专利名称：一种新型的免疫佐剂及含有该免疫佐剂的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型的免疫佐剂以及含有该免疫佐剂的疫苗。
背景技术：
免疫佐剂简称佐剂，是指先于抗原或与抗原同时应用，能非特异性地增强或改变 机体针对抗原的特异性免疫应答能力，增强相应抗原的免疫原性的物质。佐剂的研究距今已有较长的历史。目前可供应用的佐剂已有100余种，传统的佐 剂一般可分为四类①无机佐剂，如氢氧化铝，明矾等。②有机佐剂，微生物及其产物如分枝 杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、内毒素、细菌提取物(胞壁酰二肽)等； ③合成佐剂，如人工合成的双链多聚核苷酸(双链多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、异丙肌 苷等；④油剂，如弗氏佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油等。弗氏佐剂目前在实验动物 中最常用，但不适宜于人类使用，而且动物多次注射后也常会发生佐剂病。近20年来，由于免疫学的进展，新型疫苗的开发，促进了新型佐剂的研究。与传 统的灭活或活体疫苗相比，由基因工程重组抗原或化学合成多肽组成的现代疫苗往往存在 免疫原性弱等问题，需要新型的免疫佐剂来增强其作用。尽管传统的铝盐佐剂是目前唯一 全球公认的人用佐剂，但其与许多重组或合成的多肽疫苗抗原共同免疫时未能激发有效的 免疫应答，使之很难满足新型疫苗发展的需要，因此，需要研发更为安全有效的人用新型佐 剂，尤其是安全无毒、能够刺激较强细胞免疫应答的佐剂，以及适合粘膜疫苗、DNA疫苗和癌 症疫苗的免疫佐剂。新型免疫佐剂种类繁多，近期研究较多的包括以下几种(1)细胞因子佐剂。如白介素1、白介素2、干扰素和白介素12等，具有明显的免疫 佐剂效应，可增强病毒、细菌和寄生虫疫苗的保护效应，激发对肿瘤抗原的免疫反应；(2)核酸佐剂。如CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)，在抗过敏性疾病、肿瘤和传染病 等方面有重要的应用；(3)免疫刺激复合物佐剂。免疫刺激复合物是由抗原物与皂树皮中提取的一种糖 苷与胆固醇按1 1 1混合后自发形成的一种具有较高免疫活性的脂质小泡，应用于多 种细菌、病毒和寄生虫病的疫苗，具有产生“全面”免疫应答的效力，可长期增强特异性抗体 应答。并能有效地通过黏膜给药，用于抗呼吸道感染；(4)脂质体佐剂。脂质体是人工合成的具有单层或多层单位膜样结构的脂质小囊， 由一个或多个类似细胞单位膜的类脂双分子包裹水相介质所组成，具有佐剂兼载体效应。 脂质体的结构有利于将抗原递呈给抗原处理细胞或其他免疫活性细胞。吞噬细胞吞噬脂质 体并破坏其膜结构，释放抗原并形成免疫复合物，有利于维持长时间的高效价抗体及产生 免疫记忆。脂质体在宿主体内可以生物降解，本身无毒性，并且能降低抗原的毒性，无局部 注射反应。脂质体可与弗氏佐剂或氢氧化铝胶混合使用，效果更佳；(5)热休克蛋白佐剂。热休克蛋白是一类广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质， 是生物细胞应激反应的诱导产物。研究发现，HSP可以成为一种新型的佐剂，是现在免疫佐剂研究，尤其是肿瘤免疫治疗研究的热点。现有佐剂多数是外源性物质，除了所需要的免疫刺激作用外，佐剂还能引起不良 反应。其中局部的不良反应有炎症、结节、脓肿等，全身的不良反应有过敏、发热、免疫抑制， 甚至有致畸、致癌、致突变等危险。这些不良反应可能由佐剂和抗原本身的相互作用引起， 也可能是佐剂引起的对特定抗原的应答，或疫苗佐剂引起的细胞因子所致。为了解决这些 问题，理想的佐剂应该有以下特征能促进体液和细胞介导的免疫应答，能作用于弱免疫性 抗原，而且不引起有害的副作用；能以不同途径免疫，能用于不同抗原；能在免疫抑制个体 中发挥作用；应用于食用动物不应留有毒素残留；能有效影响免疫反应质量(型的控制、局 部免疫以及细胞类型的控制)；稳定；便宜而且容易产生免疫应答。
发明内容
本发明的目的在于，克服上述现有技术的缺陷而提供一种新型的免疫佐剂及含有 该免疫佐剂的疫苗。本发明的一种新型的免疫佐剂，其主要成分为重组人钙调磷酸酶B亚基。更具体的，所述佐剂包括含有重组人钙调磷酸酶B亚基的制剂。优选地，所述制剂 包括生理上可接受的液体制剂、乳液制剂或冻干制剂。本发明的另一目的在于重组人钙调磷酸酶B亚基在制备免疫佐剂中的应用。本发明的又一目的为上述免疫佐剂在免疫治疗药物以及免疫疫苗中的应用。本发明还提供一种免疫疫苗，其中的佐剂至少包括上述的免疫佐剂。本发明的发明人通过基因重组的方法构建了表达CNB的基因工程大肠杆菌，通过 发酵工艺，纯化工艺等方面的研究，获得了高表达、高纯度并符合基因工程药物产品质量标 准的的CNB蛋白样品，为CNB的产业化奠定了基础。发明人用PCR的方法构建了 CNB的N端(1_84)和C端(85-169)结构域的表达体 系，并对两个功能结构域的结构和性质进行了研究，鉴于CNB的药理作用研究成果，以及小 分子肽作为佐剂的良好前景，发明人利用基因工程方法表达纯化了 CNB结构域片断-CNB的 C端结构域(DC)和N端结构域(DN)蛋白，进一步对其功能进行研究。首先，进行本发明的佐剂质粒的构建和表达。本发明佐剂的cDNA来自大鼠脑cDNA 文库(Perrino B et al，J. Biol. Chem. .，1996，270 :340)。
通过 5，引物5，-CCGCCATATGGGAAATGAGGCGAGTT-3，和 3，弓丨物5，-CGCGGGATCCTC 八〇八041~07\0^0^-3，经？0 扩增，在琼脂糖凝胶电泳上分离？0 产物，于而61和BamHI酶切 后，经T4DNA连接酶装入pET-21a表达载体，转化到感受态大肠杆菌E. coli菌株BL21 (DE3) PlysS中，保存于含氨苄青霉素50ug/ml的LB琼脂培养板，挑取单菌落预培养，将预培养 液加入含50ug/ml含氨苄青霉素的TM培养基中，37°C摇床以250rpm保温培养5_6小时， 4500rpm, 20分钟离心，弃上清，收获菌体。其次，进行本发明佐剂的制备1、超声破碎菌体按1升菌体培养液的1/10-1/20体积加入缓冲液QOmmol/L Tris, pH7. 4, lmmol/L EDTA，0. 2mmol/L PMSF，lmmol/L β -巯基乙醇)，然后以输出功率 40%破碎细胞，时间为2-3分钟。2、分离纯化破碎后菌体经70-100°C沸水浴30-60分钟，12000rpm离心20分钟后取上清，此为粗提液。按体积加3mmol/L CaCl2, lmmol/L β -巯基乙醇和0. 5mol/LNaCl 后 上预先经缓冲液(20mmol/LTris, ρΗ7·4，0· 5mmol/LCaCl2，lmmol/L β -巯基乙醇)平衡的 phenyl-Sepharose CL-4B层析柱，再用同样的缓冲液洗尽杂蛋白，最后用缓冲液20mmol/ LTris, pH7. 4，lmmol/L EGTA,0. 5mmol/L DTT洗脱，所得产物经冷冻干燥后进行凝胶过滤层 析，将冻干粉用缓冲液溶解后，上预先经缓冲液(PBS，20mmol/L Na2HP04-NaH2P04, pH6. 5) 平衡的kphadex G-25层析柱，将缓冲体系更换为适用于生理实验的PBS体系。随后将所得 产物上预先经缓冲液(20mmol/LNa2HP04-NaH2P04，pH6. 5)平衡的 DEAE Sepharose FF 层析 柱，经同样缓冲液进一步洗去杂蛋白，最后用缓冲液20mmOl/LNa2HP04-NaH2P04+0. 15mol/L NaCl洗脱目的蛋白，所得产物用缓冲液QOmmol/L Na2HP04-NaH2P04, pH7. 4)调节至pH7. 4 后，调节浓度为lmg/ml，0. 22um无菌过滤器过滤除菌后，分装密封，经冷冻干燥后于_20度 保存。然后，本发明佐剂的质量控制及使用方法为1.纯度分析=SDS-PAGE鉴定，纯度为98%以上.2.物理化学性质鉴定等电点4. 8，光吸收值ε 277nml%= 3. 13.浓度测定用紫外分光光度法.4.鉴别实验本佐剂抗体免疫印迹阳性，紫外吸收光谱.5.生物活性激活钙调蛋白磷酸酶A亚基，激活巨噬细胞增殖.6.内毒素测定参照2005年版药典，鲎试剂法.7.性状及使用方法为水溶性，水中溶解度大，水溶液无色，澄清。可在生理盐水 或中性PH的缓冲液中冷冻干燥保存2年以上，临用前用少量生理盐水或缓冲液溶解即可。 免疫动物时，可与缓释剂(如弗氏不完全佐剂等)共同使用。本发明的优点是由于本发明的免疫佐剂是一种生物体内广泛存在的内源性蛋白 质，在进化上高度保守，因此毒副作用很低。相比于原理相似的现有蛋白类佐剂如热休克蛋 白，本佐剂有其显著的优越性，主要有以下几方面(1)纯化制备方法简便易行，产量大，成本低。这是比需要加标签纯化的热休克蛋 白在制备方面的优势；(2)稳定性强，耐热度高，保存期长。(3)可与抗原简单混合后直接有效作用于动物和人。而热休克蛋白只能与抗原融 合表达后，方才有作用，单独的热休克蛋白与抗原混合后没有促进抗原反应的作用。本佐剂 在使用方式上也具有灵活多样的优点。(4)本佐剂在人和动物(如大鼠、小鼠等)中的基因序列基本一致，同源性高。动 物实验的结论和人体实验的连贯性较强。而热休克蛋白在动物体和人体中的基因同源性较 低，动物实验的数据和人体数据可比性差，对于最终用于人体治疗有一定的风险。这是本佐 剂在安全性上的优点。经过多年对于钙调磷酸酶B亚基(CNB)作用机理的研究，我们验证了，CNB可刺激 巨噬细胞和脾细胞等的增殖，并初步鉴定出，CNB可与参与先天免疫调节的单核细胞的表面 受体Tol 1-样受体4相互结合，激活胞浆内的核转录因子NF κ B转位入核，激活NF κ B通路， 引起许多相关细胞因子、趋化因子等的基因及蛋白表达水平升高，分泌量增加，从而激活先 天免疫系统的应答。先天免疫系统是机体防御病原物入侵的第一道防线，也是后天免疫系统应答激活的基础和调控者。我们已有的实验数据证实CNB可以激活先天免疫系统，这是 CNB成为一种新型免疫佐剂的理论基础。
具体实施例方式实施例1 本佐剂对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响1.百白破疫苗免疫小鼠的脾细胞增殖实验按人、小鼠体表面积与用药剂量折算表，确定小鼠疫苗注射量，一免后两周加强 免疫一次，二免后两周杀死小鼠无菌取脾制备单个脾细胞悬液，台盼蓝检测细胞存活率在 95 %以上，调整细胞浓度到1 X 106/ml，每孔加入100 μ 1细胞悬液到96孔细胞培养板上。将 6. 5 μ 1疫苗用RPMI 1640稀释1000倍后，每孔加100 μ 1为实验组；每孔加入100 μ 1 RPMI 1640为空白组。实验组和空白组各设5个重复孔，37°C，5% C02培养48 72h，每孔加入 20 μ 1 5 μ g/ml MTT，继续培养4h。3000rpm,离心IOmin,弃上清，每孔加入150 μ 1 DMSO震 荡15min使沉淀完全溶解，细胞板在酶标仪上读取吸光度(A)值，检测波长570nm，参考波长 630nm。刺激指数SI =加药组OD值/对照组OD值。百白破疫苗免疫的小鼠的脾细胞再次 经抗原刺激后被活化增殖，我们检测了各组小鼠的脾淋巴细胞的体外增殖能力。结果显示， adjuvant组(佐剂组)小鼠的脾细胞增殖能力高于对照组，且有显著性差异。结果如下表 所示。百白破疫苗免疫小鼠的脾细胞增殖佐剂组 生理盐水组
权利要求
1.一种新型的免疫佐剂，其主要成分为重组人钙调磷酸酶B亚基。
2.根据权利要求1所述的免疫佐剂，其特征在于所述佐剂包括含有重组人钙调磷酸 酶B亚基的制剂。
3.根据权利要求2所述的免疫佐剂，其特征在于所述制剂包括生理上可接受的液体 制剂、乳液制剂或冻干制剂。
4.重组人钙调磷酸酶B亚基在制备免疫佐剂中的应用。
5.根据权利要求1所述的免疫佐剂在免疫治疗药物以及免疫疫苗中的应用。
6.一种免疫疫苗，其中的佐剂至少包括权利要求1所述的免疫佐剂。
全文摘要
本发明涉及一种新型的免疫佐剂及含有该免疫佐剂的疫苗。其中，所述的免疫佐剂，其主要成分为重组人钙调磷酸酶B亚基。所述的免疫疫苗至少含有上述的免疫佐剂。本发明的免疫佐剂纯化制备方法简便易行，产量大，成本低。而且，稳定性强，耐热度高，保存期长；可与抗原简单混合后直接有效作用于动物和人。此外，本发明的佐剂在人和动物(如大鼠、小鼠等)中的基因序列基本一致，同源性高。动物实验的结论和人体实验的连贯性较强。
文档编号A61K39/00GK102038950SQ20091023642
公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月21日 优先权日2009年10月21日
发明者吴武, 李景, 王艳丽, 陈勍, 魏群 申请人:北京师范大学