专利名称：一种妇炎康片指纹图谱的测定方法
技术领域：
本发明涉及中药制剂检测技术领域，是一种中药制剂指纹图谱的测定方法，特别是中 药妇炎康片指纹图谱测定方法的建立。
背景技术：
中药制剂妇炎康片为《卫生部药品标准中药成方制剂》第18册收载的品种，是国家 中药保护品种，由赤芍、丹参、黄柏、芡实、当归、土茯苓、山药、三棱等13味药组成， 具有活血化瘀、软坚散结、清热解毒、消炎止痛、除湿止痛等功效，为妇科常用中药。适 用于慢性附件炎、盆腔炎、阴道炎、膀胱炎、慢性阑尾炎、尿路感染等症。其疗效已得到 临床的验证。药理实验表明，妇炎康片对小鼠巴豆油、大鼠角叉菜胶致炎及大鼠棉球肉芽
肿均有抑制作用能抗致炎剂所致组织液渗出对热板及醋酸致痛有镇痛作用；提高动物 胸腺及脾脏重量；对金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、大肠杆菌、白色念珠菌均有抑 制作用。
随着科学技术的发展，现代分析检测仪器的普及应用，使中药检测分析水平有了显著 提高，药品质量控制方法不断完善。其中，指纹图谱技术在中药质量控制中发挥越来越重 要的作用。中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类 成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段，中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药 指纹图谱对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要的意义。日本汉方药主要生产企业 在20世界80年代就已经在企业内部采用高效液相指纹图谱控制质量。美国FDA最近几年 制定的植物草药指南中已经明确把指纹图谱作为混合物质群的质量控制方法(FM， Guidance of Industry : Botanical Drug (Draft) 2004)。随着研究的深入，作为中医 理论的实践产物，中药，尤其是复方中药，其中所含的任一成分都不能代表其整体疗效， 单一的含量测定指标也无法全面反映并控制制剂质量。人们逐渐认识到，现行的参照西药 (合成药)质量控制模式的质量标准不能恰当地反映重要内在的质量。未来，中药的发展 趋势将从现行的质量控制模式向一种综合的、宏观的、可量化的鉴别与主要有效成分含量 测定结合的模式转变。中药指纹图谱采用光谱、色谱等分析方法，对中药材(中成药)的 成分进行检测，形成特有的专属化学图谱，该图谱能全面反映中药所含内在化学成分的种 类和数量，具有相对唯一性。另外，中药指纹图谱正好体现了中医药的整体、宏观、复杂 的特点。
4妇炎康片是临床常用的妇科药物。是否能够保证药物质量以及有效成分的含量，是决 定妇炎康片疗效的基础。目前，生产妇炎康片有数家厂家，其质量良莠不齐，因而其稳定 性难以保证。建立妇炎康片有效的质量评价方法，确保妇炎康片的质量稳定，直接关系到 妇炎康片产品的有效性、安全性、稳定性。因此，采用指纹图谱技术对妇炎康片实行质量 控制，以保证妇炎康片的质量更加安全、稳定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种中药复方制剂妇炎康片高效液相色谱指纹图谱的测定方 法，采用此指纹图谱测定方法，可以有效控制妇炎康片的质量，保证妇炎康片的安全性、 稳定性。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案 一种妇炎康片指纹图谱的测定方法，其 特征在于包括以下步骤
① 供试品溶液的制备取妇炎康片成品，研细，精密称取一定量粉末，精密加入乙醇， 密塞，称定重量，超声处理，放冷，用乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，过微 孔滤膜，即得；
② 对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品、丹酚酸B对照品、盐酸小檗碱对照品， 加甲醇制成含各对照品的适宜浓度的混合溶液，摇匀，过微孔滤膜，即得对照品溶液；
③ 测定精密吸取供试品溶液、对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，照高效液相 色谱法测定，得色谱指纹图谱，其中色谱条件采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的 色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.04mol/L磷酸二氢钾(含0. 1。/。磷酸)水溶液为流动相B， 进行梯度洗脱；检测波长分别为230nm、 286nm、 265nm。
本发明突出的实质性特点及优点如下
1. 本发明以妇炎康片中主要有效成分芍药苷、丹酚酸B、盐酸小檗碱为指标建立指纹 图谱，代表了妇炎康片的药效活性，能有效地控制妇炎康片的质量，适用于妇炎康片中化 学成分的检测，对成品质量进行全面控制。
2. 本发明对芍药苷、丹酚酸B、盐酸小檗碱等3种化学有效成分同时进行检测，注重 图谱的"整体特征"，并可根据图谱进行上述各有效成分的含量测定，避免了只测定某一 个化学成分来判定妇炎康片质量的片面性。本发明为完整、准确评价妇炎康片的质量提供 了新的标准，能有效控制妇炎康片的质量。
3. 本发明的指纹图谱检测方法，其优点是简便、稳定、精密度高、重复性好、易于操 作，能从色谱的整体特征中把握妇炎康片的质量情况。
图l是230nm波长下对照品芍药苷、丹酚酸B、盐酸小檗碱的色谱图； 图2是230nm波长下妇炎康片HPLC指纹图谱；
图3是286rai波长下对照品芍药苷、丹酚酸B、盐酸小檗碱的色谱图； 图4是286nm波长下妇炎康片HPLC指纹图谱；
图5是265nm波长下对照品芍药苷、丹酚酸B、盐酸小檗碱的色谱图6是265nm波长下妇炎康片HPLC指纹图谱。
具体实施例方式
本发明的妇炎康片指纹图谱的测定方法，包括以下步骤-
① 供试品溶液的制备取妇炎康片成品，研细，精密称取一定量粉末，精密加入乙醇， 密塞，称定重量，超声处理，放冷，用乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，过微 孔滤膜，即得；
② 对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品、丹酚酸B对照品、盐酸小檗碱对照品， 加甲醇制成含各对照品的适宜浓度的混合溶液，摇匀，过微孔滤膜，即得对照品溶液；
③ 测定精密吸取供试品溶液、对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，照高效液相 色谱法测定，得色谱指纹图谱，其中色谱条件采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的 色谱柱；以乙腈为流动相A，以0. 04niol/L磷酸二氢钾(含0. 1%磷酸)水溶液为流动相B， 进行梯度洗脱；检测波长分别为230nra、 286nm、 265nm。
本发明所述的指纹图谱，供试品所得图谱与对照品所得图谱，其相应峰的保留时间应 --对应。
本发明所述的供试品溶液制备方法取妇炎康片成品5 20片，除去包衣，研细，取 样品0.1 0.5g，精密称定，精密加入乙醇50mL，密塞，称定重量，超声处理10 30分 钟，放冷，称定重量，用乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45um微孔滤 膜，即得。所用乙醇为体积比70%乙醇。超声处理条件功率为100 250W,频率20 50kHz， 较佳的条件是功率250W，频率50kHz:超声处理时间为30分钟较好。
本发明所述的对照品溶液制备方法精密称取芍药苷对照品、丹酚酸B对照品、盐酸 小檗碱对照品，加甲醇制成每lml含芍药苷对照品60pg、丹酚酸B对照品80吗、盐酸小 檗碱对照品40Mg的混合溶液，摇匀，过0.45^微孔滤膜，即得。
本发明所述的指纹图谱测定方法，采用高效液相色谱仪器检测，适用于HP1100、 Waters、 DI0NEX、岛津等各种品牌高效液相色谱仪(含DAD检测器)。色谱条件以十八烷基硅垸键合硅胶为填充剂的色谱柱(4.6mm x250mm， 5pm)，检测波长为230nm、 286nm、
265nm，柱温30'C，进样量10pL,记录时间为45分钟；流速1.0mL/min，以乙腈为流动
相A，以磷酸二氢钾水溶液为流动相B，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如表l:
表1流动相梯度洗脱表 时间(min) 流动相A(y。) 流动相B(W
0 10 14—15 86—85
10 14 15—18 85—82
14 28 18—23 82—77
28 40 23—33 77—67
40 45 33 67
上述流动相A和流动相B溶液的配制比例是按体积比配制。较好的，流动相B为 0.04mol/L磷酸二氢钾(含0.1%磷酸)水溶液。色谱柱较好的为DIKMA Kromasil C18色谱柱， 其规格为4.6咖X250咖，5拜。检测波长为230nm、 286咖、265咖，该三个波长同时测定， 分别为芍药苷、丹酚酸B、盐酸小檗碱的法定测定波长。
本发明所述妇炎康片的色谱指纹图谱测定方法，参照高效液相色谱法(《中国药典》 2005年版一部附录VI D)，结合指纹图谱的要求进行测定。
色谱条件与系统适用性试验采用DIKMA Kromasil C18色谱柱(4. 6咖X250mra， 5pm)， 以乙腈为流动相A, 0.04mol/L磷酸二氢钾(含0.1%磷酸)水溶液为流动相B，按比例进行梯 度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温30。C，检测波长为230nm、 286nm、 265nm。理论板数 按芍药苷峰(230nm)计算应不低于8000，按丹酚酸B峰(286nm)计算应不低于10000， 按盐酸小檗碱峰(265nm)计算应不低于20000。
测定法分别精密吸取供试品溶液及对照品溶液各lOpL，注入高效液相色谱仪，照高 效液相色谱法测定，记录色谱指纹图谱。
下述结合较佳的实施方案作进一步的解释说明，对本发明不构成限制。对于本领域技 术人员而言，根据本发明所公开的技术内容，本领域技术人员将很清楚本发明的其他实施 方式，本发明实施例仅作为示例。在不违反本发明主旨及范围的情况下，可对本发明进行 各种改变和改造，但只要使用本发明所属的指纹图谱测定方法，均在本发明保护范围之内。 实施例l:妇炎康片指纹图谱的测定
仪器及材料Agilent 1100高效液相色谱仪(HP ChemStation化学工作站)；色谱柱 DIKMAKromasUC18柱(4.6mmX250醒，5)ini);电子天平(Sartorious CP225D、 Sartorious BP110S);超声波清洗仪(SB-5200,宁波新芝科器研究所)；妇炎康片(薄膜衣)。供试品溶液的制备取妇炎康片20片，除去薄膜衣，研细，取粉末样品0.3g，精密 称定，置100mL锥形量瓶中，精密加入70%乙醇50mL，称定重量，超声处理(功率250W， 频率50kHz)30分钟，放冷，称定重量，用70%乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液， 过0.45陶微孔滤膜，即得。
对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品、丹酚酸B对照品、盐酸小檗碱对照品， 加甲醇制成每lml含芍药苷对照品6(mg、丹酚酸B对照品801^、盐酸小檗碱对照品40Pg 的混合溶液，摇匀，即得。
测定方法照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。色谱条件和
系统适用性试验色谱柱DI腿A Kromasil C18 (4.6mmx250咖，5nm);以乙腈为流动相
A，以0.04mol/L磷酸二氢钾(含0. 1M粦酸)水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，见表2;流 速为1.0ml/min;检测波长为分别为230nm、 286nm、 265nm;柱温30。C;进样量10uL。 分别精密吸取供试品溶液及对照品溶液各10pL，注入高效液相色谱仪，记录45min色谱(见 图1 6)，供试品色谱图中，以对照品溶液中盐酸小檗碱峰保留时间相应位置上的峰为参 照峰；理论板数按芍药苷峰(230nm)计算应不低于8000,按丹酚酸B峰(286nm)计算 应不低于10000，按盐酸小檗碱峰(265nm)计算应不低于30000。
表2流动相梯度洗脱表 时间(min) 流动相A(W 流动相B(先)
0 10 14—15
10 14 15—18 85—82
14 28 18—23 82—77
28 40 23—33 77—67
40 45 33 67
色谱柱的选择
曾选用PhenomenexlunaC18 (2)柱(4.6mmX250腿，5nm)、 DIKMA Kromasil Cl8柱 (4.6纖X250mm， 5^im)、 Lichrosher C18柱(4.6mmX250mm, 5pm)、 Agilent Zorbax ODS 柱(4.6mmX250讓，5fim)、 Kromasil Packing C18柱(4.6mmX250mm， 5jim)等色谱柱进行 试验筛选，比较分离度、出峰数、峰形、柱效等，结果以Kromasil C18柱(4.6mmX250mm， 5nm)较为合适，故选择其作为色谱指纹图谱研究的色谱柱。
流动相的选择
曾选用甲醇一水、甲醇一磷酸溶液、乙腈一水、乙腈一磷酸溶液、乙腈一磷酸二氢钾 溶液等多组流动相系统，以不同比例和不同梯度进行梯度系统。结果以乙腈一0.04mol/L
8磷酸二氢钾溶液(含0. 1%磷酸)的梯度洗脱为佳，色谱图上各色谱峰分离效果及形状较好， 故选择其作为指纹图谱研究的流动相。 共有峰的选择及指纹图谱的建立
根据10批样品测定结果，综合10批样品色谱图从5min至40min之间，230nm下有 8个峰是共有峰，其中3号峰是芍药苷峰；在286nm下有7个峰是共有峰，其中4号峰是 丹酚酸B峰；在265nm下有8个峰是共有峰，其中7号峰是盐酸小檗碱峰。各批样品中的 共有峰总面积占总峰面积的80%以上。根据中药色谱指纹图谱相似度评价系统(国家药典 委员会2004 A版)，采用均值法，各批次样品指纹图谱之间的相似度均大于0.90。
在详细说的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专 利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任 何简单修改、等同变化与修改，均属于本发明技术方案的范围，且本发明亦不受限于说明 书中所举例的实施方式。
权利要求
1、一种妇炎康片指纹图谱的测定方法，其特征在于包括以下步骤①供试品溶液的制备取妇炎康片成品，研细，精密称取一定量粉末，精密加入乙醇，密塞，称定重量，超声处理，放冷，用乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，过微孔滤膜，即得；②对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品、丹酚酸B对照品、盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成含各对照品的适宜浓度的混合溶液，摇匀，过微孔滤膜，即得对照品溶液；③测定精密吸取供试品溶液、对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得色谱指纹图谱，其中色谱条件采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以乙腈为流动相A，以磷酸二氢钾水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长分别为230nm、286nm、265nm。
2、 根据权利要求1所述的妇炎康片指纹图谱的测定方法，其特征在于所述步骤① 中，取妇炎康片成品5 20片，除去包衣，研细，取样品O. 1 0.5g，精密称定，精密加 入乙醇50mL，密塞，称定重量，超声处理10 30分钟，放冷，称定重量，用乙醇补足减 失重量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45yra微孔滤膜，即得。
3、 根据权利要求2所述的妇炎康片指纹图的谱测定方法，其特征在于所述乙醇采 用体积比为70%乙醇；所述的超声处理条件功率为100 250W，频率20 50kHz。
4、 根据权利要求1所述的妇炎康片指纹图谱的测定方法，其特征在于所述步骤②中，分别精密称取适量芍药苷对照品、丹酚酸B对照品、盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成 每lraL含芍药苷对照品60ug、丹酚酸B对照品80iig、盐酸小檗碱对照品40y g的混合 溶液，摇匀，过0.45Mm微孔滤膜，得对照品溶液。
5、 根据权利要求l所述的妇炎康片指纹图的谱测定方法，其特征在于所述步骤③ 中，以乙腈为流动相A，以0.04mol/L磷酸二氢钾(含0. 1M粦酸)水溶液为流动相B。
6、 根据权利要求1所述的妇炎康片指纹图谱的测定方法，其特征在于所述步骤③ 中，色谱条件为检测波长分别为230nm、 286nm、 265nm;柱温30°C;进样量10uL;按体 积比例，流动相梯度洗脱程序为0 10分钟，流动相A比例由14%递升至15%，流动相B比例由86%递减至85%; 10 14分钟，流动相A比例由15°/。递升至18%，流动相B比例由85%递减至82%; 14 28分钟，流动相A比例由18%递升至23%，流动相B比例由82%递减至77%; 28 40分钟，流动相A比例由23%递升至33%，流动相B比例由77%递减至67%;40 45分钟，流动相A比例保持33%，流动相B比例保持67%。
7、 权利要求1所述的妇炎康片指纹图谱的测定方法，其特征在于所述的指纹图谱记录时间为45min，在所述检测波长下有6 8个共有特征峰，理论板数按芍药苷峰(230nm) 计算不低于8000，按丹酚酸B峰(286nm)计算不低于10000，按盐酸小檗碱峰(265nm) 计算不低于30000。
8、 权利要求l所述的妇炎康片的指纹图谱的测定方法，应用于妇炎康片的质量控制。
9、 权利要求1所述的妇炎康片的指纹图谱的测定方法，应用于包括片剂、颗粒或胶 囊的妇炎康剂型的质量控制。
10、 权利要求1所述的妇炎康片的指纹图谱的测定方法，应用于含有妇炎康处方组 成的中药复方及其制剂的质量控制。
全文摘要
本发明涉及一种妇炎康片指纹图谱的测定方法，其首先将妇炎康片研细，精密称取妇炎康片粉，加乙醇溶液浸泡，超声处理，放冷，补重，摇匀，滤过，续滤液用微孔滤膜滤过，作为供试品溶液；然后制备对照品溶液；采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；采用梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为磷酸二氢钾水溶液；检测波长分别为230nm、286nm、265nm；精密吸取供试品溶液及对照品溶液分别注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。本发明的指纹图谱检测方法，操作简便、稳定方法、精密度高、重复性好，用于妇炎康片的质量控制，能从色谱的整体特征来确保妇炎康片及其相关产品的有效性、稳定性和均一性。
文档编号A61K36/9066GK101502630SQ20091003778
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月11日 优先权日2009年3月11日
发明者景运条, 王德杭, 蒋东旭, 蒋晨光, 谢友良, 陈长青, 黄有带, 黄鸣清 申请人:江门德鑫制药有限公司