寡聚体的尺寸大于100kDa( > 20聚体)。通过AFM的形态学观察结果说明毒性多聚体 在形态学上为异质的(颗粒状，珠形与环形)。为实证所述毒性聚合体实际上为展示体内突触毒性的生物活性分子，本发明人用 靶向1A9与2C3识别的毒性聚合体的抗Αβ寡聚体被动免疫疗法对幼Tg2576小鼠在其记忆 障碍发生之前进行处理。本发明人首次提出了支持下述结论的证据，即在Tg2576小鼠中天 然发生的年龄依赖性记忆恶化可通过被动免疫疗法使用抗A β寡聚体特异性抗体(1Α9与 2C3)来预防。在本文中，通过Y迷宫测试评估的短期记忆障碍类似于在轻度认知障碍(MCI) 与早期AD中观察到的Αβ积聚相关记忆障碍。对经1Α9与2C3分别给药的Tg2576小鼠， 所述Y-迷宫测试显示良好的、几乎正常的结果。当通过新物体识别任务，Morris水迷宫与 附线索的恐惧条件任务评估时，依赖所述抗A β寡聚体抗体长期记忆保持近乎正常。较之PBS处理组，抗体处理的小鼠组中见到了血液中All阳性寡聚体的选择性增 加，该现象与所述抗体预防记忆障碍发病的能力(记忆保持能力)相一致。1A9抗体处理亦 展示了阻抑大脑Αβ积聚的作用。2C3抗体处理显示了较之1Α9抗体处理较高的A-Il阳性 寡聚体血液水平。然而2C3抗体处理的大脑A β积聚阻抑功能并不清楚。相应的，1Α9识 别的寡聚体视为较之2C3识别的寡聚体对大脑Aβ积聚具有更大的作用。所述聚合体在大 脑Αβ积聚中所起的作用可基于下述假定加以解释神经毒性1Α9聚合体是构象较为稳定 的可溶性有毒寡聚体，而神经毒性2C3聚合体为非常不稳定、短命的寡聚中间体，其出现于 聚合过程的早期阶段，其构象非常易于变化。本发明人在本文中公开了抗寡聚体抗体对阿尔茨海默氏病的体内预防作用，这是 第一个直接证明体内形成的有毒Αβ寡聚体能抑制神经细胞的功能，由此诱导阿尔茨海默 氏病的症状的证据。本发明人获取的数据也是支持Αβ在人类大脑中展示体内神经毒性这一观点的 第一个证据。众所周知人类内嗅皮层为易受AD影响的区域。在此区域内，NFT形成与神经 细胞丧失发生于老年斑形成之前。因此，内嗅皮层是被普遍接受的淀粉样蛋白级联假说无 法适用的一个例外区域。然而该不一致长期以来受人忽略，无人研究。本发明人提出并验证了下述假说，即迄今为止未被鉴定的、不可见的Αβ寡聚体， 在内嗅皮质中有害于神经细胞并导致记忆障碍。为验证该假说，本发明人针对主要为Braak NFT IilJIII期的高龄人，半定量地分析了他们内嗅皮层中的1Α9与2C3免疫反应性十二聚 体。1Α9与2C3免疫反应性12聚体在Braak NFT I到II期的健康个体的内嗅皮质中已经 存在，且随着BraakNFT分期的进展而增加。在AD中发现所述12聚体显著增加。从而，说 明1Α9与2C3免疫反应性12聚体的出现发生于人类大脑中认知机能障碍发病之前。另一 方面，通过生物化学与免疫组织化学技术，阐明了老年斑含有1Α9与2C3免疫反应性A β寡 聚体。而且，揭示了不溶化的淀粉样蛋白原纤维自身具有中和神经毒性的活性。这些发现 表明，当存在Αβ寡聚体但无老年斑形成时，Aβ寡聚体发挥体内毒性，从而可为记忆障碍 的原因。
36
如上所述，本发明人的数据首次了直接证明记忆障碍的原因为在体内由内源Αβ 寡聚体造成的突触功能障碍。尽管之前使用过主动免疫疗法(Janus D，2000，Nature; Morgan D，2000，Nature)与被动免疫疗法(Bard F，2222，Nat med ；DeMattos RB, PNAS, 2001)，如何阻止学习能力丧失与记忆障碍的机理仍然仅为猜测。一个广泛提出的可能性是 所述抗体通过血脑屏障到达脑部，并在体内直接中和作为记忆缺陷原因的可溶性Αβ寡聚 体。第二个可能性，即所谓“库理论(sink theory)”，认为所述抗体在外周耗尽外周血A β 池，并从而激活Αβ自脑中的清除。DeMattos等人报道外周施用的抗A β抗体不仅运输大 脑Αβ单体，且亦运输Αβ 二聚体进入血浆，并亦将脑Aβ运输入CSF(DeMattos RB et al.， PNAS，98 ;8850-8855，2001)。本发明人亦揭示A β寡聚体存在于人类CSF中，且在AD患者 中增加。从而确认了 Αβ寡聚体可用作AD的诊断标记。进一步，本发明人首次提供了支持 下述观点的证据，即Αβ寡聚体存在于Tg2586小鼠的血浆中，并且，在特异性捕获并中和 Αβ寡聚体的通过静脉内注射的被动免疫疗法中，无需向脑内递送抗体，且在外周位点亦即 血管作用即可实现Αβ寡聚体从脑到血液中的清除。此外，本发明人首次提出了下述证据， 即被动免疫疗法不但可阻抑老年斑形成，而且还可阻抑淀粉样蛋白老年斑介导的间接神经 细胞损伤(肿大变性的神经突形成)。这些结果确证所述Aβ寡聚体为阿尔茨海默氏病发 病的分子基础，且使用寡聚体特异性抗体的选择性控制使人们不但可能从治疗性的视点控 制阿尔茨海默氏病，从预防性的视点控制阿尔茨海默氏病也成为可能。进一步，我们证实了 所施用抗体的一部分转移入脑部。这表明阻抑记忆障碍的效果是多种作用联合施加的，这 些作用例如对脑中可溶性Αβ寡聚体的直接中和，通过新生Fc受体将抗体-Aβ寡聚体免 疫复合物运输到血液中(DeaneR，2005，J Neurosci)，以及上述“库”作用。建立准确的发病前诊断以识别具有罹患AD高风险的病例对涉及预防/治疗策略 而言非常重要。本文所报道的在AD中CSF中0/M比例的显著增加，期望其为发病前诊断标 志的有力候选。产业应用性本发明所提供的抗体可用于，例如，对阿尔茨海默氏病基于静脉内注射的预防性 被动免疫治疗，并作为对该疾病发病前诊断，疾病监视，药物功效监视/评价等的生物学标
ο进一步，本发明所述的抗体可望对阿尔茨海默氏病预防/治疗方法以及早期诊断 标志的建立产生极大的贡献，其中上述预防/治疗方法对引发该疾病的病理学状况的分子 具有选择性。本发明人获取了支持下述结论的证据抗体疗法，即使其以脑内病理学状况 为靶标，亦可令人满意地通过外周静脉内给药来达成，而无需考虑所述抗体的脑内转移。此 外，本发明人获得了证据显示即使在外周静脉内给药疗法中，被施用的抗体的一部分转移 到脑内，并产生直接效应，同样无需考虑所述抗体的脑内转移。从而，本发明可望大大加快 阿尔茨海默氏病抗体疗法的进展。
3权利要求
一种结合Aβ寡聚体的抗体，其中所述抗体不结合Aβ单体。
2.一种结合Αβ寡聚体的抗体，该Αβ寡聚体结合包含具有SEQ ID Ν0:1的氨基酸序 列的H链与具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列的L链的抗体。
3.一种结合Αβ寡聚体的抗体，所述Αβ寡聚体结合包含具有SEQ IDN0:21的氨基酸 序列的H链与具有SEQ ID NO 23的氨基酸序列的L链的抗体。
4.一种结合A β寡聚体的抗体，所述A β寡聚体结合于包含具有SEQ IDNO :41的氨基 酸序列的H链与具有SEQ ID NO 43的氨基酸序列的L链的抗体。
5.下述(1)到(20)中任一项的抗体(1)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 9的氨基酸序列作为⑶Rl、SEQ ID NO 11的氨 基酸序列作为⑶R2、以及SEQ ID NO 13的氨基酸序列作为⑶R3的H链；(2)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 15的氨基酸序列作为⑶Rl、SEQ ID NO 17的氨 基酸序列作为⑶R2、以及SEQ ID NO 19的氨基酸序列作为⑶R3的L链；(3)一种抗体，其包含⑴的H链与⑵的L链；(4)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 5的氨基酸序列作为VH的H链；(5)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列作为VL的L链；(6)一种抗体，其包含⑷的H链与(5)的L链；(7)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO :29的氨基酸序列作为⑶Rl，SEQ ID NO :31的氨 基酸序列作为⑶R2，与SEQ ID NO 33的氨基酸序列作为⑶R3的H链；(8)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 35的氨基酸序列作为⑶Rl，SEQ ID NO 37的氨 基酸序列作为⑶R2，与SEQ ID NO 39的氨基酸序列作为⑶R3的L链；(9)一种抗体，其包含(7)的H链与⑶的L链；(10)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 25的氨基酸序列作为VH的H链；(11)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 27的氨基酸序列作为VL的L链；(12)一种抗体，其包含(10)的H链与(11)的L链；(13)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 49的氨基酸序列作为⑶Rl、SEQ ID NO :51的 氨基酸序列作为⑶R2、以及SEQ ID NO 53的氨基酸序列作为⑶R3的H链；(14)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 55的氨基酸序列作为⑶Rl、SEQ ID NO 57的 氨基酸序列作为⑶R2、以及SEQ ID NO 59的氨基酸序列作为⑶R3的L链；(15)一种抗体，其包含(13)的H链与(14)的L链；(16)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 45的氨基酸序列作为VH的H链；(17)一种抗体，其包含具有SEQ ID NO 47的氨基酸序列作为VL的L链；(18)一种抗体，其包含(16)的H链与(17)的L链；(19)一种抗体，其是在(1)到(18)中任一项的抗体中替换、缺失、添加和/或插入一个 或多个氨基酸而得到的，其具有与所述(1)到(18)中任一项的抗体等价的活性；和(20)一种抗体，其结合(1)到(18)中任一项的抗体所结合的表位。
6.权利要求5所述的抗体，其中所述抗体为嵌合抗体或人源化抗体。
7.一种组合物，其包含权利要求1到6任一所述的抗体与药用载体。
8.—种抗认知机能障碍剂，其包含权利要求1到6任一所述的抗体或权利要求7的组 合物作为活性成分。
9.一种阿尔茨海默氏病治疗剂，其包含权利要求1到6任一所述的抗体或权利要求7 的组合物作为活性成分。
10.一种阿尔茨海默氏病进展阻抑剂，其包含权利要求1到6中任一所述的抗体或权利 要求7的组合物作为活性成分。
11.一种老年斑形成阻抑剂，其包含权利要求1到6任一所述的抗体或权利要求7的组 合物作为活性成分。
12.—种A β积聚阻抑剂，其包含权利要求1到6中任一项所述的抗体或权利要求7的 组合物作为活性成分。
13.一种抗神经毒性剂，其包含权利要求1到6中任一项所述的抗体或权利要求7的组 合物作为活性成分。
14.一种Αβ淀粉状蛋白纤维形成抑制剂，其包含权利要求1到6中任一项所述的抗体 或权利要求7的组合物作为活性成分。
15.一种抗突触毒性剂，其包含权利要求1到6中任一项所述的抗体或权利要求7的组 合物作为活性成分。
16.一种检测A β寡聚体的方法，其包括使用权利要求1到6中任一项所述的抗体检测 自受试者收集的试样中所含的Aβ寡聚体的步骤。
17.—种诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法，其包括使用权利要求 1到6中任一项所述的抗体检测收集自受试者的试样中的Αβ寡聚体。
18.—种诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法，其包括下述步骤(a)使收集自受试者的试样与权利要求1到6中任一项所述的抗体接触；和(b)测量所述试样中Αβ寡聚体的量，其中当步骤(b)中测得的量大于健康个体时，确定所述受试者为可能的阿尔茨海默氏 病患者。
19.一种诊断受试者是否为可能的阿尔茨海默氏病患者的方法，其包括下述步骤(a)使收集自受试者的试样与权利要求1到6中任一项所述的抗体以及结合Aβ单体 的抗体接触；以及(b)测量所述试样中Αβ寡聚体对Αβ单体的比例，其中当步骤(b)中测得的比例大于健康个体时，确定所述受试者为可能的阿尔茨海默 氏病患者。
20.权利要求16到19中任一项所述的方法，其中所述试样为血液或脑脊液。
21.一种用于权利要求16到19中任一项所述的方法的药剂。
22.一种用于权利要求16到19中任一项所述的方法的试剂盒。
全文摘要
本发明人成功地生产了仅特异识别可溶性Aβ寡聚体(其为生理性分子)而不识别可溶性Aβ单体的单克隆抗体。发现该抗体作为针对阿尔茨海默氏病诊断/治疗的单克隆抗体是有用的。
文档编号A61K39/395GK101965365SQ20088012221
公开日2011年2月2日 申请日期2008年10月17日 优先权日2007年10月19日
发明者松原悦朗, 柴田昌夫, 横关达己 申请人:伊缪纳斯制药株式会社;独立行政法人国立长寿医疗研究中心