专利名称：纤维蛋白原-420及其活性结构域的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及纤维蛋白原-420及其活性结构域的新用途。
背景技术：
纤维蛋白原存在于血液当中，是凝血过程中的一种重要蛋白，又称为凝血因子I，其分子量大约340，000道尔顿，由两个亚基通过二硫键连接形成二聚体，每个亚基由3条多 肽链相互缠绕组成，分别叫做A，B，C链。在凝血过程中，纤维蛋白原被凝血酶酶切，生成纤 维蛋白进而形成不溶的纤维蛋白多聚体，由纤维蛋白多聚体形成的血纤维和血小板一起构 成牢固的止血栓。纤维蛋白原在血液中的含量约为1. 5-4毫克/毫升，同时纤维蛋白原也 是一种应激蛋白，其含量与机体的免疫状态有关，且可以反映心脑血管疾病的危险程度。纤维蛋白原-420是纤维蛋白原的一种亚型，其A链C末端比普通的纤维蛋白原的 A链延伸出一个球状结构域，该球状结构域与B，C链末端的球状结构域具有很高的同源性， 称作alpha EC结构域蛋白。纤维蛋白原_420的分子量约为420，000道尔顿，有别于一般 组织纤维蛋白原的分子量340，000道尔顿。蛋白构象病(protein misfolding disease)是由于组织中特定的蛋白质发生了 构象变化，进而聚集并产生淀粉样沉淀(amyloidosis)，最终出现组织器官的病理性改变的 一类疾病，如阿尔茨海默症，疯牛病等都属于这一类病症。对于这类病症目前还没有很好的 防治方法。已有的方法如单克隆抗体技术，化学小分子，合成多肽等，存在免疫排斥，缺乏广 谱性，副作用大，体内半衰期短等缺点。细胞内存在大量的热休克蛋白(heat shock protein)或分子伴侣(chaperone)， 在机体遭受刺激时大量表达，保护细胞内的蛋白免受高温、自由基、有机溶剂(如乙醇)等 的伤害。但是在循环系统内不存在热休克蛋白，机体保护细胞外的蛋白分子的机制目前还 不清楚。
发明内容
本发明的目的是提供纤维蛋白原-420及其活性结构域的新用途。本发明人的研究表明，纤维蛋白原-420是人体自身的蛋白分子，在体内不会被很 快降解，也不会产生免疫排斥反应；具有分子伴侣活性和广谱的非特异性的保护作用，能促 进变性蛋白正确折叠，稳定蛋白构象和功能，可以在蛋白复性、质量控制中变性蛋白检测和 抗蛋白变性等方面广泛应用。所述的蛋白可以为重组蛋白或天然蛋白。纤维蛋白原-420分子包含alpha EC结构域蛋白，并且单独alpha EC结构域蛋白 也具有与纤维蛋白原-420相同的或类似的功能；其中，alpha EC结构域蛋白的氨基酸序列 如序列表中序列1所示；纤维蛋白原-420具体可为人的纤维蛋白原-420。纤维蛋白原-420或alpha EC结构域蛋白可以通过配制成蛋白试剂来使用。所 述蛋白试剂至少包括纤维蛋白原-420或alpha EC结构域蛋白，也不排除其他的溶剂和添 加剂。所作用的其他蛋白和纤维蛋白原-420或alpha EC结构域蛋白的比例在25 1到1 100的之间，当然包括1 1这样的比值，都可以达到比较好的效果。不同的最佳比值 取决于应用的具体情况。本发明的研究表明纤维蛋白原-420或alpha EC结构域蛋白能抑制变性的蛋白聚 集保护蛋白活性，可用于制备治疗蛋白构象病病的药物。其中，所述治疗蛋白变性疾病的药物，是以纤维蛋白原-420或alpha EC结构域蛋 白为活性成分的药物。所述治疗蛋白变性疾病的药物可用于治疗多种原因引起的蛋白变性 疾病，如发烧引起的热变性，由烟、酒、氧自由基等有害物质造成的蛋白变性。其中，所述治疗蛋白构象病的药物，是以纤维蛋白原-420或alpha EC结构域蛋白 为活性成分的药物。本发明的纤维蛋白原-420或alpha EC结构域蛋白能捕捉蛋白的解折叠过程，通 过帮助蛋白正确的折叠或者使其保持在一个折叠的状态，从而保持功能或者防止蛋白聚 集，继而稳定蛋白的活性和功能。因此，纤维蛋白原-420或alpha EC结构域蛋白可增强蛋 白抗变性能力，在体外可作为蛋白稳定剂使用。其中，所述蛋白稳定剂，是以纤维蛋白原-420或alpha EC结构域蛋白为活性成分 的蛋白稳定剂；所述蛋白稳定剂可抑制那些容易聚集沉淀的蛋白的聚集；所述蛋白稳定剂 还可以保护酶的活性，如稳定柠檬酸合成酶、荧光素酶，胰岛素等的酶活性。
在生物诊断试剂盒中，尤其是ELISA免疫诊断试剂盒中交联了报告酶的抗体(如 辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶或者荧光素酶)稳定性下降，加入纤维蛋白原-420或alpha EC结构域蛋白可以提高产品保质期和蛋白质试剂的稳定性，达到提高产品质量的目的。纤维蛋白原-420或alpha EC结构域蛋白还可以用于识别正在解折叠和变性的蛋 白，因此还可在蛋白质产品质量控制检测中应用。
图1为纤维蛋白原-420和alpha EC结构域蛋白抑制柠檬酸合成酶热变性聚集。图2为alpha EC结构域蛋白抑制柠檬酸合成酶化学变性聚集。图3为纤维蛋白原-420抑制柠檬酸合成酶热变性失活。图4为alpha EC结构域蛋白抑制柠檬酸合成酶热变性失活。图5为alpha EC结构域蛋白特异性识别变性柠檬酸合成酶蛋白。
具体实施例方式实施例1、纤维蛋白原-420和alpha EC结构域蛋白抑制柠檬酸合成酶变性聚集a、纤维蛋白原-420和alpha EC结构域蛋白的制备纤维蛋白原-420是先从血液或脐带血中纯化出混合的纤维蛋白原，然后再进一 步纯化出纤维蛋白原-420。方法如下(1)混合纤维蛋白原的纯化首先取新鲜的血液或脐带血，加入蛋白酶抑制剂，在 4°C低温离心2000rpm，吸出上清，得到淡黄色的血浆。向血浆中加入甘氨酸干粉使其终浓度 达到2. 1M，同时搅拌使甘氨酸完全溶解，得到絮状白色沉淀。5000rpm离心15min得到的沉 淀用原来血浆体积的1/3的缓冲液(0. 15M氯化钠，0.01M磷酸钠，pH 6.4溶解)，重复该步 骤，直到溶解后体积为原来血浆体积的1/10。加入等体积的纯水稀释。然后将稀释后的溶液在2-5°C静置6小时，离心去除沉淀，上清液加入等体积0. 3M的氯化钠溶液，再加入95%乙醇使乙醇终浓度达到8% (体积比)，同时温度降低到_3°C，沉淀充分后5000rpm离心得 到的沉淀作为下一步纯化纤维蛋白原-420的原料。(2)纤维蛋白原-420的纯化(1)得到的纤维蛋白原沉淀溶于0. 3M氯化钠溶液 然后透析到0. 005mol/L Tris-磷酸缓冲液，pH 8. 6 (摩尔浓度按照磷酸根计算)。层析柱 选用Mono Q HR 10/10阴离子交换柱(Pharmacia)。上样后洗脱采用分步pH洗脱，首先从 0. 005mol/L Tris-磷酸缓冲液迅速过渡到0. 2mol/L Tris-磷酸缓冲液，pH 6.0，然后维持 0. 2mol/L Tris-磷酸缓冲液，pH 6. 0洗脱12倍柱体积，最后采用线性梯度洗脱12倍柱体积 过渡到0.5mol/L Tris-磷酸缓冲液，pH4. 2。在最后一步线性洗脱时得到纤维蛋白原-420 蛋白。蛋白透析到125mmol/L氯化钠，25mmol/L HEPES缓冲液(pH 7.4)中进行保存。alpha EC结构域蛋白按照如下方法获得alpha EC结构域蛋白复性与纯化以人肝脏cDNA文库为模板设计引物进行PCR扩 增。引物序列为5-GGAATTCCATATGGACTGTGATGATGTCCTCC-35-ACCGCTCGAGCTATTGGGTCACAAGGGGCC-3在引物中引入了限制性内切酶NdeI和XhoI的酶切位点。PCR扩增的退火温度 55°C。PCR扩增出的α EC片段经限制性内切酶NdeI和XhoI酶切后，连接到同样双酶切的 pET_30a表达载体(Novagen公司)中，构建的重组表达载体转化到大肠杆菌感受态细胞 BL21/DE3(北京鼎国生物技术公司)中，获得重组菌。挑取重组菌单克隆接种到10毫升LB 培养基(卡那霉素100 μ g/ml)，培养过夜。然后转接到1升的LB培养基(卡那霉素100 μ g/ ml)中，待菌液浊度0D_值达到0. 8左右的时候，加入0. 5mM IPTG诱导4小时后离心收集 菌体。破碎菌体后，收集包涵体蛋白。溶解并还原包涵体蛋白后，用阴离子交换柱纯化。上 样缓冲液8M尿素、20mMTris-HCl和pH 8. 0,30mM BME ；洗脱缓冲液为上样缓冲液中添加IM 氯化钠。采用线性梯度洗脱，分步收集洗脱峰。电泳检测蛋白纯度。选取纯度大于80%的 组分进行复性实验。复性时，蛋白浓度用含8M尿素的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)调整 到小于0. 2mg/ml，然后透析到20mM Tris-HCl, 150mM氯化钠，ImM氯化钙，pH 8. 0中。间隔 至少4小时换一次透析液，至少换两次复性液，充分透析过夜。最后透析到20mM Tris-HCl 的上样缓冲液中准备纯化复性蛋白。采用阴离子交换柱进行纯化。上柱前离心或用0.22 微米孔径的滤膜过滤。采用盐离子线性梯度洗脱，分步收集蛋白峰。用氧化电泳检测纯度。b、纤维蛋白原-420和alpha EC结构域蛋白抑制柠檬酸合成酶热变性聚集柠檬酸合成酶是三羧酸循环中的一个关键酶，但该蛋白热稳定性很差，体外在 43°C就会很快变性聚集，进而形成沉淀。柠檬酸合成酶聚集过程可以用光散射的变化反映 出来，实验方法如下用荧光仪FL4500(日立公司)检测光散射过程，调节仪器激发光为500nm，发射 光为500nm，狭缝宽度为2. 5nm ；将柠檬酸合成酶溶解在40mM HEPES缓冲液中，使其终浓度 为0. 15 μ M，实验组1中同时加入0. 15 μ M纤维蛋白原-420，实验组2中同时加入0. 15 μ M alpha EC结构域蛋白，对照组1同时加入相同体积的HEPES溶液，对照组2同时加入相同 体积的1. 2 μ M的牛血清白蛋白，将实验样品放入43°C水浴中，检测光散射信号，实验重复3 次。
光散射信号检测实验结果如图1所示，表明加热200秒内，对照组1和2的柠檬酸合成酶就开始发生聚集，可以检测到光散射信号的增加；而实验组1和2中柠檬酸合成酶聚 集明显变少，实验组2对于柠檬酸合成酶的热变性聚集的抑制效果好于实验组1，0. 15μΜ alpha EC结构域蛋白几乎完全抑制等摩尔浓度柠檬酸合成酶的43°C热变性聚集过程。图1中(〇)代表对照组1，( Δ )代表对照组2，( )代表实验组1，( □)代 表实验组2。C、纤维蛋白原-420和alpha EC结构域蛋白抑制柠檬酸合成酶化学变性聚集柠檬酸合成酶在盐酸胍和还原剂条件下(6M盐酸胍，IOmMDTT,室温孵育2小时) 完全还原变性后，用40mM HEPES缓冲液稀释到终浓度为0. 15 μ M，实验组1中同时加入 0. 3μΜ alpha EC结构域蛋白，实验组2中同时加入0. 6 μ M alphaEC结构域蛋白，对照组1 同时加入相同体积的HEPES溶液，对照组2同时加入相同体积的1. 2μ M的牛血清白蛋白。 然后检测各个样品的光散射信号，实验重复3次。用荧光仪FL4500(日立公司)检测光散 射过程，调节仪器激发光为500nm，发射光为500nm，狭缝宽度为2. 5nm。光散射信号检测实验结果如图2所示，与对照组相比，实验组明显改变聚集过程。 0. 3 μ M alpha EC就可以明显抑制聚集，0. 6 μ M的alpha EC则几乎完全抑制聚集。图2中(〇)对照组1，( ·)对照组2，(Δ )实验组1，( □)加入0. 6 μ M alphaEC。实施例2、纤维蛋白原-420和alpha EC结构域蛋白保护柠檬酸合成酶(CS)活性纤维蛋白原-420和alpha EC结构域蛋白抑制柠檬酸合成酶(CS)热变性失活的 实验方法如下将柠檬酸合成酶溶解在40mM HEPES缓冲液中，使其终浓度为0. 075 μ Μ,实验组1 中同时加入0. 075 μ M纤维蛋白原-420，实验组2中同时加入0. 15 μ M纤维蛋白原-420，实 验组3中同时加入0.075 μ M alpha EC结构域蛋白，实验组4中同时加入0. 15 μ M alpha EC结构域蛋白，对照组加入等体积的HEPES缓冲液。将实验样品放入43°C水浴中，同时开 始检测柠檬酸合成酶活性的变化。将柠檬酸合成酶加热前的活性定为100%。柠檬酸合成酶活性测定方法如下930μ 1 TF缓冲液(50mM Tris, 2mM EDTA, ρΗ8. 0), 10 μ 1 IOmM 草酰乙酸(oxaloacetic acid)，10 μ 1 IOmM DTNB，30 μ 15mM 乙酰辅 酶A (acetyl-CoA)，将上述溶液混合后迅速加入20 μ 1含有柠檬酸合成酶的溶液，立刻检测 412nm的紫外吸收动态变化，吸光度变化线性曲线的斜率代表酶活性大小。柠檬酸合成酶活性测定结果如图6和7所示，表明随着时间推移，对照组柠檬酸合 成酶的活性迅速降低，但是实验组都能够有效的减慢柠檬酸合成酶的活性丧失的速度。图3中，(〇)代表对照，(Δ )代表实验组1，( □)代表实验组2 ；图4中，(〇) 代表对照，(Δ )代表实验组3，( □)代表实验组4。实施例3、alpha EC结构域蛋白特异性识别变性柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶与alpha E C结构域蛋白混合在一起孵育，当在43°C加热5min或 IOmin后，上清分别加入抗柠檬酸合成酶的抗体和抗alpha EC的抗体进行免疫共沉淀。柠 檬酸合成酶与alpha EC混合在一起在室温孵育，然后上清分别加入抗柠檬酸合成酶的抗体 和抗alpha EC的抗体进行免疫共沉淀，作为对照实验。实验结果如图5，表明加入抗柠檬酸合成酶的抗体，变性的柠檬酸合成酶能被沉淀 下来，同时alpha EC结构域蛋白也能够被沉淀下来。加入抗alpha EC结构域蛋白的抗体，alpha EC结构域蛋白被沉淀下来，柠檬酸合成酶也能够被沉淀下来。上述实验结果说明加 热后，柠檬酸合成酶与alpha EC结构域蛋白形成了复合物，这样其中一种蛋白的抗体就也 能够同时把另一个蛋白沉淀下来。对照实验没有发生免疫共沉淀。这个结果说明alpha EC 结构域蛋白能够特异性的识别并结合热变性的柠檬酸合成酶。图5中，图上部分为用柠檬酸合成酶的抗体免疫共沉淀，电泳后用alpha EC抗体 检测，泳道1为alpha EC阳性对照，泳道2为在室温孵育10分钟然后共沉淀，泳道3和4 为在43°C分别加热5和10分钟后共沉淀；图下部分为用alpha EC的抗体免疫共沉淀，电 泳后用柠檬酸合成酶抗体检测，泳道1为柠檬酸合成酶阳性对照，泳道2为室温孵育10分 钟后共沉淀，泳道3和4为在43°C分别加热5和10分钟后共沉淀。图中“CS”代表柠檬酸 合成酶，“alpha EC”代表alpha EC结构域蛋白。序列表<110>清华大学<120>纤维蛋白原-420及其活性结构域的新用途<130>CGGNARW92137<160>1<210>1<211>236<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Asp Cys Asp Asp Val Leu Gln Thr His Pro Ser Gly Thr Gln Ser Gly151015lie Phe Asn lie Lys Leu Pro Gly Ser Ser Lys lie Phe Ser Val Tyr202530Cys Asp Gln Glu Thr Ser Leu Gly Gly Trp Leu Leu lie Gln Gln Arg354045Met Asp Gly Ser Leu Asn Phe Asn Arg Thr Trp Gln Asp Tyr Lys Arg505560Gly Phe Gly Ser Leu Asn Asp Glu Gly Glu Gly Glu Phe Trp Leu Gly65707580Asn Asp Tyr Leu His Leu Leu Thr Gln Arg Gly Ser Val Leu Arg Val859095Glu Leu Glu Asp Trp Ala Gly Asn Glu Ala Tyr Ala Glu Tyr His Phe100105110Arg Val Gly Ser Glu Ala Glu Gly Tyr Ala Leu Gln Val Ser Ser Tyr115120125Glu Gly Thr Ala Gly Asp Ala Leu lie Glu Gly Ser Val Glu Glu Gly130135140Ala Glu Tyr Thr Ser His Asn Asn Met Gln Phe Ser Thr Phe Asp Arg
145150155160Asp Ala Asp Gln Trp Glu Glu Asn Cys Ala Glu Val Tyr Gly Gly Gly165170175Trp Trp Tyr Asn Asn Cys Gln Ala Ala Asn Leu Asn Gly lie Tyr Tyr
180185190Pro Gly Gly Ser Tyr Asp Pro Arg Asn Asn Ser Pro Tyr Glu lie Glu195200205Asn Gly Val Val Trp Val Ser Phe Arg Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Arg210 215 220Ala Val Arg Met Lys lie Arg Pro Leu Val Thr Gln22523023权利要求
如下a)或b)的蛋白在抑制蛋白聚集或变性蛋白复性中的应用；a)其氨基酸序列为序列表中的序列1；b)纤维蛋白原-420；所述纤维蛋白原-420优选为人的纤维蛋白原-420。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述a)或b)的蛋白与所述变性蛋白的 摩尔比为25 1至1 100。
3.如下a)或b)的蛋白在制备用于预防和/或治疗蛋白构象病的药物中的应用；a)其氨基酸序列为序列表中的序列1；b)纤维蛋白原-420；所述纤维蛋白原-420优选为人的纤维蛋白原-420。
4.一种用于预防和/或治疗蛋白构象病的药物，其活性成分是如下a)或b)的蛋白；a)其氨基酸序列为序列表中的序列1；b)纤维蛋白原-420；所述纤维蛋白原-420优选为人的纤维蛋白原-420。
5.如下a)或b)的蛋白在抗蛋白变性中的应用；a)其氨基酸序列为序列表中的序列1；b)纤维蛋白原-420；所述纤维蛋白原-420优选为人的纤维蛋白原-420。
6.一种用于治疗蛋白变性疾病的药物，其活性成分是如下a)或b)的蛋白；a)其氨基酸序列为序列表中的序列1；b)纤维蛋白原-420；所述纤维蛋白原-420优选为人的纤维蛋白原-420。
7.一种蛋白稳定剂，其活性成分是如下a)或b)的蛋白；a)其氨基酸序列为序列表中的序列1；b)纤维蛋白原-420；所述纤维蛋白原-420优选为人的纤维蛋白原-420。
8.如下a)或b)的蛋白在蛋白质产品质量控制检测中应用；a)其氨基酸序列为序列表中的序列1；b)纤维蛋白原-420；所述纤维蛋白原-420优选为人的纤维蛋白原-420。
全文摘要
本发明公开了纤维蛋白原-420及其活性结构域的新用途。纤维蛋白原-420分子包含alpha EC结构域蛋白，并且单独alpha EC结构域蛋白也具有与纤维蛋白原-420相同的或类似的功能。纤维蛋白原-420及其活性结构域可以在抑制蛋白聚集、帮助蛋白复性、抗预防和/或治疗蛋白构象病的药物、质量控制中变性蛋白检测和抗蛋白变性等方面广泛应用。
文档编号A61K38/17GK101822823SQ200910079569
公开日2010年9月8日 申请日期2009年3月6日 优先权日2009年3月6日
发明者付彦, 唐华东, 罗永章 申请人:清华大学