专利名称：一种用于修复尿道的复合物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及一种以脱细胞的膀胱黏膜下 胶原筋膜(BAMG)为支架的复合物及其制备方法和用途。
背景技术：
尿道下裂和不同原因引起的尿道狭窄是泌尿外科常见的疾病，其中尿道下裂的发 病率在1/250-1/350。但由于尿道黏膜组织的有限，给尿道的修复带来了极大的困难。
目前多采用的是天然或人工的生物支架材料进行尿道修复，但由于其在降解过程 中造成的炎症反应较剧烈，影响到细胞的分化和增殖及尿道的修复，易引起尿道狭窄，而脱 细胞的膀胱黏膜下胶原筋膜(BAMG)取材于膀胱组织，由于其来自尿路系统，生物相容性 好，且富含胶原纤维，组织结构疏松，有利于细胞生长，且其属天然材料，降解过程中反应较 小，是一种理想的生物支架。 但国内外学者报道的动物实验和临床运用均需保留尿道板，将BAMG覆盖其上，如 果尿道缺损严重甚至于闭锁，无残留尿道板可利用，需要行全管状尿道替代时，单纯的脱细 胞胶原筋膜修复的效果不甚理想。以往组织工程化尿道的上皮直接选择尿路上皮细胞，如 切取小块膀胱黏膜后，分离出移行上皮细胞，通过体外培养，再植入支架。虽然此法能保证 组织工程化尿道上皮细胞的同源性，但缺点也非常明显，即手术创伤大，步骤繁琐。
因此，本领域迫切需要开发新的有效、操作简便、安全的尿道修复用复合物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新的尿道修复用复合物。
本发明的另一 目的就是提供所述复合物的制法和用途。 在本发明的第一方面，提供了一种用于修复尿道的复合物，所述用于修复尿道的 复合物含有脱细胞的膀胱黏膜下胶原筋膜(bladder acellularmatrix graft, BAMG)和表 皮细胞。 在另一优选例中，所述的膀胱黏膜下胶原筋膜和表皮细胞来自于同种同体或同种 异体。 在另一优选例中，以复合物的总体积计，其中含有的表皮细胞的密度为1-3X106 个/ml。 在另一优选例中，所述的表皮细胞是皮肤表皮细胞。 在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的本发明提供的用于修复尿道的复合 物的制备方法，所述的方法包括步骤 (1)将表皮细胞接种于脱细胞的膀胱黏膜下胶原筋膜；禾口 (2)在适合表皮细胞生长的条件下培养10-30天，得到如上所述的本发明提供的 用于修复尿道的复合物。 在另一优选例中，所述的膀胱黏膜下胶原筋膜和表皮细胞来自于同种同体或同种异体。 在另一优选例中，表皮细胞的接种量为l-3Xl(f个/ml。 在另一优选例中，步骤(2)的培养是在完全浸没或气液交界的情况下，于 37±0. 5°C，5% C02和饱和湿度下进行。 在本发明的第三方面，提供了一种如上所述的本发明提供的用于尿道修复的复合 物的用途，用作或用于体外构建尿道移植物。 据此，本发明提供了新的有效、操作简便、安全的尿道修复用复合物。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，发现体外预先植入上皮细胞的胶原筋膜进行修 复尿道可有效避免修复段中央区域上皮细胞爬行覆盖困难这一棘手的难点。本发明采用皮 肤表皮细胞作为种子细胞，尤其是选择了包皮的表皮细胞作为细胞主体。
定义 如本文所用，"复合"是指将上皮细胞种植于膀胱黏膜下胶原筋膜形成本发明提供 的复合物的过程。 如本文所用，"膀胱黏膜下胶原筋膜(BAMG)"是指一种天然的生物可降解材料， 可以使用本领域常规的方法获得，也可以通过商购渠道，例如但不限于，将家兔、犬、或 人的膀胱在0.2% Triton X-100和氢氧化胺组成的溶液中处理得到的。优选脱细胞的 BAMG，以该生物可降解材料的总重量计，其中细胞的含量为0. 5-6乂106个/0112，较佳地为 0. 8-4. 5 X 106个/cm2，更佳地为1_3 X 106个/cm2。在本发明中，BAMG的形状没有特别限制， 通常为管状的。
复合物 本发明提供的复合物中含有BAMG和表皮细胞，以复合物的总体积计，其中表皮细 胞的密度为l-3X106个/ml。所述的BAMG和表皮细胞来自于同种同体或同种异体。常用 的BAMG来自猪、牛、羊、狗、兔等非人哺乳动物。优选BAMG来自于同种异体，表皮细胞则来 源于同种同体。 可用于本发明的表皮细胞优选自皮肤表皮细胞，更佳地是来自包皮的表皮细胞。 表皮细胞的分离和培养方法都是本领域中熟知的。用于形成复合物的表皮细胞优选体外培 养、增殖、传代达细胞密度为1-3 X 106个/cm2的。
制备方法 本发明提供的复合物可用以下方法制备 (1)将表皮细胞接种于脱细胞的膀胱黏膜下胶原筋膜；表皮细胞的接种量为 l-3Xl。6个/ml ; (2)在适合表皮细胞生长的条件下(如完全浸没或气液交界的情况下，于
37±0. 5°C，5% C02和饱和湿度下)培养10-30天，得到本发明提供的复合物。 本发明提供的复合物回植于体内用于修改尿道或可用作尿道移植物。优选适用于
尿道缺损严重甚至于闭锁，无残留尿道板可利用的。 本发明的主要优点在于 (1)本发明使用的种子细胞是皮肤表皮细胞，来源丰富，体外易于培养扩增。
(2)本发明选择了包皮的表皮细胞作为种子细胞主体，其优点在于包皮取材容易， 创伤小，为将来组织工程化尿道修复在人体的运用创造了可行性和便利性，其社会效益和 给临床医疗机构带来的经济效益都是相当可观的。 下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否 则所有的百分比和份数按重量计。 本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在 100毫升的溶液中溶质的重量。 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文 中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1 同种兔的膀胱粘膜下组织的显微分离，脱细胞，胶原筋膜的制备
切取兔的膀胱，在显微镜下分离出黏膜下层，将其置入双蒸水，0.2% Triton X-100和氢氧化胺组成的脱细胞液中，处理，漂洗以脱去组织中的细胞成分，以避免免疫反 应的发生，并切取部分黏膜下组织进行鉴定以判断脱细胞效果。 膀胱粘膜下组织经脱细胞液处理后，呈疏松的薄膜状，随机取材后，经HE染色，光 镜观察筋膜为疏松的胶原成分，无论是在上皮层还是在其下的真皮层，大部为结构疏松的 胶原纤维，未见有细胞存在，表明脱细胞效果良好，避免今后回植入体内时可能发生的异体 之间的排异反应，表明脱细胞效果良好。
实施例2 兔包皮表皮细胞的分离、培养、增殖 氯胺酮麻醉下，解剖切取小块兔包皮组织，运用DSBS2和多种蛋白酶(胰酶)处 理，分离出表皮细胞，将其种植在3T3滋养层上，加入由KSFM+EGF+牛垂体提取素组成的细 胞培养液，体外培养，增殖，传代，使之达到一定细胞密度(2.7Xl()6个/cm2)。通过免疫组 化对扩增后的表皮细胞标记(抗AE1/AE3)进行鉴定。 分离消化后的上皮细胞生长良好，经免疫组化测定为正常上皮细胞，并传代3代，
细胞数量达到植入生物支架并生长的需要。 实施例3 复合物的制备及使用 材料和方法 —、实施例2得到的扩增后的表皮细胞与BAMG复合，运用浸没和气液交界培养技 术(气液交界培养技术方法取雄性幼兔，体重0. 3kg，采用3%氯胺酮麻醉，麻醉生效后，局 部消毒，剪取1X0. 5cm的包皮组织，取下的皮肤置入加KSFM溶液20毫升的离心管中，离心 管放入冰桶保存。皮肤取出置入40C的0. 25%氯霉素溶液+青链霉素，冲洗5分钟/次，连 续三次。准备眼科小剪刀一把，小镊子两把，修剪皮下组织，制成1厘米*2毫米大小。采用 PBS溶液漂洗三次。置入Dispase II中在40C消化14小时。弃取DSBS，用镊子和剪刀剥离真皮和表皮。表皮置入培养皿中，加(0. 05%胰酶+0. 02% EDTA)在25度情况下放置30 分钟。加入10X胎牛血清的DMEM，终止胰酶作用。采用150目金属不锈钢过滤网，滤出细 胞悬液。使用1500转/分离心机离心5分钟，去除上清液，加PBS 6毫升，摇匀，再离心一 次，去上清液。加KSFM，摇匀，接用移液管反复吹打后，接种在培养皿底部，加KSFM10-15毫 升。放入370C、5XC02、饱和湿度细胞培养箱。第三天换培养液，以后每三天换一次液。细 胞生长、增殖到80%融合时传代。吸去培养液，PBS溶液冲洗，加入0. 05X胰酶，370C消化 1分钟，加入胎牛血清和DMEM，终止胰酶作用，并用刮器在培养皿底部刮落贴壁的细胞，PBS 液冲洗，形成单细胞悬液，以1 : 3接种于新的培养皿内。每3天在细胞换液的同时，将培 养皿置于光学显微镜下，观察细胞生长状况，形态，贴壁情况。)，体外共培养21天，利用光 镜和电镜和免疫组化方法进行组织学和细胞标记物鉴定(抗AE1/AE3，P63) ，Brdu加入复合 物进行标记。 二、24只IO月雄兔，分成两组，分别采用剥离1. 5cm尿道粘膜后植入表皮细胞和胶 原筋膜形成的复合物(实验组)和未接种细胞的胶原筋膜(对照组)进行修复。观察时间 点分别设为术后1、2、6、12月四个观察点，每次每组处死3只实验对象，观察愈合效果。
三、兔组织工程学尿道的组织结构研究，包括阴茎部尿道的大体形态、组织学修复 段上皮细胞的形态特性和免疫组化学研究以及Brdu着色变化情况的光镜观察。
四、兔组织工程学尿道的功能评估 术前和术后不同观察点，兔的排尿情况，尿道造影等，以此判断组织工程学尿道的
尿动力学状况。
结果 对照组6例(6/12)发生狭窄(尿道造影证实)，造影显示发生狭窄的部位正是在
修复段尿道，长度约1.5cm左右，3例(3/12)发生尿瘘，4例(4/12)完全失败。 对照组的雄兔，修复段尿道中间组织苍白隆起，组织致密坚硬，且管腔狭小。术后
尿道修复段组织切片的HE染色显示 术后2周修复段取材，植入的胶原筋膜依然存在。 术后8周修复段取材，植入的胶原筋膜已降解。 对照组8周和6月的粘膜下层存在较多紊乱的平滑肌肌束，肌束粗大，创面为单一 上皮细胞覆盖，表面凹凸不平。 抗角蛋白AE1/AE3抗体显示修复段尿道为上皮细胞所覆盖。
脱细胞基质载体和表皮细胞结合构建尿道的实验研究 1、实验对象在术前的尿道造影无明显差异，尿道通畅。术后两周左右经观察发现 留置尿管自行脱落排出，实验组无一例发生尿瘘，12例对象尿道造影显示尿道基本通畅，无 明显梗阻现象存在。 2、术后切取的尿道组织标本大体观察术后1月时，实验组尿道除少量残留可吸
收线头外，修复段尿道已全部被粘膜所覆盖，粘膜光洁完整，管腔无明显狭小；至术后6月，
修复段尿道粘膜已与正常尿道无异；术后12月，已显示正常尿道表现。 3、术后尿道修复段组织切片的HE染色免疫组化结果(A)术后1月，修复段尿道
粘膜层次单一，缺乏复层和乳头结构；术后2月复层上皮结构形成，平滑肌细胞形态与周边
正常细胞无明显差异，肌层中的血管中有部分充血，角蛋白染色阳性；术后6月细胞形态和层次仍呈复层扁平结构；而术后12月修复段尿道上皮细胞已表现为类似移行上皮细胞结 构。(B)术后6月时，可观察到修复段组织和正常尿道的交界处，显示修复段的复层扁平细 胞层与多乳头隆起的尿路上皮细胞之间仍有鲜明的区别，角蛋白染色显示两种上皮的角蛋 白结构的区别；而术后12月时，修复段与宿主之间已无明显界限存在。
4、免疫荧光标记情况通过共聚焦显微镜观察发现，Brdu标记在术后1月清晰显 示植入上皮细胞层存在，并与宿主的自体上皮细胞层形成鲜明的分界面；术后2月Brdu着 色的上皮细胞明显减少，且位置基本位于基底层；术后6月及12月修复段上皮细胞曾已无 荧光标记细胞存在。 结果表明，相对于无细胞的胶原筋膜，植入表皮细胞的胶原筋膜可运用于全管状 尿道修复，修复效果良好，有希望成为尿道修复的理想材料，此项研究也为组织工程技术和 泌尿外科相结合寻找一个切入点。 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范 围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术 实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将 被视为涵盖于该权利要求范围之中。
权利要求
一种用于修复尿道的复合物，其特征在于，它含有脱细胞的膀胱黏膜下胶原筋膜(bladder acellular matrix graft，BAMG)和表皮细胞。
2. 如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述的膀胱黏膜下胶原筋膜和表皮细胞 来自于同种同体或同种异体。
3. 如权利要求1所述的复合物，其特征在于，以复合物的总体积计，其中含有的表皮细 胞的密度为l-3Xl()6个/ml。
4. 如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述的表皮细胞是皮肤表皮细胞。
5. —种如权利要求1一4任一所述的复合物的制备方法，其特征在于，所述的方法包括 步骤 (1) 将表皮细胞接种于脱细胞的膀胱黏膜下胶原筋膜；(2) 在适合表皮细胞生长的条件下培养10-30天，得到如权利要求1-4任一所述的复合物。
6. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的膀胱黏膜下胶原筋膜和表皮细 胞来自于同种同体或同种异体。
7. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，表皮细胞的接种量为l-3X106个/ml。
8. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)的培养是在完全浸没或气液交 界的情况下，于37±0. 5°C，5% C02和饱和湿度下进行。
9. 一种如权利要求l-4任一所述的复合物的用途，其特征在于，用作或用于体外构建 尿道移植物。
全文摘要
本发明公开了一种用于修复尿道的复合物及其制备方法和用途。所述用于修复尿道的复合物含有脱细胞的BAMG和表皮细胞。本发明还提供了该复合物的制备方法和用途。
文档编号A61L27/38GK101700413SQ20091019895
公开日2010年5月5日 申请日期2009年11月18日 优先权日2009年11月18日
发明者傅强, 宋小飞, 廖国龙, 徐月敏, 邓辰亮 申请人:上海市第六人民医院