专利名称：一种香青兰总黄酮提取物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种香青兰总黄酮提取物及其制备方法与应用。
背景技术：
冠心病是严重危害人类健康的疾病之一，该病发病率高、致死率高，发病机制复杂，使 得该病的防治成为难点，此类治疗药物一直是药学工作者研究的热点。植物药在冠心病的防 治方面具有独特的优势，取得了较好的临床结果。
香青兰(Dracocepto/ww woWflv/c L)是唇形科青兰属一年生草本植物，系维吾尔族、 蒙古族习用药材。药材标准收载于《卫生部药品标准》维药分册(标准号WS3-BW-0073-98) 和1977年版《中国药典》。药用部位为干燥地上部分，夏季盛花期采割，除去杂质，晒干。维 药分册记载的功能主治为益心护脑，保肝健脾，增强感觉力，补充保护力，填益智慧力，开 通脑中闭塞。用于心悸心痛，头晕脑胀，反应迟钝，感觉低下，思维不敏，胃虚肝弱，机体 自然力下降。维医用于治疗冠心病及血液质旺盛(高血压)等疾病,几百余年的实践证明,疗效 确切。部颁标准维药分册收载的成方制剂中，组方含香青兰的制剂有6种，多用于心悸、心痛 方面疾病的治疗。香青兰提取物对于多种自由基具有清除作用，对于异丙肾上腺素诱导的小 鼠急性心肌缺血具有保护作用。单方制剂"益心巴迪然吉布亚颗粒"治疗冠心病具有良好的疗 效。临床研究表明，益心巴迪然吉布亚颗粒治疗冠心病心绞痛在总有效率达到85.5%，与复 方丹参片疗效相当。
尽管近年来，有关香青兰提取物清除自由基、治疗冠心病、降血脂等方面的文献较多， 但研究对象均为香青兰水煎液或提取物，益心巴迪然吉布亚颗粒也属水煎浓縮制得的粗制剂， 药效物质不明确，服药量大，质量可控性不强。本申请的发明人对香青兰进行了系统成分研 究，结果表明，香青兰主要含有黄酮、三萜类成分，其中黄酮类成分为公认的具有抗氧化、 清除自由基作用的一类化合物，银杏总黄酮、山楂总黄酮己经是临床应用的心血管疾病治疗 药物。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种总黄酮含量高的香青兰总黄酮提取物。 一种香青兰总黄酮提取物，是通过以下方法制备的
(1)将香青兰地上部分粉碎，用0~95%乙醇(指体积份数，当取到"0"时即为纯水)回 流提取1 8次，每次溶剂用量为药材重量的1~20倍，每次提取时间为0.5~10小时，合并提取液，过滤，回收乙醇(如减压回收)，浓縮得浸膏；
(2) 将上述得到的浸膏加水稀释，加水量为浸膏重量的2 20倍，然后上大孔树脂柱或 聚酰胺柱吸附，浸膏重量与吸附填料体积的比是h 0.5~10，单位g: ml，色谱柱径与柱高比 为1:1~30，然后依次用水和浓度为5~95%的乙醇洗脱，流速为0.5~3,5个柱体积/小时；
(3) 收集乙醇洗脱液，进行减压浓縮或真空干燥或喷雾干燥或冷冻干燥，即得香青兰总 黄酮提取物。
所述香青兰总黄酮提取物中总黄酮含量大于50%，主要有效成分黄酮类化合物田蓟苷含 量大于5.0%。
一种香青兰总黄酮提取物的制备方法，步骤如下
(1) 将香青兰地上部分粉碎，用0~95%乙醇(指体积份数，当取到"0"时即为纯水)回 流提取1 8次，每次溶剂用量为药材重量的1~20倍，每次提取时间为0.5~10小时，合并提 取液，过滤，回收乙醇(如减压回收)，浓縮得浸膏；
(2) 将上述得到的浸膏加水稀释，加水量为浸膏重量的2 20倍，然后上大孔树脂柱或 聚酰胺柱吸附，浸膏重量与吸附填料体积的比是1:0.5 10,单位g:ml，色谱柱径与柱高比为 1:1~30，然后依次用水和浓度为5~95%的乙醇洗脱，流速为0。5~3.5个柱体积/小时；
(3) 收集乙醇洗脱液，进行减压浓縮或真空干燥或喷雾千燥或冷冻干燥，即得香青兰总 黄酮提取物。
所述的香青兰总黄酮提取物在制备治疗动脉硬化、冠心病、心绞痛药物中的应用。 所述的香青兰总黄酮提取物在制备预防动脉硬化、冠心病、心绞痛保健品中的应用。 所述应用是将香青兰总黄酮提取物与磷脂按照重量比1: 0.2~1: 25的比例制成磷脂复合 物，可以直接将磷脂复合物制成口服制剂服用。也可以将香青兰总黄酮提取物与医学上可接 受的辅料混合制成胶囊剂(包括软胶囊)、片剂、散剂、颗粒、口服液、酒剂、丸剂、微丸剂、 合剂、酊剂中的任意一种服用，优选颗粒剂、胶囊剂、片剂。 所述磷脂为大豆磷脂或卵磷脂。 所述乙醇的浓度均为体积份数。 '
本申请的发明人对提取物进行了成分分离，得到的主要成分经NMR确定为田蓟苷，结
构如下:<formula>formula see original document page 4</formula>采用紫外分光光度法，以田蓟苷为对照品，对提取物进行含量测定，总黄酮含量以田蓟 苷计大于50%， HPLC测定田蓟苷的含量，其在总黄酮提取物中含量大于5.0%，色谱图如图 1、图2所示。
本发明采用大孔树脂或聚酰胺吸附的方法，分离得到了香青兰总黄酮，其中田蓟苷 (tilianin)是其主要成分。采用紫外比色法，以田蓟苷为对照品，测定了香青兰总黄酮含量 不低于50%。高效液相色谱法测定田蓟苷含量不低于5。0%。该提取对于结扎冠状动脉前支 造成的急性犬心肌缺血具有保护作用，可明显减轻犬急性心肌缺血程度，縮小缺血范围，明 显增加麻醉犬冠脉流量。
图1为香青兰总黄酮提取物HPLC色谱图； 图2为田蓟苷对照品HPLC色谱图。
具体实施例方式
以下将在实施例中对本发明进行详细的说明，但下述实施例仅为说明之目的，并非用于 限制本发明。
实施例h香青兰总黄酮提取物的制备
香青兰50Kg,以药材重量10倍的50%乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液， 过滤，浓缩至浸膏。浸膏加水10倍稀释，上大孔树脂柱吸附(HPDIOO，河北宝恩化工)，原 药材重量与大孔树脂体积比为1:5 (g:ml)，色谱柱径高比为1:10，用蒸馏水洗脱，洗脱液弃 去，后用75%乙醇洗脱，流速为l柱体积/小时，乙醇洗脱液减压浓縮，浓縮液喷雾干燥，即 得，收率为2.5%。
实施例2:香青兰总黄酮提取物的制备
香青兰50 Kg，以药材重量8倍的50%乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液， 过滤，浓缩至浸膏。浸膏加水IO倍稀释，上聚酰胺柱吸附(60-90目)，原药材重量与聚酰 胺体积比为1:3 (g:ml)，色谱柱径高比为1:8，用蒸馏水洗脱，洗脱液弃去，后用75%乙醇 洗脱，流速为l柱体积/小时，乙醇洗脱液减压浓缩，浓缩液喷雾干燥，即得，收率为2.8%。
实施例3:香青兰总黄酮提取物的制备
香青兰50Kg，以与药材重量等重的95%乙醇回流提取8次，每次5小时，合并提取液， 过滤，浓縮至浸膏。浸膏加水20倍稀释，上大孔树脂柱吸附(HPDIOO，河北宝恩化工)，原 药材重量与大孔树脂体积比为1:10 (g:ml)，色谱柱径高比为1:20,用蒸馏水洗脱，洗脱液弃 去，后用95%乙醇洗脱，流速为2柱体积/小时，乙醇洗脱液减压浓缩，浓縮液喷雾干燥，即得，收率为1 .9%。
实施例4:香青兰总黄酮提取物的制备
香青兰50Kg，以与药材重量等重的75%乙醇回流提取5次，每次10小时，合并提取液， 过滤，浓縮至浸膏。浸膏加水10倍稀释，上大孔树脂柱吸附(HPDIOO，河北宝恩化工)，原 药材重量与大孔树脂体积比为1:0.5 (g:ml)，色谱柱径高比为1:30，用蒸馏水洗脱，洗脱液弃 去，后用50%乙醇洗脱，流速为3.5柱体积/小时，乙醇洗脱液减压浓縮，浓縮液喷雾干燥， 即得，收率为1.7%。
实施例5:香青兰总黄酮提取物的制备
香青兰50Kg，以药材重量20倍的5。/。乙醇回流提取2次，每次10小时，合并提取液， 过滤，浓縮至浸膏。浸膏加水2倍稀释，上大孔树脂柱吸附(HPDIOO，河北宝恩化工)，原 药材重量与大孔树脂体积比为1:1 (g:ml)，色谱柱径高比为1:1，用蒸馏水洗脱，洗脱液弃去， 后用20%乙醇洗脱，流速为0.5柱体积/小时，乙醇洗脱液减压浓缩，浓缩液喷雾干燥，即得， 收率为1.5%。
实施例6:香青兰总黄酮提取物的制备
香青兰50 Kg，以药材重量5倍的0%乙醇(即为纯水)回流提取1次，提取10小时， 合并提取液，过滤，浓縮至浸膏。浸膏加水15倍稀释，上聚酰胺柱吸附(60~90目)，原药 材重量与树脂体积比为1:8 (g:ml),色谱柱径高比为1:5,用蒸馏水洗脱，洗脱液弃去，后用 70%乙醇洗脱，流速为3柱体积/小时，乙醇洗脱液减压浓缩，浓縮液喷雾干燥，即得，收率 为2.0%。
实施例7:香青兰总黄酮提取物的制备
香青兰50Kg，以药材重量10倍的20%乙醇回流提取7次，每次0.5小时，合并提取液， 过滤，浓縮至浸膏。浸膏加水IO倍稀释，上聚酰胺柱吸附(60 卯目)，原药材重量与树脂 体积比为1:5 (g:ml)，色谱柱径高比为1:25，用蒸馏水洗脱，洗脱液弃去，后用50%乙醇洗 脱，流速为2.5柱体积/小时，乙醇洗脱液减压浓縮，浓縮液喷雾干燥，即得，收率为2.2%。
实施例8:香青兰总黄酮提取物的制备
香青兰50Kg，以药材重量10倍的40%乙醇回流提取4次，每次6小时，合并提取液， 过滤，浓縮至浸膏。浸膏加水IO倍稀释，上聚酰胺柱吸附(60~90目)，原药材重量与树脂 体积比为1:2 (g:ml)，色谱柱径高比为1:20，用蒸馏水洗脱，洗脱液弃去，后用60%乙醇洗 脱，流速为2柱体积/小时，乙醇洗脱液减压浓縮，浓縮液喷雾干燥，即得，收率为2.0%。
实施例9。.片剂的制备香青兰总黄酮提取物20 g，加入玉米淀粉40g,糊精25g，充分混匀，制颗粒，干燥， 整粒，加适量滑石粉，压片，即得。 实施例10:胶囊剂的制备
香青兰总黄酮提取物20 g，加入淀粉40g、糊精20g，微晶纤维素10g，充分混匀，制 颗粒，千燥，整粒，加入适量硬脂酸镁，装胶囊，即得。 用实施例1制得的提取物进行药效学和毒理学研究 一、香青兰总黄酮提取物对犬心肌缺血的保护作用
1、 仪器与试剂
BioPAC多导生理信号采集分析系统，美国BioPAC公司；CBI激光多普勒血流计，美国 CBI公司；KNOEPRO型全自动生化分析仪，芬兰康艺仪器公司；AVL945型血气分析仪。 阳性药复方丹参片，0.25 g/片，广州白云山和记黄埔中药有限公司产品；
2、 试验动物杂种犬40只，体重11.0~16。0kg，雌雄兼有。
3、 香青兰总黄酮对麻醉犬急性心肌缺血的影响
正常健康犬20只，雌雄兼有，随机分为4组，即香青兰总黄酮大剂量组20mg/kg，香青 兰总黄酮小剂量组10 mg/kg，阳性对照药复方丹参片100 mg/kg及心肌缺血模型组。动物经 2.5%戊巴比妥钠(25mg/kg)静脉麻醉，分离气管并插管，备接电动呼吸器行人工呼吸。分 离股静脉备用。犬右侧卧位，于左侧第四肋间隙开胸，做心包床，分离冠状动脉左前降支1/2 处，引线备结扎用。将心外膜电极缝于心外膜上，经波段开关与BioPAC多导生理信号采集 分析系统相连记录心外膜电图。结扎冠状动脉后30min记录心外膜电图，记录30个导联ST 段移位的总值(2>ST)及ST段移位超过2mv的导联数(N-ST)作为药前值。经十二指肠给 药，心肌缺血模型组给予生理盐水。分别记录给药开始后15 min、 30min、 60min、 90min、 120min、 180min及240min的心外膜电图，计算》ST、 N-ST及其变化率。同时分别于给药 前和给药后2h、 4h由犬股静脉取血检测CK-MB、 CK、 AST、 LDH。给药后4h，经左心耳 根部向左房注入碳素墨水1.0ml/kg，迅速取下心脏，去除脂肪、心房及右室肌，于-20'C下冰 冻3040min，称重。在冠状动脉结扎点下平行冠状沟将左心室切成等厚的5片，分别称重， 用求积仪测量每片心肌两面碳素墨水染色区(非缺血区)及未染色区(缺血区)面积，计算 缺血区占左心室肌重量的百分率。然后将5片心肌置于37。CN-BT染液中，振摇染色15min 取出，如上测出梗塞区及非梗塞区面积，计算梗塞区占左心室肌重量的百分率，并计算出梗 塞区占缺血区心肌重量的百分率。结果表明，香青兰总黄酮大剂量组给药后180min 240min 可以明显减轻麻醉犬急性心肌缺血程度(Z-ST)，与心肌缺血模型组比较有明显差异(pO.05);小剂量组有一定药效作用，但无统计学意义。复方丹参片给药240 min明显减轻麻醉犬急性 心肌缺血程度(p<0.05)。香青兰总黄酮大剂量组给药后180 min~240 min明显縮小麻醉犬急 性心肌缺血范围(N-ST)，与心肌缺血模型组比较有明显差异(p<0.05)，小剂量组无统计学 意义，但有縮小趋势。复方丹参片给药240min明显縮小麻醉犬急性心肌缺血范围。用N-BT 染色显示的心肌梗塞面积与心外膜电图测定的结果一致。 二、香青兰总黄酮提取物急性毒性试验
取正常小鼠20只，雌雄各半，灌胃给予香青兰总黄酮提取物，高剂量达到允许的最大给 药浓度和小鼠最大给药体积，结果动物无一死亡，健康情况良好，皮毛光亮，活动度良好。 14天后处死动物，肉眼观察主要脏器，未见明显异常。表明该提取物毒性极小。
结论药效学研究结果表明，香青兰总黄酮经肠道给药可以明显缩小动物模型组心肌缺 血范围，可用于治疗缺血性冠心病、心绞痛，毒性实验表明，该提取物毒性极低。
权利要求
1.一种香青兰总黄酮提取物，其特征在于其总黄酮含量大于50％，总黄酮提取物中田蓟苷的含量大于5.0％，其是通过以下方法制备的(1)将香青兰地上部分粉碎，用0～95％乙醇回流提取1～8次，每次溶剂用量为原料药材重量的1～20倍，每次提取时间为0.5～10小时，合并提取液，过滤，回收乙醇，浓缩得浸膏；(2)将上述得到的浸膏加水稀释，加水量为浸膏重量的2～20倍，然后上大孔树脂柱或聚酰胺柱吸附，浸膏重量与吸附填料体积的比是1∶0.5～10，单位g∶ml，色谱柱径与柱高比为1∶1～30，然后依次用水和浓度为5～95％的乙醇洗脱，流速为0.5～3.5个柱体积/小时；(3)收集乙醇洗脱液，进行减压浓缩或真空干燥或喷雾干燥或冷冻干燥，即得香青兰总黄酮提取物。
2. —种香青兰总黄酮提取物的制备方法，其特征在于，步骤如下(1) 将香青兰地上部分粉碎，用0~95%乙醇回流提取1~8次，每次溶剂用量为药材重量 的1 20倍，每次提取时间为0.5 10小时，合并提取液，过滤，回收乙醇，浓縮得浸膏；(2) 将上述得到的浸膏加水稀释，加水量为浸膏重量的2 20倍，然后上大孔树脂柱或聚 酰胺柱吸附，浸膏重量与吸附填料体积的比是1:0.5 10，单位g:ml，色谱柱径与柱高比为 1:1~30,然后依次用水和浓度为5~95%的乙醇洗脱，流速为0.5-3.5个柱体积/小时；(3) 收集乙醇洗脱液，进行减压浓縮或真空干燥或喷雾干燥或冷冻干燥，即得香青兰总 黄酮提取物。
3. 权利要求1所述的一种香青兰总黄酮提取物在制备治疗动脉硬化、冠心病、心绞痛药物中 的应用。
4. 权利要求1所述的一种香青兰总黄酮提取物在制备预防动脉硬化、冠心病、心绞痛保健品 中的应用。
5. 根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于是将香青兰总黄酮提取物与磷脂按照重量 比1: 0.2~1: 25的比例制成磷脂复合物。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述磷脂为大豆磷脂或卵磷脂。
7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于将磷脂复合物直接制成口服制剂。
8. 根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于将香青兰总黄酮提取物与医学上可接受的 辅料混合制成胶囊剂、片剂、散剂、颗粒、口服液、酒剂、丸剂、微丸剂、合剂、酊剂中 的任意一种。
全文摘要
本发明公开了一种香青兰总黄酮提取物，是通过以下方法制备的先用乙醇进行提取，然后上大孔树脂柱或聚酰胺柱吸附，乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，进行减压浓缩或真空干燥或喷雾干燥或冷冻干燥，即得香青兰总黄酮提取物。所述香青兰总黄酮提取物中总黄酮含量大于50％，主要有效成分黄酮类化合物田蓟苷含量大于5.0％。所得香青兰总黄酮提取物可以用来制备治疗动脉硬化、冠心病、心绞痛的药物或保健品。
文档编号A61K36/53GK101537039SQ20091002059
公开日2009年9月23日 申请日期2009年4月24日 优先权日2009年4月24日
发明者任冬梅, 娄红祥, 王亚俊 申请人:山东大学