专利名称：双半乳糖基二酰甘油酯的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于药用天然表面活性剂的制备及应用技术领域，涉及双半乳 糖基二酰甘油酯的制备方法及其应用，具体涉及其制备方法及其作为主动 耙向药物载体的应用。
背景技术：
在双半乳糖基二酰甘油酯(DGDG)分子中，存在着一个二酰基甘油及 两个彼此连接的半乳糖残基，第一个半乳糖残基与甘油骨架上的C-3位-OH 基团直接相连。第二个半乳糖残基与第一个半乳糖以a-l, 6糖苷键连接， 其中，R,、 R2为不同种类的脂肪酸，在由燕麦麸皮提取的糖脂中，多为棕 榈酸(dsH3,CO;16:0)、油酸((:171133(:0;18:1)、亚油酸(CnH3,CO;18:2)、亦有 少量的亚麻酸(C,7H29CO;18:3)、硬脂酸(C17H35CO; 18:0)、月桂酸 (d,H23CO;12:0)等。DGDG不是一种纯净物，而是一组结构相近的混合物， 其结构如图1。从其结构来看，半乳糖单元的羟基和半乳糖酰基甘油为亲 水性基团，脂链为亲脂性基团，这使得半乳糖脂具有明显的两亲性，是一 种天然的非离子型表面活性剂。制取半乳糖脂的方法已在专利 CNM4478A中公开报导，它是从燕麦粉、面筋粉、黑麦片中提取分离而 得，用乙醇提取，硅胶柱分离，洗脱液分别为不同比例的已烷与异丙醇和 丙酮。其方法的主要缺点是所用原料均为粮食，成本较高；乙醇提取液 中提取了较多的杂质成分，为下一步分离精制增加了困难；最终由丙酮洗 脱液精制所得DGDG中仍有杂质。DGDG的两亲性，使其可作为表面活性 物质使用，由于其分子类似截头圆锥，于水中可自发形成双分子层，进而 形成类脂质体或囊泡。基于以上两点，DGDG可作为药物、营养品，化妆 品、食品、农用品的载体材料使用。然而以其作为中药活性物质的载体材 料未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种低成本且更为纯净的DGDG提取分离方法。 提取物杂质少，精制得到的DGDG为薄层层析纯，无刺激性与溶血性，并 以其作为中药活性物质的载体材料。
本发明是这样实现的燕麦麸皮中含有较多的脂质成分，故选用麸皮而 不用造价较高的燕麦粉；由丙酮所得提取物中杂质较少；通过两次硅胶柱 进行分离，最后一次硅胶柱釆用分离度较好的氯仿-甲醇系统洗脱，分离得 到纯净的DGDG。
其制备工艺步骤是
取燕麦麸皮，用2 4倍量(w/v)丙酮于40~56匸下，提取2 4小时，浸 提3次，合并浸提液。浸提液40 5(TC下减压浓缩，所得棕色油用2 3倍 量(w/w)硅胶拌样。于分离柱中先加入与拌样硅胶等量的空白硅胶，后加入 拌样硅胶，然后用环已烷-丙酮的10 30:90 70(v/v)混合洗脱液洗脱，用量 为柱中总硅胶用量的2 4倍(w/w)，最后用丙酮洗脱，用量为柱中总硅胶用量的2.5 5倍(w/w)。丙酮洗脱液40 5(TC下减压浓缩，所得黄色粘稠膏状 物为粗制DGDG,将其用1 3倍量(w/w)硅胶拌样。于分离柱中加入拌样硅 胶2 4倍量(w/w)的空白硅胶，后加入拌样硅胶，然后用氯仿-甲醇的 70 90:30 10(v/v)混合液洗脱，用量为柱中总硅胶量的4 8倍(v/w)，最后用 氯仿-甲醇的60 80:40 20(v/v)混合液洗脱，用量为柱中总硅胶量的5 10倍 (v/w)。氯仿-甲醇的60 80:40 20 (v/v)洗脱液中即为精制DGDG。
亦可将燕麦麸皮用二氧化碳超临界进行脱脂，萃取釜压力为 29.0~31.2MPa,萃取筌温度为35~45°C，分一温度为40~60°C，分二温度为 20 40°C，系统流量为70 83Kg七'1。脱脂后的燕麦麸皮用2 4倍量丙酮于 40 56t:下，提取2 4小时，浸提3次，合并浸提液。浸提液40 50。C下减 压浓缩，浓缩液用1 3倍量(w/w)珪胶拌样。于分离柱中加入拌样硅胶2 4 倍量(w/w)的空白硅胶，后加入拌样硅胶，然后用氯仿-甲醇的 70 90:30 10(v/v)混合液洗脱，用量为柱中总硅胶量的4 8倍(v/w),最后用 氯仿-甲醇的60 8(h40 20(v/v)混合液洗脱，用量为柱中总硅胶量的5~10倍 (v/w)。氯仿-甲醇的60 80:40 20(v/v)洗脱液中即为精制DGDG。
所得DGDG以硅胶薄层展开，展开剂为氯仿-甲醇-水混合溶剂，薄层板 挥干后左侧喷糖的显色剂苯胺-二苯胺磷酸，右侧喷通用显色剂10%硫酸 乙醇溶液，85。C下加热IO分钟显色，如图2:
所得DGDG以硅胶薄层展开，展开剂为氯仿-丙酮-乙酸混合溶剂,薄层 板挥干后右侧喷糖的显色剂苯胺-二苯胺磷酸，左侧喷通用显色剂10%硫 酸乙醇溶液，85。C下加热IO分钟显色，如图3:
通过对比可见所提DGDG较为纯净，在薄层板中未检出杂质。 将所得DGDG用lmol.L"HCl于75。C下水解1小时，与半乳糖标准品 共薄层展开，展开剂分别为乙酸乙酯-甲醇-乙酸-水=12:3:3:2,氯仿-甲醇-水=70:21:3，氯仿-甲醇-水=16:9:2,薄层板挥干后喷显色剂苯胺-二苯胺磷 酸，85。C下加热5分钟显色，结果分别如图4、图5、图6。由图可知三 种展开剂下Rf相同，说明水解后所得为半乳糖。
所得DGDG样品H'-NMR ( Bruker AX-300型核磁共振波谱仪，TMS 内标)如图7。
应用NMR法测得HLB值如Table 1: HLB= 18.24R+ 1.80
Table 1 The result of HLB value determination
批号 R HLB
200804 8^
200805 0.285 700 200809 0.316 7.56
应用荧光探针法测得DGDG的临界胶束浓度为2xl0、丄"。
4DGDG的安全性评价 、溶血试验
按《中药、天然药物刺激性和溶血性研究的技术指导原则》测得结果， 1.5。/。DGDG水溶液无溶血现象。
2、刺激性试验(兔耳皮下注射法)
取两只家兔，将其两耳中部的毛褪去，左耳中部皮下注射被试物(1.5 。/。的DGDG水溶液)O.lmL，右耳中部皮下注射等量生理盐水。观察注射 局部有无红肿和充血现象，并与生理盐水组对照，以判断样品有无刺激性。
各时间点观察结果如Table 2
Table 2 The results of stimulation test
观察家兔
0.25无红肿、充血现象，药液与生理盐水组相比吸收较慢
0.50无红肿、充血现象，药液扩散
0,75无红肿、充血现象，药液继续扩散
1.00无红肿、充血现象，右耳变平
2.00无红肿、充血现象，右耳恢复『.常，左耳变平4.00无红肿、充血现象，左耳触摸仍有少量未吸收药物
12.00无红肿、充血现象，左耳触摸IH常，药液完全吸收
24.00无红肿、充血现象，左耳触摸iH常，药液完全吸收
通过刺激性试验证明DGDG无刺激性。
由于DGDG中含有酯键及不饱和双键，应密闭于低温(-4。C)下保存。 本发明所制备的DGDG杂质少，精制得到的DGDG为薄层层析纯，
无刺激性与溶血性，并可以作为中药活性物质的载体材料。
图1为DGDG的分子结构
图2为以氯仿-甲醇-水展开后DGDG的薄层色谱图
图3为以氯仿-丙酮-乙酸展开后DGDG的薄层色谱图
图4为以乙酸乙酯-甲醇-乙酸-水展开酸水解DGDG的薄层色谱图
图5为以氯仿-甲醇-水(70:21:3)展开酸水解DGDG的薄层色谱图
图6为以氯仿-甲醇-水(16:9:2)展开酸水解DGDG的薄层色谱图
图7为DGDG的H'-NMR谱图
图8为香叶油亚微乳粒径及其分布图
图9为葫芦素类脂质体纯化后的HPLC色谱图
图10为30min时葫芦素类脂质体的组织分布图
图11为lh时葫芦素类脂质体的组织分布图
图12为2h时葫芦素类脂质体的组织分布图
图13为4h时葫芦素类脂质体的组织分布图
具体实施例方式
实施例1:丙酮提取-硅胶柱分离DGDG
称取巿售燕麦麸皮500g加入U20mL丙酮于56。C下浸提4小时，浸提 3次，合并3次浸提液。浸提液于50。C下减压浓缩，浓缩液用100g硅胶拌 匀，挥干溶剂。在分离柱中加入110g空白硅胶，后加入拌样硅胶。先以环 已垸-丙酮的28:72(v/v)的混合液680mL洗脱，最后用丙酮900mL洗脱。丙 酮洗脱液于47。C下减压浓缩，浓缩物用30g硅胶拌样，挥千溶剂。在分离 柱中加入100g空白硅胶，后加入拌样硅胶。先以650mL氯仿-甲醇的 85:15(v/v)混合液洗脱，最后以680mL氯仿-甲醇的70:30(v/v)混合液洗脱， 回收氯仿-甲醇的70:30(v/v)混合洗脱液，所得即为精制DGDG。 实施例2: 二氧化碳超临界脱脂-提取分离DGDG
称取巿售燕麦麸皮500g，放入二氧化碳超临界萃取设备的萃取釜中， 设置萃取压力31MPa，萃取温度42。C，分离器一温度为48°C，分离器二 温度为25"，系统流量为控制在75 78Kg-h-1，每半小时于分离器一中接取 萃取物，共萃取3小时。取出萃取后的燕麦麸皮，用1200mL丙酮于50。C 下浸提2.5小时，浸提3次，合并3次浸提液。浸提液于45。C下减压浓缩。 浓缩液用25g硅胶拌样，挥干溶剂。在分离柱中加入85g空白硅胶，后加 入拌样硅胶。先以700mL氯仿-甲醇的85:15(v/v)混合液洗脱，最后以750mL 氯仿-甲醇的70:30(v/v)混合液洗脱，回收氯仿-甲醇的70:30(v/v)混合洗脱 液，所得即为精制DGDG。 实施例3:香叶油DGDG亚微乳的制备
称取DGDG0.8g，香叶油2g，油酸钠0.1g，涡旋混匀后5(TC下保温， 加入100mL(5(TC)注射用水，搅拌至成均一乳剂，将其用组织匀浆机剪切 5min后，入高压乳匀，压力750bar，匀质5次，即得。平均粒径222.2nm, 粒径分布较窄。见图8。 实施例4:葫芦素DGDG类脂质体的制备
称取DGDG75mg，胆固醇8mg,葫芦素4mg，适量氯仿溶解，倒入茶 形瓶中减压旋转蒸发，形成薄膜后，倒入磷酸盐缓冲液，超声分散，过 0.45pm滤膜两次即得。所得制剂微柱离心法纯化，除去游离葫芦素。所以 纯化制剂异丙醇破坏，进HPLC分析，可检出葫芦素药物峰。见图9。 实施例5:葫芦素DGDG类脂质体的组织分布
由实施方法四制备制剂，同时制备含药量相等的葫芦素水溶液，作为 对照。Wistar大鼠雌雄各半，体重200±20g。按常规组织分布试验方法， 分别测定30min， lh， 2h, 4h时的组织分布，结果如图10, 11, 12, 13。
权利要求
1.双半乳糖基二酰甘油酯的制备方法，其特征在于采用以下步骤制备取燕麦麸皮用丙酮提取，浸提液减压浓缩，所得棕色油状物用2～3倍量(w/w)硅胶拌样吸附。在分离柱中先加入空白硅胶，后加入拌样硅胶，空白硅胶∶拌样硅胶＝2～4∶1(w/w)，然后用环己烷-丙酮的10～30∶90～70(v/v)混合液洗脱，最后用丙酮洗脱；丙酮洗脱液减压浓缩，所得粘稠膏状物用1～3倍量(w/w)硅胶拌样吸，在分离柱中先加入空白硅胶，后加入拌样硅胶，空白硅胶∶拌样硅胶＝2～4∶1，然后用氯仿-甲醇的70～90∶30～10(v/v)混合液洗脱，最后用氯仿-甲醇的60～80∶40～20(v/v)混合液洗脱，氯仿-甲醇的60～80∶40～20(v/v)混合洗脱液中即为精制DGDG；或将燕麦麸皮用二氧化碳超临界萃取进行脱脂，脱脂后的燕麦麸皮用丙酮提取，浸提液减压浓缩，用1～3倍量(w/w)硅胶拌样吸附。在分离柱中先加入空白硅胶，后加入拌样硅胶，空白硅胶∶拌样硅胶＝2～4∶1(w/w)，然后用氯仿-甲醇的70～90∶30～10(v/v)混合液洗脱，最后用氯仿-甲醇的60～80∶40～20(v/v)混合液洗脱，氯仿-甲醇的60～80∶40～20(v/v)混合洗脱液中即为精制DGDG。
2、 根据权利要求l所述的制备方法，其特征在于二氧化碳超临界 萃取釜压力为29.0 31.2MPa,萃取釜温度为35 45°C,分离器一温度为 40 60°C,分离器二温度为20 40°C,系统流量为70 83Kg七"。
3、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于燕麦麸皮用丙酮 提取中，所用丙酮用量为燕麦麸皮的2 4倍(v/w),提取温度为40 56°C, 提取时间2 4小时，浸提3次，合并浸提液。
4、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于环已烷-丙酮的 10 30:90 70 (v/v)混合洗脱液用量为柱中硅胶总用量的2 4倍(v/w)。
5、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于丙酮洗脱液用量 为柱中硅胶总用量的2.5 5倍(Ww)。
6、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于氯仿-甲醇的 70 90:30 10(v/v)混合洗脱液用量为柱中总硅胶量的4 8倍；氯仿-甲醇的 60~80:40 20 (v/v)混合洗脱液用量为柱中硅胶总用量的5 10倍(v/w)。
7、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所制备的双半乳糖 基二酰甘油酯可以和药学上可接受的载体结合制成乳剂和类脂质体,其中 含有0.01 30y。(w/w)的双半乳糖基二酰甘油酯，其余为中药活性物质、极 性溶剂和其它辅料。
8、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所制备的双半乳 糖基二酰甘油酯的半乳糖残基可作为配体，具有肝靶向性。
9、 根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于所制备的双 半乳糖基二酰甘油酯制成的乳剂和类脂质体中，其递送途径包括皮下、 肌肉和静脉。
全文摘要
本发明涉及一种药用天然表面活性剂-双半乳糖基二酰甘油酯(Digalactosyldiacylglycerol，DGDG)制备方法及其作为药物载体的应用。其制备工艺是将燕麦麸皮用丙酮提取，浸提液浓缩后用硅胶吸附，分别以不同极性的洗脱液洗脱，最终洗脱液中即为精制DGDG。亦可先用二氧化碳超临界对燕麦麸皮进行脱脂，然后用丙酮提取，提取液浓缩后用硅胶吸附，以不同极性洗脱液洗脱后可得精制DGDG。其亲水亲油平衡值为7.00～8.15，临界胶束浓度约为2×10<sup>-3</sup>g·L<sup>-1</sup>。该制备方法原料廉价易得，所得DGDG为薄层层析纯，无溶血性与刺激性。由于DGDG的两亲和在水中可自组装形成双层囊泡的性质，使其可作为药物的载体。DGDG分子中的半乳糖残基，可作为配体，特异性的识别肝实质细胞上的半乳糖受体，实现配体介导的主动肝靶向。
文档编号A61K47/26GK101550172SQ20091001149
公开日2009年10月7日 申请日期2009年5月12日 优先权日2009年5月12日
发明者乔明曦, 李新刚, 胡海洋, 赵庆春, 赵秀丽, 陈大为 申请人:沈阳药科大学