半合成GLP-1肽-Fc融合构造、方法及其用途的制作方法

专利名称：半合成GLP-1肽-Fc融合构造、方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含化学连接到免疫球蛋白Fc蛋白的生物活性肽的组合物。更具体 地讲，本发明涉及具体的促胰岛e素释放组合物，该组合物包含化学连接到抗体Fc的GLP-I 肽和经修饰的多肽类似物的构造。相关领域描述重组蛋白质是一类新兴治疗剂。此类重组治疗剂在蛋白质制备和化学修饰方面取 得了进步。此类修饰通过，例如，延长半衰期(如通过阻止其接触蛋白分解酶)、提高生物活 性或减少不良副作用，有可能增强治疗蛋白质的治疗效果。一种此类修饰是利用融合到受 体蛋白质的免疫球蛋白片段，例如依那西普。也已经利用Fc域构建治疗蛋白质，以尝试提 供更长的半衰期或整合诸如Fc受体结合、蛋白质A结合和补体结合之类功能。糖尿病是一种日渐普遍的流行病，据估计，到2025年，糖尿病将影响3亿以上的人 口，因此急需一种有效的药物治疗方法。2型糖尿病占所有病例的90-95%。因血糖水平持 续升高引起的并发症包括心血管疾病、肾病、神经病和视网膜病。此外，在2型糖尿病晚期 时，胰腺的β细胞死亡，从而停止分泌胰岛素。目前对糖尿病的治疗会产生多种有害的副 作用，其中包括低血糖和体重增加。此外，目前对2型糖尿病的治疗并不能治愈这种疾病， 而只是延缓时间，直至患者需要接受胰岛素治疗。胰高血糖素样肽-I(GLP-I)是在口服葡萄糖负荷试验之后由肠的L细胞分泌 的37个氨基酸的肽。随后在第6和第7位之间进行内源性分裂，产生具有生物活性的 GLP-I (7-37)肽。GLP-I (7-37)肽序列可以分成2个结构域。肽的氨基端区参与信号发送， 而肽的剩余部分则看上去以螺旋构象与GLP-I受体的细胞外环结合。在葡萄糖刺激下，活 性GLP-I与胰腺上的GLP-I受体结合，并导致胰岛素分泌增加(促胰岛素释放作用)。此 外，已经发现GLP-I会抑制胃排空，从而减少释放到循环中的葡萄糖量，并可能减少食物摄 取。这些作用结合在一起会降低血糖水平。还已表明GLP-I可以抑制细胞凋亡并促进胰腺 内的β细胞增殖。因此，GLP-I是一种降低血糖并维持糖尿病患者胰腺内的β细胞的引 人注目的治疗剂。此外，GLP-I的活性受血糖水平控制。当血糖水平降低至某个阈值水平 时，GLP-I不具有活性。因此，不存在与涉及GLP-I的治疗有关的低血糖风险。GLP-I疗法的可行性已经在临床上得到了证明。输注GLP-I六周会有效降低2型 糖尿病患者的空腹血糖水平和8小时平均血糖水平。GLP-I疗法还会改善3细胞功能。艾 塞那肽是一种目前进入临床试验阶段的GLP-I类似物。艾塞那肽最早是在希拉毒蜥的唾液 中发现，并且与GLP-I有53%的相似性。艾塞那肽可以结合GLP-I受体，并引发信号转导级 联，从而导致与GLP-I (7-37)有关的多种活动。迄今为止，已经发现艾塞那肽可以降低2型 糖尿病患者体内的HbAlc水平和血清果糖胺水平。此外，艾塞那肽可以延迟健康志愿者的 胃排空，并抑制其对食物的摄取。然而，GLP-I会在体内迅速被二肽基肽酶IV(DPP-IV)蛋白酶钝化。因此，与GLP-I
4肽有关的疗法的有效性会受限于其快速清除和较短的半衰期。例如，GLP-I (7-37)的血清半 衰期只有3至5分钟。当皮下给药时，GLP-I (7-36)酰胺的作用时间为约50分钟。即使是 耐内源性蛋白酶裂解的类似物和衍生物，也没有足够长的半衰期，不可避免地要每隔24小 时重复给药。例如，艾塞那肽对DPP-IV具有耐受性，但由于半衰期较短，并且体内药物动力 学具有显著的变异性，因此也需要每日饭前服用两次。目前进入临床试验阶段的另一种化 合物NN2211是一种脂化的GLP-I类似物。该药物的预期剂量为每日一次。当希望在较长时间内保持较高的药物血液浓度时，因为这样需要反复给药，治疗 剂的快速清除会很不方便。此外，对于那些以往治疗方案仅包括服用口服药物的糖尿病患 者而言，药效持久的化合物尤其重要。这些患者要过渡到实施包括多次注射药物的治疗方 案，往往要经历一段非常困难的时期。半衰期延长的GLP-I疗法比起正在研发的其他GLP-I 肽和化合物具有明显的优势。已经公开了在多个位置进行置换、缺失和修饰的多种GLP-I类似物。参见，例如， Buckley, D. I.、Habener, J. F.、Mallory, J. B.禾口 Mojsov, S. , GLP-I analogs useful for diabetes treatment (用于治疗糖尿病的GLP-1类似物)WO 91/11457。此外，已经制备了 多种杂合肽。已经为多受体结合制备了含有GLP-1、胰高血糖素和醋酸艾塞那肽(一种从希 拉毒蜥(Heloderma suspectum)的唾液腺分离的高亲和性GLP-I受体激动剂，其与GLP-I 具有53%的同源性)片段的杂合肽。在N-端加上胰高血糖素序列可以阻断DPP-IV裂解。 通过引入的半胱氨酸进行的C-端聚乙二醇修饰不会导致活性丧失。通过将马来酰亚胺基经三甘醇与添加到C-端的赖氨酸的ε氨基连接，可以制备 具有改善的半衰期的GLP-I类型。在体内，该GLP-I与白蛋白结合并与白蛋白半胱氨酸形 成共价键。为了延长半衰期，通过重组制备了包含GLP-I或类似物的融合蛋白质，其中该肽 的C-端羧基通过富含甘氨酸-丝氨酸的连接基融合到IgG4的N-端氨基酸。已经将白蛋 白和Fc融合构造与GLP-I和类似物一起公开。因此，本领域需要具有治疗T2D的GLP-I活性的组合物，该组合物具有延长的血清 半衰期。在天然GLP-I肽序列基础上形成这种分子的若干方法包括掺入了脂质、亲水性聚 合物(例如PEG)或所讨论的免疫球蛋白融合构造的耐蛋白酶类似物、衍生物或缀合物。因此，将GLP-I肽或类似物与免疫球蛋白Fc融合的方法是延长肽半衰期的一种方 式。然而，由于这种融合蛋白质是通过重组方式表达，因此只限于包含20种天然哺乳动物 氨基酸。虽然利用某些技术可以通过操作遗传密码将非天然氨基酸掺入到蛋白质中，但这 些方法局限于使用Na-L-氨基酸。有多种生物活性肽的类似物含有D-氨基酸、Ne-氨基酸 或高级同系物、非氨基酸部分和使用非半胱氨酸侧链的环状肽。此外，一些生物活性肽需要 游离的羧酸基团产生活性。这些结构都不能通过重组技术掺入到融合蛋白质中。

发明内容
本发明涉及GLP-I肽半合成免疫球蛋白Fc融合蛋白质，其可以掺入通过重组技术 无法获得的上述所有GLP-I肽类似物的变体。不仅活性GLP-I肽的生物活性得以保留，而 且两种肽在免疫球蛋白Fc支架上的独特呈现也可以显示出通过目前对GLP-I的构效关系 的了解所无法预测或解释的生物活性。
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因此，在一个方面，本发明涉及医用生物活性缀合物，其包含被非肽键缀合到抗体 Fc片段的GLP-I肽或其类似物。该生物活性治疗剂被直接缀合到抗体Fc片段，或通过共价 键间接缀合到抗体Fc的氧化氨基酸部分，其中活性羰基为醛或酮。在生物活性缀合物的另 一方面，将GLP-I肽直接或间接键合到Fc的共价键通过选自由下列基团组成的组的亲核基 团与Fc的含羰基活性部分反应形成伯胺、胼、酰胼、卡巴胼、氨基脲和硫代卡巴胼。本发明还涉及具有下列通式的组合物B-(L)n-(F) (I)其中B表示至少一个生物活性GLP-I肽、变体或衍生物，F表示包含-⑶ P-CH2-CH3结构的抗体Fe，其中X表示可以通过标准分子生物工程技术掺入和制备的任何 天然存在的氨基酸，其中m为0-20的整数，D为多聚或二聚域(例如免疫球蛋白铰链区的 至少一部分)，P为0至1的整数，CH2表示免疫球蛋白CH2恒定区的至少一部分，该区与免 疫球蛋白CH3恒定区的至少一部分相连。L表示包含基本上非免疫原性的聚合物结构的连 接基，并且在生物活性部分和F之间提供柔性键合，其允许结构具有交替取向，其中η可以 为整数0或1。当η为0时，B和F之间的键合为非肽共价键。当η为1时，L和F之间的 键合为非肽键。在一个实例中，L由聚(烯化氧)残基(例如聚乙二醇)构成。所得构造 可以任选地通过缔合或共价键合(例如但不限于Cys-Cys 二硫键)进一步连接相同或其他 多肽、聚合物、标记物、放射性同位素或活性物。在特定实例中，本发明包括化学式I的缀合物，其包含如下化学式表示的化合物B-F (II)及其多聚体，其中B的C-端连接到F的N-端，或者B的N-端连接到F的 N-端，并且F缺乏二聚域； B-L-F (III)及其多聚体，其中F为不合二聚域的Fc域，并且通过N-端连接到L，L 在交替位点进一步连接到B的C-端；或者其中F为所述能够形成Fc域的多肽并通过N-端 连接到L，L在交替位点进一步连接到B的N-端；以及B1-F-B2(IV)，其中B1和B2为相同或不同的GLP-I肽，或者通过在相同GLP-I上的 交替位点缀合到F，并且其中F具有二聚域；以及B1-L1-F-L2-B2(V)，其中B1和B2为相同或不同的GLP-1肽，或者分别通过Bl和Β2 上的交替位点缀合到L1和L2，并且其中F具有二聚域。在每种情况下，B和F之间的连接， 或者L和F之间的连接是非肽键。该组合物也涵盖GLP-I缀合物与未缀合到GLP-I的免疫球蛋白重链多聚化而成的 组合物。这种组合物(例如一价组合物)可以是化学式I-V的缀合物与游离重链共价或非 共价缔合而成或者通过已缔合的重链(如在预成形的Fc区)的一价缀合而成。在一个实例中，本发明涉及一种方法，该方法以位点特异性方式化学修饰GLP-I 肽，以增加其血清半衰期而不降低分子的生物活性。本发明的方法包括在抗体Fc的N-端 形成活性羰基以及通过非肽键将GLP-I肽缀合到其上的步骤。在一个实例中，该方法涉及 将GLP-I肽缀合到具有用于缀合的第一位点和第二位点的聚合物(例如PEG聚合物)，其中 GLP-I肽键合到第一位点，并且将具有亲核官能团的PEG的第二缀合位点与存在于抗体Fc 的N-端的醛键合，当用重组蛋白技术表达时，该醛由N-端丝氨酸或苏氨酸残基氧化断裂产 生。


图1所含图形示出了生物活性检测分析法中生物活性GLP-I肽1与野生型GLP-I 肽的活性对比，其中GLP-I受体结合刺激的cAMP是在与供试品接触的INS-IE细胞中测得。图2中的图示出了图2所示cAMP检测中肽3相比野生型GLP-I肽的相对cAMP刺 激活性。图3中的图示出了几种GLP-I肽-Fc缀合物在用cAMP检测分析法测量时的活性。
具体实施例方式MMFMOC 9-芴甲氧羰基；Boc 叔丁氧羰基；GLP-I 胰高血糖素样肽_1 ；术语“缀合物”旨在意指将分子(例如生物活性肽)通过与Fc上的活性羰基反应 形成的腙或半卡巴腙键共价连接到抗体Fc所形成的实体，该连接可以通过在二者之间掺 入合成聚合物分子(例如聚乙二醇)实现，并且当存在聚合物时，该聚合物通过与Fc上的 活性羰基反应形成的腙或半卡巴腙键结合到Fe。如本文所用，术语“Fe”、“含Fc的蛋白质”或“含Fc的分子”是指具有至少一个免 疫球蛋白CH2和CH3域的单体、二聚体或异二聚体蛋白质。当通过官能团连接到二聚或多 聚域(例如抗体铰链域)时，CH2和CH3域可以形成该蛋白质分子(如抗体)的二聚体区域 的至少一部分。抗体分子的Fc部分(可结晶片段或补体结合片段)表示通过用多种肽酶 (本例中为胃蛋白酶)消化抗体而产生的其中一个具有良好表征性的片段。虽然各种抗体 片段是根据完整抗体的消化进行的定义，但技术人员将会知道，此类Fc片段可以通过化学 方法或利用重组DNA方法、肽展示等从头合成。CH2和CH3域优选地衍生自人类生殖序列， 例如W02005005604所公开的序列。如本文所用，术语“肽”和“蛋白质”可互换使用，是指通过肽键将氨基酸残基连接 在一起的聚合物。该术语意指包括任何尺寸、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。然而，通常肽 至少有六个氨基酸长，而蛋白质则至少有50个氨基酸长。肽通常具有最多约10，OOODa的 分子量，而分子量在该值以上的肽则通常被称之为蛋白质。肽侧链的修饰可能与糖基化、羟 基化等一起存在。另外，可以将其他非肽分子(包括脂质和小药物分子)连接到多肽。蛋 白质可以为天然存在的、重组的或合成的，或者为它们的任意组合。肽也可以为天然存在的 蛋白质或多肽的片段。蛋白质可以为单分子或多分子络合物。术语“蛋白质”也可以适用 于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基为对应于天然存在的氨基酸的人造化学类似 物。其中一个或多个氨基酸残基为“非天然”氨基酸，而不对应于任何天然存在的氨基酸的 氨基酸聚合物也涵盖于本文所用术语“肽”和“蛋白质”中。所谓“血清半衰期延长”或“t1/2延长”是指修饰的生物活性分子相对于其未修饰 形式在循环半衰期方面的正向变化。通过在给药生物活性分子后在不同时间点采集血样并 确定该分子在每份血样中的浓度，可以测得血清半衰期。通过测量血清浓度随时间的变化 可以计算血清半衰期。通过比较修饰分子(如缀合分子)与未修饰分子的血清半衰期，可 以确定血清半衰期或t1/2的相对增量。该增量有利地为至少约两倍，但较小的增量也可能 是有效的。
术语“融合蛋白质”是指由两个或更多个多肽构成的蛋白质，虽然该蛋白质通常在 自然状态下未连接，但可通过肽键由各自的氨基端和羧基端连接形成单个连续的多肽。应 当理解，两个或更多个多肽组分既可以直接连接，也可以通过充当间隔基并提供柔性的一 个或多个氨基酸的序列间接连接。本领域和本文所用术语“官能团”、“活性部分”、“活性位点”、“化学活性基团”和 “化学活性部分”是指分子的截然不同的可定义部分或单元。这些术语在化学领域一定程 度上是同义词，并且本文所用的术语表示执行某些功能或活性并与其他分子反应的分子部 分。当与官能团结合使用时，术语“活性的”旨在包括那些易于与其他分子上的亲电或亲核 基团反应的官能团，这与那些需要强催化剂或不切实际的反应条件才能反应的基团(即非 活性或惰性基团)形成对比。例如，如本领域可以理解的那样，术语“活性酯”将包括易与诸 如胺之类的亲核基团反应的酯。示例的活性酯包括N-羟基丁二酰亚胺酯或1-苯并三唑基 酯。通常，活性酯将在几分钟内与胺在含水介质内发生反应，而某些酯(例如甲酯或乙酯) 需要强催化剂才能与亲核基团反应。如本文所用，术语“官能团”包括受保护官能团。术语“受保护官能团”或“保护基”或“保护基团”是指在某些反应条件下分子内 存在可以防止或阻断某些化学活性官能团发生反应的部分(即保护基团)。保护基团会 发生变化，具体取决于被保护化学活性基团的类型以及所采用的反应条件和分子内是否 存在附加的活性基团或保护基团。本领域已知的保护基团可见于Greene，T. W.，et al., Protective Groups InOrganic Synthesis,3rd ed. , John Wiley & Sons, New York, N. Y. (1999) (Greene, T. W.等人，《有机合成中的保护基团(第三版)》，John Wiley & Sons (New York)，N. Y.，1999 年)。本文所用术语“键”或“连接基”(L)是指优选地通过一个或多个共价键用于连接 互连部分(例如两个聚合物链段或聚合物端与生物活性剂(例如多肽)上存在的活性官能 团)的原子或原子集合。所谓“残基”是指在与一个或多个分子反应之后剩余的分子部分。例如，多肽链中 的氨基酸残基是指与相邻氨基酸残基形成肽键之后剩余的氨基酸部分。乙醛酰官能团是通 过高碘酸盐处理多肽上的N-端丝氨酸或苏氨酸形成的残基。如本文所用，“GLP-1肽”或“GLP-1肽、变体或衍生物”可以为至少一个GLP-I肽、 GLP-I片段、GLP-I同源物、GLP-I类似物或GLP-I衍生物。GLP-I肽具有约25至约45个天 然存在或非天然存在的氨基酸，这些氨基酸与天然GLP-I (7-37)具有足够的同源性，使得 通过与胰腺内β细胞上的GLP-I受体结合可表现出促胰岛素活性。GLP-I (7-37)具有氨基 酸序列 HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (SEQ ID NO :1)。GLP-I片段是从GLP-I (7-37)或其类似物或衍生物的N-端和/或C-端截掉一个 或多个氨基酸后获得的多肽。GLP-I同源物是将一个或多个氨基酸添加到GLP-I (7-37)或 其片段或类似物的N-端和/或C-端后形成的肽。GLP-I类似物是将GLP-I (7-37)的一个 或多个氨基酸修饰和/或取代后形成的肽。GLP-I类似物与GLP-I (7-37)或GLP-I (7_37) 的片段具有足够的同源性，使得该类似物具有促胰岛素活性。GLP-I衍生物被定义为这样的 分子其具有GLP-I肽、GLP-I同源物或GLP-I类似物的氨基酸序列，但又另外具有其氨基 酸侧基、α-碳原子、端氨基或端羧酸基团中的一个或多个的化学修饰。GLP-I 肽
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本领域已知多种活性GLP-I片段、类似物和衍生物，并且这些类似物和衍生物 中任何一种也都可以为本发明的GLP-I模拟体的一部分。本领域已知的一些GLP-I类 似物和 GLP-I 片段在美国专利 No. 5，118，666,5, 977，071 和 5，545，618 以及 Adelhorst， et al.，J. Biol. Chem. 269 6275(1994) (Adelhorst 等人，《生物化学杂志》，1994 年， 第269卷第6275页)中有所描述。例子包括但不限于GLP-I (7-34)、GLP-I (7-35)、 GLP-I (7-36)、Gln9-GLP-1 (7-37)、D-Gln9-GLP_1 (7-37)、Thrl6-Lysl8-GLP-1 (7-37)以及 LyslS-GLP-I (7-37)。任何GLP-I化合物都可以是本发明异源融合蛋白质的一部分，只要 该GLP-I化合物本身能够通过GLP-I受体进行结合并诱导信号。GLP-I受体结合和信号转 导可利用体外检测分析法评估，例如，分别在EP 619，322和美国专利No. 5，120，712中描述 的方法。本领域已知多种活性GLP-I片段、类似物和衍生物，任何这些类似物和衍生物也可 以是本发明的异源融合蛋白质的一部分。本文提供了新型GLP-I类似物以及本领域已知的 GLP-I类似物和衍生物的一些例子。为了防止被DPP-IV降解和钝化，制备了多种GLP-I类似物，包括Na-甲 基-His1、α-甲基-His1、去氨基-His1 和咪唑-乳酸-GLP-l(Sarrauste deMenthiere et al. 2004Eur. J. Med. Chem. 39 473-480 (Sarrauste deMenthiere 等人，《欧洲医药化学杂 志》，2004年，第39卷第473-480页))。除了 甲基-His1-GLP-I之外，所有这些类似物在 体外存在DPP IV的情况下都能保持稳定。它们都表现出相当于RINm5F细胞中天然GLP-I 的受体亲和力和体外生物活性。只有去氨基-His1-GLP-I相比天然GLP-I表现出丧失了 15 倍的受体亲和力。所有类似物都刺激了 RINm5F细胞中浓度相当于GLP-I的细胞内cAMP的 产生。防止被DPP-IV降解的另一种方法是对天然GLP-I序列中的所选氨基酸残基进行 修饰或置换。在另一个实施例中，可以将N-端氨基酰化(如乙酰化)，以防止被DPP-IV识 别和裂解。适用于本发明的合适的GLP-I肽、变体和衍生物的非限制性例子以SEQID NO 2 表不:HiS-Xaa2-Xaa3-Gly-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-XaalI-Xaal2-Xaal3~Xa al4-Xaal5-Xaal6-Xaal7-Xaal8-Xaal9-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-X aa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31，其中Xaa2 为 Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、lie、Val、Glu、Asp 或 Lys ；Xaa3 为 Glu、Asp 或 Lys ；Xaa5 为 Thr、Ala、Gly、Ser、Leu、lie、Val、Arg、His、Glu、 Asp 或 Lys ；Xaa6 为 Phe、His、Trp 或 Tyr ；Xaa7 为 Thr 或 Asn ；Xaa8 为 Ser、Ala、Gly、Thr、 Leu、lie、Val、Glu、Asp 或 Lys ；Xaa9 为 Asp 或 Glu ；XaalO 为 Val、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、 lie、Met、Tyr、Trp、His、Phe、Glu、Asp 或 Lys ；Xaall 为 Ser、Val、Ala、Gly、Thr、Leu、lie、 Glu、Asp 或 Lys ；Xaal2 为 Ser、Val、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Glu、Asp 或 Lys ；Xaal3 为 TyrΛ Phe、Trp、Glu、Asp 或 Lys ；Xaal4 为 Leu、Ala、Met、Gly、Ser、Thr、Leu、lie、Val、Glu、Asp 或 Lys ；Xaal5 为 Glu、Ala、Thr、Ser、Gly、Gin、Asp 或 Lys ；Xaal6 为 Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、 IIe、Val、Gin、Asn、Arg、Cys、Glu、Asp 或 Lys ；Xaal7 为 Gin、Asn、Arg、His、Glu、Asp 或 Lys ； Xaa 18 为 Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、lie、Val、Arg、Glu、Asp 或 Lys ；Xaal9 为 Ala、Gly、Ser、 Thr、Leu、Ile、Val、Met、Glu、Asp 或 Lys ；Xaa20 为 Lys、Arg、His、Gln、Trp、Tyr、Phe、Glu 或 Asp ；Xaa21 为 Glu、Leu、Ala、His、Phe、Tyr、Trp、Arg、Gin、Thr、Ser、Gly、Asp 或 Lys ；Xaa23 为 lie、Ala、Val、Leu 或 Glu ；Xaa24 为 Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、lie、Val、His、Glu、Asp 或Lys ；Xaa25 为 Trp> Phe> Tyr> Glu、Asp 或 Lys ；Xaa26 为 Leu> Gly、Ala、Ser> Thr> lie、Val> Glu、Asp 或 Lys ；Xaa27 为 Val、Leu、Gly、Ala、Ser、Thr、Ile、Arg、Glu、Asp 或 Lys ；Xaa28 为 Lys、Asn、Arg、His、Glu 或 Asp ；Xaa29 为 Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、lie、Val> Arg、Trp> Tyr> Phe>Pro>His>Glu>Asp 或 Lys ；Xaa30 为 Arg、His、Thr、Ser、Trp、Tyr、Phe、Glu、Asp 或 Lys ； Xaa31 为 Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、lie、Val、Arg、Trp> Tyr> Phe> His、Glu、Asp、Lys。GLP-I肽、变体或衍生物的另一个优选组示例于SEQ ID NO 3 :His-Xaa2-Xaa3_Gl y-Thr-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-XaaIO-Ser-Xaa12-Tyr-Xaa14-Glu-Xaa16~Xaa17-Xaa18~Xaa 19-Lys-Xaa21-Phe-Xaa23-Ala-Trp-Leu-Xaa27-Xaa28-Gly-Xaa30,其中Xaa2 为 Ala、Gly 或 Ser ；Xaa3 为 Glu 或 Asp ；Xaa6 为 Phe 或 Tyr ；Xaa7 为 Thr 或 Asn ；Xaa8 为 Ser、Thr 或 Ala ； Xaa9 为 Asp 或 Glu ；XaalO 为 Val、Leu、Met 或 Ile ；Xaal2 为 Ser 或 Lys ；Xaal4 为 Leu、Ala 或 Met ；Xaal6 为 Gly、Ala、Glu 或 Asp ；Xaal7 为 Gln 或 Glu ；Xaal8 为 Ala 或 Lys ；Xaal9 为 Ala、Val、lie、Leu 或 Met ；Xaa21 为 Glu 或 Leu ；Xaa23 为 lie、Ala、Val、Leu 或 Glu ；Xaa27 为 Val 或 Lys ；Xaa28 为 Lys 或 Asn ；Xaa30 为 Arg 或 Glu0一组醋酸艾塞那肽在SEQ ID NO :4中给出并具有化学式His Xaa2 Xaa3Gly Thr Phe Thr Xaa8 Asp XaalO Ser Lys Gln Xaa14 Glu Glu Glu AlaVal Arg Leu Xaa22 Xaa23 Glu Xaa25 Leu Lys Xaa28 Gly Gly Pro SerSer Gly Ala Pro Pro Pro_Z，其中 Xaa2 为 Ser、Gly 或 Thr ；Xaa3 为 Asp 或 Glu ；Xaa8 为 Ala、Ser 或 Thr ；XaalO 为 Leu、lie、Val、苯苷 氨酸或Met ；Xaal4为Ala、Leu、Ile、苯苷氨酸、Val ；Xaa22为Phe、Tyr或萘基丙氨酸；Xaa23 为lie、Val、Leu、苯苷氨酸、叔亮氨酸或Met ；Xaa25为Ala、Trp、Phe, Tyr或萘基丙氨酸； Xaa28 为 Ala 或 Asn ；Z 为-OH 或 NH2,如 US7223725 中所公开。这些肽可通过本领域公开和/或已知的方法制备。序列中的(以及本说明书中的， 除非在特定情况下下具体说明)Xaas包括特定的氨基酸残基、衍生物或其修饰的氨基酸。 由于二肽基肽酶IV(DPP-IV)这种酶可能会导致所观察到的所给药的GLP-I在体内迅速钝 化，优选采用避开DPP-IV活性的GLP-I肽、同源物、类似物和衍生物。 这些肽也可以包括被取代的或添加至其氨基酸序列中的修饰氨基酸、非天然存在 的氨基酸和特殊的氨基酸。下表列出了示例性的修饰氨基酸、非天然存在的氨基酸和特殊
的氨基酉2。
修饰(特殊)氨基酸符号
2-氨基己二酸Aad
3-氨基己二酸Baad
β-丙氨酸，β-氨基丙酸bAla
2-氨基丁酸Abu
4-氨基丁酸4Abu
6-氨基己酸Acp
2-氨基庚酸Ahe
2_氨基异丁酸Aib
3_氨基异丁酸BAib
2-氨基庚二酸Apm
2，4-二氨基丁酸Dbu
肽3抗体 Fc在本发明中，该构造的抗体Fc部分可以衍生自天然存在的完整的分离抗体、分离 的单克隆抗体或通过重组或化学方法或组合方法从头合成。通过蛋白水解裂解重链，可方 便地由完整抗体(优选地为人抗体或含有人恒定区的抗体)制备抗体Fc区。木瓜蛋白酶 (一种植物酶)在存在还原剂(如半胱氨酸)的情况下会裂解重链CHl域和CH2域之间 (His和Thr之间)的人IgGl分子，使苏氨酸成为N-端残基。当在存在半胱氨酸的情况下， 对被称为c7E3的抗体进行木瓜蛋白酶酶切时，组氨酸残基处于阿昔单抗的C-端位置。虽 然Fab域通常仍然会抵御木瓜蛋白酶的降解，但延长处理时间或过量木瓜蛋白酶通常会导 致Fc域过度酶切。因此，当希望恢复完整Fc区时，必须小心控制反应条件。Fc区保留了 结合蛋白质A的能力并且可以利用蛋白质A亲和色谱法进行纯化。共同拥有的专利申请 (W02007/024743)公开了糖基化的Abs的Fc区比去糖基化或非糖基化Abs更能抵御木瓜蛋 白酶的酶切作用。因此，如果要对Fc区去糖基化，则该步骤应在木瓜蛋白酶酶切之后进行。在另一个实施例中，Fc区可通过重组方法合成，并且可以代表任何人类/亚型或 所需另一物种。公众可从某些出版物(例如Kabat，et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Dept. Health (1983) (Kabat 等人，免疫学相关蛋白质序列， 美国卫生部，1983年))或在线获得人和动物免疫球蛋白的序列。以引用方式并入本文的 W02005005604总结了衍生自人类生殖信息的序列以及已知的可用治疗性人抗体序列及其 变体。具体引用了图32-40部分所示人免疫球蛋白类别IgAp IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgGS1, IgG24和IgM重链的序列和变体，并在W02005005604的SEQ ID NOS 32-40中进行 了叙述，该专利提供了合成人抗体Fc区的信息来源。
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抗体的Fc区或域使抗体具有被称为“效应子功能”的非抗原结合功能，例如补体 结合、抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)以及通过将该二聚体结构的亚区与免疫细胞 表面受体(Fe受体)结合来介导的其他功能。具有改变的效应子功能的Fc区多肽序列的 某些天然和合成变体包括亚型变体，例如，IgG1UgGZ1, IgGS1UgGZA以及突变型多肽，如在， 例如，美国专利 No. 5624821、6528624、6737356、7183387 和专利公布 W004099249A2 中所描 述。虽然在很大程度上，这些功能通过破坏靶(抗原展示)细胞促成了抗体中和能力， 但这些功能也取决于连接到CH2域内的Fc的多糖(参见，例如，Jefferis & Lund. 2002. Immunology Letters. 82 (1-2) :57_65，2002 (Jefferis 和 Lund,《免疫学快报》，2002 年，第 82卷第(1-2)期第57-65页)。因此，当Fc被脱去多糖时，将失去杀伤作用。当在细菌宿 主细胞内重组表达时，可以通过天然方式制备Fe，或者也可以在需要时利用糖苷酶以酶促 方式将其移除。当使用含有Xm-D-CH2_CH3的Fc时，X的天然氨基酸允许融合蛋白质具有交替的取 向和结合性质，从而提供了结构柔性。连接基连接基优选地由通过肽键连接到一起的氨基酸构成。因此，在优选实施例中，连接 基由肽键连接的1至20个氨基酸构成，其中氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。正如本 领域的技术人员所熟知的那样，其中一些氨基酸可以是糖基化的。在更优选的实施例中，这 1至20个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。甚至 更优选地，连接基大部分由无空间位阻的氨基酸(例如甘氨酸和丙氨酸)构成。因此，优选 的连接基为聚(Gly-Ser)、聚甘氨酸(尤其是(Gly)4, (Gly)5)、聚(Gly-Ala)和聚丙氨酸。 连接基的其他具体例子为=(Gly)3Lys (Gly) 4(SEQID NO 5), (Gly) 3AsnGlySer (Gly) 2 (SEQ ID NO :6)、(Gly)3Cys (Gly)4 (SEQ ID NO 7)以及 GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO :8)。就上述命名的含义而言，例如，(Gly)3Lys(Gly)4表示 Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly。Gly和Ala的组合也是优选的。此处所示连接基是示 例性的，本发明范围内的连接基可以长得多，并且可以包括其他残基。非肽连接基也是可能的。例如，可以采用烷基连接基，如-NH-(CH2)S-C(O)-,其中 s = 2-20。这些烷基连接基可以进一步被任何无空间位阻基团取代，例如被低级烷基(如 C1-C6)、低级酰基、卤素(如Cl、Br)、CN、NH2、苯基等取代。示例的非肽连接基为PEG连接 基，其具有100至5000kD、优选为100至500kD的分子量。可以改变肽连接基，以按照上述 相同方式形成衍生物。连接基优选地为聚合物。合适的聚合物包括，例如，聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯 烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺、 葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧乙烯多元醇、肝素、肝素片段、多 糖、纤维素和纤维素衍生物(包括甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、聚烷 撑二醇及其衍生物、聚烷撑二醇共聚物及其衍生物、聚乙烯基乙醚、以及α，β-聚[(2-羟 乙基)-DL-天冬酰胺等或其混合物。在本发明的一个方面，聚合物具有限定的化学组成和 分子量范围。在一个优选的实施例中，该聚合物为PEG。连接基可以由选自由下列物质组成的组的一个或多个部分构成1-20个氨基酸
13的肽、由1-50个乙烯氧基单元组成并任选地与末端氨基、羟基、巯基和/或羧基衍生化的聚 乙二醇；分子量300-40，000并任选地与末端氨基、羟基、巯基和/或羧基衍生化的多分散聚 乙二醇；任选地与末端羟基、氨基和/或羧基衍生化的C2_2(l烷基；以及任选地与末端羟基、 巯基、氨基和/或羧基衍生化的取代的C2_2(l烷基。包含上述合适的活性亲核物质的连接部 分在与GLP-I肽缀合之前，也可以连接到用生物方法在N-端生成的该构造的载体分子(如 抗体Fe)上。当出现在化学式I的缀合物中时，连接基(L)可以包括生物稳定或可生物降解的 聚合物链或单元。例如，当处于生理环境中时，根据键的活泼性，具有重复键的聚合物可以 具有不同程度的稳定性。通过按照已知的低分子量类似物的水解速率来计算其在生理环境 中的相对水解速率，可以将具有这种键的聚合物进行分类，例如，从较不稳定到较稳定依次 为聚碳酸酯(--O--C(O)--O--) >聚酯(--C(O)--O--) >聚氨酯(--NH--C(O)--O--) >聚 原酸酯(一0-C((0R) (R' ))-0-) >聚酰胺(一C(O)-NH--)。类似地，使水溶性聚合物 与靶分子相连接的键合系统可以是生物稳定或可生物降解的，例如，从较不稳定到较稳定 依次为碳酸酯(一O--C(O)--O--) >酯(一C(O)--O--) >氨基甲酸酯(一NH--C(O)--O--) >原酸酯(一0-C((0R) (R' ))-0-) >酰胺(一C(O)--NH--)。这些键以举例的方式列出， 并非旨在限制本发明的可溶聚合物的聚合物链或连接基中可用的键的类型。制备缀合物的方法虽然本发明的组合物可以通过本领域已知的或有待发现的任何方法进行制备，但 本文提供了 一些尤其适合生成这些组合物的方法。Fc蛋白质的制备和綴合准备通过生物方法生成的多聚载体分子(例如，包含至少一部分被称为铰链的含半胱 氨酸区的抗体Fe)是由以多聚(二聚)形式分泌的重组表达蛋白质产物制备的。当采用哺 乳类宿主细胞表达蛋白质时，最终产物可以被糖基化。当采用原核宿主细胞(如大肠杆菌) 表达蛋白质时，正常情况下不进行糖基化。如果蛋白质含有N连接或0连接的糖基，该碳水化合物易于被用来影响N-端乙二 醛基的形成的氧化剂氧化，从而生成另外的羰基活性种。在化学键合之前，使用N-糖酰胺 酶(PNGase)，然后再通过疏水作用HPLC进行纯化，可以移除碳水化合物。在Fc域的至少一个重链的N-端的第一肽键之前的残基内形成活性(亲电)羰基， 从而为缀合反应制备了 Fc域的N-端残基。作为适合制备本发明构造所用的方法的亲电部 分所包括的活性羰基构型包括醛和酮。当形成酮时，端基选自由1-6个碳构成的直链或支 链低级烷基、由1-6碳构成的取代的直链或支链低级烷基、芳基或取代的芳基。抗体Fc可以天然包含丝氨酸或苏氨酸，或者可以通过本领域熟知的方法进行工 程化，或者通过化学方法改变将丝氨酸或苏氨酸展示于N-端。在本发明的方法的其中一个方面，抗体Fc为具有N-端Thr的人IgGl-Fc，其中 N-端Thr是用木瓜蛋白酶裂解任何全长人IgGl抗体的产物。由植物衍生酶木瓜蛋白酶 (E.C.4. 3. 22. 2)将(N-端至)铰链区(连接形成Fc区并且位于His和Thr之间的两条 或更多条链)以上的抗体的重链裂解，从而让Thr成为N-端残基。在本发明的另一方面， 该蛋白酶选自由下列蛋白酶组成的组纤溶酶、胃蛋白酶、包括MMP-7的基质金属蛋白酶、 中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)、基质裂解素(MMP-3)、巨噬细胞弹性蛋白酶(MMP-12)、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶以及其他植物酶，例如无花果蛋白酶(EC. 3. 4. 22. 3)和菠萝蛋白酶 (E. C. 3. 4. 4. 24)。当采用其他蛋白分解酶时，优选地选择一种在铰链域以上裂解的酶，如纤 溶酶、HNE或木瓜蛋白酶。在一个方面，通过用高碘酸对抗体Fc的N-端氨基酸有选择地进行化学氧化，可以 制备N-端水合乙醛酸(方案I)，从而制备GLP-I肽半合成免疫球蛋白Fc融合蛋白质。在 正常条件下水合乙醛酸不会与氨基发生反应。然而，它却会与胼、羰腙和肟快速而有选择地 发生反应，生成席夫碱(即-C = N-)。该基团对于水解中等稳定，可以释放肽，并可通过用 NaBH3CN之类的试剂温和还原而达到完全稳定。方案I.具有N-端苏氨酸的Fc的氧化和缀合。 因此，在用生物方法产生的成熟多肽的N-端残基为丝氨酸或苏氨酸的具体实施 例中，尤其有效的方法是通过选择性地与高碘酸发生化学氧化反应来制备N-端水合乙 酸酸(Geoghegan and Stroh. 1992 Bioconjugate Chem3 138-146 (Geoghegan 禾口 Stroh, 1992 年，《生物共轭化学》，第 3 卷第 138-146 页)和 US5362852 ；Garnter, et al. 1996. Bioconjugate Chem. 7 38-44 (Garnter 等人，1996 年，《生物共轭化学》，第 7 卷第 38-44 页) 以及WO 98/05363 (1998年2月12日))。2-氨基乙醇结构-CH(NH2)CH(OH)-存在于蛋白 质和肽的N-端Ser或Thr中以及羟赖氨酸中。其在pH 7环境下被高碘酸迅速氧化，从而 在N-端产生醛。因此，根据以下方案II，用于制备定点连接所需活性羰基的高碘酸方法对 于N-端位置将是唯一的。
只有包含N-端苏氨酸或丝氨酸的蛋白质可以与高碘酸反应以生成N-端水合乙醛酸衍生物，然而，已经报道了利用芴甲氧羰基保护的α，α ’-二氨基乙酸衍 生物(Fmoc-NH2CHCO2H)合成乙醛酰肽的方法(Far and Melnyk. 2005. J Peptide Sci 11 (7) 424-430 (Far和Melnyk, 2005年，《肽科学杂志》，第11卷第7期第424-430页))。蛋白 质的N-端甘氨酰残基可以通过转氨作用转化为醛，例如使用乙醛酸在相对温和的条件下 进 亍(Dixon, H. B. F. and Fields, R. 1979. Methods Enzymol. 25 409-419 (Dixon, H. B. F.禾口 Fields,R.，1979年，《酶学方法》，第25卷第409-419页))。另一种添加氨基酸残基的方法 是利用蛋白分解酶(例如胰蛋白酶、羧肽酶Y)通过逆蛋白水解进行，如Rose所描述的方法 (Rose, et al. 1983. Biochem J. 211 :671_676 (Rose 等人，1983 年，《生物化学杂志》，第 211 卷第 671-676 页))。在存在还原剂的情况下，醛或酮的羰基在含水条件下可以与氨基反应生成酰胺。 醛或酮在温和条件下与亲核基团(例如胼、酰胼和0-烷基羟胺)快速而有选择地发生反 应，生成席夫碱(即-C = N")、甲亚胺、腙和肟，通过用诸如NaBH3CN之类试剂还原可以使这 些物质完全稳定。产生乙醛酰-Fe、醛-Fc或酮基-Fc之后，可以让它们与待缀合的其他分子上的亲 核部分发生反应，这些亲核部分选自由下列基团组成的组氨基氧基、胼、酰胼或氨基脲基 团(Fields and Dixon, (1968)，Biochem. J. 108 :883_887 (Fields 和 Dixon, 1968 年，《生物 化学杂志》，第 108 卷第 883-887 页)；Gaertner et al.，(1992)，Bioconjugate Chem. 3 262-268 (Gaertner等人，1992年，《生物共轭化学》，第3卷第262-268页)；Geoghegan and Stroh, (1992)，Bioconjugate Chem. 3 138-146 (Geoghegan 禾口 Stroh，1992 年，《生 物共轭化学》，第 3 卷第 138-146 页)；Gaertner et al.，(1994)，J. Biol. Chem. 269 7224-7230 (Gaertner等人，1994年，《生物化学杂志》，第269卷第7224-7230页))。术语 “胼”包括二嗪的烃基衍生物(H2NNH2)15当一个或多个取代基为酰基时，该化合物为酰胼。 N-亚烷基衍生物为具有R2C = NNR2结构的腙。腙通常通过用=NNH2 (或取代类似物)取 代=0衍生自醛或酮。乙醛酰基团与胼反应会形成腙。因此，在本发明中，乙醛酰-Fc(HCO-CO-Fc)、酮基-Fc或简单醛-Fc(HCO-Fc)可以 与具有胼或酰胼官能团的活化的GLP-I肽反应，以在Fc结构的一个或两个N-端形成腙，并 且按照下列方案(III)可以将所形成的腙进一步还原为胼化合物 与醛(包括但不限于乙醛酰)或酮的第二类反应被称为维蒂希反应。维蒂希 反应是醛或酮与三苯基膦叶立德(通常称为维蒂希试剂)或三正丁基膦反应生成烯烃 和三烷基氧膦的化学反应(Wittig，G. ；Schollkopf,U. Ber. 1954，87，1318 (Wittig，G.、 Schol lkopf, U. Ber.，1954 年，第 87 卷第 1318 页)；ffittig, G. ；Haag, W. Ber. 1955，88， 1654 (ffittig, G.、Haag, W. Ber.，1955 年，第 88 卷第 1654 页))。应当理解的是，当采用重组或天然分离的多聚蛋白质(例如Fe)时，缀合物将提供 结构的选择，对于生物活性肽而言，该结构是多价的，并且对于连接到蛋白质多个N-端的 肽而言，该结构可以为杂聚肽。在抗体Fc被用作载体分子的实例中，生物活性肽可以连接 到Fc 二聚体的两个N-端残基上。在另一个实施例中，只有一个生物活性肽连接到抗体Fc 的其中一个N-端上。在另一个实施例中，两个不同的生物活性肽连接到抗体Fc的N-端， 形成可以具有“双重生物活性”的“双特异”缀合物。在通过N-端连接肽的实施例中，可以用标准固相化学法合成肽。在将肽装配到树 脂上并移除N-端保护基团之后，将受到适当保护的双官能连接基连接到脱保护的N-端氨基。在N-端连接肽的另一个实施例中，与树脂的最终连接可以掺入能够选择性地与 醛基或酮基反应的连接基，将连接基-肽从树脂上裂解并移除残留保护基团将为缀合提供 适当的肽组合物。作为另外一种选择，在与肽连接之后，可以进一步衍生化连接基剩余的官 能团，以产生将与醛基或酮基反应的官能团。利用采用液相化学法的类似策略可以生成类 似的肽组合物。在希望通过C-端连接肽的实施例中，可以通过固相化学法合成肽，并通过胼或胼 衍生物从树脂上裂解肽，然后再移除保护基团以生成适当官能化的肽。当连接基将在C-端 缀合时，可以将连接基直接连接到树脂，然后再装配肽。可以用胼或胼衍生物将肽-连接基 从树脂上裂解，然后再移除保护基团，以生成适当官能化的肽-连接基。作为另外一种选 择，可以在树脂(例如，Universal PEG NovaTag树脂(Novabiochem))上制备肽。接着可 以移除Universal PEG Novatag树脂上的Mmt基团，得到游离的氨基。该氨基可以被衍生 化，以生成将与醛基或酮基反应的官能团。作为另外一种选择，将受到适当保护的双官能连 接基连接到氨基。利用采用液相化学法的类似策略可以生成类似的肽组合物。
GLP-I肽和肽连接基构造的制备该组合物的GLP-I肽可以通过合成化学法或重组法或这两种方法的组合制备。 GLP-I肽可以制备成全长聚合物或合成为非全长片段再进行连接。肽的化学合成是本领域 的技术人员熟知的用于固相或液相肽合成的常规方法。对于固相肽合成而言，所谓的聚酰 胺或聚苯乙烯树脂上的t-Boc (叔丁氧羰基)和Fmoc (芴甲氧羰基)化学法(参见N-端保 护基团)已经成为常规方法(分别由Merrifield，RB.在1963年和Sheppard, RC.在1971 年提出)。与核糖体蛋白合成不同，固相肽合成是从C-端向N-端进行。氨基酸单体的N-端 被这两个基团保护并添加到脱保护氨基酸链上。对于t-Boc而言，脱保护需要诸如三氟乙 酸之类的强酸；对于Fmoc而言，则需要诸如哌啶之类的碱。依次逐步连接氨基酸的逐步延 伸法对于包含2个和100个氨基酸残基之间的小肽而言是理想的。将非天然存在的残基掺入到GLP-I肽或蛋白质中。可根据本发明使用并仍然可 以形成肽的主链的非核糖体装配氨基酸的例子包括但不限于D_氨基酸、β-氨基酸、伪谷 氨酸盐、Y-氨基丁酸、鸟氨酸、高半胱氨酸、N-取代氨基酸(R. Simon et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. (1992) 89 :9367_71 (R. Simon 等人，《美国国家科学院院刊》，1992 年，第 89 卷第 9367-9371 页)；WO 9119735 (Bartlett 等人)、美国专利 No. 5，646，285 (Baindur))、 α -氨基亚甲氧基乙酸(氨基酸-Gly 二肽电子等排物)、以及α -氨基氧基酸和具有非基 因编码的侧链官能团的其他氨基酸衍生物等。也可以采用含有下列基团的肽类似物硫代 酰胺、插烯酰胺、胼基、亚甲氧基、硫亚甲基、磷酰胺、羟基酰胺、羟基乙烯、还原的酰胺以及 取代的还原酰胺电子等排物和磺酰胺。在另一种方法中，已经通过密码子抑制法将非天然氨基酸引入重组生成的蛋白质 中。在一个方面，密码子抑制技术的使用适于在要缀合的多肽链内任何合适的位置引入醛 或酮官能团或任何其他官能团(参见例如AmbrxW02006/132969)。作为另外一种选择，重组表达方法尤其有用。利用宿主细胞(一种人工改造的细 胞，其包含编码肽序列的核酸，并且可以将核酸转录、翻译以及任选地将肽分泌到细胞生长 培养基中)表达重组蛋白质是本领域的常规方法。对于重组生产方法而言，通常用常规方 法合成编码肽的氨基酸序列的核酸，然后将其整合进表达载体。对于制备包含与其他多 肽序列或其他蛋白质或蛋白质片段或域融合的肽的多肽组合物而言，这类方法是尤其优选 的。宿主细胞可以任选地选自下列细胞的至少一种大肠杆菌(E. Coli)、C0S-1、C0S-7、 HEK293、BHK21、CHO、BSC-U Hep G2，653、SP2/0，293、HeLa、骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆虫或 植物细胞，或它们的任何衍生细胞、永生细胞或转化细胞。还提供了生产至少一种肽的方 法，其包括在体外、体内或原位条件下翻译编码肽的核酸，使得肽以可检测或可回收的量表 达。这类技术为本领域所熟知，参见，例如，Ausubel，et al.，ed.，Current Protocolsin Molecular Biology, John Wiley & Sons，Inc.，NY，NY(1987-2001) (Ausubel 等人编著，《现 代分子生物学实验技术》，John Wiley & Sons，Inc. (NY)，NY，1987-2001 年)；Sambrook， et al. , Molecular Cloning :Α Laboratory Manual,2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989) (Sambrook 等人，《分子克隆实验指南(第二版)》，Cold SpringHarbor, NY, 1989 年)。綴合物的制备一旦包含N-端醛或酮的Fc多肽已分离，将包含合适亲核基团的GLP-I分子与Fc区在含水条件下反应，并分离缀合物。因此，GLP-I分子可以包含如本文所定义的连接基L。 作为另外一种选择，在化学式I中充当连接基L的部分可以包含能够与醛或酮在含水条件 下反应的亲核物质并且充当连接基L的部分可以缀合到Fc区，随后可以用本领域已知的任 何合适方法将该缀合物连接到GLP-I分子上。在本发明方法的一个实施例中，本发明所期望的蛋白质或肽的缀合的一般过程包 括以下步骤(1)将第一活性基团掺入到GLP-I部分上，(2)将GLP-I部分与聚合物进行反 应，该聚合物与GLP-I部分上的第一活性组分形成共价键，(3)将聚合物与氧化的抗体Fc 反应形成共价连接的GLP-I-Fc缀合物，以及(4)纯化GLP-I-Fc缀合物。其中就GLP-I肽 而言，GLP-I部分上结合的第一活性基团可以是肽残基内存在的活性基团，例如游离羧基、 N-端的游离α -氨基或肽链中残基的活性侧基。可以通过本领域提出的任何方法将连接基连接到预先合成的本发明全长GLP-I 肽上。可以在固相合成过程中在从树脂上裂解以获得胼衍生化肽之前用三-Boc-胼基乙酸 在最终的残基处便利地完成GLP-I肽缀合到Fc域上的活化，或者作为另一种选择，可以如 上文所述将GLP-I肽缀合到连接基上，该连接基将包含能够与Fc的活性羰基反应的官能团。定点或选择性连接PEG的若干方法已有所描述。例如，WO 99/45026提出的方法是 对N-端丝氨酸残基进行化学修饰，形成适合与末端具有酰胼或氨基脲官能团的聚合物反 应的醛官能团。美国专利No. 5，824，784和5，985，265提出的方法是使具有羰基的聚合物 与蛋白质的氨基端在还原烷化反应条件和可促进选择性攻击N-端的pH条件下进行反应。 WO 99/03887和美国专利No. 5，206, 344和5，766，897涉及经工程化掺入到蛋白质的氨基酸 序列的半胱氨酸残基(添加半胱氨酸的变体)的定点聚乙二醇化。这些方法比非特异性连 接有优势，因为可以通过有策略地将聚合物连接到与肽的官能团部分远离的残基上来保护 GLP-I肽的域和结构。作为另外一种选择，通过重组或化学合成方法制备肽后，可以将活性 基团引入到肽上，优选地引入到可以保持肽的生物活性的位点。“活性基团”或“官能团”是可以在适当条件下与第二化学官能团反应，使得在展示 第一官能团的化学物种与展示第二官能团的化学物种之间形成共价键的原子排列方式。例 如，可与胺(-NR2)反应的活化基团包括亲电子基团，例如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、卤素(氯、 溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等。可以与硫醇反应的活化基团包括，例如，马来 酰亚胺、碘代乙酰基、丙烯酰基(acrylolyl)、吡啶基二硫化物、5-硫醇-2-硝基苯甲酸硫 醇(TNB-硫醇)等。醛官能团可以与含胺或酰胼的分子偶联，并且叠氮基可以与三价含磷 基团反应以形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺键。将活化基团引入分子的合适方法是本领域已知 的(参见例如 Hermanson, G. T. , Bioconjugate Techniques, Academic Press :San Diego, CA (1996) (Hermanson, G. T.，《生物交联技术》，Academic Press :San Diego (CA)，1996年))。化学活性官能团选自由伯胺或仲胺、羟基、硫醇、羧基、醛和酮组成的组。检测组合物的方法本发明的缀合物保留或显示所需的生物活性，该生物活性可以通过本领域技术人 员已知的任何体外、体内或任何替代标记或适当的响应来检测、分析或测量。例如，典型的 所需生物活性为蛋白质-蛋白质相互作用，如配体结合或靶结合，可以简单地通过固相捕 获试验(如ELISA)对其进行测量。在其他情况下，可以测量由于缀合物与靶蛋白或细胞的接触而引起的生物活性，例如通过测量受体活化来测量生物活性，可以通过其对细胞内过 程(如Ca2+释放或细胞内cAMP浓度)的作用来定量受体活化。在更复杂的缀合物检测方 法中，可以观察到对细胞、器官或动物的下游效应。在本发明的半合成GLP-I类似缀合物的情况中，所有与天然或“野生型”GLP-I有 关的作用都可用于确定缀合物的生物活性。此类测量包括用细胞内cAMP表示的GLP-I受 体结合、GLP-I受体活化，测量给药缀合物后，例如，分离的胰岛或整个胰腺中或在动物血清 中测得的胰岛素分泌量或变化量。GLP-I受体为G蛋白质偶联受体(GPCR)，它与其他“家 族B”受体(如胰泌素、胰高血糖素和血管活性肠肽的受体)具有序列同一性。检测GLP-I 生物活性的另一种方法是Liu et al. 2004. Cell Biol. Internat. 28 :69_73 (Liu 等人，2004 年，《国际细胞生物学》，第28卷第69-73页)中提出的胰管细胞分化检测分析法。药物制备和制品在另一方面，本发明涉及通过共价连接有机部分进行修饰的、如本文所述的半合 成GLP-I Fc融合构造。此类修饰可以产生具有改善的药动学性质(如延长的体内血清半 衰期)的GLP-I蛋白质。有机部分可以是线性或支化的亲水聚合基团、脂肪酸基团或脂肪 酸酯基团。在具体实施例中，亲水聚合基团可以具有约800至约120，000道尔顿的分子量， 并且可以是聚链烷二醇(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、碳水化合物聚合物、氨基 酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，并且脂肪酸或脂肪酸酯基团可包含约8至约40个碳原子。本发明的修饰模拟体和配体结合片段可以包含一个或多个有机部分，其可以直接 或间接共价结合到GLP-I模拟体或指定部分或变体上。与本发明的GLP-I模拟体或配体结 合片段结合的每个有机部分可以独立地是亲水聚合基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。如 本文所用，术语“脂肪酸”包括单羧酸和二羧酸。“亲水聚合基团”，该术语在本文中使用时 是指在水中比在辛烷中更易溶的有机聚合物。例如，聚赖氨酸在水中比在辛烷中更易溶。 因此，通过聚赖氨酸的共价结合来修饰的GLP-I模拟体包括在本发明范围内。适用于修饰 本发明模拟体的亲水聚合物可以是直链或支链的，并且包括，例如，聚链烷二醇(例如PEG、 单甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PPG等)、碳水化合物(例如葡聚糖、纤维素、寡糖、多糖等)、 亲水性氨基酸聚合物(例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚环氧链烷(例如，聚环 氧乙烷、聚环氧丙烷等)和聚乙烯吡咯烷酮。优选地，修饰本发明GLP-I模拟体的亲水聚合 物作为单独的分子实体具有约800至约150，000道尔顿的分子量。例如，可以使用PEG25QQ、 PEG500O、PEG7500、PEG900O、PEG1Oooo、PEG125OO、
PEG15000和PEG2tl,,,其中下标为以道尔顿为单位的聚
合物的平均分子量。亲水聚合基团可以由1至约6个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基团取代。由脂肪酸或脂 肪酸酯基团取代的亲水聚合物可以通过采用合适的方法制备。例如，包含胺基的聚合物可 以与脂肪酸或脂肪酸酯的羧基偶联，并且脂肪酸或脂肪酸酯上的活化羧基(例如用N，N-羰 基二咪唑活化)可以与聚合物上的羟基偶联。适用于修饰本发明模拟体的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的或可包含一个或多 个不饱和单位。适用于修饰本发明模拟体的脂肪酸包括，例如，正十二烷酸(C12，月桂酸)、 正十四烷酸(C14，肉豆蔻酸)、正十八烷酸(c18，硬脂酸)、正二十烷酸(C2tl，花生酸)、正 二十二烷酸(C22，山嵛酸)、正三十烷酸(C3tl)、正四十烷酸(C4tl)、顺式-Δ 9-十八烷酸(C18, 油酸)、全顺式-Δ 5，8，11，14- 二十碳四烯酸(C2tl，花生四烯酸)、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等。合适的脂肪酸酯包括包含直链或支链的低级烷基的二羧酸单酯。 低级烷基可包含1至约12个，优选1至约6个碳原子。本发明的GLP-I蛋白质组合物还可包含任何合适辅助剂中的至少一种，例如但不 限于稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等。可药用辅助剂是优 选的。此类无菌溶液的非限制性例子和制备方法是本领域熟知的，例如但不限于Kermaro， Ed. ,Remington'sPharmaceutical Sciences, 18th Edition,Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990 (Gennaro 编辑，《雷明顿氏制药科学(第 18 版)》，MackPublishing Co. (Easton, PA)，1990年)。如本领域熟知的或如本文所述的，可以常规选择适用于GLP-I模拟体组合 物的给药方式、溶解性和/或稳定性的可药用载体。在本组合物中有用的药学赋形剂和添加剂包括但不限于蛋白质、肽、氨基酸、脂 质和碳水化合物(例如糖，包括单糖、二、三、四和寡糖；衍生糖，例如糖醇、糖醛酸、酯化糖 等；和多糖或糖聚合物)，它可以单独或组合存在，单独或组合地构成1-99. 99重量％或 体积％。示例性蛋白质赋形剂包括血清清蛋白，例如人血清清蛋白(HSA)、重组人清蛋白 (rHA)、明胶、酪蛋白等。也可以在缓冲能力方面起作用的代表性氨基酸/GLP-I模拟体或指 定部分或变体组分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨 酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。一种优选的氨基 酸是甘氨酸。适合在本发明中使用的碳水化合物赋形剂包括，例如，单糖，例如果糖、麦芽糖、半 乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如 棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；和糖醇，例如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳 糖醇、木糖醇山梨糖醇(山梨醇)、肌醇等。用于在本发明中使用的优选碳水化合物赋形剂 是甘露糖醇、海藻糖和棉子糖。GLP-I模拟体组合物还可包括缓冲剂或pH调节剂；通常，缓冲剂是由有机酸或碱 制备的盐。代表性缓冲剂包括有机酸盐，例如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀 酸、乙酸或邻苯二甲酸的盐；Tris，盐酸三羟甲基氨基甲烷或磷酸盐缓冲剂。用于本发明组 合物的优选缓冲剂是有机酸盐，例如柠檬酸盐。此外，本发明的GLP-I模拟体或指定部分或变体组合物可以包括聚合赋形剂/添 加剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖(聚合糖)、葡萄糖结合剂(例如环糊精，例如2-羟丙 基_ β _环糊精)、聚乙二醇、调味剂、抗微生物剂、增甜剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂 (例如聚山梨醇酯，例如“TWEEN 20”和“TWEEN 80”)、脂质(例如磷脂、脂肪酸)、类固醇 (例如胆固醇)和螯合剂(例如EDTA)。适合在根据本发明的GLP-I模拟体组合物中使用的这些和另外已知的药学赋形 剂和/或添加剂是本领域已知的，例如，如在下列文献中列出的“Remington =The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed. ,Williams & Williams, (1995)(《雷明顿制药科学与 实践(第 19 版)》，Williams & Williams，1995 年)以及“Physician，s Desk Reference", 52nd ed. ,Medical Economics,Montvale,NJ(1998)(《临床医生手册(第 52 版)》，Medical Economics (Montvale, NJ)，1998年)，所述参考文献的公开内容以引用方式全文并入本文 中。优选的载体或赋形剂材料是碳水化合物(例如糖和糖醇)和缓冲剂(例如柠檬酸盐) 或聚合剂。
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如上文所述，本发明提供了稳定制剂，其可以优选地包含具有盐水或选定盐的 合适缓冲液，以及任选的包含防腐剂的防腐溶液和防腐制剂，以及适合药用或兽用的多 用途防腐制剂，其中药用制剂中包含至少一种GLP-I模拟体或指定部分或变体。防腐制 剂包含至少一种已知的防腐剂或任选地选自由至少一种下列物质组成的组溶于含水稀 释剂的酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苄醇、亚硝酸苯汞、苯氧基乙醇、甲醛、氯代丁 醇、氯化镁(如六水合物)、烷基苯甲酸酯(甲基、乙基、丙基、丁基等)、烷基苄基二甲基 氯化铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和乙基汞硫代水杨酸钠或它们的混合物。可以使用本领 域已知的任何合适的浓度或混合物，例如0. 001-5 %或其中的任何范围或值，例如但不限 于0. 001、0· 003、0· 005、0· 009、0· 0U0. 02,0. 03,0. 05,0. 09,0. U0. 2、0· 3、0· 4、0· 5、0· 6、 0. 7、0· 8、0. 9、1. 0、1. Ul. 2、1· 3、1· 4、1· 5、1. 6、1. 7、1. 8、1. 9、2· 0、2. 1、2· 2、2· 3、2· 4、2· 5、 2. 6、2· 7、2· 8、2· 9、3· 0、3· 1、3· 2、3· 3、3· 4、3· 5、3· 6、3· 7、3· 8、3· 9、4· 0、4· 3、4· 5、4· 6、4· 7、 4. 8、4. 9，或其中的任何范围或值。非限制性例子不含防腐剂，包含0.1-2%的间甲酚(如 0. 2、0· 3、0· 4、0· 5、0· 9、1· 0% )、0· 1-3% 的苄醇(如 0·5、0·9、1· 1、1. 5、1· 9、2· 0、2· 5 % )、 0. 001-0. 5% 的乙基汞硫代水杨酸钠(如 0. 005,0. 01)、0. 001-2. 0% 的酚(如 0. 05,0. 25、 0. 28,0. 5,0. 9,1. 0% )、0· 0005-1. 0% 的烷基苯甲酸酯(如 0. 00075,0. 0009,0. 001,0. 002、 0. 005,0. 0075,0. 009,0. 01,0. 02,0. 05,0. 075,0. 09,0. 1,0. 2,0. 3,0. 5,0. 75,0. 9,1. 0 % )寸。可以任选地添加一种或多种药用抗菌剂。间甲酚或酚是优选的药用抗菌剂。可以 通过添加一种或多种可药用的盐调节离子强度或张力。可以通过添加一种或多种赋形剂进 一步调节制剂的等张性。甘油是可调节等张性的赋形剂的例子。适用于给人或其他动物给 药的药用装置不含有毒元素或有害污染物，而且不会影响其中的活性化合物的活性。本发明的GLP-I融合蛋白质的药用盐形式可以在本发明中使用。常用于形成酸加 成盐的酸为无机酸(如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等)、有机酸(如对甲苯璜酸、甲磺 酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸等)。优选的酸加成盐为由矿物 酸(如盐酸或氢溴酸)形成的盐。碱加成盐包括衍生自无机碱的盐，如铵或者碱金属或碱 土金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等。可用于制备本发明盐的此类碱包括氢氧化钠、氢氧 化钾、氢氧化铵、碳酸钾等。药用用途和给药方法普通医生可以通过任何已知的有效途径进行给药。外周肠胃外给药是其中一种方 法。在医药文献中，通常将肠胃外给药理解为用无菌注射器或某些其他医疗设备(如输液 泵)将药剂注射到体内。外周肠胃外给药途径可以包括静脉、肌内、皮下和腹膜内给药途径。本发明的异源融合蛋白质还适合于通过属于非肠胃外途径的口腔、直肠、鼻腔或 下呼吸道途径进行给药。在这些非肠胃外途径中，优选的是下呼吸道途径和口腔途径。可以用本发明的融合蛋白质治疗多种疾病和病症。本发明的融合蛋白质主要通过 对称为“GLP-1受体”的受体起作用来发挥其生物作用。因此可以用本发明的GLP-I融合 蛋白质治疗可对GLP-I受体刺激或给药GLP-I化合物积极响应的患有疾病和/或病症的 受试者。这些受试者被认为“需要用GLP-I化合物进行治疗”或“需要GLP-I受体刺激”。 包括患有非胰岛素依赖性糖尿病、胰岛素依赖性糖尿病、中风(参见WO 00/16797)、心肌梗塞(参见WO 98/08531)、肥胖症(参见WO 98/19698)、术后分解代谢变化(参见美国专利 No. 6，006, 753)、功能性消化不良和过敏性肠综合征(参见WO 99/64060)的受试者。还包 括需要用GLP-I化合物进行预防性治疗的受试者，如具有发展为非胰岛素依赖性糖尿病的 风险的受试者(参见W000/07617)。患有葡萄糖耐受性异常或空腹血糖耐受性异常的受试 者、就受试者的身高和体格而言其体重超出正常体重约25%的受试者、部分胰切除的受试 者、其父母中的一人或多人具有非胰岛素依赖性糖尿病的受试者、得过妊娠糖尿病的受试 者以及得过急性或慢性胰腺炎的受试者有发展为非胰岛素依赖性糖尿病的风险。“有效量”的GLP-I化合物是当给需要GLP-I受体刺激的受试者给药时可产生所需 的治疗和/或预防效果而不会引起有害的副作用的量。“所需治疗效果”包括以下一者或多 者1)与疾病或病症有关的症状有所改善；2)与疾病或病症有关的症状延迟发作；3)与未 经治疗的患者相比寿命有所延长；以及4)与未经治疗的患者相比生活质量提高。例如，治 疗糖尿病的“有效量”的GLP-I化合物为与不治疗相比可更好地控制血糖浓度，从而延迟糖 尿病并发症(如视网膜病、神经病或肾病)的发作的量。预防糖尿病的“有效量”的GLP-I 化合物为与不治疗相比可延迟血糖水平升高的发作的量，血糖水平升高需要用抗高血糖药 物(如磺酰脲、噻唑烷二酮、胰岛素和/或双胍)进行治疗。可有效地使患者血糖恢复正常的融合蛋白质的剂量将取决于多种因素，其中包括 但不限于受试者的性别、体重和年龄、不能调节血糖的严重程度、给药路径和生物利用率、 融合蛋白质的药动学性质、药效和剂型。已对本发明进行了一般性的描述，以下实例将进一步公开本发明的实施方案。实例1 制备活化的GLP-I肽实例IA(His-「D_Ala]-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Yal-Lys-Gly-ArR-Gly-(N~3~ 氨丙 基)-PEG3-NH-C0-CH。-NH-NHJ。如前文所述(Siegel，etal. 1999 Regulatory Peptides 79 :93_102 (Siegel 等 人，1999年，《调节性多肽》，第79卷第93-102页))合成并活化在第二残基含有D-丙氨酸 取代基的GLP-I (7-36，NH2)肽类似物(肽1)。在采用2. 0版SynthAssist的ABI 433A肽合成仪上制备肽，通过Fastmoc 0. 25 mM Monitoring Previous Peakif Fmoc/HBTU Ufitf。 i^M Universal PEG NovaTag 树月旨(549mg，252mmol)进行合成。Fmoc-Phe-Thr (YMe，MePro)-OH用于序列中的第六和第七 氨基酸位。Fmoc-Ser (But)-Ser (YMe，MePro)-OH用于序列中的第i^一和第十二氨基酸位。 树脂的最终重量为1. ISgo 将树脂用乙醇洗涤3次，每次2分钟，然后用二氯甲烷洗涤3次，每次2分钟。为了 移除Mmt侧基，将HOBt-水合物(9. 186g，0. 6M)溶解于IOOmL 二氯甲烷/2，2，2-三氟乙醇， 并将25mL所得溶液加入树脂中，轻轻混和1小时。滤除溶剂，重复上述步骤三次。用二氯甲 烷将树脂洗涤3次，每次2分钟，然后用二氯甲烷的N-甲基吡咯烷酮溶液洗涤1次，2分钟， 再用N-甲基吡咯烷酮洗涤3次，每次2分钟。在树脂中加入三-Boc-胼基乙酸(911. Omg， 2. 33mM) ,HBTU (884. 3mg，2. 38mM)、H0Bt/N_ 甲基吡咯烷酮(2. 33mL, 1M)和 2. 3mL N-甲基吡 咯烷酮，充分混和，直到所有组分都溶解，加入4-甲基吗啉(0. 769mL，3mM)，用润湿试纸条
23检测PH值(pH8. 5)，然后在环境温度下搅拌19小时。依次用N-甲基吡咯烷酮洗树脂3次，每次2分钟；用二氯甲烷/N-甲基吡咯烷酮 洗涤1次，2分钟；用二氯甲烷洗涤3次，每次2分钟；用甲醇洗涤3次，每次2分钟；用乙醚 洗涤1次，2分钟，然后减压干燥2小时。树脂重量为1. 14g。在环境温度下，将三氟乙酸(30mL)、酚(2. 25g)、二硫苏糖醇(1.5g)、苯甲硫醚 (1. 5mL)、三异丙基硅烷(1. 5mL)和水(1. 5mL)的20mL裂解混合物在闪烁管内搅拌2小时， 从树脂(0.371g)上裂解肽。滤除树脂，并添加预冷的乙醚(600mL)以沉淀肽。过滤分离得 到的固体用乙醚洗涤。减压干燥粗肽得到535mg。将粗肽上样到两根Vydac C-18柱(10mm，2. 5X 25cm)上，先用0-40%的梯度 (80 %乙腈/0. 1 %三氟乙酸水溶液)以6mL/min的流速洗脱5分钟，再用40-60 %的梯 度(80%乙腈/0. 三氟乙酸水溶液)以6mL/min的流速洗脱60分钟。收集馏分并用 HPLC进行分析，合并纯的馏分并冷冻干燥，得到54. Omg白色产物。毛细管电泳显示峰面 积大于93%。(理论分子量3，630. 1 ；单同位素分子量3，627. 9)实际分子量LC-MS 3，630. 8Da[M+H]+SELDI-MS :3，627. 5Da[M+H] +3, 724/8Da[M+97]+。实例IB(His-「D-Alal-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Yal-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly -Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-NH-CH2-CH2-(0-C H2-CHJ^-C0-Gly-NH~NH2)。使用上述含2D-丙氨酸的GLP-I (7-36, NH2)肽类似物制备替代性活化试剂(肽 2)。在采用2. 0版SynthAssist的ABI 433A肽合成仪上制备肽，通过Fastmoc 0. ImM Monitoring Previous Peak 软件进行 Fmoc/HBTU 化学分析。使用 Fmoc-Gly-SASRIN 树脂 (139mg, IlOmmol)进行合成。Fmoc-Phe-Thr (YMe，MePro)-0H用于序列中的第六和第七氨基 酸位。Fmoc-Ser (But)-Ser (YMe，MePro)-OH用于序列中的第^^一和第十二氨基酸位。对于连接部分，序列中的第三十二氨基酸位使用0-(N-Fmoc-2-氨基乙 基)-0’ -(2-羧乙基)_十一乙二醇。用乙醇洗涤树脂，然后减压干燥过夜。树脂的最终重 量为 0. 480g。将树脂(189mg)与5mL的10%胼(无水)在二甲基甲酰胺中混合，在环境温度下 搅拌2小时。将树脂滤出，用ImL 二甲基甲酰胺洗涤，并在滤液中加入IOOmL热水(70°C )。 将滤液冷却至环境温度后放置1小时，然后在10°C环境下冷冻2小时。过滤白色沉淀物，用 水(3次，每次20mL)和乙醚(3次，每次40mL)洗涤，然后减压干燥，得到126mg白色固体。 在环境温度下，用三氟乙酸(20mL)、酚(1.5g)、二硫苏糖醇(1. Og)、苯甲硫醚(1. OmL)、三异 丙基硅烷(1. OmL)和水(1. OmL)的15mL裂解混合物将保护肽(120mg)去保护2小时。滤 除树脂，添加预冷的乙醚(400mL)以沉淀肽，过滤分离肽，然后用乙醚洗涤。在减压条件下 干燥粗肽，得到95mg白色固体。将粗肽等分，一前一后上样到两根Vydac C-18柱(10mm，2. 5X 25cm)上，采用 0-30%的梯度(80%乙腈/0. 三氟乙酸水溶液)以6mL/min的流速洗脱5分钟，再采用 30-60%的梯度(80%乙腈/0. 三氟乙酸水溶液)以6mL/min的流速洗脱60分钟。收 集馏分并用HPLC进行分析，合并纯的馏分并冷冻干燥，得到23mg白色产物。毛细管电泳显示峰面积大于94%。(理论分子量4，026. 5 ；单同位素分子量4，024. 1)。实际分子量 LC-MS :4，028. ODa [M+H]+。实例IC(NH,-NH-CH,-C0-NH-CH,-CH,-0- (CH,~CH,-Q) ^-CH.-CH.-Q-CH.-CH.-CQ-Hi s~「D-Alal -Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Yal-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-NH2)。使用上述含29-丙氨酸的GLP-I (7-36, NH2)肽类似物制备替代性活化试剂(肽 3)。在采用2. 0版SynthAssist的ABI 433A肽合成仪上制备肽，通过Fastmoc 0. 25mM Monitoring Previous Peak 软件进行 Fmoc/HBTU 化学分析。使用 Rink 树脂(833mg， 250mmol)进行合成。在第 21、23 和 24 位分另使用 Fmoc-Gly-Thr (YMe，MePro)-0H, Fmoc-Phe-Thr (YMe，MePro) -OH 和 Fmoc-Val-Ser (YMe, MePro)-0H。在第 28 位使用 0-(N-Fmoc-2-氨基乙基)-0，_(2_羧乙基)-i^一乙二醇，在第29位使用三-Boc-胼基乙 酸。树脂最终重量为1. 74g。在环境温度下，使用1. 5g酚、3ml乙二硫醇、0. 5ml苯甲硫醚、 0.5ml水和IOml TFA的混合物对肽进行4小时的去保护，同时将其从树脂中移除。滤除树 脂，并添加乙醚以沉淀肽。离心分离固体，用醚充分洗涤并减压干燥。将材料上样到两根Vydac C-18柱(10mm，2. 5X25cm)上，采用40-90%梯度(80% 乙腈/0. 1 %三氟乙酸水溶液)以6mL/min的流速洗脱90分钟。收集馏分并用HPLC进行分 析，合并纯的馏分并冷冻干燥，得到白色粉末状的肽。理论分子量4028. 5 ；单同位素分子 量4026. 1。实际分子量4027. 2[M+H]+。实例ID制备GLP-I (7-36)肽-连接基-酰肼(Mj-NH-CHrCO-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe -Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Yal-Lys-GlY-ArR-Gly-NH,)。在采用2. O版SynthAssist的ABI 433A肽合成仪上制备肽，通过Fastmoc 0. 25mM Monitoring Previous Peak 软件进行 Fmoc/HBTU 化学分析。使用 Rink 树脂进 行合成。Gly-Thr、Phe-Thr 和 Val-Ser 序列分别使用 Fmoc-Gly-Thr (Ψ Me, MePro) -OH, Fmoc-Phe-Thr (ΨΜθ, MePro) -OH 和 Fmoc-Val-Ser (ΨΜθ，MePro) -OH。添加GLP-I序列的His1之后，将Boc3-胼基乙酸连接到树脂肽。在环境温度下，使 用1. 5g酚、3ml乙二硫醇、0. 5ml苯甲硫醚、0. 5ml水和IOmlTFA的混合物对肽进行4小时的 去保护，同时将其从树脂中移除。滤除树脂，并加入乙醚以沉淀肽。离心分离固体，用醚充 分洗涤并减压干燥。将材料上样到两根Vydac C-18柱(10mm，2. 5X25cm)上，采用40-90%梯度(80% 乙腈/0. 1 %三氟乙酸水溶液)以6mL/min的流速洗脱90分钟。收集馏分并用HPLC进行分 析，合并纯的馏分并冷冻干燥，得到白色粉末状胼肽。实例IE制备GLP-I (7-36)肽-连接基-肼基(NH。-NH-CH。-CO-NH-Oi-CH。-(O-Qj-CH2) CQ-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Al a~LyS-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys~Gly-Arg-Gly~NH9)。
25
使用ABI 433合成器和FastMoc化学方法(0. 25mmol合成量)。二肽 Gly-Thr, Phe-Thr 和 Val-Ser 分别使用假脯氨酸二肽 Fmoc-Gly-Thr(ΨΜθ, MePro)-OH, Fmoc-Phe-Thr (YMe, MePro) -OH 和 Fmoc-Val-Ser (ΨΜθ，MePro) -0Η。所用保护基团为 N-端 Fmoc, His (Trt)、Glu (O-叔丁基)、Ser (O-叔丁基)、Asp (O-叔丁基)、Tyr (O-叔丁基)、 Gln (Trt) ,Lys (BOC)和 Trp (BOC)。使用 0. 20g 0. 53meq/g 的 Rink Amide ChemMatrix 树脂 进行合成。见“与树脂连接之后，将^⑴呼！^^-氨基乙基)…'-(2-羧乙基)-十一乙 二醇(Fmoc-PEG12-CO2H)连接到肽树脂，然后再连接Boc3-胼基乙酸。肽树脂的最终重量为 0.677g。在环境温度下，使用IOml TFA、3ml乙二硫醇、1. 5g酚、0. 5ml水和0. 5ml苯甲硫醚 的混合物对肽进行4小时的去保护，同时将其从树脂中裂解。滤除树脂，并将滤液直接倒入 250ml冷二乙醚中。通过离心分离得到固体，通过在乙醚中悬浮并离心进行洗涤，减压干燥 得到400mg白色固体。将粗肽等分，一先一后上样到两根Vydac C-18柱(4. 6X250mm，IOm)上，用 30-60 %的线性梯度(80 %乙腈/0. 1 % TFA水溶液)以5ml/min的流速洗脱90分钟。在 214nm处监测柱。分析馏分，收集含有正确产物的馏分并冷冻干燥，得到所需的白色固体产 物。(分子量=C18tlH286N44O6tl的理论分子量4026. 55 ；实际分子量4，026. 90)实例IF制备GLP-I (7-36)肽-连接基(NHrNH-CO-CH2-CH2-CO-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Ph e-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu~Phe~IIe-Ala-Trp -Leu-Val-Lys-Gly-ArR-Gly-NH,)。使用ABI 433合成器和FastMoc化学方法(0. 25mmol合成量)。二肽 Gly-Thr, Phe-Thr 和 Val-Ser 分别使用假脯氨酸二肽 Fmoc-Gly-Thr(ΨΜθ, MePro)-0H, Fmoc-Phe-Thr (ΨΜθ，MePro)-OH 和 Fmoc-Val-Ser (ΨΜθ,MePro) -OH0 所用保护基团为 N-端 Fmoc, His (Trt)、Glu (0-叔丁基)、Ser (0-叔丁基)、Asp (0-叔丁基)、Tyr (0-叔丁基)、 Gln (Trt) ,Lys (BOC)和 Trp (BOC)。使用 0. 20g 0. 53meq/g 的 Rink Amide ChemMatrix 树脂 进行合成。His1与树脂连接之后，将丁二酸一甲基酯连接到肽树脂。用N-甲基吡咯烷酮和 乙醇洗涤所得肽树脂，减压干燥至恒重。在环境温度下，将肽树脂与5mL 10%的胼(无水)在二甲基甲酰胺中混合并搅拌 2小时。将树脂滤出，用ImL 二甲基甲酰胺洗涤，并在滤液中加入IOOmL热水(70°C )。将滤 液在4°C下冷冻24小时。过滤所得沉淀，用水(3次，每次20mL)和乙醚(3次，每次40mL) 洗涤，然后减压干燥，得到白色固体。在环境温度下，用三氟乙酸(20mL)、酚(1.5g)、二硫苏 糖醇(1. Og)、苯甲硫醚(1. OmL)、三异丙基硅烷(LOmL)和水(LOmL)的15mL裂解混合物 将保护肽去保护2小时。滤除树脂，加入冷乙醚(400mL)以沉淀肽，过滤分离肽，用乙醚洗 涤，然后减压干燥。将粗肽等分，先后上样到两根Vydac C-18柱(4. 6X250mm，10m)上，采用20-70 % 的线性梯度(80 %乙腈/0. 1 % TFA水溶液)以5ml/min的流速洗脱90分钟。在214nm处 监测柱。分析馏分，收集含有正确产物的馏分并冷冻干燥，得到所需的白色固体胼肽。实例IG制备GLP-I (7-36)肽-连接基-肼(NH。-NH-C0-CH。-CH。-C0-NH-CH。-CH。- (Q-CH9-CHo) ^-CQ-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Al a-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Yal-Lys-Gly-ArR-Gly-NHq) 0使用ABI 433合成器和FastMoc化学方法(0. 25mmol合成量)。二肽 Gly-Thr, Phe-Thr 和 Val-Ser 分别使用假脯氨酸二肽 Fmoc-Gly-Thr(ΨΜθ, MePro)-OH, Fmoc-Phe-Thr (ΨΜθ,ΜθΡγο)-OH 和 Fmoc-Val-Ser (ΨΜθ,MePro) -OH0 所用保护基团为 N-端 Fmoc, His (Trt)、Glu (O-叔丁基)、Ser (O-叔丁基)、Asp (O-叔丁基)、Tyr (O-叔丁基)、 Gln(Trt)、Lys (BOC)和 Trp(BOC)。使用 0. 175g 0. 53meq/g 的 Rink Amide ChemMatrix 树 脂进行合成。见“与树脂连接之后，将^⑴呼！^^-氨基乙基)…'_(2-羧乙基)-十一 乙二醇(Fmoc-PEG12-CO2H)连接到肽树脂，然后再连接丁二酸一甲基酯。在环境温度下，将所得肽树脂与5mL 10%的胼(无水)在二甲基甲酰胺中混合并 搅拌2小时。将树脂滤出，用ImL 二甲基甲酰胺洗涤，并在滤液中加入IOOmL热水(70°C )。 将滤液在4°C下冷冻过夜。过滤所得沉淀，用水(3次，每次20mL)和乙醚(3次，每次40mL) 洗涤，然后减压干燥，得到白色固体。在环境温度下，用三氟乙酸(20mL)、酚(1.5g)、二硫苏 糖醇(1. Og)、苯甲硫醚(1. OmL)、三异丙基硅烷(LOmL)和水(LOmL)的15mL裂解混合物 将保护基团从肽中移除2小时。滤除树脂，加入预冷乙醚(400mL)以沉淀肽，过滤分离肽， 用乙醚洗涤，然后减压干燥。将粗肽等分，先后上样到两根Vydac C-18柱(4. 6X250mm，10m)上，采用20-70 % 的线性梯度(80 %乙腈/0. 1 % TFA水溶液)以5ml/min的流速洗脱90分钟。在214nm处 监测柱。分析馏分，收集含有正确产物的馏分并冷冻干燥，得到所需的白色固体胼肽。实例IH制备GLP-I (7-36)肽-肼(His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Se r-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Yal-Lys-Glγ-ArR-Glγ -NH-NH,)。在采用2. 0版SynthAssist的ABI 433A肽合成仪上制备肽，通过Fastmoc 0. 25mM Monitoring Previous Peak 软件进行 Fmoc/HBTU 化学分析。使用 Rink 树脂 进行合成。Gly-Thr, Phe-Thr 禾Π Val-Ser 分别使用 Fmoc-Gly-Thr (ΨΜθ，MePro)-0Η, Fmoc-Phe-Thr (ΨΜθ, MePro) -OH 和 Fmoc-Val-Ser (ΨΜθ，MePro) -OH。在环境温度下，将所得肽树脂与5mL 10%的胼(无水)在二甲基甲酰胺中混合并 搅拌2小时。将树脂滤出，用ImL 二甲基甲酰胺洗涤，并在滤液中加入125mL热水(70°C )。 将滤液在4°C下冷冻过夜。过滤所得沉淀，用水(3次，每次20mL)和乙醚(3次，每次40mL) 洗涤，然后减压干燥，得到白色固体。在环境温度下，用三氟乙酸(20mL)、酚(1.5g)、二硫苏 糖醇(1. Og)、苯甲硫醚(1. OmL)、三异丙基硅烷(LOmL)和水(LOmL)的15mL裂解混合物 将保护肽去保护2小时。滤除树脂，加入预冷乙醚(400mL)以沉淀肽，过滤分离肽，用乙醚 洗涤，然后减压干燥。将粗肽等分，先后上样到两根Vydac C-18柱(4. 6X250mm，10m)上，采用20-70% 的线性梯度(80 %乙腈/0. 1 % TFA水溶液)以5ml/min的流速洗脱90分钟。在214nm处 监测柱。分析馏分，收集合有正确产物的馏分并冷冻干燥，得到所需的白色固体胼肽。实例II制备GLP-I (7-36)肽衍生物-连接基-肼(His-「D-Alal-Glu-Gly-Thr-Phe_Thr-Ser-Asp-Yal-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Y al-Lys-Gly-Arg-Gly-NH-CH,-CH,- (Q-CH.-CHj ^-CQ-GIy-NH-NHj。在采用2. 0版SynthAssist的ABI 433A肽合成仪上制备肽，通过Fastmoc 0. ImM Monitoring Previous Peak 软件进行 Fmoc/HBTU 化学分析。使用 Fmoc-Gly-SASRIN 树 脂进行合成。Phe-Thr 禾 Π Ser-Ser 序列分别使用 Fmo c-Ph e-Thr (Ψ Me，MePro) -OH 和 Fmoc-Ser (t_Bu) -Ser (ΨΜθ, MePro) -OH。将0-(N-Fmoc_2-氨基乙基)-0，-(2-羧乙基^一乙二醇(Fmoc-PEG12-CO2H)连 接到树脂，然后连接各个氨基酸，得到保护肽_连接基_树脂。用乙醇洗涤树脂，然后减压 干燥过夜。在环境温度下，将肽树脂与5mL 10%的胼(无水)在二甲基甲酰胺中混合并搅 拌2小时。将树脂滤出，用ImL 二甲基甲酰胺洗涤，并在滤液中加入IOOmL热水(70°C )。 将滤液冷却至环境温度后放置1小时，然后在4°C下冷冻22小时。过滤白色沉淀，用水(3 次，每次20mL)和乙醚(3次，每次40mL)洗涤，然后减压干燥，得到白色固体。在环境温度 下，用三氟乙酸(20mL)、酚(1.5g)、二硫苏糖醇(l.Og)、苯甲硫醚(1. OmL)、三异丙基硅烷 (l.OmL)和水(LOmL)的15mL裂解混合物将保护肽去保护2小时。滤除树脂，添加预冷的 乙醚(400mL)以沉淀肽，过滤分离肽，然后用乙醚洗涤。减压干燥粗肽。将粗肽等分，上样到两根Vydac C-18柱(10_，2. 5 X 25cm)，采用30-70 %的梯 度(80%乙腈/0. 三氟乙酸水溶液)以6ml/min的流速纯化60分钟。收集馏分并用 HPLC进行分析，合并纯的馏分并冷冻干燥，得到23mg白色产物。毛细管电泳显示峰面积 大于94%。(理论分子量4，026. 5;单同位素分子量4，024. 1)。实际分子量LC-MS 4，028. ODa [M+H]+。实例IJ制备GLP-I (7-36)肽衍生物-连接基-肼(His-「D-Alal-Glu-Gly-Thr-Phe_Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-V al-Lys-GlY-ArR-GlY-PEG,-CO-CH,-NH-NH,)。在采用2. 0版SynthAssist的ABI 433A肽合成仪上制备肽，通过Fastmoc 0. 25mM Monitoring Previous Peakif Fmoc/HBTU Ufitf。 i^M Universal PEG NovaTag 树脂(549mg，252mmol)进行合成。Phe-The 和 Ser-Ser 序列分别使用 Fmoc-Phe-Thr (ΨΜθ, MePro) -OH 和 Fmoc-Ser (But) -Ser (ΨΜθ, MePro) -OH。树脂的最终重量为 1. 18g。 将树脂用乙醇洗涤3次，每次2分钟，然后用二氯甲烷洗涤3次，每次2分钟。为了 移除Mmt基团，将HOBt-水合物(9. 186g，0. 6M)溶解于IOOmL 二氯甲烷/2，2，2-三氟乙醇 中，并将25mL所得溶液加入树脂中，轻轻混和1小时。滤除溶剂，重复上述步骤三次。用二 氯甲烷将树脂洗涤3次，每次2分钟，然后用二氯甲烷的N-甲基吡咯烷酮溶液洗涤1次，2分 钟，再用N-甲基吡咯烷酮洗涤3次，每次2分钟。在树脂中加入Boc3-胼基乙酸(911. Omg， 2. 33mM) ,HBTU (884. 3mg，2. 38mM)、H0Bt/N_ 甲基吡咯烷酮(2. 33mL, 1M)和 2. 3mL N-甲基吡 咯烷酮，充分混和，直到所有组分均溶解。加入N-甲基吗啉(0. 769mL，3mM)，用湿润试纸条 检测PH值(pH8. 5)，然后在环境温度下搅拌19小时。 依次用N-甲基吡咯烷酮洗树脂3次，每次2分钟；用二氯甲烷/N-甲基吡咯烷酮 洗涤1次，2分钟；用二氯甲烷洗涤3次，每次2分钟；用甲醇洗涤3次，每次2分钟；用乙醚
28洗涤1次，2分钟，然后减压干燥2小时。树脂重量为1. 14g。在环境温度下，将三氟乙酸(30mL)、酚(2. 25g)、二硫苏糖醇(1.5g)、苯甲硫醚 (1. 5mL)、三异丙基硅烷(1. 5mL)和水(1. 5mL)的20mL裂解混合物在闪烁管内搅拌2小时， 从树脂(0.371g)上裂解肽。滤除树脂，并添加预冷的乙醚(600mL)以沉淀肽。过滤分离得 到的固体用乙醚洗涤。减压干燥粗肽得到535mg。将粗肽上样到两根Vydac C-18柱(10謹，2. 5 X 25cm)，采用40-60 %的梯度 (80%乙腈/0. 三氟乙酸水溶液)以6mL/min的流速纯化60分钟。收集馏分并用 HPLC进行分析，合并纯的馏分并冷冻干燥，得到54. Omg白色产物。毛细管电泳显示峰面 积大于93%。(理论分子量3，630. 1 ；单同位素分子量3，627. 9)实际分子量LC-MS 3，630. 8Da[M+H]+SELDI-MS :3，627. 5Da[M+H] +3, 724/8Da[M+97]+。实例IK制备GLP-I (7-36)肽-连接基-肼(His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Va I-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Yal-Lys-Gly -Arg-Gly-PEG2-CO- (CH,-CH,-Q)^-CH,-CH,-NH-CQ-CH,-CH,-CQ-NH-NHj。在采用2. 0版SynthAssist的ABI 433A肽合成仪上制备肽，通过Fastmoc 0. 25mM Monitoring Previous Peakif Fmoc/HBTU Ufitf。 i^M Universal PEG NovaTag 树脂(549mg，252mmol)进行合成。Phe-The 和 Ser-Ser 序列分别使用 Fmoc-Phe-Thr (ΨΜθ， MePro) -OH 和 Fmoc-Ser (But) -Ser (ΨΜθ, MePro) -OH。树脂的最终重量为 1. 18g。将树脂用乙醇洗涤3次，每次2分钟，然后用二氯甲烷洗涤3次，每次2分钟。为 了移除Mmt基团，将HOBt-水合物(9. 186gm,0. 6M)溶解于IOOmL 二氯甲烷2，2-三氟 乙醇中，并将25mL所得溶液加入树脂中，轻轻混和1小时。滤除溶剂，重复上述步骤三 次。用二氯甲烷将树脂洗涤3次，每次2分钟，然后用二氯甲烷的N-甲基吡咯烷酮溶液洗 涤1次，2分钟，再用N-甲基吡咯烷酮洗涤3次，每次2分钟。在肽树脂的游离氨基中添加 0-(N-Fmoc-2-氨基乙基)-0，-(2_羧乙基)-i^一乙二醇(Fmoc-PEG12-CO2H)，然后使用溶于 N-甲基吡咯烷酮的HBTU和HOBt添加丁二酸一甲基酯。依次用N-甲基吡咯烷酮洗树脂3次，每次2分钟；用二氯甲烷/N-甲基吡咯烷酮 洗涤1次，2分钟；用二氯甲烷洗涤3次，每次2分钟；用甲醇洗涤3次，每次2分钟；用乙醚 洗涤1次，2分钟，然后减压干燥2小时。在环境温度下，将肽树脂与25mL 10%的胼(无水)在二甲基甲酰胺中混合并搅拌 2小时。将树脂滤出，用ImL 二甲基甲酰胺洗涤，并在滤液中加入250mL热水(70°C )。将滤 液冷却至环境温度后放置1小时，然后在4°C下冷冻16小时。过滤白色沉淀，用水(3次，每 次20mL)和乙醚(3次，每次40mL)洗涤，然后减压干燥，得到白色固体。在环境温度下，用 三氟乙酸(20mL)、酚(1. 5g)、二硫苏糖醇(1. Og)、苯甲硫醚(1. OmL)、三异丙基硅烷(1. OmL) 和水(l.OmL)的裂解混合物将保护肽去保护2小时。滤除树脂，添加预冷的乙醚(400mL) 以沉淀肽，过滤分离肽，然后用乙醚洗涤。减压干燥粗肽。将粗肽上样到两根Vydac C-18柱(10mm，2. 5 X 25cm)，采用40-80%的梯度(80% 乙腈/0. 1 %三氟乙酸水溶液)以6mL/min的流速纯化60分钟。收集馏分并用HPLC进行分 析，合并纯的馏分并冷冻干燥，得到所需的白色粉末。实例IL
制备GLP-I (7-36)肽-连接基-肼(His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Va I-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Yal-Lys-Gly -Arg-Gly-PEG2-CO- (CH,-CH,-0)^-CH,-CH,-NH~C0-CH,-NH-NHj。在采用2. 0版SynthAssist的ABI 433A肽合成仪上制备肽，用于通过Fastmoc 0. 25mM Monitoring Previous Peak 软件进行 Fmoc/HBTU化学分析。合成中使用 Universal PEG NovaTag 树脂。Phe-The 和 Ser-Ser 序列分别使用 Fmoc-Phe-Thr (Ψ Me, MePro)_0H 和 Fmoc-Ser (But) -Ser (ΨΜθ, MePro) -OH。将树脂用乙醇洗涤3次，每次2分钟，用二氯甲烷洗涤3次，每次2分钟。为了移 除Mmt基团，将HOBt-水合物(9. 186g，0. 6M)溶于IOOmL 二氯甲烷/2，2，2-三氟乙醇，取 25mL加入树脂中，轻轻混和1小时。通过过滤除去溶剂，以上步骤重复三次。用二氯甲烷 将树脂洗涤3次，每次2分钟，用溶于N-甲基吡咯烷酮的二氯甲烷洗涤1次，2分钟，再用 N-甲基吡咯烷酮洗涤3次，每次2分钟。向肽树脂的游离氨基添加0-(N-Fmoc-2-氨基乙 基)-0’ -(2-羧乙基^一乙二醇(Fmoc-PEG12-CO2H),然后使用溶于N-甲基吡咯烷酮的 HBTU和HOBt添加Boc3-胼基乙酸。接着将树脂用N-甲基吡咯烷酮洗涤3次，每次2分钟，用二氯甲烷/N-甲基吡咯 烷酮洗涤1次，2分钟，用二氯甲烷洗涤3次，每次2分钟，用甲醇洗涤3次，每次2分钟，用 乙醚洗涤1次，2分钟，然后减压干燥两小时。在环境温度下，用三氟乙酸(30mL)、酚(2. 25g)、二硫苏糖醇(1.5g)、苯甲硫醚 (1. 5mL)、三异丙基硅烷(1. 5mL)和水(1. 5mL)的裂解混合物从树脂上裂解肽2小时。通过 过滤除去树脂并加入预冷的乙醚(600mL)以沉淀肽。通过过滤分离所得的固体并用乙醚洗 涤。减压干燥粗肽，得到白色固体。将粗肽等分，在两根Vydac C-18柱(10mm，2. 5 X 25cm)上纯化，使用20-70%的梯 度(80%乙腈/0. 三氟乙酸水溶液)以6mL/min的流速洗脱60分钟。收集馏分并用HPLC 进行分析，合并纯的馏分并冷冻干燥，得到所需的肽衍生物。实例IM制备酰胺化GLP-I (7-36)肽-连接基-肼(Mi-NH-Oi-Oj-(O-Oj-Oi)1^-CO-His -Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Lys~Gly-Arg-Gly~NH9)。使用ABI 433合成仪和FastMoc化学法(0. 25mmol合成量)。二肽Gly-Thr、 Phe-Thr 和 Val-Ser 分另Ij 使用伪脯氨酸二肽 Fmoc-Gly-Thr (ΨΜθ, MePro)_0H、 Fmoc-Phe-Thr (ΨΜθ, MePro) -OH 和 Fmoc-Val-Ser (ΨΜθ，MePro) -0Η。所用的保护基团 为 N-端 Fmoc、His (Trt)、Glu (0-叔丁基)、Ser (0-叔丁基)、Asp (0-叔丁基)、Tyr (0-叔 丁基)、Gln(Trt)、Lys (BOC)和 Trp(BOC)。合成中使用 0. 20g 0. 53meq/g 的 Rink Amide ChemMatrix树脂。His1与树脂连接之后，将0_ (Boc3-2-胼基乙基)_0’_ (2-羧乙基)-i^一 乙二醇(Boc3-胼基-PEG12-CO2H)连接到肽树脂。在环境温度下，使用IOml TFA、3ml乙二硫醇、1. 5g酚、0. 5ml水和0. 5ml苯甲硫醚 的混合物对肽同时进行4小时的去保护以及从树脂上的裂解。通过过滤除去树脂，并将滤 液直接倒入250ml冷乙醚中。通过离心分离所得的固体，通过在乙醚中悬浮并离心进行洗 涤，然后减压干燥，得到400mg白色固体。
将粗肽等分，一前一后上样到两根Vydac C-18柱(4. 6X250mm，IOm)上，使用 20-70%的线性梯度(80%乙腈/0. 1 % TFA水溶液)以5ml/min的流速洗脱90分钟。在 214nm处监测柱。分析镏分，合并含有正确产物的那些馏分并冷冻干燥，得到所需的白色固 体产物。实例IN制备GLP-I (7-36)肽-连接基-肼(His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Va I-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Yal-Lys-Gly -Arg-Gly-PEG厂CO- (CH。-CH。_0)~CH,-NH-NHj。在采用2. 0版SynthAssist的ABI 433A肽合成仪上制备肽，用于通过Fastmoc 0. 25mM Monitoring Previous Peak 软件进行 Fmoc/HBTU化学分析。合成中使用 Universal PEG NovaTag 树脂。Phe-The 和 Ser-Ser 序列分别使用 Fmoc-Phe-Thr (YMe，MePro) -OH 和 Fmoc-Ser (But) -Ser (YMe，MePro) -0H。将树脂用乙醇洗涤3次，每次2分钟，用二氯甲烷洗涤3次，每次2分钟。为了移 除Mmt基团，将HOBt-水合物溶于IOOmL 二氯甲烷/2，2，2-三氟乙醇，取25mL加入树脂中， 轻轻混和1小时。通过过滤除去溶剂，以上步骤重复三次。用二氯甲烷将树脂洗涤3次，每 次2分钟，用溶于N-甲基吡咯烷酮的二氯甲烷洗涤1次，2分钟，再用N-甲基吡咯烷酮洗 涤3次，每次2分钟。使用溶于N-甲基吡咯烷酮的HBTU和HOBt向肽树脂的游离氨基添加 0-(Boc3-2-胼基乙基)-0，-(2-羧乙基^一乙二醇(Boc3-胼基-PEG12-CO2H)。接下来将树脂用N-甲基吡咯烷酮洗涤3次，每次2分钟，用二氯甲烷/N-甲基吡 咯烷酮洗涤1次，2分钟，用二氯甲烷洗涤3次，每次2分钟，用甲醇洗涤3次，每次2分钟， 用乙醚洗涤1次，2分钟，然后减压干燥两小时。在环境温度下，用三氟乙酸(30mL)、酚(2. 5g)、二硫苏糖醇(1.5g)、苯甲硫醚 (1. 5mL)、三异丙基硅烷(1. 5mL)和水(1. 5mL)的裂解混合物从树脂上裂解肽2小时。通过 过滤除去树脂并加入预冷的乙醚(600mL)以沉淀肽。通过过滤分离所得的固体并用乙醚洗 涤。减压干燥粗肽，得到白色固体。将粗肽等分，在两根Vydac C-18柱(10mm，2. 5 X 25cm)上纯化，使用20-70%的梯 度(80%乙腈/0. 三氟乙酸水溶液)以6mL/min的流速洗脱60分钟。收集镏分并用HPLC 进行分析。合并纯的镏分并冷冻干燥，得到所需的肽衍生物。实例10制备酰胺化GLP-I (7-36)肽-连接基-肼(Mi-NH-ai-CO-NH-gj-aial·- (O-Qj-CH,) ,-0-CH,-CH,-CH,-NH-CH,-0-CH,-CO-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-G Iy-NH,)。使用ABI 433合成仪和FastMoc化学法(0. 25mmol合成量)。二肽Gly-Thr、 Phe-Thr 和 Val-Ser 分另Ij 使用伪脯氨酸二肽 Fmoc-Gly-Thr (ΨΜθ, MePro) -0H, Fmoc-Phe-Thr (ΨΜθ, MePro)-OH 和 Fmoc-Val-Ser (ΨΜθ，MePro)_0H。所用的保护基团为 N-端 Fmoc、His (Trt)、Glu (0-叔丁基)、Ser (0-叔丁基)、Asp (0-叔丁基)、Tyr (0-叔丁 基)、Gln (Trt)、Lys (BOC)和 Trp (BOC)。合成中使用 Rink Amide ChemMatrix 树脂。His1 与树脂连接之后，将{3- [2- (2- {2-[3- (9H-芴-9-基氧羰基氨基)-丙氧基]-乙氧基}-乙氧基)_乙基氨基]-1-甲基-2-氧基-丙氧基}_乙酸(Fmoc-PEG2-CO2H)连接到肽树脂，然 后再连接Boc3-胼基乙酸。在环境温度下，使用TFA、3ml乙二硫醇、1. 5g酚、0. 5ml水和0. 5ml苯甲硫醚的混 合物对肽同时进行4小时的去保护以及从树脂上的裂解。通过过滤除去树脂，并将滤液直 接倒入250ml冷乙醚中。通过离心分离所得的固体，通过在乙醚中悬浮并离心进行洗涤，然 后减压干燥，得到白色固体粗肽。将粗肽等分，一前一后上样到两根Vydac C-18柱(4. 6 X 250mm，IOm)上，并使用 30-60%的线性梯度(80%乙腈/0. TFA水溶液)以5ml/min的流速洗脱90分钟。在 214nm处监测柱。分析镏分，合并合有正确产物的那些馏分并冷冻干燥，得到所需的白色固 体产物。实例2 制备乙酵酰-Fc在重链的一个位点上可使用木瓜蛋白酶裂解IgGl型/亚型人抗体，产生具有 N-端苏氨酸的Fc片段。在本研究中，利用包含IgG4抗体人恒定区的鼠-人嵌合体7E3作 % Fc (Kohmura et al. 1993 Arterioscler Thromb. 13 1837-42 (Kohmura 等人，1993 年，《动 脉硬化、血栓形成与血管生物学》，第13卷第1837-1842页)；EP418316)。7E3 IgG Fc的去糖基化将135ml Fc (5mg/ml)渗析到 IOmM Tris (pH 7. 5)中。向渗析液中添加 IOOml PNGase F (500, 000u/ml)，并将所得的溶液在37°C下孵育3天。将去糖基化的Fc在TosoHaas 苯基5PW柱(5. 5 X 200mm, 10m)上纯化，使用0-50% B的梯度以llml/min的流速洗脱(缓 冲液A 0. IM磷酸钠和IM硫酸铵，pH 6. 5 ；缓冲液B 0. IM磷酸钠(pH 6. 5)。理论分子量 49，864. 4，实际分子量49，868. 4。去糖基化Fc的氧化 将55ml去糖基化的Fc (8. 9mg/ml，得自205号实验)渗析到1 %的NaHC03 (pH 8. 4) 中,得到 56. 3ml 8. 6mg/ml 的溶液。加入 40. 6ml 1 % 的 NaHC03 (pH 8. 4)，将浓度调至 5. Img/ ml(10-4mmol 蛋白/ml，相当于 2X10-4mmol N-端苏氨酸/ml)。在 1 % 的 NaHC03 (pH 8.4) 中制备12. 5mg/ml的甲硫氨酸溶液，取11. 9ml加入Fc溶液中。制备20mg/ml的NaI04水溶液。取2. 12ml (42. 4mg)加入Fc中。将反应混合物在 环境温度下轻轻搅拌15分钟。加入乙二醇(2. 8g，2. 3ml)，将反应物再轻轻搅拌20分钟。 将溶液渗析到0. IM NaOAc (pH 4.5)中，得到120ml 4. Omg/ml的溶液。将溶液分成2. 5ml 的等分试样，在-20°C下冷冻并直接使用，无需进一步纯化。实例3 制备肽-FC綴合物使用实例IA的肽1 向乙醛酰-Fc (2. 5ml,4mg/ml)中加入12mg活化的GLP-1类似物(肽1A)。将试管 在4°C的冰箱中放置24小时。制备lmg/ml的NaBH3CN溶液，取IOOml加入反应物中，然后 将反应物放回冰箱过夜。向样本中加入IOOmg硫酸铵。将样本上样到TosoHaas苯基5PW柱 (5. 5X200mm, 10m)上，使用0-100% B的梯度以llml/min的流速洗脱(缓冲液A:0. IM磷酸 钠和IM硫酸铵，pH 6. 5 ；缓冲液B :0. IM磷酸钠，pH 6. 5)。合并馏分，浓缩到大约8ml，并渗 析到PBS中。理论分子量57，005. 8 ；单同位素分子量56，970. 4 ；实际分子量57，004. 3。使用实例IB的肽2
32
向乙醛酰-Fc (2. 5ml,4mg/ml)中加入IOmg活化的GLP-1类似物(肽1B)。将试管 在4°C的冰箱中放置24小时。制备lmg/ml的NaBH3CN溶液，取IOOml加入反应物中，然后 将反应物放回冰箱过夜。向样本中加入IOOmg硫酸铵。将样本上样到TosoHaas苯基5PW柱 (5. 5X200mm, IOm)上，使用0-100% B的梯度以llml/min的流速洗脱(缓冲液A:0. IM磷酸 钠和IM硫酸铵，pH 6. 5 ；缓冲液B :0. IM磷酸钠，pH 6. 5)。合并馏分，浓缩到大约8ml，并渗 析到PBS中。理论分子量57，883. 8 ；单同位素分子量57，850. 9 ；实际分子量57，796. 5。使用实例IC的肽3 向乙醛酰-Fc(2. 5ml，4mg/ml)中加入8mg肽1C。将试管在4°C的冰箱中放置24 小时。制备lmg/ml的NaBH3CN溶液，取IOOml加入反应物中，然后将反应物放回冰箱过夜。 向样本中加入IOOmg硫酸铵。将样本上样到TosoHaas苯基5PW柱(5. 5X 200mm，IOm)上， 使用0-100% B的梯度以llml/min的流速洗脱(缓冲液A :0. IM磷酸钠和IM硫酸铵，pH 6. 5 ；缓冲液B 0. IM磷酸钠，pH 6. 5)。合并馏分，浓缩到大约8ml，并渗析到PBS中。理论 分子量57，802. 6 ；单同位素分子量57，766. 8 ；实际分子量57，811. 1。得自肽3的一价构造向乙二醛-Fc (2. 5ml,4mg/ml)中加入1. 5mg肽3。将试管在4°C的冰箱中放置24 小时。制备lmg/ml的NaBH3CN溶液，取IOOml加入反应物中，然后将反应物放回冰箱过夜。 向样本中加入IOOmg硫酸铵。将样本上样到TosoHaas苯基5PW柱(5. 5X 200mm，IOm)上， 使用50-100% B的梯度以llml/min的流速洗脱(缓冲液A :0. IM磷酸钠和IM硫酸铵，pH 6. 5 ；缓冲液B 0. IM磷酸钠，pH 6. 5)。合并馏分，浓缩到大约8ml，并渗析到PBS中。理论 分子量53，792. 2 ；单同位素分子量53，758. 5 ；实际分子量53，803. 7。实例4 肽-FC缀合物的牛物活件采用cAMP检测分析法测试肽缀合物的活性，该方法测量通过GPCR调节腺苷酸环 化酶活性后产生的cAMP。cAMP检测分析法LANCE cAMP检测分析法(Hemmila I. 1999. LANCE =Homogeneous Assay Platform for HTS. J Biomol Screen. 4(6),303-308(Hemmila I.，1999年，LANCE : 用于HTS的均相检测分析平台，《生物分子筛选杂志》，第4卷第6期第303-308页))是一 种均相时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)免疫分析法。该检测分析法基于以下两者间 的竞争铕标记的cAMP示踪剂，以及用于结合通过Alexa Fluor 647染料标记的cAMP特 异性抗体上的位点的样本cAMP。铕标记的示踪剂络合物由Biotin-cAMP与用铕-W8044螯 合物标记的链霉亲和素之间的紧密相互作用形成。当抗体与Eu-SA/b-cAMP示踪剂结合时， 340nm的光脉冲会激发示踪剂的Eu螯合物分子。Eu螯合物发出的能量被转移到抗体上的 Alexa分子，继而发出665nm的光。在存在cAMP的情况下，665nm下试验样本的荧光强度测 量值将减小，所得的信号将与样本的cAMP浓度成反比(LANCE cAMP手册)。细胞与检测分析。在RPMI 1640/10% FBS/1% L-谷氨酰胺/1%丙酮酸钠/1% 非必需氨基酸/50 μ M β-巯基乙醇中培养INS-IE细胞(得自ClaesWollheim，Geneva, Switzerland. Endocrinology, 1992,130 (1) 167-178 (《内分泌学》，1992 年，第 130 卷第 1 期第167-178页))，将其保持在37°C、含5% CO2的增湿培养箱中。通过胰蛋白酶消化让细 胞传代，每7天传代培养一次。为了进行检测分析，将INS-IE细胞在汇合时涂布于96孔板(COstar3610)上，让
33其在正常生长培养基中恢复4天。从孔中吸出培养基，并先后加入24ul AlexaFluor 647 抗cAMP抗体(LANCE cAMP试剂盒，PerkinElmer (Boston, MA))和24ul系列稀释的供试品 (溶于PBS/0. 5% BSA/0. 5mM IBMX中)。在室温下将细胞刺激7分钟，然后在含有Eu-SA/ b-cAMP示踪剂的缓冲液中裂解。将板在室温下孵育1小时，然后测量665nm处的荧光强度。 根据标准曲线确定cAMP浓度。MM将图1所示并如实例IA制备的肽1对INS-IE细胞中cAMP的刺激能力与野生型 GLP-I进行比较。如图2通过图解所示，结果表明修饰肽的生物活性无损失。如图4通过图解所示，将如实例3所述缀合到人Fc区的修饰GLP-1肽对INS-IE 细胞中cAMP的刺激能力进行比较。如图所示，所有构造都表现出活性。N-端连接的GLP-I 类似物(肽3)的活性出人意料，因为如前所示，通过2个氨基酸在N-端截短GLP-I产生了 较弱的激动剂活性，而8氨基酸N-端截短则使肽失活(Montrose-Rafizadehet al. 1997. J. Biol. Chem. 272 21201-21206 (Montrose-Raf izadeh 等人，1997 年，《生物化学杂志》，第 272卷第21201-21206页))。然而，当以同一检测分析法测试肽3的一价缀合物时，将高达 IOOnM的浓度用于检测分析时未检测到活性。
权利要求
一种用于制备药物组合物的免疫球蛋白融合蛋白，所述蛋白具有以下通式B (L)n (F) (I)其中B表示至少一个生物活性GLP 1肽、变体或衍生物，F表示包含(X)m (D)p CH2 CH3结构的抗体Fc，其中X表示可以通过标准分子生物工程技术掺入和制备的任何天然存在的氨基酸，其中m为0 20的整数，D为多聚或二聚域，p为0至1的整数，CH2表示连接到免疫球蛋白CH3恒定区的至少一部分的免疫球蛋白CH2恒定区的至少一部分；L表示包含基本上非免疫原性的聚合物结构的连接基，并且在所述生物活性部分和F之间提供柔性键合，其中n可以为整数0或1；并且当n为0时，B和F之间的键合为非肽共价键，当n为1时，L和F之间的键合为非肽键。
2.根据权利要求1所述的具有化学式B-F的蛋白及其多聚体，其中B的C-端连接到F 的N-端，或者其中B的N-端连接到F的N-端，F不含二聚域。
3.根据权利要求1所述的具有化学式B-L-F的蛋白及其多聚体，其中F为不含二聚域 的Fc域并通过N-端连接到L，并且L在交替位点进一步连接到B的C-端；或者其中F为 所述能够形成Fc域的多肽并通过N-端连接到L，L在交替位点进一步连接到B的N-端。
4.根据权利要求1所述的具有化学式B1-F-B2(IV)的蛋白，其中B1和B2为相同或不同 的GLP-1，或者通过同一 GLP-I上的交替位点缀合到F上，并且其中F具有所述二聚域。
5.根据权利要求1所述的具有化学式B1-L1-F-L2-B2(V)的蛋白，其中B1和B2为相同或 不同的GLP-1，或者分别通过Bl和Β2上的交替位点缀合到L1和L2上，并且其中F具有所 述二聚域。
6.根据权利要求1所述的蛋白，其中B和F之间的所述键合或L和F之间的所述键合 选自胼和碳酰胼基团。
7.一种用于制备根据权利要求6所述的蛋白的方法，其中所述胼键通过乙醛 酰-Fc (HCO-CO-Fc)、酮基-Fc或简单醛-Fc (HCO-Fc)的反应而形成，其中所述乙醛 酰-Fc (HCO-CO-Fc)、酮基-Fc或简单醛-Fc (HCO-Fc)与具有胼或酰胼官能团的活化GLP-I 肽发生反应，在所述Fc结构的一个或两个N-端形成腙，其可进一步被还原成所述胼键。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述乙醛酰-Fc与之前已缀合到所述GLP-I肽上 的连接基反应，其中所述连接基包括选自由胼和酰胼部分组成的组的亲核基团。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述乙醛酰-Fc与连接基(L)上的胼反应，所述连 接基还包含非胼的第二反应基团。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的蛋白，其中所述连接基包含至少一个乙二醇单兀。
11.根据权利要求1所述的蛋白，其中所述多肽B具有SEQID NO :2的序列。
12.根据权利要求1所述的蛋白，其中B包含选自由SEQID No. 1的GLP-I (7_36)或其 类似物组成的组的肽。
13.根据权利要求1所述的蛋白，其中D为免疫球蛋白铰链区的至少一部分。
14.一种药物组合物，其包含与药用载体组合的根据权利要求1-6中任一项所述的蛋白。
15.一种用于治疗患者新陈代谢病症的方法，所述方法包括给予需要此类治疗的患者 治疗有效量的含有根据权利要求1所述的蛋白的药物组合物。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述病症的特征在于缺乏血糖控制。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述病症选自由1型糖尿病、前期糖尿病和2型 糖尿病组成的组。
全文摘要
本发明涉及半合成的生物分子，所述半合成的生物分子为GLP-1肽与人多聚蛋白或蛋白片段(例如由非肽键连接的抗体Fc)的缀合物。所述构造表现出生物活性，可用于制备治疗组合物和治疗制剂，用于治疗特征在于缺乏胰岛素控制能力的疾病。
文档编号A61K39/00GK101918027SQ200880123863
公开日2010年12月15日 申请日期2008年11月3日 优先权日2007年11月2日
发明者G·赫夫纳 申请人:森托科尔奥索生物科技公司