专利名称：克林霉素磷酸酯异构体,其分析制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分析化学领域，尤其涉及药物分析化学领域，特别涉及一种克林霉素 磷酸酯异构体，及其分析和制备方法.
背景技术：
克林霉素磷酸酯在体外无抗菌活性，进入体内后在磷酸酯酶的作用下迅速水解为 克林霉素，在体内转化成具有强抗菌活性的N-去甲基克林霉素，主要作用于细菌核糖体的 50S亚基，从而阻止肽链的延长而干扰细菌DNA和细菌蛋白的合成，尚可清除细菌表面的A 蛋白和绒毛状外衣，使细菌容易被吞噬和杀灭。克林霉素磷酸酯主要对革兰氏阳性球菌及 厌氧菌有很强的抗菌活性，其作用及用途与克林霉素盐酸盐相似，但吸收迅速，作用持久， 血药浓度较盐酸盐高两倍，是一个兼有抗厌氧菌与需氧菌作用的广谱抗生素。目前市场上 已有水针剂、输液剂、注射剂、无菌分装粉针剂、冻干粉针剂等，临床应用以注射剂为主。任何影响药物纯度的物质均称为杂质，一般而言，杂质是指在生产和储存过程中 引进或产生的药物以外的其他化学物质。药品质量标准中的杂质是指在按照经国家有关药 品监督管理部门依法审查批准的规定工艺和规定原辅料生产的药品中，由其生产工艺和原 辅料带入的杂质，或经稳定性实验确证的在存储过程中产生的降解产物。药品质量标准中 的杂质不包括变更生产工艺或变更原辅料而产生的新的杂质，也不包括渗入或污染的外来 物质。药品生产企业变更生产工艺或原辅料，并由此带进新的杂质对原质量标准的修订，均 应依法向有关药品监督管理部门申报批准。药物的杂质一般与特定的药物有关，源于以下几个方面1.源自于药品生产过程中普遍使用的溶酶、催化剂等；2.反应不完全而存在的反应原料，反应初始复合物、合成中间产品、副产品等与合 成过程相关的物质；3.贮存过程中的氧化、分解、水解产物；4.手性化合物中的光学异构体；5.药物的多种晶型；6.动植物药物提取物中除有效成分生物碱挥发油、有机酸等小分子外，还存在分 子量较大的蛋白质、蹂质、淀粉、树脂等杂质； 7.放射药品中的衰减物质；8.生物工程制品中异常表达的蛋白质；9.重金属及无机盐。药物杂质按化学类别和特性可分为有机杂质、无机杂质、有机挥发性杂质。按来 源可分为有关物质(包括化学反应的前体、中间体、副产物和降解产物等)、其他杂质和外 来杂质等。按结构关系，杂质又可分为其他留体、其他生物碱、几何异构体、光学异构体和 聚合物等。按毒性，又可分为毒性杂质和普通杂质等。普通杂质即为在存在量下无显著不 良生物作用的杂质，而毒性杂质为具有强烈不良生物作用的杂质。
杂质检测是药品质量控制的一个重要环节，药品质量当中的含量测定是指原料药 和制剂中主要成分的含量，有关物质是指原料药和制剂当中的有机杂质。通过有关物质检 查，弄清有关物质的来源、性质、检测方法及其限量，可以优化合成路线、实验条件等因素， 进而避免其产生有关物质或其降到最低限度，从多方面保证和提高药品质量，减少药物的 不良反应。药物杂质检查分析方法应灵敏、专属。随着科学技术的进步，分离、分析手段的不 断提高，药物杂质的检测方法得到了不断的改进。检测药物杂质的方法很多，能较好的进 行分离，鉴定药物的杂质，如高效液相色谱、气相色谱、紫外、红外光谱、薄层色谱分析、毛细 管区带电泳、薄层毛细管电泳等，这些分析方法广泛应用于药品含量测定和杂质检测。近年 来，质谱技术在药物杂质分析方面应用日益广泛，气相色谱联用技术、液相色谱联用技术已 经成为药物杂质分析的重要手段。开发新原料药和新制剂过程中的杂质研究，应严格按照国家有关新药申报的要求 进行研究，也可以参照ICH的文本Q3A(新原料药中的杂质)和Q3B(新制剂中的杂质)进 行研究，并对杂质的安全性和降解产物进行安全性评价。其具体要求有如下几点1.对合成、纯化和储存中实际存在的杂质和潜在的杂质，应采用有效的分离分析 方法进行检测；2.对于表观含量在0. 及其以上的杂质以及表观含量在在0. 以下的具有强 烈生物作用的杂质或毒性杂质予以定性或确证其结构；3.对在稳定性试验中出现的降解产物，也应按上述要求进行研究；4.新药质量标准中的杂质检查项目应包括经研究和稳定性考察检出的，并在批量 生产中出现的杂质和降解产物，并包括相应的限度；5.除降解产物和毒性杂质外，在原料药中已经控制的杂质，在制剂中一般不再控 制；6.原料药和制剂中的无机杂质，应根据其生产工艺、起始原料情况确定检查项目， 但对于毒性无机杂质，应在质量标准中规定其检查项。在仿制药的研制和生产中，如发现杂质的种类与原始开发药品不同或与已有法定 杂质不同，必须增加新的杂质项检查项目，应该严格按照上述方法进行研究，申报新的药品 质量标准或对原质量标准进行修订，并报有关药品监督管理部门审批。共存的异构体和抗生素多组分一般不作为杂质检查项目，作为共存物质，必要时 在质量标准中规定其比例，以保证生产用的原料药与申报注册时的一致性。但当共存时的 物质为毒性杂质时，该物质就不再认为是共存物质。单一对映体药物，其可能共存的其他对 映体应作为杂质检查。消旋药物，当已有其单一对映体药物的法定质量标准时，应在该消旋 体的质量标准中设旋光度检查项目。有机挥发性杂质，应根据生产工艺中所用有机溶剂及其残留情况，确定检查项目。 可参考中国药典关于有机挥发性杂质的要求，或参考ICH文本Q3C(残留溶剂指导原则)。 对残留的毒性溶剂，应规定其检查项目。为了保证用药安全，原料药/制剂中的每一个杂质都必须进行安全性评估也就是 说必须建立保证安全性的杂质限度，ICH准则要求药物中杂质的限度为0. 1% (对毒性药 物限度更低)，高于此水平的所有未知杂质应鉴别出来，而更重要的是，所有高于0. 的杂质应研究其毒性。ICH在2007年2月7日修订的“新原料药中的杂质”指导原则，根据 原料药的每日最大剂量将原料药分为两类，并分别制定了杂质的报告阈值、鉴定阈值与合 理限度。其中的报告阈值是指所有高于此阈值的杂质及含量均应记入每批产品的检验报告 中，并反应在申报资料中。而鉴定阈值是指所有高于此阈值的杂质均应对其结构进行确证。 合理限度是指只要质量标准中制定的杂质限度不高于此限度，就不需要提供该限度的制定 依据，均认为该限度是合理的。对于新制剂，ICH在2003年2月5日修订的“新制剂中的杂质”指导原则中也做了 明确规定，该指导原则同样根据不同的用药剂量制订了杂质的报告阈值、鉴定阈值和合理 限度。欧盟药品主管部门要求生产企业(1)应在稳定性研究中设立未知杂质(0. ) 的限度；(2)应对限度大于或等于0. 的未知杂质进行结构确定和安全性验证。对于某些 抗生素类药物要求更高，例如发酵产品红霉素，该品种已经EP收载，并规定杂质的可忽略 限度为0.06%，且任何杂质不得超过3.0%。欧盟药品主管部门要求，任何大于可忽略限度 0. 06%的未知峰给予结构确定并提出适当的杂质限度建议，当杂质达到该限度即对其进行 安全性评价。FDA也尤其关注药物生产中药物的纯度和剂量的安全性，要求药品生产者对杂 质进行全面的分析，并尽可能的提供较多的结构信息。通常，超过0. 的杂质需鉴定出来 并且用选择性好的方法进行定量分析，而且对0.01% 0. 的杂质也表示浓厚的兴趣。尽管杂质限度的确定对于药品研发非常重要，但国内药品研发的现实情况并不令 人乐观。从近几年的新药申报情况分析，在杂质的研究和限度确定方面存在着较多的问题， 主要表现为部分药品研究单位对杂质研究的重要性了解不深；标准中对杂质的控制不够 全面和准确；制订杂质限度时考虑问题不够全面，很少考虑杂质对药品安全性的不良影响； 即使在杂质的含量明显超出正常工艺所允许的范围时，也不注意对现在的处方和工艺进行 必要的优化，以降低杂质的限度。《中国药典》、《美国药典》、《欧洲药典》和《英国药典》均有克林霉素磷酸酯相关物 质项的收载，而《英国药典》和《欧洲药典》的收载更为全面，《英国药典》和《欧洲药典》根 据生产工艺和克林霉素磷酸酯的降解途径在“可能的杂质”项收载了林可霉素、克林霉素 B2-磷酸酯、克林霉素3-磷酸酯、克林霉素4-磷酸酯和克林霉素五个杂质。《中国药典》中对克林霉素磷酸酯仅仅对杂质的总量进行了限定，对单一杂质研究 不具体，而欧盟药品主管部门和FDA均要求对克林霉素磷酸酯原料药中表观含量0. 1 %及 其以上的杂质，进行结构鉴定和安全性验证。
发明内容
本发明目的在于对克林霉素磷酸酯原料药的杂质进行研究，主要在于分离制备杂 质的标准品并且鉴定原料药中的杂质结构。根据本发明的方法对原料药中的杂质进行分 析、制备和结构鉴定，可以为杂质的毒理学研究和阐明不良反应发生机制提供基础，同时也 可以为工艺合成实验条件的选择提供参考，有利于生产过程中药品质量的控制。根据本发明的第一个方面，其提供了一种结构式如下式I所示的克林霉素磷酸酯 异构体
权利要求
1.克林霉素磷酸酯异构体，其结构式如下式I所示
2.如权利要求1所述克林霉素磷酸酯异构体的分析制备方法，其特征在于对克林霉素 磷酸酯原料进行分析，并从中分离制备所述克林霉素磷酸酯异构体，包括下列步骤a)用LC-MS法测定所述克林霉素磷酸酯原料，根据被分析成分的相对保留时间和/或 分子量确定所述原料中的克林霉素磷酸酯异构体；b)根据步骤a)中所述克林霉素磷酸酯异构体的相对保留时间和/或分子量确定柱层 析法的条件，使用正相硅胶柱层析富集该保留时间和/或分子量对应的被分析成分；c)根据步骤a)中所述克林霉素磷酸酯异构体的相对保留时间所显示的色谱保留行为 确定制备色谱法的条件，用制备色谱法收集所述相对保留时间对应的被分析成分。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤a)中，所述的LC-MS法测定所采用的 流动相PH值为4. 00 5. 00。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤a)中，所述的LC-MS法测定所采用的 柱温为20°C 40°C。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤a)中，所述的LC-MS法测定所采用的 流动相包含15% 25%乙腈。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤a)中，所述的LC-MS法测定所采用的 流动相包含0. 0. 3%氨水。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤a)中，所述的LC-MS法测定所采用 HPLC条件为流动相20%乙腈，0. 氨水;PH甲酸调pH至4. 90 ；柱温25°C ；流速 1. Oml/min ；检测波长2IOnm ；色谱柱 Diamonsil ODS C18，5 μ m，250 X 4. 6mm 柱。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤b)中，所述的正相硅胶柱层析法富集 采用的固定相为100 200目硅胶，流动相为乙酸乙酯和水饱和正丁醇1 1混合溶剂。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤b)包括bl将样品溶解于去离子水后，湿法上柱；Μ使用乙酸乙酯水饱和正丁醇比例1 1混合溶剂洗脱，每30ml洗脱液接收一批；在第114批时换乙酸乙酯水饱和正丁醇=1 1.5混合溶剂为淋洗剂，第177批时更换 淋洗剂为乙酸乙酯水饱和正丁醇=1 2，洗至全部组分淋洗出； b3合并收集140-162批的洗脱液备用。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤c)中，所述的制备色谱法所采用条 件包括流动相15% 30%有机相，0. 1 0.3%氨水；其中有机相为乙腈和甲醇4 1的混合 溶液；pH甲酸调pH至4. 00 7. 00 ； 柱温20°C 40°C ；色谱柱Waters μ Bondapak ODS C18，5 μ m，7. 8mmX 300mm柱，或者Agela Venusil ODS XBP C18，5 μ m，IOmmX 250mm 柱。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤c)中，所述的制备色谱法所采用条 件为流动相25. 5%有机相，0.1%氨水，其中有机相为乙腈和甲醇4 1的混合溶液； pH甲酸调pH至6. 64 ； 流速 1. Oml/min ； 检测波长2IOnm色谱柱 Agela Venusil ODS XBP C18，5 μ m，IOmmX 250mm 柱。 柱温25 °C 进样量120μ 1 ；收集保留时间为28. 467分钟处的峰相对应的被分析物。
12.如权利要求1所述的克林霉素磷酸酯异构体用于制备抗革兰氏阳性菌药物的用途。
13.如权利要求12所述用途，其中所述革兰氏阳性菌包括抗枯草杆菌和金黄色葡萄球菌。
14.根据权利要求2 11中任一项所述方法制备的杂质标准品，其特征在于，所述杂质 具有如下结构式I
15.如权利要求14所述的杂质标准品用于分析克林霉素磷酸酯原料的用途。
全文摘要
本发明提供克林霉素磷酸酯异构体，其分析制备方法和用途，用于对克林霉素磷酸酯原料进行分析，并从中分离制备所述克林霉素磷酸酯异构体，包括下列步骤用LC-MS法测定所述克林霉素磷酸酯原料，根据被分析成分的相对保留时间和/或分子量确定所述原料中的克林霉素磷酸酯异构体；根据步骤所述克林霉素磷酸酯异构体的相对保留时间和/或分子量确定柱层析法的条件，使用正相硅胶柱层析富集该保留时间和/或分子量对应的被分析成分；根据步骤所述克林霉素磷酸酯异构体的相对保留时间所显示的色谱保留行为确定制备色谱法的条件，用制备色谱法收集所述相对保留时间对应的被分析成分。
文档编号A61K31/7056GK102060883SQ20091019898
公开日2011年5月18日 申请日期2009年11月18日 优先权日2009年11月18日
发明者吴彤, 孙秋实, 李志敏, 李悦, 王慧敏, 陈述增 申请人:上海医药工业研究院