专利名称：一种Cs-4发酵菌丝体多糖及其制备方法与用途的制作方法
技术领域：
本发明属中药制药领域，具体涉及一种以蝙蝠蛾拟青霉(Cs-4)菌丝体为原料制备的Cs-4 发酵菌丝体多糖及其制备方法与用途。
背景技术：
冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordyc印s sinensis (Berk.) Sacc.寄生在蝙蝠蛾 科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，是名贵中药材(以下简称虫草)。由于天然虫草生 长环境特殊，且价格较高，不能满足市场的需求。因此，人们利用现代生物发酵技术培育出 虫草菌丝体来代替天然虫草。中国中医科学院中药研究所于1982年从云南迪庆藏族自治州采 集的冬虫夏草样品上分离获得十几个菌株，并对其中4个菌株进行了培养和形态学的研究， 经鉴定命名为蝙蝠蛾拟青霉(Paecilonyces h印ialid chen & Dai Cs-4，以下简称Cs-4;虫 草菌丝的生理研究.邵爱娟、戴如琴等，中国中医药科技，1994年第1巻第5期[J].)。中国 医学科学院药物研究所1982年从青海化隆县采集的新鲜冬虫夏草中分离得到Cs-4菌株， 经鉴定也是蝙蝠蛾拟青霉。后来，以蝙蝠蛾拟青霉培养发酵的菌丝体为原料制成的药品成功 上市，药品名称为金水宝胶囊。
虫草多糖具有广泛的生理活性。大量医学实验证实，虫草多糖可提高人体免疫能力，改 善呼吸系统，可使肾上腺重量、血浆皮质醇、醛固酮及肾上腺内胆固醇含量增加，有促进肾 上腺的作用，并具有抗肿瘤、抗辐射、降血糖和止咳、化痰、润肺和延缓衰老等药理作用。 随着现代生物技术的发展，人工发酵培养成为获取虫草多糖的新途径。
中国专利CN200810120873. 0公开了以Cs-4发酵废液为主要原料制备虫草多糖的提取方 法，发酵废液中虫草多糖的含量较低，杂质多，不宜分离纯化，其多糖主要为胞外多糖，并 非来自菌丝体内的胞内多糖，来自Cs-4发酵虫草菌丝体内的胞内多糖还未见有应用于医药领 域的相关报道。
肾小球硬化和肾间质纤维化是各种慢性肾脏疾病发展至终末期的共同病理基础，因此有
效延缓肾小球硬化、肾间质纤维化的进程能有效地延缓慢性肾衰竭的进展。TGF-ei是最重
要的导致肾小球硬化、肾间质纤维化因子，TGF-Pl通过刺激成纤维细胞、肾小球细胞等增 加细胞外基质(ECM)成分合成，抑制多种ECM降解酶的活性，抑制ECM的降解，刺激小管上 皮细胞转分化为肌成纤维细胞，从而导致肾组织的纤维化。因此，TGF-Pl是理想的抗肾纤 维化的靶标。
发明内容
本发明人以Cs-4发酵菌丝体为原料，采用水提、醇沉、脱色以及超滤等方法得到分子量 在50万以下的Cs-4发酵虫草菌丝体胞内多糖(以下简称Cs-4多糖)，通过药理药效试验， 发现本发明的多糖具有很好的抗肾小球硬化、抗肾间质纤维化的作用。.
本发明的多糖还具有很好的提高机体免疫力的作用。
本发明的多糖以Cs-4发酵菌丝体的胞内多糖为主，分子量在1万至50万之间，更确切 地说，本发明的多糖分子量在1万至20万之间会具有更好的药理效果。
本发明的多糖可用于制备治疗和预防肾小球硬化和肾间质纤维化药物或保健品。
本发明的Cs-4发酵菌丝体的胞内多糖提取物可应用药剂学上可接受的辅料，制成片剂、 胶囊、含片、软胶囊、冻干含片、液体胶囊、注射液等药物剂型。
本发明可通过以下技术方案来实现
Cs-4发酵虫草菌丝体多糖(以下简称Cs-4多糖)的制备
取Cs-4发酵虫草菌丝体，粉碎，用水加热提取3次，每次加入6-12倍重量的水，加热 提取1-3小时，滤过，滤液静置过夜，高速离心(20000转/分钟)，用截留分子量为10000 的超滤膜超滤浓縮，浓缩至截留液体积与虫草菌丝体重量比为1: 2 (g/ml)，加乙醇使含醇 量达20%，静置过夜，滤过，取上清液，继续加乙醇使含醇量达60%-70%,静置，滤过，沉淀 用水溶解，再用乙醇醇沉一次，使含醇量达70%-80%，静置，取沉淀加蒸馏水使溶解，加20% 的三氯乙酸溶液使其浓度达1%,冷藏静置，高速离心(20000r/min)，离心液加水至药液与 生药量比为2: 1，用截留分子量为500000的中空纤维柱超滤，超滤浓缩液用3倍量蒸馏水 超滤洗涤，超滤出的滤出液浓缩到药液体积与虫草菌丝体重量之比为1: 2，加乙醇使含醇量 达80%，静置，抽滤，沉淀用80%的乙醇洗尽残留的三氯乙酸，再用乙醇洗涤数次，7(TC， 6. 6KPa 的条件下真空干燥，或者冷冻干燥，粉碎，得Cs-4发酵虫草菌丝体多糖提取物(Cs-4多糖)。
下面通过实验例对本发明作进一步的说明。
一、本发明的Cs-4发酵虫草菌丝体多糖提取物多糖的含量测定
1、多糖的含量测定
仪器与试剂
紫外一可见分光光度计(日本岛津UV-2450型)、数显恒温水浴锅冊一4 (国华电器有限 公司)、葡萄糖对照品(中国药品生物制品检定所，批号U0833 — 200602)、苯酚、浓硫酸(北 京化学试剂公司，均为分析纯)标准曲线的制备
精密称取葡萄糖标准品适量，用蒸馏水配制成0. lmg/ml的标准品溶液，分别精密吸取 葡萄糖标准液O. 1、 0.3、 0.5、 0.7、 0.9、 l.lml，置于具塞试管中，加蒸馏水使体积为2.0 ml，再加6y。苯酚液1.0 ml，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0ml，摇匀，放置5分钟，置沸水浴上 加热15分钟，取出，冷水冷却至室温；另以蒸馏水2. Oml，同上述操作作为空白对照，于490nm 处利用分光光度计测定吸收值。以标准品葡萄糖量(yg)为横坐标，吸收值为纵坐标,计算得 回归方程:Y^.0077X +0.0057， R=0.9997，说明标准品葡萄糖量在0 110w g范围内与吸收 值呈良好的线性关系。
样品含量测定
精密称取Cs-4发酵虫草菌丝体多糖提取物(实施例3所得多糖提取物)适量，用蒸馏水 配制成0.2mg/ml的供试品溶液，吸取供试品溶液0. 加蒸馏水至2.0 ml,分别按标准曲 线制备项下方法制备，测定吸收值，按线性回归方程求得Cs-4发酵虫草菌丝体多糖提取物多 糖的含量为67.8% 。
二、 Cs-4发酵虫草菌丝体多糖提取物的药效实验例 1、材料 1.1实验动物
健康雄性Wistar大鼠60只，体重180-220g，由军事医学科学院动物中心提供，并饲 养在该中心动物实验室。 1.2药物
Cs-4发酵虫草菌丝体多糖提取物(由江西金水宝药业提供，具体按实施例3工艺制得)； 尿毒清颗粒(广州康臣药业有限公司)；腺嘌呤(国药集团化学试剂有限公司)。
1. 3主要试剂
兔抗大鼠TGF-P1多克隆抗体、二步法免疫组化检测试剂盒(北京中山生物技术有限 公司)；TGF-e 1R I、 TGF-e 1R II的RT-PCR引物(上海博亚生物技术有限公司)，Trizol试 剂盒(美国Invitrogen公司)提供，琼脂糖(美国Sigma公司)。 2方法
2. 1造模随机取12只大鼠作为正常组给予蒸馏水灌胃，其余大鼠给2. 5%腺嘌呤混悬液 按250mg'kg-、cf1灌胃，连续给药21d。取眼底静脉血0. 5ml，测血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)， 确证造模成功。
2.2分组
造模大鼠分为4组，每组10只病理模型组、尿毒清组、Cs-4发酵虫草菌丝体多糖(以下简称虫草多糖)高剂量组(160mg/kg)、 Cs-4发酵虫草菌丝体多糖低剂量组(80mg/kg)。 2.3给药造模成功后，Cs-4发酵虫草菌丝体低剂量组按80mg'kg-"进行灌胃；高剂
量组按160mg'kg—''d—、尿毒清组按1.81g'kg—i'd爿进行灌胃，正常组和病理模型组采用2ml'k
g—'-d—'蒸馏水灌胃，共治疗60d。治疗中大鼠自由进食、饮水。
2.4取材用戊巴比妥钠麻醉，处死，用电子秤称体重后剖检，取鲜活肾组织，观察肾脏
形态，称湿重。肾组织纵切， 一部分放入4%多聚甲醛溶液固定，另一部分在液氮中保存。 3检测
3.1肾脏病理学观察常规石蜡切片，HE、 Masson染色。光镜下观察肾小球、肾小管、 肾间质、肾血管结构变化。 3.2免疫组化
一抗兔抗TGF-ei多克隆抗体；二抗生物素化山羊抗兔I g G。具体步骤石蜡切 片脱蜡脱水热修复抗原lOmin，滴加正常山羊血清封闭液，室温10min，甩去封闭液，滴加 一抗(l:50)于4。C冰箱过夜，滴加二抗(1:75)， 20'C 20min， DAB显色10-30min，苏木素 轻度复染，常规脱水，透明，封片，显微镜下观察。细胞中有匀质细颗粒状物质为阳性，分 布在细胞膜和胞浆中，以细胞膜为主。每一切片随机取5个视野，测出阳性着色面积及阳性 细胞数，用阳性细胞百分比表示该组织中此物质的含量。
3. 3 RT-PCR检测
组织总RNA的提取按照Trizol说明书进行。配置逆转录体系5xcDNA Synthesis buffer 4u 1， 0. 1M DTT lu 1, RNase OUT( 40U/u 1) ， DEPC-treated water 1 u 1， ThermoSctiptTM RT(15U/u 1)， lnl。充分混匀后，吸取8u l加入孵育后的反应管中，然后放入PCR仪，50 °C， 60min进行逆转录合成cDNA，以此为模板进行PCR扩增。
PCR扩增条件:94。C、 5min; 9化、30s、 ( ACT IN: 55。C、 TGF-P 1R I:56。C、 TGF-plR 1I:54。C lmin, 72°C、 lmin， 3 0个循环；72°C、 10min。经2%的琼脂糖凝胶电泳检测，用凝 胶成像系统分析并拍照。用ImageTool 5. 0分析各电泳条带灰度积分，以Actin的灰度积分 作为标准校正，进行半定量分析。
4、 图像分析
间质纤维化半定量分析采用彩色多媒体半定量分析系统，取Masson染色切片，每组随机 选10个视野，通过灰度调节区分视野内阳性信号面积，计算阳性总目标与统计场总面积比值， 取均值进行统计分析。免疫组化半定量分析借助高清晰度彩色病理图文报告分析系统，每张 切片随机选取10个高倍视野(X 400 )，测定肾组织TGF- e 1 ，计算其平均吸光度值，吸光度 越大表示其表达量越多。5统计学方法实验数据采用SPSS 10.0统计软件分析，多组间比较用方差分析，结果 以(义士S )表示。 6、试验结果
6.1、各组大鼠BUN、 Scr的变化
灌注腺嘌呤21天后，与正常组比较，各组BUN、 Scr显著升高(P<0.01)，结果表明， 造模成功，组间具有可比性。
表1造模后各组BUN、 Scr比较(义士S )
组别
BUN(聽1/L)
Scr(u mol/U
正常组
病理模型组
尿毒清组
Cs-4发酵虫草菌丝体多糖 低剂量组
Cs-4发酵虫草菌丝体多糖 高剂量组
12 7. 14±1.31
10 28. 87±8. 52
10 28. 69±9. 63
10 28.45±10.01
10 28. 17±9. 34
62. 35±10. 25
172. 30±16. 48* 174. 68±12. 4"
173. 32±14. 15*
171.21±15. 28*
注与正常组比较，"P<0.01 试验结果说明，模型造模成功。
6.2、 一般形态学变化
HE染色结果正常组肾小管皮、髓质分界清楚，肾间质无异常改变，无纤维组织增生， 小管管腔无结晶物沉积；病理模型组肾小管皮、髓质分界不明，肾小管萎縮，上皮细胞变性、 坏死，间质纤维呈网状或片状增生，部分小管内可见结晶物沉积；虫草多糖高剂量组肾小管 上皮细胞轻度蒌縮、变性，间质存在极少量炎症细胞，纤维组织增生不明显；尿毒清组及虫 草多糖低剂量组肾小管间质改变介于虫草多糖高剂量组与病理模型组之间。
HE染色结果表明，Cs-4发酵虫草菌丝体多糖高剂量组对肾纤维化具有较好的作用。
6.3、间质纤维化半定量
正常组肾组织胶原染色小管周围间质部分比较狭窄。病理模型组肾间质大量炎症细胞浸 润，间质纤维组织增生，面积增宽，小管部分萎缩、管腔闭塞或扩张。治疗后间质病变减轻， 纤维化明显得到改善(P〈0.01)，其中高剂量组治疗效果最好，与尿毒清组相比有统计学差异 (P<0.01)。表2各组间质纤维化半定量检测结果比较(X±S )
组别 n 间质病变平均积分
正常组120. 33±0. 11"
病理模型组82. 87±0. 32
尿毒清组92.64±0. 36"
Cs-4发酵虫草菌丝体多糖低剂量组92. 51±0. 3广
Cs-4发酵虫草菌丝体多糖高剂量组102. 12±0. 29"aa
注与病理模型组比较，**P<0.01;与尿毒清组比较，AAP<0.01
试验结果表明，CS-4发酵虫草菌丝体多糖高剂量组对腺嘌呤组所致的肾组织纤维化具有
显著的作用。
6. 4免疫组织化学
TGF-e 1在肾组织中的表达主要集中在肾小管上皮细胞，以胞浆染色为主，肾小球也可 见少量表达。其他各组表达比TGF-ei正常组明显增强(P<0.01 )，治疗组明显抑制TGF-Pl的表达，与模型组比较有统计学差异(P<0.01 )。其中高剂量组治疗效果明显，与尿毒
清组比较有统计学差异(P〈0.(H)，与低剂量组比较有统计学差异(P<0.05)。 表3治疗后各组大鼠肾脏TGF-P 1表达平均水平比较
组别nTGF-P 1(%)
正常组127. 18±0. 79**
病理模型组856. 18±11.98
尿毒清组923. 89±5.62**
Cs-4发酵虫草菌丝体多糖低剂量组921.25±4. 21
Cs-4发酵虫草菌丝体多糖高剂量组1016. 47 ±3. 54**AA
注与病理模型组比较，"P<0.001;与尿毒清组比较，AAP<0.01;
试验结果表明，Cs-4发酵虫草菌丝体多糖具有显著抑制TGF-0 l的作用。
具体实施例 实施例1
Cs-4发酵虫草菌丝体多糖片剂
Cs-4发酵虫草菌丝体多糖的制备
取Cs-4发酵虫草菌丝体10kg，粉碎，用水加热提取3次，每次加入8倍重量的水，加 热提取2小时，滤过，滤液静置过夜，高速离心(20000转/分钟)，用截留分子量为10000的超滤膜超滤浓縮，然后减压浓縮截留液至截留液体积与虫草菌丝体重量比为h 2 (g/ml)， 加乙醇使含醇量达20%，静置过夜，滤过，取上清液，继续加乙醇使含醇量达70%,静置，滤 过，沉淀用水微热(50°C)使溶解，放冷，再加乙醇使含醇量达80%，静置，抽滤，取沉淀 加蒸馏水使溶解，加20%的三氯乙酸溶液使其浓度达1%，冷藏静置，高速离心(20000r/min)， 离心液加水至药液与生药量比为2: 1，用截留分子量为500000的中空纤维柱超滤，超滤浓 縮液用3倍量蒸馏水超滤洗涤，超滤出的滤出液浓縮到药液体积与虫草菌丝体重量之比为1: 2，加乙醇使含醇量达80%，静置，抽滤，沉淀用80%的乙醇洗尽残留的三氯乙酸，再用乙醇 洗涤数次，7CTC， 6.6KPa的条件下真空干燥，粉碎，得Cs-4发酵虫草菌丝体多糖提取物
按药剂学上可接受的辅料，压制成片，包薄膜衣，即可得本发明的Cs-4发酵虫草菌丝体 多糖片剂。
实施例2
Cs-4发酵虫草菌丝体多糖胶囊
Cs-4发酵虫草菌丝体多糖的制备
取Cs-4发酵虫草菌丝体5kg，粉碎，用水加热提取3次，每次加入10倍重量的水，加 热提取1小时，滤过，滤液静置过夜，高速离心(20000转/分钟)，用截留分子量为10000 的超滤膜超滤浓縮，然后减压浓縮截留液至截留液体积与虫草菌丝体重量比为1: 1 (g/ml)， 加入1.5%的活性炭，搅拌，抽滤，滤液浓缩至药液体积与虫草菌丝体重量比为1: 2 (g/ml) 加乙醇使含醇量达20%，静置过夜，滤过，取上清液，继续加乙醇使含醇量达60%，静置，滤 过，沉淀用水微热(5(TC)使溶解，放冷，再加乙醇使含醇量达70%，静置，抽滤，取沉淀 加蒸馏水使溶解，加20%的三氯乙酸溶液使其浓度达1%，冷藏静置，高速离心(20000r/min)， 离心液加水至药液与生药量比为5: 1，用截留分子量为500000的中空纤维柱超滤，超滤出 的滤出液浓縮到药液体积与虫草菌丝体重量之比为h 2，加乙醇使含醇量达80%,静置，抽 滤，沉淀用80%的乙醇洗尽残留的三氯乙酸，再用乙醇洗涤数次，7(TC, 6.6KPa的条件下真 空干燥，粉碎，得Cs-4发酵虫草菌丝体多糖提取物。
按药剂学上可接受的辅料，压制成片，包薄膜衣，即可得本发明的Cs-4发酵虫草菌丝体 多糖片剂。
实施例3
Cs-4发酵虫草菌丝体多糖含片
Cs-4发酵虫草菌丝体多糖的制备
取Cs-4发酵虫草菌丝体10kg，粉碎，用水加热提取3次，每次加入8倍重量的水，加 热提取1.5小时，滤过，滤液高速离心(20000转/分钟)，离心液用截留分子量为10000的
9超滤膜超滤浓縮，然后减压浓縮截留液至截留液体积与虫草菌丝体重量比为h 1 (g/ml), 加入1.0%的活性炭，加热，搅拌，抽滤，滤液浓縮至药液体积与虫草菌丝体重量比为1: 2
(g/ml)，加乙醇使含醇量达20%，静置过夜，滤过，取上清液，继续加乙醇使含醇量达60%, 静置，滤过，沉淀用水微热(50'C)使溶解，放冷，再加乙醇使含醇量达8(m，静置，抽滤， 取沉淀加蒸馏水使溶解，加20%的三氯乙酸溶液使其浓度达1%，冷藏静置，高速离心
(20000r/min)，离心液加水至药液与生药量比为3: 1,用截留分子量为200000的中空纤维 柱超滤，超滤出的滤出液浓缩到药液体积与虫草菌丝体重量之比为1: 2，加乙醇使含醇量达 80%，静置，抽滤，沉淀用80%的乙醇洗尽残留的三氯乙酸，再用乙醇洗涤数次，冷冻干燥， 粉碎，得Cs-4发酵虫草菌丝体多糖提取物。
取Cs-4发酵虫草菌丝体多糖提取物，加入蔗糖，甘露醇，低取代羟丙基纤维素，少量硬 脂酸镁，混匀，压片，即得。
实施例4
Cs-4发酵虫草菌丝体多糖注射液
Cs-4发酵虫草菌丝体多糖的制备
取Cs-4发酵虫草菌丝体10kg，粉碎，用水加热提取3次，每次加入8倍重量的水，加 热提取1.5小时，滤过，滤液高速离心(20000转/分钟)，离心液用截留分子量为10000的 超滤膜超滤浓缩，然后减压浓缩截留液至截留液体积与虫草菌丝体重量比为1: 1 (g/ml)， 加入1.0%的活性炭，加热，搅拌，抽滤，滤液浓縮至药液体积与虫草菌丝体重量比为1: 2
(g/ml),加乙醇使含醇量达20%，静置过夜，滤过，取上清液，继续加乙醇使含醇量达60%, 静置，滤过，沉淀用水微热(5CTC)使溶解，放冷，再加乙醇使含醇量达80%，静置，抽滤， 取沉淀加蒸馏水使溶解，加20%的三氯乙酸溶液使其浓度达1%，冷藏静置，高速离心
(20000r/min)，离心液加水至药液与生药量比为3: 1，用截留分子量为200000的中空纤维 柱超滤，超滤出的滤出液浓缩到药液体积与虫草菌丝体重量之比为1: 2，加乙醇使含醇量达 80%，静置，抽滤，沉淀用80%的乙醇洗尽残留的三氯乙酸，再用乙醇洗涤数次，冷冻干燥， 粉碎，得Cs-4发酵虫草菌丝体多糖提取物。
取Cs-4发酵虫草菌丝体多糖提取物，加注射用水使溶解，制成每lml含多糖lOmg,加 入0.2%的药物活性炭，保持微沸15分钟，趁热滤过，滤液用0.22um的微孔滤膜滤过，滤 液灌封，灭菌，即得。
10
权利要求
1、一种虫草菌丝体多糖提取物，其特征在于其以蝙蝠蛾拟青霉(Cs-4)发酵菌丝体为原料制备而成，多糖分子量在1×104～5×105之间，按重量百分比计，其多糖的含量不低于50％。
2、 根据权利要求1所述的虫草菌丝体多糖提取物，其特征在于多糖分子量在1X104 2X10S之间，按重量百分比计，其多糖含量不低于50%。
3、 权利要求l或者权利要求2任一权利要求所述的多糖提取物的制备方法，其特征在 于该多糖提取物可由下述方法制备取Cs-4发酵虫草菌丝体，粉碎，用水加热提取3次，每次加入6-12倍重量的水，加热 提取l-3小时，滤过，滤液静置过夜，高速离心(20000转/分钟)，用截留分子量为10000 的超滤膜超滤浓縮，浓縮至截留液体积与虫草菌丝体重量比为1: 1 (g/ml)，用活性炭脱色， 抽滤，滤液浓縮至药液体积与虫草菌丝体重量比为1: 2 (g/ml)，加乙醇使含醇量达20%， 静置过夜，滤过，取上清液，继续加乙醇使含醇量达60%_70%，静置，滤过，沉淀用水溶解， 再用乙醇醇沉一次，使含醇量达70%-80%，静置，取沉淀加蒸馏水使溶解，加20%的三氯乙酸 溶液使其浓度达1%，冷藏静置，高速离心(20000r/min)，离心液加水至药液与生药量比为 2: 1，用截留分子量为500000的中空纤维柱超滤，超滤浓缩液用3倍量蒸馏水超滤洗涤，超 滤出的滤出液浓缩到药液体积与虫草菌丝体重量之比为1: 2，加乙醇使含醇量达80%,静置， 抽滤，沉淀用80%的乙醇洗尽残留的三氯乙酸，再用乙醇洗涤数次，70'C、 6.6KPa的条件下 真空干燥，或者冷冻干燥，粉碎，得Cs-4发酵虫草菌丝体多糖提取物(Cs-4多糖)。
4、 蝙蝠蛾拟青霉(Cs-4)发酵菌丝体多糖提取物在制备治疗和预防肾小球硬化、肾间 质纤维化药物或保健品中的应用。
全文摘要
本发明以蝙蝠蛾拟青霉(Cs-4)发酵菌丝体为原料，采用水提、醇沉、脱色以及超滤等方法得到分子量在50万以下的Cs-4发酵虫草菌丝体胞内多糖，通过药理药效试验，发现本发明的多糖具有较好的抗肾小球硬化、抗肾间质纤维化的作用，可用于制备抗肾小球硬化和肾间质纤维化药物。
文档编号A61K31/715GK101560268SQ20091014364
公开日2009年10月21日 申请日期2009年5月31日 优先权日2009年5月31日
发明者李义海 申请人:江西济民可信集团有限公司