专利名称：一种乳腺癌相关基因c10rf64及其应用的制作方法
一种乳腺癌相关基因C10RF64及其应用技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种新型的乳腺癌相关基 因功能的发现、mRNA水平检测、siRNA干扰靶点的发现、以及针对该靶点进行干扰对细胞生 长抑制和体内抗肿瘤作用的检测等。背景技术：
:近年来，乳腺癌的发病率呈明显上升趋势。天津市肿瘤医院流行病研 究室对近15年女性乳腺癌的发病情况进行了研究分析，结果表明，发病率从18. 2/10万上 升为25. 48/10万，高居女性恶性肿瘤发病的第二位。此外，乳腺癌的发病年龄比以往提前 了 10岁。在该医院每年3000余例接受乳腺疾病手术的患者中，20岁至40岁的白领女性占 八成以上。天津市乳腺癌发生率每年以3.97%的速度急剧上升，且呈明显低龄化趋势。乳 腺癌发病年龄提前了 10岁，20岁至40岁的白领女性成为重点人群。因此，针对乳腺癌进 行基因诊断和基因治疗方面的研究具有一定的现实意义，而乳腺癌是受多个基因调控的疾 病，其具体调控基因与调控机理尚不十分清楚。 目前，已有大量报道指出，应用RNAi技术特异性地向哺乳动物和人类的细胞中倒 入siRNA来降低靶基因mRNA的表达，进而引起靶蛋白的表达下降，达到高效的、特异的肿瘤 治疗作用。C10RF64，又叫MGC24047，是美国NIH通过哺乳动物基因采集计划(Mammalian GeneCollection)在2002年发现的一个新基因，该基因位于人类染色体lp36，mRNA总长为 948bp，编码169个氨基酸。目前该基因的研究还处于空白阶段，功能尚未被报道。
发明内容本发明目的是针对乳腺癌调控基因进行研究，提供一种乳腺癌相关 基因C10RF64及其应用。 本发明首次提出基因C10RF64与乳腺癌的发生有显著的关系，应用real-time PCR技术检测乳腺组织中的C10RF64 mRNA的表达；同时，本文通过筛查siRNA，应用 Invitrogen公司的Stealth siRNA，筛选到两个特异的针对C10RF64的耙点，针对该耙点应 用siRNA可以有效地抑制乳腺癌细胞系的细胞生长，从而为更有效地治疗有些类型的乳腺 癌提供初步的理论依据。 本发明以基因突变检测和表达检测为基础，从GenBank中获得基因C10RF64的基 因组序列和cDNA序列，根据该序列查找并设计针对该基因的引物序列，进行基因组水平和 mRNA水平的检测；然后，选择表达量较高的细胞系，应用Invitrogen公司的StealthsiRNA 进行筛选沉默效果较好的siRNA靶点。本发明中所采用的siRNA为Invitrogen公司的专利 产品Stealth siRNA，应用SRB方法检测siRNA对肿瘤细胞增殖的影响，然后将siRNA干扰 过后的肿瘤细胞植入免疫缺陷型裸鼠体内，进一步验证siRNA对肿瘤细胞增殖的影响。实 验结果表明，C10RF64虽然在基因组水平上不存在突变、缺失等变化，但是在mRNA水平有较 大的变化。 本发明所述基因C10RF64及基因C10RF64上的两个耙点可用于制备治疗乳腺癌的 药物。 本发明的优点和积极效果 本发明首次涉及一个新的乳腺癌相关基因C10RF64的功能及其应用，采用分子生物学和肿瘤遗传学手段，本发明首次确证基因C10RF64与乳腺癌的发生有显著的相关性， 同时设计了一对用于PCR的引物，筛选了两条siRNA靶点，为进一步的研究打下了坚实的基
础，为开发检测和治疗用的药物提供了理论依据。
图1是基因C10RF64在乳腺癌细胞系与乳腺癌组织及癌旁正常组织中的表达情 况， A :基因C10RF64在乳腺癌细胞系和乳腺正常永生化细胞系中mRNA表达； B :基因C10RF64在一些乳腺癌组织及对应癌旁正常组织中mRNA表达； C :基因C10RF64在B组织中real-time PCR检测结果。 图2是C10RF64表达降低能够抑制乳腺癌细胞系在体外的细胞增殖， A :两条不同靶点的siRNA在两种细胞系T-47D和MDA-MB-361中的干扰效果； B :在乳腺癌细胞系T-47D中，Clorf64的降低能够明显抑制T-47D细胞增殖； C :在乳腺癌细胞系MDA-MB-361中，Clorf64的降低能够明显抑制MDA-MB-361的
细胞增殖； 图3是降低C10RF64的表达能够降低T_47D细胞系在裸鼠体内成瘤能力， A :针对C10RF64的siRNA在T-47D细胞系中的干扰效果； B :细胞系T-47D在裸鼠体内成瘤大小； C :解剖后肿瘤实物； D :肿瘤质量统计表。 图4是降低C10RF64的表达能够降低MDA_MB_361细胞系在裸鼠体内成瘤能力， A :针对C10RF64的siRNA在MDA-MB-361细胞系中的干扰效果； B :细胞系MDA-MB-361在裸鼠体内成瘤大小； C :解剖后肿瘤实物； D :肿瘤质量统计表。
具体实施方式
实施例1 : 本发明采用real-time PCR技术检测mRNA水平的变化，引物序列如序列表序列3
和序列4，扩增片段大小为124bp，上下游引物分别在基因组上不同的外显子。 PCR反应体系(25 ii 1): H20 9. 5 ii 1 2XSYBR 12.5iil R-Primer 0. 5 u 1 R-Primer 0. 5 u 1 cDNA 2. 0 ii 1 PCR程序 95 °C 2min
95 .C10 s ，
。 卜30eydes
60 C30 s 」
结果显示，在乳腺癌细胞系和乳腺癌组织样本中基因C10RF64的表达有着明显的 规律，ER+乳腺癌细胞系和组织样本中C10RF64表达量高，ER-乳腺癌细胞系和组织样本中 C10RF64表达量低，见图1。
实施例2 : 本实施例同时采用RNAi技术，应用针对C10RF64特异耙点的siRNA进行基因沉 默，通过体外SRB检测细胞增殖进一步说明了在高表达C10RF64的细胞系中进行基因沉默， 能够有效地减缓细胞增殖的速度。 应用上述两条针对C10RF64编码区的siRNA，终浓度50nM，对乳腺癌细胞系T-47D 和MDA-MB-361进行细胞增殖实验。 1)铺24孔板，每孔5X 104个细胞/600 ii 1 RPMI1640培养基; 2) 16h后，转染细胞，siRNA浓度为50nM，同时收集细胞，用10% TCA4°C固定lh，水
洗风干后，4t:保存； 3)每天如步骤二中所述收集一个24孔板； 4)收集完所有板后，用SRB染色10min，进行1 %乙酸漂洗，风干，最终用10mMTris 缓冲液溶解，490nm测定OD值，来表示细胞多少。 结果显示，干扰掉C10RF64基因后，能够有效地抑制两种ER+细胞系的细胞增殖， 见图2。 实施例3 : 经过体外实验的验证，本发明应用裸鼠体内荷瘤实验进一步证实实验结果。两个 细胞系均用siRNA 50nM干扰48h后，植入裸鼠皮下，对照组和实验组裸鼠各8只，皮下植入 细胞量为5X106个/只(细胞植入前三天裸鼠皮下植入缓释雌激素一片)。每周用游标卡 尺测量裸鼠成瘤的大小，用公式Ji/6X长X宽2来计量肿瘤大小，五周后处死裸鼠进行解 剖，取出肿块，称重。结果显示，干扰掉C10RF64同样能够在体内降低两种乳腺癌细胞系的 成瘤能力，达到抑制肿瘤生长的目的，见图3和图4。序列表〈no〉南开大学〈120〉 一种乳腺癌相关基因C10RF64及其应用〈160>5〈170>PatentIn Version 2. 1〈210>1〈211>948〈212>DNA〈213>人(Homo sapiens)〈400>1acatcctgga agagtggcct aggacagctcctctcctgccagagcteggcaggcgccg皿60gtegccgcat ggccccgtca gaagatcccagggactggagagccaacctc皿3ggC3CC3120tccgtgagac aggcctggag accagctccggtggg皿gctggctggccatC3g皿g3CCg180tccccacggc tcacctgact tttgttettgactgcacccacgggaagcag ctctccctgg240cagcaaccgc atcaccaccc caagcccccagtcccaatcgagggcttgtc3CCCC3CC皿300
5
tg朋gacttecatcgtgttc tgtggggaaa actggcccca tctgactcgg gtgaccccca360tgggtgggggatgccttgcc caggccaggg ccaccctgcc gctctgcaga gggtctgtgg420cctcagcttccttcccagtc agcccgctct gcccccagga ggttcccgag gcteagggga■朋cccgtg朋ggctgcgcct gtgaggtctt caacttgggg aacagtcaag gactcactga540aagccctctcctcttgtgtc tgtgggcagg ccgattegct ggaagggccg ggctctgatg600cccagaggctgcaattccca gggcctggcc ctgcttcccc agcteagcag gagtcttttg660tgcttgagcc朋gg朋3cat cattegatcc gcteaggggc atctg朋3C3 tccgtcgagt720ggC卿ggC3ggateagtca cctgcacatg朋g3gactc3 ttcattcate cagc朋3tet780tectggtecatcttccacat gccaggccct gcaaagtgct ggggagatec catggttttc840ctggagctggtetttttggg gtggaggg朋cccaccctg3 ate朋te朋g teaccc朋te■atgatttcga948〈210>2〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2ggctgcgcctgtgaggtctt caact25〈210>3〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3gggaacagtc33gg3CtC3C tg朋325〈210>4〈211>17〈212>DNA〈213〉人工序列上游引物〈400>4gagccaacctC333ggC17〈210>5〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列下游引物〈400>5ccgtgggtgc18
权利要求
一种乳腺癌相关基因C1ORF64，其核苷酸序列如序列表序列1所示。
2. 如权利要求1所述的乳腺癌相关基因C10RF64，其特征在于所述的基因C10RF64上的与乳腺癌相关的两个靶点，其核苷酸序列如序列表序列2和序列3所示。
3. 如权利要求1所述的乳腺癌相关基因C10RF64，其主要检测手段是real-time PCR，引物序列如序列表序列4和序列5所示。
4. 一种权利要求1所述基因C10RF64的应用，用于制备治疗乳腺癌的药物。
5. —种权利要求2所述基因C10RF64上的靶点的应用，用于制备治疗乳腺癌的药物。
6. —种权力要求3所述基因C10RF64的引物的应用，用于检测乳腺癌的药物。
全文摘要
本发明涉及一种乳腺癌相关基因C1ORF64(又叫MGC24047)新功能的发现，mRNA表达水平、mRNA沉默、细胞增殖实验以及裸鼠荷瘤实验均显示该基因与乳腺癌有显著的相关性。针对C1ORF64mRNA序列设计real-time PCR引物，通过real-time PCR检测C1ORF64 mRNA在肿瘤与癌旁正常组织中的表达差异，结合临床病理资料，来更早的诊断乳腺癌的发生；同时，本发明采用Invitrogen公司的Stealth siRNA针对C1ORF64进行干扰，可以抑制高表达C1ORF64的乳腺癌细胞系如T-47D、MDA-MB-361的细胞生长，同时能够抑制这些细胞系在裸鼠体内形成肿瘤。因此，C1ORF64有望成为一个新型的乳腺癌相关基因。
文档编号A61P15/14GK101701220SQ20091022853
公开日2010年5月5日 申请日期2009年11月13日 优先权日2009年11月13日
发明者付丽娅, 吴晓, 朱正茂, 苏丹, 董金堂 申请人:南开大学