专利名称：一种日本血吸虫病树枝状载体-dna疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明一种日本血吸虫病树枝状载体-DNA疫苗及其制备方法，涉及人畜共患 病核酸疫苗，特别是针对血吸虫病的核酸疫苗，属于生物技术领域。
背景技术：
血吸虫病是一种严重危害人类健康、影响社会经济发展的人畜共患寄生虫病。 目前，血吸虫病流行于全球76个国家和地区，威胁着约7亿多人口的健康，估计感染人 口约2亿。我国是日本血吸虫病流行最严重的国家，经过多年积极防治，我国血吸虫病 防治工作虽取得了举世瞩目的成就，但由于日本血吸虫有40多种保虫宿主，中间宿主钉 螺分布广且难以消灭，而且再感染频繁发生，故以吡喹酮化疗为主的血防策略难以阻断 传播，血吸虫病的流行状况依然严峻。研制安全、有效的血吸虫病疫苗，控制家畜感 染，减少传播来源和对人体的威胁是WHO提出的综合防治血吸虫病中的一个主要措施， 且放在优先发展的位置上，目前已有6种曼氏血吸虫候选疫苗分子得到WH0/TDR认可。
DNA疫苗作为第三代疫苗，由于其稳定、多效、操作简便及易于制备等优点受 到广泛的关注并成为研究的热点。国内外研究者至今已在抗血吸虫病领域进行了大量的 研究，显示了良好的应用前景。日本血吸虫中国大陆株23kDa膜蛋白(SjC23)DNA疫苗， 在不同基因型小鼠C57BL/6和BALB/c和主要的保虫宿主之一大动物"猪"中进行保护 性实验都显示了较好的免疫保护作用。因此，SjC23DNA疫苗是一个很有希望的日本血 吸虫病DNA疫苗。但是，由于其保护率还未能稳定达到WHO规定的高于40X的保护力 水平，因此如何提高日本血吸虫疫苗的保护力成为当前血吸虫病疫苗亟待解决的问题， 也是当今血吸虫病DNA疫苗的研究热点。 DNA向细胞内的传递过程是影响DNA转染水平的一个关键因素，裸露的DNA 在体外和体内转染水平对真核细胞的效率都很低，并且进入细胞的DNA容易受到细胞内 核酸酶的酶切作用影响，从而使存留和表达的时间很短，难以满足治疗和预防的需要。 同时，只有载体系统有效地通过生物体内的一系列生物屏障(靶向目的细胞、组织和器 官)，DNA才能进入细胞。因此，建立安全有效的DNA载体系统对提高疫苗的保护作用 尤为重要。树枝状高分子(dendrimers)是一类三维的、高度有序的人工合成的新型纳米载 体。其中，聚酰胺-胺型树枝状高聚物(PAMAM dendrimers)是研究较为广泛和成熟的类 型，分子表面带正电荷的大量氨基能够与抗体、核酸或荧光团发生静电作用而形成复合 物，鉴于树枝状高分子的纳米结构特点，因此是一类非常理想的生物分子转运载体。近 年来，提高树枝状高分子的细胞黏附能力并降低其细胞毒性成为当前研究的热点。哺乳 动物细胞膜表面带负电荷，因此带正电荷的材料表面与细胞膜表面由于静电吸附，有利 于细胞黏附，而带负电荷的材料表面由于静电排斥，不利于细胞黏附。研究发现，将含 有丰富正电荷基团的氨基酸接枝在树枝状高分子表面，可以增加黏附细胞的数量、增强 细胞的黏附力。本发明将经改性的树枝状载体与血吸虫病DNA疫苗结合构建成树枝状载 体-DNA疫苗。2/8页
发明内容
针对单纯的DNA疫苗转染水平不高的缺点，本发明拟用生物相容性良好的 L-赖氨酸(L-lysine)对PAMAM进行表面修饰，合成生理条件下具有良好生物相容性 的PAMAM-赖氨酸接枝共聚物(PAMAM-Lys)，增加PAMAM表面氨基基团数目，增强 PAMAM的正电性，从而便于和更多的DNA负电荷相互作用，携带更多的DNA。将新 型载体PAMAM-Lys与日本血吸虫pJW4303-SjC 23DNA疫苗结合，构建成一种新型的树 枝状载体-DNA疫苗，以增强血吸虫病DNA疫苗的免疫保护作用。 本发明的技术方案 一种血吸虫病树枝状载体-DNA疫苗，由血吸虫病DNA
疫苗pJW4303-SjC23和改性的树枝状载体PAMAM-Lys结合，即为血吸虫病树枝状载
体-DNA疫苗，即PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23复合物。 该血吸虫病树枝状载体-DNA疫苗的制备方法，包括以下步骤 (l)DNA疫苗pJW4303-SjC23的构建和制备 1)根据SJC23基因序列设计一对引物P1 : 5 ， GCGCTAGCATG GCGACT TTG GGTACT-3 ，p2 : 5' GCGGATCCAAC ATT CTG ATAATCG-3' pl、 p2分别引入限制性酶切位点Nhel和BamHI，由上海生工生物工程技术服 务有限公司合成； 2)日本血吸虫总RNA的提取取lOOmg日本血吸虫中国大陆株成虫，加入 lmLTRIzol(Invitrogen公司)，用一次性研磨杵充分匀浆，在Ependorf管中，室温放置 5min， 4°C、 12,000rpm离心10min，取上清；加入200iiL氯仿，剧烈振荡混匀后室温放 置3-5min使其自然分相，4°C、 12,000rpm离心10-15min后分成三层黄色的有机相，中 间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相(约550 ii L)小心转移到新Ependorf管 中，加入550iiL冰冷的异丙醇，室温放置10-20min， 4°C、 12,000rpm离心10min， RNA 沉淀于管底，弃上清；在RNA沉淀中加入lmL用RNase-free水配制的75X乙醇，轻轻颠 倒混匀，以清洗RNA沉淀，室温放置1-2分钟晾干沉淀后加入100 ii L去RNA酶双蒸水 (RNase-free水)溶解，其浓度及纯度经BECKMAN DU-600核酸蛋白测定仪测定，-70°C 保存备用； 3)cDNA第一链的合成 在Ependorf管中加RNA 1 y g， 75 °C变性5min，迅速置于冰浴中；加入 2iiL10X反转录缓冲液、4iiL25m mol/LMgC12溶液、2 ii L10m mol/L dNTP液、1 ii L RNA酶抑制剂、0.5 ii g反转录引物Oligo dT(12 18个核苷酸组成)和20单位的AMV 反转录酶(Invitrogen公司)，用RNase-free水补充到20 y L，充分混匀，42t:反应1 3h 后加pH 8.0的0.5mol/L EDTA 2 y L终止反应；95。C加热5min灭活AMV反转录酶，置冰 浴5min，合成的cDNA第一链保存于-20^备用；
4)RT-PCR RT-PCR反应体系如下cDNA第一链10iiL、 10X Buffer 10 ii L、 25m mol/L MgCl2溶液6iiL、 10m mol/L dNTP液2 ii L、弓l物pl2yL、弓l物p22yL、 Taq DNA聚合 酶2.5单位、加ddH20至总体积100 ii L ;
反应条件为95。C预变性5min; 95。C变性30s， 56。C退火30s， 72。C延伸lmin， 进行30个循环；末次循环后72t:延伸10min ;取5 y L反应产物行1 %琼脂糖凝胶电泳， 凝胶成像系统鉴定RT-PCR产物片段大小与目的片段SJC23大小相同即657bp ;其核苷酸 序列为SEQIDNO : 1
5)DNA疫苗的构建 本发明采用pJW4303真核表达质粒(DNA immunisation with Onchocerca volvulus chitinase induces partial protection against challenge infection with L31arvae in mice.Harrison RA， WuY， EgertonG， Bianco AE.Vaccine. 1999Novl2 ; 18(7-8) : 647-655.)作为血吸虫 抗原基因SjC 23的表达载体。取含真核表达质粒pJW4303的大肠杆菌XLl-blue单菌落 于含氨苄青霉素(Amp，终浓度100 g/mL)的3mL培养基中，37°C、 250rpm振荡培养 16h，按照Promega公司质粒DNA小量抽提试剂盒(Wizard Plus Minipreps DNA Purification System)抽提质粒； 限制性内切酶Nhel和BamHI双酶切质粒pJW4303 : pJW430316iiL、 Nhe I
1 ii L、 BamH I 1 ii L、 Buffer B 2 ii L，总体积20 ii L， 37。C水浴4h ;将所得的SJC23在相同条件下用限制性内切酶NheI和BamHI酶切； 将酶切纯化后的SJC23与pJW4303用T4DNA连接酶进行连接，连接反应如下
pJW43036iiL、 SjC232iiL、 T4DNA连接酶1 y L、 10X缓冲液liiL，总体积10iiL，
16。C水浴过夜12 16h ; 连接产物转化大肠杆菌XLl-blue后，鉴定阳性重组子，通过双酶切及DNA测序 鉴定，得到的阳性重组子即为重组质粒pJW4303-SjC23 ;
6pNA疫苗的大量制备pJW4303-SjC23质粒DNA的大量制备按Qiagen公司Qiagen-2500操作说明进 行，制备的质粒DNA溶解于无菌生理盐水，其浓度及纯度经BECKMAN DU-600核酸蛋 白测定仪测定，所制备DNA的A260/A280为1.85 1.95，浓度均调整为lmg/mL ;
p)聚酰胺-胺树枝状高分子(PAMAM，乙二胺为内核)的端基改性
1)縮合反应 由于PAMAM的代数越高，末端端基数越多，细胞毒性也越大，故本发明对目 前常用的4.0代PAMAM进行改性(购自SIGMA公司)。以无水N， N- 二甲基甲酰胺 (DMF)为溶剂，将4.0代PAMAM lg和氨基保护的L-赖氨酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)4g加入 50mL三颈瓶中，加入1-羟基苯并三唑(HOBt)、苯并三氮唑-N， N， N' ， N'-四甲基 脲六氟磷酸酯(HBTU)和N， N-二异丙基乙胺(DIPEA)(HOBt : HBTU : DIPEA质量比
为i : i : 2)组成的縮合剂(o.ig)，通氮气，室温搅拌反应4h;加入大量乙醚使产物沉
淀析出，离心去除上层清液，然后用过量乙醚洗涤沉淀，离心收集得到氨基保护的L-赖 氨酸改性聚酰胺-胺树枝状高分子(PAMAM-Lys(Boc)-Fmoc)淡黄色沉淀。
2)芴甲氧羰基(Fmoc-)保护基的脱除 Fmoc-保护基在酸性条件下稳定，但在10%哌啶下很容易脱除，缺点是进行其 它反应时要尽量避免使用强碱性条件。实验中，加入哌啶和无水DMF(体积比为30 : 70) 脱除Fmoc-官能团。先用14mL DMF溶解上述步骤1)所得产物氨基保护的L-赖氨酸改 性聚酰胺-胺树枝状高分子(PAMAM-Lys(Boc)-Fmoc)，再加入6mL哌啶，然后在室温下冷凝回流lh。反应完成后，产物在大量乙醚中沉淀，离心去除上层清液；并用过量乙醚 多次洗涤沉淀，离心收集沉淀物，得到白色粉末状沉淀。
3)叔丁氧羰基(Boc-)保护基的脱除 Boc-保护基在碱性条件下稳定，但可以在酸性条下脱除。实验中，以三氟乙酸 和无水DMF(体积比为1 : 9)脱除Boc-官能团。先用9mL无水DMF溶解步骤2)所得脱 除芴甲氧羰基(Fmoc-)保护基的氨基保护的L-赖氨酸改性聚酰胺-胺树枝状高分子产物， 再加入lmL三氟乙酸，室温冷凝回流lh。反应完成后，产物在大量乙醚中沉淀，离心去 除上层清液。并用过量乙醚多次洗涤沉淀，离心收集沉淀物，得到白色粗产品沉淀，即 为L-赖氨酸改性聚酰胺-胺树枝状高分子(PAMAM-Lys)。
4)产物纯化 将步骤3)所得产物L-赖氨酸改性聚酰胺-胺树枝状高分子(PAMAM-Lys)溶于 双蒸水并在4t:条件下用截留分子量为14000的透析膜透析12h，冷冻干燥条件下收集产 物，得到白色粉末PAMAM-Lys。 PAMAM改性前后的结构变化如图1所示。从图1中 可以看出，改性后PAMAM-Lys内层结构不发生变化，表面基团增多，末端氨基数目比 4.0代PAMAM增加一倍，分子半径明显增大。
5)PAMAM-Lys的表征将PAMAM-Lys(2 3mg)粉末样品与无水溴化钾(约300mg)研细后放入模
具中，在真空下用压片机加压制成含有分散样品的卤盐薄片，固定在样品架上，采用
Magna 750型傅立叶变换红外光谱仪对PAMAM-Lys进行结构表征；同时用德国Bruker公
司Avance300核磁共振仪对PAMAM-Lys进行"H-NMR结构表征。观测频率为399Hz，重
水(D20)做溶剂。红外光谱和核磁共振光谱表征的结果说明赖氨酸改性4.0代PAMAM
树枝状高分子的合成是成功的。(3)树枝状载体-DNA疫苗的制备 将PAMAM-Lys树枝状载体聚合物溶于生理盐水中，配成lmg/mL备用，由于整 代PAMAM及其衍生物的外层-NH2在水溶液中容易电离，从而带一个单位的正电荷，但 质粒单核苷酸在水溶液中通常带单个负电荷，因此选用电荷比(U，即聚合物外层正电 荷的摩尔数与DNA中磷酸基团负电荷的摩尔数之比作为确定整代PAMAM树枝状高分子 与质粒DNA配比的标准。计算公式为
Cplai;mid X Kplasmid—Cp0jvmcr X i\'p0jvmcr
^-■，十A —- 上式中，Cplasmid为质粒浓度(mg/mL)， Vplasmid为质粒体积(P L)， 330为质粒单核 苷酸分子量，Mp。lymCT为聚合物相对分子质量，Cp。lymCT为聚合物浓度(mg/mL)， Np。lymCT为聚 合物表面基团数，V为需要加入的聚合物体积(PL)。 由公式计算出电荷比R^ = 0.5、 1、 2、 4、 8、 10时所需要的聚合物用量。具 体制备过程如下用移液枪分别量取10y L质粒DNA溶液和所需体积的树枝状高分子溶 液，然后在Eppendorf管中混合均匀，振荡10s， 37。C静置10min，即为血吸虫病树枝状载 体-DNA疫苗，即PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23复合物。本发明的有益效果日本血吸虫病pJW4303-SjC23疫苗与PAMAM-Lys结合构
建成的树枝状载体-DNA疫苗具有明显提高宿主的免疫反应性和免疫保护作用，而且与
8宿主组织细胞具有良好的生物相容性。该疫苗具有十分广阔的应用前景。
图1PAMAM改性前后的结构变化。(a)4.0G PAMAM， (b)PAMAM-Lys。 图2样品的透射电镜图。A、纯质粒(X5万倍)，B、 PAMAM-Lys/DNA(R^—=
4， X8万倍)。 图3各组免疫小鼠IgG抗体水平。1、对照组1(pJW4303)， 2、对照组2(PAMAM-Lys)3、 pJW4303-SjC23组，4、 PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23组。
具体实施例方式
实施例1 :树枝状载体-DNA疫苗的特性分析 1 、电泳阻滞实验通过琼脂糖凝胶电泳确定质粒DNA与PAMAM-Lys树枝状高分子完全复合的最佳电荷比R^-。结果表明PAMAM-Lys在电荷比为4时结合DNA能力达到最强。 2、树枝状载体-DNA疫苗的形态考察用透射电子显微镜(TEM)观察疫苗形态。分别将质粒DNA和树枝状载体-DNA疫苗溶液10 ii L滴在铜网上，吸附2min后，用滤纸将溶剂吸干；再用10iiL2X醋酸双氧铀滴在铜网上进行负染色，吸附2min后，再用滤纸吸干。待晾干后放置于电镜下观测。结果质粒DNA与树枝状载体结合后，较纯质粒直径变小，树枝状载体-DNA疫苗的粒径趋向于平均化；PAMAM-Lys/DNA复合物(R^ = 4)形成的复合物图像上呈现出规则排列的粒子形态，粒径在50 100nm之间(图2)。 3、树枝状载体-DNA疫苗的稳定性考察将该树枝状载体-DNA疫苗溶液放置Oh、 6h、 12h、 24h、 36h后，1%琼脂糖凝胶电泳分析，考察疫苗的稳定性。结果树枝状高分子与质粒DNA的复合物在36h时间内没有发生解离，有较好的稳定性。
实施例2树枝状载体的体外细胞毒性评价 取生长状态良好的293人胚肾细胞，调整细胞浓度至lX105/mL，均匀铺于96孔板(100iiL/孔)，于37。C， 5XCO2细胞培养箱中培养12h后将5.0代PAMAM、PAMAM-Lys聚合物溶液及PAMAM/DNA复合物溶液按照2 y L、 10 y L、 50 y L三组用量加入到96孔板中，每组作3个复孔。培养4h后加入100 ii L 5%小牛血清(FCS)DMEM培养基(GIBCO)，于37°C、 5% C02细胞培养箱中继续分别培养12h、 24h和48h。 显微镜观察细胞的形态变化，噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞相对增殖率，考察不同加药量和
用药时间对细胞形态及细胞活性的影响。细胞相对增殖率
<formula>formula see original document page 9</formula> 5XFCSDMEM培养基中培养的细胞作为阴性对照，其细胞相对增殖率设为
100%，阳离子聚合物多聚赖氨酸(PLL)作为阳性对照，本底设为5XFCSDMEM培养
基、MTT、 二甲基亚砜(DMSO)，不含细胞。各复孔的OD值取平均数。树枝状高分子5.0代PAMAM和PAMAM-Lys在10 y L(浓度约为100 y g/mL)用量下没有表现出明显的细胞毒性；PAMAM-Lys细胞相对增殖率为91.7%， 5.0GPAMAM 细胞相对增殖率为80.2% ，而阳离子聚合物PLL相对增殖率仅为27.6%; PAMAM-Lys细 胞毒性明显低于5.0GPAMAM ;与4.0GPAMAM相比，PAMAM-Lys增加了末端氨基基 团数目，即表面正电荷数目，从而提高了与DNA的结合效率；与具有相同末端基团数目 的5.0GPAMAM相比，PAMAM-Lys可降低因多步合成所造成的细胞毒性，证实了所合成 树枝状载体PAMAM-Lys具有良好的生物相容性，可以用于生物体内实验。
实施例3树枝状载体-DNA疫苗的免疫反应性测定 将50只实验小鼠随机分为4组，即pJW4303(对照组1)、 PAMAM-Lys(对照组 2)、 pJW4303-SjC23和PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23，每组12 14只。各组小鼠分别注射 纯化的pJW4303、 PAMAM-Lys、 pJW4303-SjC23和复合物PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23 于小鼠股四头肌，每鼠100iig，左右腿各50iig。每隔2周加强免疫1次，剂量和方法 相同，共免疫3次。首次免疫前及末次免疫后4周分别经尾静脉采血，分离血清置-2(TC 保存备用。采用间接ELISA法检测免疫后小鼠的抗体，评价经疫苗免疫后小鼠产生特异 性抗体的水平。抗体检测结果表明，pJW4303-SjC23疫苗和PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23疫 苗均能诱导小鼠产生特异性IgG抗体，A站。值分别为0.546±0.152、 0.725±0.165，与 pJW4303-SjC23相比，PAMAM-lys/pJW4303-SjC23的抗体水平显著升高(P < 0.05)，对照 组1(pJW4303)和对照组2(PAMAM-Lys)均未检测到特异性抗体(图3)。
实施例4脾细胞培养上清中细胞因子检测 末次免疫后3周，每组各取2只小鼠拉颈处死，无菌取脾脏，常规法制备单个脾 细胞悬液，用SjC23-大亲水片段蛋白(SjC23-HD)[日本血吸虫(大陆株)23kD分子(SJC23) 大亲水肽段(HD)在PGEX-5X-1中表达。余传信.朱荫昌.殷旭仁.何伟.华万全.实用 寄生虫病杂志2000(4)]作为剌激原诱生细胞因子。具体步骤 l)拉颈处死小鼠，75X酒精浸泡3 5min，取出后置于平皿中，无菌取脾脏。
2)脾脏用镊子研磨，通过200目不锈钢筛网滤下，用不完全RPMI-1640(GIBCO) 培养液悬浮至5mL。 3)1000rpm离心5min ;弃去上清，在沉淀中加2mL红细胞裂解液，混匀。
4)1000rpm离心5min ;弃去上清，用5mL不完全RPMI-1640培养液重悬脾细 胞。 5)1000rpm离心5min ;小心吸掉上清，用10% FCS RPMI-1640完全培养液调整 细胞浓度为6Xl(f个/mL。 6)在96孔细胞培养板上，每孔加脾细胞悬液100iiL，加剌激原100iiL。每组小 鼠的脾细胞悬液分为二份， 一份以SjC23(5 ii g/mL)作为剌激原，余下的一份加10% FCS 完全RPMI-1640培养液作为对照。每份样品均行双复孔检测。 7)培养板置培养箱中，5%C02， 37t:培养72h，离心收集上清进行细胞因子检 测。流式细胞仪检测鼠白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素5(IL-5)、 Y干扰素(IFN-Y)、肿瘤坏死因子(TNF)水平，操作按照BD公司试剂盒说明书，采用流 式细胞微球法(CBA法)进行检测。脾细胞经SJC23剌激，IL-2、 IFN- Y和TNF的细胞 因子水平，相对于空质粒对照组1(pJW4303)和改性树枝状载体对照组2(PAMAM-Lys)，
10疫苗组pJW4303-SjC23组和PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23组均有所升高，且PAMAM-Lys/ pJW4303-SjC23组明显高于pJW4303-SjC23组(表1)。 各组的IL-4和IL-5的水平均低于 检测限。 表1细胞因子IL-2、 IFN- Y和TNF检测结果
IL-2 (pg/mL) !FN-y (pg/mL) TNF (pg/mL)
组别 -■- ——
傘A甜蹈SjC23空白对照S i C.2 j空白对照
l)AMA M習Lys/p J W43 03邻23,,02<20329.71<202聽J4<20
pJW'130-VSj(，2352,86<2092扁<20107,86<20
对麗龜1 (ijJW4303》<20<20<2041,24<20
对照纟H 2 (iWMAM-Lys》<20<2030.12<2039,73<20 实施例5免疫保护性试验 将50只实验小鼠随机分为4组，即pJW4303(对照组1)、 PAMAM-Lys(对照组 2)、 pJW4303-SjC23和PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23，每组12 14只。各组小鼠分别注 射pJW4303、 PAMAM-Lys、 pJW4303-SjC23及PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23于小鼠股四 头肌，每鼠100iig，左右各50yg。每隔2周加强免疫1次，剂量和方法相同，共免疫3 次。第3次免疫后4周每只小鼠经腹部皮肤感染(40士1)条尾蚴。攻击感染后42d剖杀 小鼠，用枸橼酸生理盐水灌冲，在门静脉收集成虫并计数，取出肝脏称重后剪碎置5mL 5XK0H溶液中，37t:消化过夜，计数虫卵。按下列公式计算减虫率及减卵率 减虫率=[(对照组平均每鼠成虫数-实验组平均每鼠成虫数y对照组平均每鼠成
虫数]X100X 减卵率=[(对照组平均每鼠肝脏虫卵数-实验组平均每鼠肝脏虫卵数)/对照组平 均每鼠肝脏虫卵数]X100X 各实验组小鼠所检成虫数低于对照组，P<0.01。 相对于对照组l， pJW4303-SjC23组和PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23组减虫率分别为34.00%和45.33%，且 PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23组减虫率显著高于pJW4303-SjC23组，P < 0.05 ;对照组1
与对照组2差异无显著性(P > 0.05)各组小鼠检获的成虫数见表2。
表2各组小鼠检获的成虫数的比较
组别*小鼠数成虫数P值
(x±s)(%)
pJW4303-SjC231219息4.1134.00<0.()1
PAM扁層Lys/pJ，4303-SjC231216,德2.4145.33<0.01
对麗组1 (pJW4303)1330扉5,06—<0.01
对照组2 (PAMAM-Lys)1329息3J91.9>0.05 各组小鼠肝脏组织中检获的虫卵数见表3。各实验组小鼠肝脏组织检获的虫 卵数均低于对照组，P < 0.01。
相对于对照组1， pJW4303-SjC23组和PAMAM-Lys/ pJW4303-SjC23组减卵率分别为40.14X禾P 59.61%， PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23组减卵 率显著高于pJW4303-SjC23组，P < 0.05 ;对照组1与对照组2差异无显著性(P > 0.05)。
表3各组小鼠肝脏组织检获的虫卵数的比较
组别*小鼠数虫卵数 (X ±s)减卵率 (%)P值
pJW4303-SjC23124300tttlOU540.14<0.01
PAMAM-Lys/pJW棚3画SjC231263727±1138759.61<0.01
对廳蕴l (pJW4303)106454±26742—<0,01
对照组2 (PAMA.M-Lys)131〗27i5土20148>0.05 序列表 SEQIDNO : 1 atggcgactt tgggtactgg gatgaggtgt ctgaagagtt gtgtgttcat attgaacatt 60 atctgtctgt tatgttccct tgtattaata ggcgctggtg catatgtaga agttaaattc 120 agccagtatg aggctaattt acataaagtc tggcaggcgg ctcccatcgc aattattgtg 180 gttggagtgg taattctcat agtaagcttc ttgggctgtt gtggagctat aaaggaaaac 240 gtctgcatgc tttacatgta tgcatttttc cttattgtcc ttctgattgc tgagttggtc 300 gccgccattg ttgcggtggt gtacaaggat aaaatcgatg acgaaattaa tacactaatg 360 actggtgctc tggaaaatcc aaacgaggaa她acggcaa ccatggataa gatacaaaca 420 tcattccatt gttgtggagt caaaggtcca gacgattata aagggaatgt gccagcatca 480 tgtaaagaag ggcaagaagt ttatgttcag ggttgtctat ctgtctttag tgcattctta 540 aaacgcaact taataattgt tgcctgtgtg gcattcggtg tatgcttctt ccaactgcta 600 agcatcgtta tagcttgttg tttgggtcaa cgaatacacg attatcagaa tgtttaa 657 pi : 5， -GCGCTAGCATGGCGACTTTGGGTACT-3， p2:5， -GCGGATCC AAC ATT CTG ATAATCG-3，
1权利要求
一种日本血吸虫病树枝状载体-DNA疫苗，其特征在于由血吸虫病DNA疫苗pJW4303-Sj23和改性的树枝状载体PAMAM-Lys结合，即为血吸虫病树枝状载体-DNA疫苗，即PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23复合物。
2. 权利要求1所述的血吸虫病树枝状载体-DNA疫苗的制备方法，其特征在于它包括 以下步骤(1)DNA疫苗pJW4303-SjC23的构建和制备1) 根据SJC23基因序列设计一对引物p 1 : 5' -GC GCTAGC ATG GCG ACT TTG GGTACT-3' p2 : 5' -GC GGATCC AAC ATT CTG ATAATCG-3' pl、 p2分别引入限制性酶切位点Nhe I和BamH I;2) 日本血吸虫总RNA的提取取100mg日本血吸虫中国大陆株成虫，加入lmL TRIzol，用一次性研磨杵充分匀浆，在Ependorf管中，室温放置5min， 4°C、 12,000rpm 离心10min，取上清；加入200 y L氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分 相，4°C、 12,000rpm离心10-15min后分成三层黄色的有机相，中间层和无色的水相， RNA主要在水相中，把水相小心转移到新Ependorf管中，加入550 y L冰冷的异丙醇，室 温放置10-20min， 4°C、 12,000rpm离心10min， RNA沉淀于管底，弃上清；在RNA沉淀 中加入lmL用RNase-free水配制的75%乙醇，轻轻颠倒混匀，以清洗RNA沉淀，室温 放置l-2min晾干沉淀后加入100 y L RNase-free水充分溶解，其浓度及纯度经BECKMAN DU-600核酸蛋白测定仪测定，-70°〇保存备用；3) cDNA第一链的合成在Ependorf管中加RNA lyg， 75。C变性5min，迅速置于冰浴中；加入2iiL10X 反转录缓冲液、4iiL 25m mol/LMgCl2溶液、2 y L 10m mol/L dNTP液、1 y L RNA酶抑 制剂、0.5iig反转录引物OligodT和20单位的AMV反转录酶，用RNase-free水补充到 20iiL，充分混匀，42。C反应1 3h后加pH8.0的0.5mol/LEDTA2iiL终止反应；95°C 加热5min灭活AMV反转录酶，置冰浴5min，合成的cDNA第一链保存于-20匸备用；4) RT-PCRRT-PCR反应体系如下cDNA第一链10 ii L、 10XBuffer 10 ii L、 25mmol/L MgC12 溶液6iiL、 10mmol/LdNTP液2iiL、弓l物pl2yL、弓l物p22yL、 TaqDNA聚合酶2.5 单位、加ddH20至总体积100 ii L ;反应条件为95。C预变性5min; 95。C变性30s， 56。C退火30s， 72。C延伸lmin，进行 30个循环；末次循环后72t:延伸10min ;取5 y L反应产物行1 %琼脂糖凝胶电泳，凝胶 成像系统鉴定RT-PCR产物片段大小与目的片段SJC23大小相同，即657bp ;5pNA疫苗的构建采用pJW4303真核表达质粒作为血吸虫抗原基因SjC 23的表达载体，取含真核表达 质粒pJW4303的大肠杆菌XLl-blue单菌落于含终浓度100 y g/mL氨苄青霉素的3mL培养 基中，37°C、 250rpm振荡培养16h，按照Promega公司质粒DNA小量抽提试剂盒抽提质 粒；限制性内切酶Nhel和BamHI双酶切质粒pJW4303 : pJW4303 16yL、 Nhel lyL、 BamH I 1 ii L、 Buffer B 2 ii L，总体积20 ii L， 37。C水浴4h ;将所得的SJC23在相同条件下用限制性内切酶Nhe I和BamH I酶切；将酶切纯化后的SJC23与pJW4303用T4 DNA连接酶进行连接，连接反应如下 pJW4303 6 ii L、 SjC23 2 y L、 T4 DNA连接酶1 P L、 10 X缓冲液1 y L，总体积10 y L， 16。C水浴过夜12 16h ;连接产物转化大肠杆菌XLl-blue后，鉴定阳性重组子，通过双酶切及DNA测序鉴 定，得到的阳性重组子即为重组质粒pJW4303-SjC23 ;6)DNA疫苗的大量制备pJW4303-SjC23质粒DNA的大量制备按Qiagen公司Qiagen-2500操作说明进行，制 备的质粒DNA溶解于无菌生理盐水，其浓度及纯度经BECKMAN DU-600核酸蛋白测定 仪测定，所制备DNA的A260/A280为1.85 1.95，浓度均调整为lmg/mL ;(2) 聚酰胺-胺树枝状高分子乙二胺为内核的PAMAM的端基改性1) 縮合反应对4.0代PAMAM进行改性以无水N， N-二甲基甲酰胺为溶剂，将4.0代PAMAM lg，和氨基保护的L-赖氨酸Fmoc-Lys(Boc)-OH4g，加入50mL三颈瓶中，加入1-羟基 苯并三唑HOBt、苯并三氮唑-N， N， N' ， N'-四甲基脲六氟磷酸酯HBTU和N， N-二异丙基乙胺DIPEA， HOBt : HBTU : DIPEA质量比为1 : 1 : 2组成的縮合 剂0.1g，通氮气，室温搅拌反应4h;加入乙醚使产物沉淀析出，离心去除上层清液， 用过量乙醚洗涤沉淀，离心收集得到氨基保护的L-赖氨酸改性聚酰胺-胺树枝状高分子 PAMAM-Lys(Boc)-Fmoc淡黄色沉淀；2) 芴甲氧羰基Fmoc-保护基的脱除用14mL无水DMF溶解PAMAM-Lys(Boc)-Fmoc，再加入6mL哌啶，哌啶无水 DMF体积比为30 : 70，然后在室温下冷凝回流lh，反应完成后，产物在大量乙醚中沉 淀，离心去除上层清液；并用过量乙醚多次洗涤沉淀，离心收集沉淀物，得到白色粉末 状沉淀；3) 叔丁氧羰基Boc-保护基的脱除以三氟乙酸和无水DMF脱除Boc-官能团，三氟乙酸无水DMF体积比为1 : 9， 先用9mL无水DMF溶解步骤2)所得脱除Fmoc-保护基后的产物，再加入lmL三氟乙 酸，室温冷凝回流lh，反应完成后，产物在大量乙醚中沉淀，离心去除上层清液，并用 过量乙醚多次洗涤沉淀，离心收集沉淀物，得到白色粗产品沉淀，即为L-赖氨酸改性聚 酰胺-胺树枝状高分子PAMAM-Lys ;4) 产物纯化将步骤3)所得产物PAMAM-Lys溶于水并在4"C条件下用截留分子量为14000的透析 膜透析12h，冷冻干燥条件下收集产物，得白色粉末PAMAM-Lys;(3) 树枝状载体-DNA疫苗的制备将PAMAM-Lys树枝状载体聚合物溶于生理盐水中，配成lmg/mL备用；用移液枪 分别量取10 y L质粒DNA溶液和所需体积的树枝状高分子PAMAM-Lys溶液，高分子外 层正电荷的摩尔数与DNA中磷酸基团负电荷的摩尔数之比，即电荷比R^-为0.5、 1、 2、 4、 8或10.时所需要的聚合物体积用量计算公式为3<formula>formula see original document page 4</formula>上式中，Cplasmid为质粒浓度mg/mL， Vplasmid为质粒体积P L， 330为质粒单核苷酸分 子量，Mp。lymCT为聚合物相对分子质量，Cp。lymCT为聚合物浓度mg/mL， Np。lymCT为聚合物表 面基团数，V为需要加入的聚合物体积P L ;然后在Eppendorf管中混合均匀，振荡10s， 37。C静置10min，即为血吸虫病树枝状载 体-DNA疫苗；即PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23复合物。
全文摘要
一种日本血吸虫病树枝状载体-DNA疫苗及其制备方法，涉及人畜共患病核酸疫苗，特别针对血吸虫病的核酸疫苗，属于生物技术领域。本发明由血吸虫病DNA疫苗pJW4303-SjC23和改性的树枝状载体PAMAM-Lys结合，即为血吸虫病树枝状载体-DNA疫苗PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23复合物。其制备方法，包括以下步骤(1)DNA疫苗pJW4303-SjC23的构建和制备，(2)聚酰胺-胺树枝状高分子乙二胺为内核的PAMAM的端基改性，(3)树枝状载体-DNA疫苗的制备。日本血吸虫病DNA疫苗pJW4303-SjC23与PAMAM-Lys结合构建成的树枝状载体-DNA疫苗，具有明显提高宿主的免疫反应性和免疫保护作用，而且与宿主组织细胞具有良好的生物相容性。该疫苗具有十分广阔的应用前景。
文档编号A61K48/00GK101690806SQ20091003624
公开日2010年4月7日 申请日期2009年10月12日 优先权日2009年10月12日
发明者朱荫昌, 李新松, 王晓婷, 赵松, 郭玲香, 高秋端 申请人:江苏省血吸虫病防治研究所;东南大学