专利名称：RGDfK修饰的冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒及其制备方法
RGDfK修饰的冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒及其制备方法技术领域
本发明属于化学制药领域，具体地说，涉及RGDH(修饰的冬凌草甲素聚乳酸载药 纳米粒及其制备方法。
背景技术：
在纳米粒(nanoparticles，NP)表面进行修饰，连接特定的配基，通过配体-受体 相互作用，使纳米粒与靶部位表达的受体特异性结合，可以达到主动靶向。常用的配体、受 体等包括特定的表面活性剂、糖类、叶酸、低密度脂蛋白受体、尿激酶受体、肿瘤坏死因子受 体家族、转铁蛋白和多肽等。目前研究较多的多肽类介导的靶向给药系统多为单抗、转铁蛋 白、谷胱甘肽、RGD多肽及其类似物等。其中RGD多肽及其类似物作为肿瘤靶向介导的配体 是近年研究的热点领域。
整合素(integrin)是一类细胞膜表面糖蛋白受体家族分子，由a、β两个亚基 通过非共价键连接而成的异二聚体蛋白质，主要介导细胞与细胞之间及细胞与细胞外间质 (ECM)之间的黏附。目前研究发现受体家族包括至少18个a亚单位和9个β亚单位，共 同组成超过25种不同的整合素。a、β两种亚基均由长的胞外段(氨基端)、跨膜段、短的 胞内段(羧基端)三部分组成。a亚基的胞外段识别ECM的R⑶序列(Arg-Gly-Asp，精氨 酸-甘氨酸-天冬氨酸)介导细胞与ECM之间的黏附；β亚基的胞内段与细胞骨架相连。 整合素参与构成的ECM，广泛影响细胞的生长、生存、增殖、分化、侵袭和转移等生物学行为。
整合素在肿瘤血管新生的过程中起着不可缺少的作用。在体外和体内实验中， B1 β 整合素均影响血管生成。3整合素的作用最为重要且研究最多。在肿瘤血管生成中的作用主要表现在参与内皮细胞的激活和迁移、介导内皮细胞增 殖、抑制内皮细胞凋亡、参与bFGF诱导的血管生成、参与VEGF诱导的血管生成、诱导环加氧 酶的产生等。
整合素主要是通过识别配体分子中特定的氨基酸短肽序列“精氨酸-甘氨酸-天 冬氨酸”(RGD)而介导细胞的各种生理作用。R⑶序列是多种生物细胞外基质和血浆蛋白结 构中常见的基本成分，也是广泛存在于细胞间识别系统的基本单位，能与细胞表面整合素 特异性结合，从而介导许多重要的生命活动。外源性RGD肽可与体内含RGD序列的物质竞 争结合，从而竞争性抑制RGD-整合素介导的各种生命活动。
研究证明，整合素家族中3的配体即含有RGD序列的多肽及其类似物对肿瘤 血管内皮细胞的粘附和迁移有明显的抑制作用；R⑶肽还可诱导肿瘤细胞中caspase-3和 caspase-7表达的增高，从而促进肿瘤细胞的凋亡。整合素av β 3在多种肿瘤细胞表面和新 生血管内皮细胞上有高表达，但在成熟血管内皮细胞和绝大多数正常器官系统中不 表达或者很少量的表达。因此，是理想的肿瘤靶向治疗靶点，其配体RGD肽可以作为 靶向载体，携带效应分子，抑制肿瘤生长和新生血管的形成，使肿瘤组织供养系统中断，细 胞萎缩、凋亡。
RGD用于介导纳米给药系统的主动靶向和抗肿瘤研究，已成为近年来药物新型给药系统研究的前沿领域。
主动靶向给药系统通过载体结构修饰或生物识别作用将药物定向运送至病变部 位发挥药效，而不损伤周围的正常细胞、组织和器官。在纳米粒表面进行修饰，连接特定的 配基，通过配体一受体相互作用，使NP与靶部位表达的受体特异性结合，可达到主动靶向。 常用的配体、受体等包括特定的表面活性剂、糖类、叶酸、低密度脂蛋白受体、尿激酶受体、 肿瘤坏死因子受体家族、转铁蛋白和多肽等。多肽类物质多数源于内源性肽或其他天然肽， 其具有活性高、剂量小、毒副作用低、代谢终产物为氨基酸等突出特点。其中RGD多肽及其 类似物是近几年国际上研究较为热点的领域。
冬凌草甲素(Oridonin，0RI)，是我国首先从冬凌草中分离的抗癌活性成分，属 于贝壳杉烯二萜类化合物，具有抑制肿瘤细胞的增殖、抑制癌细胞DNA、RNA和蛋白质的合 成、诱导细胞凋亡、抗突变和β受体阻断作用；对体外培养的Hela细胞、人体食管癌细 胞、肝癌细胞及白血病细胞等多种人体癌细胞有明显的细胞毒作用。由于其良好的抗肿瘤 效果和较小的毒副作用，近年来得到广泛关注，已有环糊精包合物、固态类脂纳米粒、 PCL-PE0-PCL载药纳米粒和聚乳酸纳米粒的研究报道。目前临床用药主要有冬凌草片剂、冬 凌草糖浆剂，由于冬凌草甲素水溶性不好、稳定性差、生物半衰期短、口服后血药浓度和肿 瘤细胞周围的药物浓度低，生物利用度低，限制了其疗效的发挥；另有冬凌草素注射剂，但 是注射时有局部有刺激性、可发生静脉炎等副作用，限制了其使用。冬凌草甲素固态类脂纳 米粒、PCL-PE0-PCL载药纳米粒等纳米给药系统，仅能达到被动靶向，限制了其在非网状内 皮系统肿瘤上的应用，且存在药物易泄漏等问题。
RGDfK (精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-L-苯丙氨酸-赖氨酸，分子式C27H43N9O8，分子 量621)是一种含有R⑶序列的五肽，易吸潮，呈白色结晶粉末或片状，-20°C冰箱存放。其 中RGD序列用于识别癌细胞膜上的整合素3受体；f作为稳定肽链空间结构的基团。
权利要求
1.一种RGDfK修饰的冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒的制备方法，其特征是，该方法包 括如下步骤冬凌草甲素与聚乳酸PLA共溶于丙酮-乙醇混合液中，在搅拌下与质量浓度为0. 5-2 % 的F-68水溶液混合，持续搅拌2-lOmin，60°C以下减压除去有机溶剂，0. 8 μ m以下微孔滤膜 滤过，制得冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒ORI-NP溶液；在ORI-NP溶液中加入5-15倍PLA摩尔浓度的1-乙基_3_( 二甲基胺丙基)碳化二 亚胺盐酸盐EDC -HCl和N-羟基硫代琥珀酰亚胺sulfo-NHS，用2- (N-吗啡啉)乙磺酸MES 调pH = 5-6，搅拌使活化，活化温度为0°C _25°C，活化时间为4h-24h，过凝胶柱，保持温度 IO0C以下，除去过量的EDC · HC1、sulfo-NHS、MES和反应副产物；收集纳米粒胶体溶液，加 入RGDfK，RGDfK和PLA的摩尔比为0. 1:1-2: 1，置冰浴中搅拌4_Mh，上凝胶柱除去过 量的RGDfK和副产物，收集带乳光的胶体溶液，即得ORI-NP-RGDfK胶体溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，丙酮-乙醇混合液中丙酮和乙醇的体积比为
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是，RGDfK和PLA的摩尔比为0.5 1。
4.权利要求1或2或3所述方法制得的RGDfK修饰的冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒。
5.根据权利要求4所述的RGDfK修饰的冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒，其特征是，90% 的纳米粒子的粒径分布在50-190nm。
全文摘要
本发明公开了一种RGDfK修饰的冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒的制备方法。本发明在用改良自乳化溶剂扩散法制备冬凌草甲素聚乳酸纳米粒的基础上，选择复合多肽缩合剂EDC·HCl和NHS-sulfo，采用两步缩合反应，制备ORI-NP-RGDfK。本发明制备的ORI-NP-RGDfK具有明显的缓释特征，对肿瘤具有良好的选择性分布；对小鼠移植性肝癌具有良好的抑瘤作用，肿瘤坏死明显，生存期显著延长，生存质量得到改善，ORI-NP-RGDfK抗肿瘤效果显著优于ORI组和ORI-NP组(P＜0.05)。
文档编号A61K31/352GK102028951SQ20091005798
公开日2011年4月27日 申请日期2009年9月29日 优先权日2009年9月29日
发明者于燕燕, 冯年平, 刘颖, 许洁, 赵继会 申请人:上海中医药大学