用于integrinα_vβ₃阳性肿瘤的RGD多肽放射性药物及其制备方法

专利名称：用于integrinα_vβ₃阳性肿瘤的RGD多肽放射性药物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤诊断及治疗的放射性药物，特别涉及用于integrin av|33阳性 肿瘤的RGD多肽放射性药物及其制备方法。
背景技术：
肿瘤生长过程中关键的一环是肿瘤血管生成。没有新的血管生成肿瘤在长 到几个厘米大小之后便不能再继续生长。肿瘤血管生成被各种蛋白分子调控， 其中包括integrinavp3。 integrinav|33是一种细胞外基质受体，它是由a和卩两个 亚基组成的异源二聚体跨膜糖蛋白。integrin av(33是整合素家族重要的组成成员， 作为与新生血管相关的分子标志物之一，它高表达在新生血管内皮细胞表面和 某些肿瘤细胞表面(成神经细胞瘤、骨肉瘤、成胶质细胞瘤、乳腺癌和前列腺癌 等)，而在已存在的血管和正常组织中不表达或表达很低。integrin (33在肿瘤生 长和转移过程中的高度限制表达，使其成为一个非常有吸引力的耙点，用于肿 瘤的诊断和治疗。
研究证实含有RGD(Arg-Gly-Asp，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列的配体与 integrin c^3具有高亲和力和特异性。不同放射性核素标记的RGD序列配体，如 现有的RGD环肽二聚体和四聚体等已被用于肿瘤的显像和治疗研究。RGD 二 聚体或四聚体比其单体具有更高的integrin (XvP3亲和力，主要源于两个因素，一 是两个RGD模序(motif)能同时与细胞表面的integrin 01^3相结合，或者是一个 RGD模序与integrin av|33结合之后增加了细胞表面结合位点局部RGD浓度。如 果两个RGD模序之间的距离足够长，那么它们可以同时与integrin 0^3结合； 如果两个RGD模序之间的距离不是足够长，那么它们只能增加局部RGD浓度。 目前报道的RGD环肽二聚体E[c(RGDxK)]2 (E代表谷氨酸，c代表环化，R代 表精氨酸，G代表甘氨酸，D代表天冬氨酸，x为f或y，分别代表苯丙氨酸或 酪氨酸)，其两个RGD模序之间的距离为6个键，由于距离不够长，因此 E[c(RGDxK)]2的两个RGD模序很难同时与细胞表面相邻的两个的integrin av(33 受体结合(参见图l)。从这个意义上讲，两个RGD模序(motif)能同时与细胞表面的integrin avP3相结合具有更重要的作用。为此，有必要提出新型的RGD多 肽二聚体，使二聚体分子中的两个RGD模序之间距离足够长以能同时与细胞表 面表达的相邻的integrin avp3受体相结合，增强RGD多肽与integrin avp3的亲和 力，提高肿瘤对药物的摄取，并在此基础上发明用于integrin av|33阳性肿瘤的 RGD多肽放射性药物，以达到更好的诊治效果。

发明内容
本发明的目的在于提供一种用于integrin avp3阳性肿瘤的RGD多肽放射性 药物及其制备方法。该药物首先将三个甘氨酸分子(G3， G:glycine)或四个聚乙 二醇分子(PEG4， PEG = Polyethylene glycol)与RGD单体连接，然后再将此二聚 化合成新型RGD环肽二聚体E[L-c(RGDxK)]2,使二聚体分子中的两个RGD模 序之间距离足够长以使其能同时与细胞表面表达的相邻的integrin avp3受体相结 合(参见图2)，即以双价形式与integrin (XvP3结合，这样会进一步增强结合亲和 力以及肿瘤对药物的摄取，达到更好的诊断治疗效果。该药物通过DOTA、DTPA、 NOTA及其衍生物作为双功能螯合剂将放射性核素mIn、 9GY、 177Lu、 68Ga及64Cu 等标记到新型RGD环肽二聚体分子上，在体内标记药物通过RGD多肽的靶向 作用浓聚到肿瘤部位，利用核医学的单光子断层显像技术和正电子断层显像技 术对integrin av|33阳性肿瘤进行显像诊断，还可以通过放射性核素放射的p—粒子 杀伤肿瘤细胞，对integrin (33阳性肿瘤进行放射靶向治疗。当通过双功能螯合 剂DOTA或DTPA或其衍生物标记放射性核素mIn时，本发明RGD多肽放射 性药物用于integrin avp3阳性肿瘤的单光子断层显像诊断。当通过双功能螯合剂 DOTA或NOTA或其衍生物标记放射性核素68Ga时，本发明RGD多肽放射性 药物用于integrin avp3阳性肿瘤的正电子断层显像诊断。当通过双功能螯合剂 DOTA或TETA或其衍生物标记放射性核素64Cu时，本发明RGD多肽放射性药 物用于integrin av|33阳性肿瘤的正电子断层显像诊断。当通过双功能螯合剂 DOTA或DTPA或其衍生物标记放射性核素9QY或177Lu时，本发明RGD多肽 放射性药物用于integrin av|33阳性肿瘤的放射靶向治疗。
本发明的目的是通过如下技术方案实现
一种用于integrin av(33阳性肿瘤的RGD多肽放射性药物，包括RGD多肽、 双功能螯合剂(Chelator)和放射性核素(Nuclide)，所述RGD多肽为RGD环肽二 聚体，所述RGD环肽二聚体是将连接剂L与RGD多肽单体c(RGDfK)连接，再
6将两个连接有连接剂L的RGD多肽单体L-c(RGDfK)二聚化而合成的RGD环肽 二聚体E[L-c(RGDxK)]2;所述放射性核素通过一个双功能螯合剂标记所述RGD 环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体与所述双功能螯合剂之间还连接有药代动力 学修饰分子 PKM ， 所述 RGD 多肽放射性药物为 Nuclide-Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2;所述RGD多肽放射性药物为无色透明 液体针剂。
所述连接剂L为PEG4或G3。
所述药代动力学修饰分子PKM为G2或G3或G4或PEG4( G2代表两个甘氨
酸分子，G4为四个甘氨酸分子)。
所述放射性核素为mIn，所述放射性核素mIn是通过双功能螯合剂DOTA 和DTPA及其衍生物中的一种标记所述RGD环肽二聚体。
所述放射性核素为64Cu，所述放射性核素64Cu是通过双功能螯合剂DOTA 和TETA及其衍生物中的一种标记所述RGD环肽二聚体。
所述放射性核素为68Ga，所述放射性核素68Ga是通过双功能螯合剂DOTA 和NOTA及其衍生物中的一种标记所述RGD环肽二聚体。
所述放射性核素为9QY或177Lu ，所述放射性核素9QY或mLu是通过双功 能螯合剂DOTA和DTPA及其衍生物中的一种标记所述RGD环肽二聚体。
所述的用于integrin a、,p3阳性肿瘤的RGD多肽放射性药物的制备方法，包 括以下步骤
a、 L-c(RGDxK)的制备 (L为PEG4或Gs)
将Boc(t-Butyl carbamate,叔丁氧羰基)保护的连接剂L溶于1 mL DMF(二甲 基甲酰胺)中，加入NHS (N-羟基琥珀酰亚胺,也为HOSu)和DCC (二环己基碳二 亚胺)，室温下搅拌反应2小时；将RGD多肽单体c(RGDxK)加入到上述反应 液中，用D正A(N,N-二异丙基乙胺)将pH调节到8.0-8.5，室温搅拌过夜；向反 应液中加入3 mL 0.5 M NH4OAc缓冲溶液(pH = 7.0)并过滤，滤液经Zorbax C18 半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干；获得产物 经ESI-MS质谱分析确认为预期产物Boc-L-c(RGDxK);将Boc-L-c(RGDxK)力口 入到3.0mLTFA(三氟乙酸)中，室温反应30分钟；旋蒸去除TFA，残留物溶 于2 mL 0.5 M NH4OAc缓冲溶液(pH = 7.0)，经Zorbax CI8半制备柱HPLC方法 分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干；获得产品经ESI-MS质谱分 析确认为预期产物L-c(RGDxK);
b、 E[L-c(RGDxK)]2的制备将Boc保护的谷氨酸(E)溶于5mLDMF，加入NHS和DCC，室温搅拌10 小时；滤掉副产物DCU(二环己基脲)，滤液真空蒸干得到粗产物；用3 mL CH2C12 溶解粗产物，滤掉不溶物，滤液浓縮至l mL左右；缓慢逐滴加入到30mL乙 醚中，析出白色沉淀，过滤并真空干燥得到产品；获得产物经& NMR核磁谱 分析确认为预期产物Boc-E(OSu)2;将Boc-E(OSu)2溶于无水1 mL DMF中，加 入L-c(RGDxK);使用DIEA调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜，经Zorbax C18 半制备柱HPLC分离纯化，合并收集液并冻干，获得产物经ESI-MS质谱分析确 认为预期产物Boc-E[L-c(RGDxK)]2。用无水TFA浸泡Boc-E[L-c(RGDxK)]25分 钟，去除Boc-保护基团；粗产品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，合并 收集液并冻干，得到产品经ESI-MS质谱分析确认为预期产物E[L-c(RGDxK)]2;
c、 PKM-E[L-c(RGDxK)]2的制备 (PKM为G2或G3或G4或PEG4)
将Boc-PKM-OSu和E[L-c(RGDxK)h溶于2 mL DMF和H20的混合液 (l:l=v:v)，使用0.1 NNaOH调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜。将反应液真 空蒸干，得到粗产品并将之溶于2mLTFA，将溶液在室温下搅拌15分钟；产品 经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻
干，获得产物经ESI-MS质谱分析确认为预期产品PKM-E[L-cCRGDxK)]2;
d、 Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2的制备(Chelator为DOTA或DTPA或NOTA 或TETA或其衍生物)
将Chelator和PKM-E[L-c(RGDxK)]2溶于1 mL DMF(二甲基甲酰胺)中，用
DIEA(N,N-二异丙基乙胺)将pH调节到8.5-9.0，室温搅拌过夜；产品经Zorbax
C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干；
e、 Nuclide-Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2的制备(Nuclide为mIn或90Y或 177Lu或68Ga或64Cu)
将0.2 mL溶有Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2偶联物(浓度0.2-0.5 mg/mL) 的NaOAc(pH = 5.0)缓冲溶液加入到西林瓶中，加入10-50 放射性核素(20-50 mCi)， 10(TC水浴加热西林瓶，反应10-15分钟，反应结束后室温冷却10分钟， 制成RGD多肽放射性药物Nuclide-Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2。
所述HPLC方法为使用LabAlliance HPLC系统配备Zorbax C18半制备柱， 梯度淋洗36分钟，流速2.5mL/min，其中流动相A为25 mMNHjOAc, B为乙 睛。淋洗梯度设定为起始时90% A和10% B， 5分钟时85% A和15% B， 30分 钟时65% A和35% B， 32-36分钟时50% A和50% B。
8本发明的有益效果
1、 在本发明RGD多肽放射性药物，首先将三个甘氨酸分子(G3)或四个聚乙 二醇分子(PEG4)与RGD多肽单体c(RGDfK)]2连接，然后再将此二聚化，即合成 E[G3-c(RGDxK)]2或E[PEG4-c(RGDxK)]2，这样两个RGD模序之间的距离就从6 个键增加到26个键或38个键，使二聚体分子中的两个RGD模序之间距离足够 长以使其能同时与细胞表面表达的相邻的integrina^3受体相结合，即以双价形 式与integrin avp3结合，这样会进一步增强结合亲和力以及肿瘤对药物的摄取， 达到更好的诊断或治疗效果。
2、 本发明不仅在两个RGD模序之间引入G3和PEG4，同时在RGD多肽分 子新型RGD环肽二聚体E[L-c(RGDxK)]2与双功能螯合剂之间引入PKM，即 Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2，以进一步改善药代动力学性质，特别是从非肿 瘤组织的清除动力学。
3、 利用本发明制备方法，当通过双功能螯合剂DOTA或DTPA或其衍生物 标记放射性核素mIn时，本发明RGD多肽放射性药物用于integrin avp3阳性肿 瘤的单光子断层显像诊断。当通过双功能螯合剂DOTA或NOTA或其衍生物标 记放射性核素68Ga时，本发明RGD多肽放射性药物用于integrin ccvp3阳性肿瘤 的正电子断层显像诊断。当通过双功能螯合剂DOTA或TETA或其衍生物标记 放射性核素64Cu时，本发明RGD多肽放射性药物用于integrin avp3阳性肿瘤的 正电子断层显像诊断。当通过双功能螯合剂DOTA或DTPA或其衍生物标记放 射性核素9()Y或177Lu时，本发明RGD多肽放射性药物用于integrin (xvp3阳性肿 瘤的放射耙向治疗。
以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。


图1为结构改造前RGD环肽二聚体与integrin avJ33受体结合示意图； 图2为结构改造后RGD环肽二聚体与integrin av|33受体结合示意图； 图3为RGD环肽二聚体及其mIn标记物结构示意图； 图4为不同RGD多肽体外受体竞争结合分析；
图5为min标记的不同RGD多肽于注射后不同时间在神经胶质瘤摄取的对比； 图6为注射mIn-DOTA-3PEG4-dimer后24 h神经胶质瘤动物模型的y显像图。
具体实施例方式
本发明实施例中所采用的材料Dicyclcohexylcarbodiimide (DCC， N,N'-二 环己基碳二亚胺)，N-hydroxysuccinimide (NHS ， N-羟基琥珀酰亚胺)， N,N-Diisopropylethylamine (DIEA， N，N-二异丙基乙胺)，N,N-Dimethylform amide (DMF， N,N-二甲基甲酰胺)，Trifluoroacetic acid (TFA，三氟乙酸)，购自美国 Sigma-Aldrich 公司。DOTA (l,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N，，N，，,N，，， -tetraacetic acid, 1,4,7,10-四氮杂环十二烷四乙酸)、DTPA (diethylenetriamine pentaacetic acid， 二乙烯三胺五乙酸)及NOTA (l,4,7-triazacyclononane-N,N，,N，， -triacetic acid, 1,4,7-三氮杂环壬烷三乙酸)购自美国Macrocyclics公司。环化 RGD多肽单体c(RGDfK)]2购自美国Peptide International, Inc.公司。mIn核素购 自美国PerkinElmer公司。 实施例1:
本实施例以min-DOTA-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2(简称mIn-DOTA-3PEG4-dimer) RGD多肽放射性药物及其制备方法为例。
min-DOTA-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2(简称min-DOTA匿3PEG4-dimer)多肽放 射性药物包括RGD环肽二聚体、双功能螯合剂DOTA和放射性核素mIn。 RGD 环肽二聚体是将连接剂PEG4与RGD多肽单体c(RGDfK)连接，再将两个连接有 PEG4的RGD多肽单体PEG4-c(RGDfK)二聚化而合成的RGD环肽二聚体，即 E[PEG4-c(RGDfK)]2，放射性核素mIn通过一个双功能螯合剂DOTA标记所述 RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体与所述双功能螯合剂之间还连接有药 代动力学修饰分子PEG4 ，所述RGD多肽放射性药物为 mIn-DOTA-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2;所述RGD多肽放射性药物为无色透明液 体针剂。
该药物首先将四个聚乙二醇分子(PEG4， PEG = Polyethylene glycol)与RGD 单体连接，然后再将此二聚化合成新型RGD环肽二聚体E[L-c(RGDxK)]2，使二 聚体分子中的两个RGD模序之间距离足够长以使其能同时与细胞表面表达的相 邻的integrin 卩3受体相结合(参见图2)，即以双价形式与integrin 卩3结合， 与现有技术RGD环肽二聚体E[c(RGDxK)]2的两个RGD模序很难同时与细胞表 面相邻的两个的integrin 01^3受体结合(参见图l)相比，新型RGD环肽二聚体 E[L-c(RGDxK)]2两个RGD模序(motif)能同时与细胞表面的integrin ^|33相结合 具有更重要的作用，进一步增强了结合亲和力以及肿瘤对药物的摄取，达到更
10好的诊治效果。
该药物通过DOTA作为双功能螯合剂将放射性核素mIn标记到新型RGD 环肽二聚体分子上，在体内标记药物通过RGD多肽的靶向作用浓聚到肿瘤部位， 利用核医学的单光子断层显像技术对integrin otv(33阳性肿瘤进行显像诊断，
min-DOTA隱PEG4-E[PEG4誦c(RGDfK)]2(min誦DOTA-3PEG4-dimer)制备方法
如下
预先配备Zorbax C18半制备柱，HPLC方法一使用LabAlliance HPLC 系统，配备ZorbaxC18半制备柱(9.4 mm x 250 mm， 100 A pore size),梯度淋洗 36分钟，流速2.5mL/min，其中流动相A为25 mM NH4OAc (pH 5.0)， B为乙 腈。淋洗梯度设定为起始时90。/。A和10%B， 5分钟时85。/。A和15。/。B， 30分 钟时65% A和35% B， 32-36分钟日寸50% A和50% B。 PEG4-c(RGDfK)的制备
将Boc(t-Butyl carbamate,叔丁氧羰基)保护的PEG4-OH溶于1 mL DMF(二 甲基甲酰胺)中，加入NHS (N-羟基琥珀酰亚胺，也为HOSu) (3.5 mg， 0.03 mmol) 和DCC(二环己基碳二亚胺)(6.2 mg, 0.03 mmol)，室温下搅拌反应2小时。将 c(RGDfK) (26.3 mg, 0.02 mmol)加入到以上反应液中，用DIEA(N,N-二异丙基乙 胺)将pH调节到8.0-8.5，室温搅拌过夜。向反应液中加入3 mL 0.5 M NH4OAc 缓冲溶液(pH = 7.0)并过滤，滤液经Zorbax C18半制备柱(HPLC方法一)分离纯 化，收集保留时间约为14分钟的馏分，合并收集液并冻干。获得产品 Boc-PEG4-c(RGDfK)约7.5 mg。 ESI-MS质谱分析结果为m/z=1665([M+H]+)， [C75H117N2。023]+理论值为1665.85。
将上述所得Boc-PEG4-c(RGDfK) (10 mg, 6 mol)加入到3.0 mL TFA (三氟乙 酸)中，室温反应30分钟。旋蒸去除TFA，残留物溶于2mL0.5MNH4OAc缓 冲溶液(pH:7.0)，经Zorbax C18半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，收集保留时 间约为14分钟的馏分，合并收集液并冻干。获得产品PEG4-c(RGDfK)约7.0 mg。 ESI-MS质谱分析结果为m/z=1565.2([M+H]+)， [C70H109N20O21]+理论值为 1565.80。
E[PEG4-c(RGDfK)]2的制备
将Boc-保护的谷氨酸(E) (0.247 g， 1.0 mmol)溶于5 mL DMF，加入NHS (0.253 g, 2.2 mmol)禾P DCC (0.453 g， 2.2 mmol)，室温搅袢10小时。滤掉副产物DCU(二环己基脲)，滤液真空蒸干得到粗产物。用3mLCH2Cl2溶解粗产物，滤 掉不溶物，滤液浓縮至l mL左右。缓慢逐滴加入到30mL乙醚中，析出白色 沉淀，真空千燥得到产品0.27g。获得产物经"HNMR核磁谱分析确认为预期产 物Boc-E(OSu)2。
将上述所得Boc-E(OSu)2(4.4 mg, 0.01 mmol)溶于无水1 mL DMF中，加入 PEG4-c(RGDfK) (5.28 mg， 0.03 mmol)。使用DIEA调节pH值至8.0-9.0，室温搅 拌过夜，经ZorbaxC18半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，合并收集液并冻干， 得到15 mg白色粉末。经ESI-MS质谱分析确认为预期产物 Boc-E[PEG4-c(RGDfK)]2 。 ESI-MS质谱分析结果为m/z=1913.13([M+H]+)， [C86H138N21028]+理论值为1912.99。
用无水TFA浸泡上述产物Boc-E[PEG4-c(RGDfK)]2 5分钟，去除Boc-保护 基团。粗产品经Zorbax C18半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，合并收集液并 冻干，得到产品经ESI-MS质谱分析确认为预期产物E[PEG4-c(RGDfK)]2 。 ESI-MS 质谱分析结果为m/z^813.0([M+H]+)， [C81H13QN21026]+理论值为1812.99。
PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2的制备
将Boc-PEG4-OSu(5.1mg, llnmol)和E[PEG4-c(RGDfK)]2(5 mg, 2.76 [imol)溶 于2 mL DMF和H20的混合液(l:l=v:v)，使用0.1 N NaOH调节pH值至8.0-9.0， 室温搅拌过夜。然后反应液真空蒸干，得到粗产品，溶于2mLTFA，将溶液在 室温下搅拌15分钟。产品经Zorbax C18半制备柱(HPLC方法一)分离纯化，收 集保留时间为16.4分钟时的馏分，合并收集液并冻干。获得预期产品 PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2约2.4 mg，纯度大于95%。 ESI-MS质谱分析结果为 m/z^2061.46([M+H]+)， [C92H151N22031]+理论值为2061.1。
DOTA-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (简称DOTA-3PEG4-dimer)的制备
将DOTA-OSu (5.0 mg， 10.0 ^M)和PEG4-E[PEG4-c(RGDfk)]2 (10.30 mg， 5.0 (iM)溶于1 mL无水DMF,使用DIEA调节pH值至8.5 - 9.0，室温 搅拌过夜；向反应液中加入3mL0.5MNH4OAc缓冲溶液(pH-7.0)并过滤，滤 液经Zorbax C18半制备柱HPLC(方法一)分离纯化，收集保留时间为22.5分钟 时的馏分，合并收集液并冻干，得到产物4.0 mg (产率为33%)。 ESI-MS质 谱分析结果m/z=2447.35 ([M+H]+)， [C1Q8H177N26038]+理论值为2447.27。
mIn-DOTA-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2的制备将0.2 mL溶有DOTA-3PEG4-dimer(浓度0.25 mg/mL)的NaOAc(pH-5,0)缓 冲溶液加入到西林瓶中，加入20pL放射性核素标记液(20-50mCi)， IO(TC水浴 加热西林瓶,反应10-15分钟，反应结束后室温冷却10分钟，制成本发明的RGD 多 肽 放 射 性 药 物 mIn-DOTA-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)〗2 (11 !ln-DOTA陽3PEG4-dimer)。
本发明的RGD多肽放射性药物中，当连接剂L为G3、药代动力学修饰分 子PKM为G3时，本发明药物为 mIn-DOTA-G3-E[G3-c(RGDfK)]2 (mIn-DOTA-3G3-dimer)。药代动力学修饰分子PKM也可以是G2或G4。
本发明的RGD多肽放射性药物中，当双功能螯合剂为DTPA时，本发明药 物可以是mIn-DTPA-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (mIn-DTPA-3PEG4-dimer)或 mIn-DTPA-GrE[G3-c(RGDfK)]2 (mIn-DTPA-3G3-dimer)。药代动力学修饰分子 PKM也可以是G2或G4。
本实施例中，本发明RGD多肽放射性药物使用双功能螯合剂DOTA或 DTPA或其衍生物标记放射性核素"'In。本实施例中的RGD多肽放射性药物用 于单光子断层显像技术对integrin av(33阳性肿瘤进行显像诊断。
参见图3，图3为RGD环肽二聚体及其min标记物结构示意图。
对依据本发明方法制备的RGD多肽放射性药物mIn-DOTA-3PEG4-dimer取 样进行放射性HPLC分析(HPLC方法二使用LabAllianceHPLC系统，配备放 射性在线检测器和ZorbaxC18分析柱(4.6 mm x 250 mm, 300 A pore size),梯度 淋洗25分钟，流速1.0mL/min，其中流动相A为25 mM NH4OAc (pH 5.0)， B 为乙腈。淋洗梯度设定为起始至2分钟时90% A和10% B， 5分钟时85% A和 15% B， 20分钟时80% A和20% B， 25分钟时90% A和10% B)， mIn-DOTA-3PEG4-dimer的标记率>95%，经Sep-Pak C18柱纯化后放射化学纯 度〉98%。
DOTA-3PEG4-dimer与integrin avp3结合亲和力测定高表达integrin avp3的 U87MG人神经胶质瘤细胞作为实验样本，使用"I-c(RGDyK)作为integrin av(33 受体特异性结合的放射性配基，采用竞争结合实验测定DOTA-3PEG4-dimer的 IC50值(半抑制浓度)，并设 c(RGDyK) 、 DOTA-PEG4-c(RGDfK) (DOTA-PEG4-monomer)、 DTPA-Bz-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (DTPA-3PEG4-dimer) 、 DOTA-G3-E[Grc(RGDfK)]2(DOTA-3G3-dimer) 、 DOTA-E[c(RGDfK)]2 (DOTA-dimer)和DOTA-E{E[c(RGDfK)]2}2 (DOTA-tetramer)为对照。实验结果显示，c(RGDyK)、 DOTA-PEG4-monomer 、 DOTA画dimer、 DOTA-3PEG4-dimer 、 DTPA-3PEG4-dimer、 DOTA-3Grdimer和DOTA-tetramer竞争^I-c(RGDyK)与 U87MG细胞结合的ICso值分别为49.9 ± 5.5 nM， 42.1 ± 3.5 nM， 8.0土2.8nM， 1.3 ± 0.2 nM， 1.3 ± 0.3 nM， 1.1 ± 0.1 nM和1.4 ± 0.1 nM (参见图4)，表明 DOTA-3PEG4-dimer、 DTPA-3PEG4-dimer以及DOTA-3G3-dimer与integrin av(33 的亲和力明显好于其RGD多肽单体和现有二聚体，说明改造后的RGD环肽二 聚体能以双价形式与integrin av(33结合。
mIn-DOTA-3PEG4-dimer在荷瘤裸鼠生物分布将荷U87MG人神经胶质瘤 BALB/c裸鼠随机分成若干组，每组4只。各组实验裸鼠分别经尾静脉注射100 |LiL ( 74kBq)不同的min标记的RGD多肽，于注射后0.5小时，1.0小时，4.0小时 和24.0小时按组分别处死实验裸鼠，取血及主要脏器，称重并测量放射性计数， 经衰变校正后计算每克组织百分注射剂量率(Q/。ID/g)。
在U87MG人神经胶质瘤动物模型中，mIn-DOTA-3PEG4-dimer 、 mIn-DOTA-3G3-dimer及mIn-DTPA-3PEG4-dimer的肿瘤摄取明显高于 mIn-DTPA-dimer(参见图5)。这充分说明 mIn-DOTA-3PEG4-dimer 、 mIn-DOTA-3G3-dimer及mIn-DTPA-3PEG4-dimer是以双价形式与integrin avp3 结合，而mIn-DTPA-dimer是以单价形式与integrin 0^3结合。参见图6，图6 为荷U87MG人神经胶质瘤裸鼠注射mIn-DOTA-3PEG4-dimer后24 h的y显像图 (图中箭头代表肿瘤部位)。 实施例2:
本实施例中，本发明RGD多肽放射性药物使用双功能螯合剂DOTA或TETA 或其衍生物标记放射性核素64Cu，当连接剂L为PEG4、药代动力学修饰分子 PKM为PEG4时，本发明药物为64Cu-DOTA-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (64Cu曙DOTA-3PEGrdimer)或64Cu-TETA-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)〗2 (64Cu-TETA-3PEG4-dimer)，其制备方法同实施例1。药代动力学修饰分子PKM也可以是G2
或G4。
当连接剂L为G3、药代动力学修饰分子PKM为G3时，本发明药物为^Cu -DOTA-G3-E[Grc(RGDfK)]2 (64Cu-DOTA-3G3-dimer)或 64Cu-TETA-GrE[Gr c(RGDfK)]2(64Cu-TETA-3G3-dimer)，其制备方法同上。药代动力学修饰分子PKM
也可以是G2或G4。
本实施例中，本发明RGD多肽放射性药物使用双功能螯合剂DOTA或TETA
14或其衍生物标记放射性核素64Cu，本实施例中的RGD多肽放射性药物用于 integrin avp3阳性肿瘤的正电子断层显像诊断。 实施例3:
本实施例中，本发明RGD多肽放射性药物使用双功能螯合剂DOTA或 NOTA或其衍生物标记放射性核素68Ga。当连接剂L为PEG4、药代动力学修饰 分子PKM为PEG4时，本发明药物为68Ga-DOTA-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (68Ga -DOTA-3PEG4-dimer)或 68Ga-NOTA-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (68Ga-NOTA -3PEG4-dimer),其制备方法同实施例1。药代动力学修饰分子PKM也可以是 G2或G"
当连接剂L为G3、药代动力学修饰分子PKM为G3时，本发明药物为"Ga -DOTA-G3-E[G3-c(RGDfK)]2 (68Ga-DOTA-3G3-dimer) 或 68Ga-NOTA-G3-E[Grc(RGDfK)]2 (68Ga-NOTA-3Grdimer)。药代动力学修饰分子PKM也可以是
G2或G4。
本实施例中，本发明RGD多肽放射性药物使用双功能螯合剂DOTA或 NOTA或其衍生物标记放射性核素68Ga，本实施例中的RGD多肽放射性药物用 于integrin avp3阳性肿瘤的正电子断层显像诊断。 实施例4:
本实施例中，本发明RGD多肽放射性药物使用双功能螯合剂DOTA或 DTPA或其衍生物标记放射性核素9QY。当连接剂L为PEG4、药代动力学修饰 分子PKM为PEG4时，本发明药物为9QY-DTPA-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (90Y-DTPA-3PEG4-dimer)或 90Y-DOTA-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)〗2 (90Y-DOTA-3PEG4-dimer)，其制备方法同实施例1。药代动力学修饰分子PKM也可以是G2
或G4。
当连接剂L为G3、药代动力学修饰分子PKM为G3时，本发明药物为 90Y-DTPA-GrE[G3-c(RGDfK)]2(90Y-DTPA-3G3-dimer) 或 90Y-DOTA-GrE[Gr c(RGDfK)]2(9QY-DOTA-3G3-dimer)，其制备方法同上。药代动力学修饰分子PKM
也可以是G2或G4。
本实施例中，本发明RGD多肽放射性药物使用双功能螯合剂DOTA或 DTPA或其衍生物标记放射性核素WY。本实施例中的RGD多肽放射性药物用 于integrin avp3阳性肿瘤的放射靶向治疗。 实施例5:
本实施例中，本发明RGD多肽放射性药物使用双功能螯合剂DOTA或DTPA或其衍生物标记放射性核素177Lu。当连接剂L为PEG4、药代动力学修饰 分子PKM为PEG4时，本发明药物为177Lu-DTPA-PEG4-E[PEG4-c(RGDfKXl2 (177Lu-DTPA-3PEG4-dimer)或 177Lu-DOTA-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2 (177Lu -DOTA-3PEG4-dimer)，其制备方法同实施例1。药代动力学修饰分子PKM也可
以是G2或G4。
当连接剂L为G3、药代动力学修饰分子PKM为G3时，本发明药物为177Lu -DTPA-G3-E[G3-c(RGDfK)〗2(177Lu-DTPA-3G3-dimer)或 177Lu-DOTA-G3-E[G3-c(RGDfK)]2 (177Lu-DOTA-3Grdimer)，其制备方法同上。药代动力学修饰分子 PKM也可以是G2或G4。
本实施例中，本发明RGD多肽放射性药物使用双功能螯合剂DOTA或 DTPA或其衍生物标记放射性核素177Lu。本实施例中的RGD多肽放射性药物用 于integrin avp3阳性肿瘤的放射靶向治疗。
1权利要求
1、一种用于integrin αvβ3阳性肿瘤的RGD多肽放射性药物，包括RGD多肽、双功能螯合剂(Chelator)和放射性核素(Nuclide)，其特征在于所述RGD多肽为RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体是将连接剂L与RGD多肽单体c(RGDfK)连接，再将两个连接有连接剂L的RGD多肽单体L-c(RGDfK)二聚化而合成的RGD环肽二聚体E[L-c(RGDxK)]2；所述放射性核素通过一个双功能螯合剂标记所述RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体与所述双功能螯合剂之间还连接有药代动力学修饰分子PKM，所述RGD多肽放射性药物为Nuclide-Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2；所述RGD多肽放射性药物为无色透明液体针剂。
2、 根据权利要求1所述的用于integrin avp3阳性肿瘤的RGD多肽放射性药物，其特征在于所述连接剂L为PEG4或G3。
3、 根据权利要求1所述的用于integrin av|33阳性肿瘤的RGD多肽放射性药 物，其特征在于所述药代动力学修饰分子PKM为G2或G3或G4或PEG4。
4、 根据权利要求1所述的用于integrin avp3阳性肿瘤的RGD多肽放射性药 物，其特征在于所述放射性核素为"'In，所述放射性核素mIn是通过双功能 螯合剂DOTA和DTPA及其衍生物中的一种标记所述RGD环肽二聚体。
5、 根据权利要求1所述的用于integrin av(33阳性肿瘤的RGD多肽放射性药 物，其特征在于所述放射性核素为64Cn，所述放射性核素"Cu是通过双功能 螯合剂DOTA和TETA及其衍生物中的一种标记所述RGD环肽二聚体。
6、 根据权利要求1所述的用于integrin av|33阳性肿瘤的RGD多肽放射性药 物，其特征在于所述放射性核素为68Ga，所述放射性核素MGa是通过双功能 螯合剂DOTA和NOTA及其衍生物中的一种标记所述RGD环肽二聚体。
7、 根据权利要求1所述的用于integrin av(33阳性肿瘤的RGD多肽放射性药 物，其特征在于所述放射性核素为或mLu ，所述放射性核素9()Y或mLu 是通过双功能螯合剂DOTA和DTPA及其衍生物中的一种标记所述RGD环肽二 聚体。
8、 一种权利要求1所述的用于integrin av|33阳性肿瘤的RGD多肽放射性药 物的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤a、 L-c(RGDxK)的制备(L为PEG4或G3)将Boc(t-Butyl carbamate,叔丁氧羰基)保护的连接剂L溶于1 mL DMF(二甲 基甲酰胺)中，加入NHS (N-羟基琥珀酰亚胺,也为HOSu)和DCC (二环己基碳二亚胺)，室温下搅拌反应2小时；将RGD多肽单体c(RGDxK)加入到上述反应 液中，用D正A(N,N-二异丙基乙胺)将pH调节到8.0-8.5，室温搅拌过夜；向反 应液中加入3 mL 0.5 M NH4OAc缓冲溶液(pH = 7.0)并过滤，滤液经Zorbax C18 半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干；获得产物 经ESI-MS质谱分析确认为预期产物Boc-L-c(RGDxK);将Boc-L-c(RGDxK)加 入到3.0mLTFA(三氟乙酸)中，室温反应30分钟；旋蒸去除TFA，残留物溶 于2 mL 0.5 M NH4OAc缓冲溶液(pH = 7.0)，经Zorbax C18半制备柱HPLC方法 分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干；获得产品经ESI-MS质谱分 析确认为预期产物L-c(RGDxK:i;b、 E[L-c(RGDxK)]2的制备 将Boc保护的谷氨酸(E)溶于5mLDMF，加入NHS和DCC，室温搅拌10小时；滤掉副产物DCU(二环己基脲)，滤液真空蒸干得到粗产物；用3 mL CH2C12 溶解粗产物，滤掉不溶物，滤液浓縮至l mL左右；缓慢逐滴加入到30mL乙 醚中，析出白色沉淀，过滤并真空干燥得到产品；获得产物经& NMR核磁谱 分析确认为预期产物Boc-E(OSu)2;将Boc-E(OSu)2溶于无水lmLDMF中，加 入L-c(RGDxK);使用DIEA调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜，经Zorbax C18 半制备柱HPLC分离纯化，合并收集液并冻千，获得产物经ESI-MS质谱分析确 认为预期产物Boc-E[L-c(RGDxK)]2;用无水TFA浸泡Boc-E[L-c(RGDxK)]2 5 分钟，去除Boc-保护基团；粗产品经ZorbaxC18半制备柱HPLC分离纯化，合 并收集液并冻干，得到产品经ESI-MS质谱分析确认为预期产物 E[L-c(RGDxK)]2;c、 PKM-E[L-c(RGDxK)]2的制备 (PKM为G2或G3或G4或PEG4)将Boc-PKM-OSu和E[L-c(RGDxK)]2溶于2 mL DMF和H20的混合液 (l:l=v:v)，使用O.l NNaOH调节pH值至8.0-9.0，室温搅拌过夜；将反应液真 空蒸干，得到粗产品并将之溶于2 mL TFA，将溶液在室温下搅拌15分钟；产 品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并 冻干，获得产物经ESI-MS质谱分析确认为预期产品PKM-E[L-c(RGDxK)]2;d、 Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2的制备(Chelator为DOTA或DTPA或NOTA 或TETA或其衍生物)将Chelator和PKM-E[L-c(RGDxK)]2溶于1 mL DMF(二甲基甲酰胺)中，用 DIEA(N，N-二异丙基乙胺)将pH调节到8.5-9.0,室温搅拌过夜；产品经Zorbax C18半制备柱HPLC分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集液并冻干； e、 Nuclide-Chdator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2的制备(Nuclide为"In或9GY或177Lu或68Ga或64Cu)将0.2 mL溶有Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2偶联物(浓度0.2-0.5 mg/mL) WNaOAc(pH = 5.0)缓冲溶液加入到西林瓶中，加入10-50 (iL放射性核素(20-50 mCi)， IO(TC水浴加热西林瓶，反应10-15分钟，反应结束后室温冷却IO分钟， 制成RGD多肽放射性药物Nuclide-Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]2。
9、根据权利要求8所述的用于integrin otv|33阳性肿瘤的RGD多肽放射性药 物的制备方法，其特征在于所述HPLC方法为使用LabAmance HPLC系统配 备Zorbax C18半制备柱，梯度淋洗36分钟，流速2.5 mL/min，其中流动相A 为25 mM NH4OAc， B为乙睛；淋洗梯度设定为起始时90% A和10% B， 5分 钟时85% A和15% B， 30分钟时65% A和35% B， 32-36分钟时50% A和50% B。
全文摘要
本发明涉及一种用于integrin α_vβ₃阳性肿瘤的RGD多肽放射性药物，包括RGD多肽、双功能螯合剂(Chelator)和放射性核素(Nuclide)，所述RGD多肽为RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体是将连接剂L与RGD多肽单体c(RGDfK)连接，再将两个连接有连接剂L的RGD多肽单体L-c(RGDfK)二聚化而合成的RGD环肽二聚体E[L-c(RGDxK)]₂；所述放射性核素通过一个双功能螯合剂标记所述RGD环肽二聚体，所述RGD环肽二聚体与所述双功能螯合剂之间还连接有药代动力学修饰分子PKM，所述RGD多肽放射性药物为Nuclide-Chelator-PKM-E[L-c(RGDxK)]₂；所述RGD多肽放射性药物为无色透明液体针剂。
文档编号A61K51/00GK101474415SQ200910077039
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月16日 优先权日2009年1月16日
发明者史继云, 凡 王, 兵 贾 申请人:北京大学