制备银杏提取物的新方法

专利名称：制备银杏提取物的新方法
制备银杏提取物的新方法本发明涉及制备基本不含持久性有机污染物的银杏提取物的方法。本发明还涉及 基本不含有机污染物的银杏提取物，其可以使用本申请的方法获得，以及还涉及其特别在 治疗领域中的用途。由于已证明银杏提取物具有血管扩张、抗氧化和神经保护的活性，因此近年来已 用于治疗目的、特别是用于治疗周围或脑的循环障碍、痴呆或痴呆综合征。在某些提取方法过程中，某些不需要的组分例如银杏酸的存在大幅减少。但是， 因为目前的环境污染，不管银杏叶的来源如何，不能排除持久性有机污染物(POP)-尽管较 少-的存在。POP是抗天然生物降解的有机化合物(在环境中持久存在)，所以它们也存在 对人健康和环境产生有害影响的风险和在活有机体的组织中蓄积(在食物链中生物蓄积) 的能力。由于POP具有持久性和生物蓄积的性质，因此它们通过海流或气流运送，可以在离 其排放处很远的地方被再次发现。因为POP的性质以及为了预防任何风险，所以需要尽可 能降低POP的浓度。根据本发明，所谓的持久性有机污染物(POP)是指多环芳烃(PAH)、多氯化联苯 (PCB)、多氯化二苯并二噁英(PCDD)和多氯化二苯并呋喃(PCDF)。在PAH中可以特别提及下 列芳香化合物苯并(a)蒽、|、苯并菲[a]、苯并(b)荧蒽、苯并(k/j)荧蒽、苯并(a)芘、茚 并(1,2,3-cd)芘、二苯(ah)蒽、苯并(ghi)茈、二苯并(al)芘、二苯并(ai)芘、二苯并(ah) 芘、二苯并(ae)芘、环戊二烯并(cd)芘和5-甲基;^。在PCDD/PCDF中可以特别提及下列化 合物=2,3,7,8-四 CDF ( “CDF” =氯二苯并呋喃)、1，2，3，7，8-五 CDF、2，3，4，7，8-五 CDF、 1，2，3，4，7，8-7^CDF、1，2，3，6，7，8-7^CDF、1，2，3，7，8，9-7^CDF、2，3，4，6，7，8-T^CDF、1， 2，3，4，6，7，8-tCDF、l，2，3，4，7，8，9-tCDF、ACDF、CDF* 2，3，7，8-四 CDD ( “CDD”=氯 二苯并二噁英)、1，2，3，7，8-五0)0、1，2，3，4，7，8-六0)0、1，2，3，6，7，8-六0)0、1，2，3，7， 8，9-六CDD、1，2，3，4，6，7，8-七CDD和八CDD。最终，在PCB中可以特别提及PCB 77、PCB 81、PCB105、PCB 114、PCB 118、PCB 123、PCB 126、PCB 156、PCB 157、PCB167、PCB 169 和 PCB 189。专利EP 431535描述了提取银杏的方法，该方法的主要目的是为了获得银杏酸浓 度降低的提取物(浓度低于lOppm、且优选低于Ippm)。专利申请WO 2006/117170提出改进专利EP 431535的制备方法，以使利用这种方 法所获得的最终提取物的多环芳烃(PAH)浓度进一步降低。该申请人已经发现，可以进一步改进专利EP 431535和专利申请W02006/117170 中所述的方法，以使利用这种方法所获得的最终提取物基本上不含如上所述的POP、包括 PAH。因此，本发明的主题是获得基本上不含持久性有机污染物的银杏叶提取物的方 法，所述方法包括下列阶段(a)在约40至100°C的温度，用含水丙酮、具有1至3个碳原子的含水醇或无水甲 醇萃取银杏叶(优选新鲜绿叶或干叶)；(b)用可在最后蒸馏阶段的过程中添加水的方法，从提取物中分离大多数有机溶
7剂至最高含量10%重量；(C)用水稀释残余的浓缩水溶液至固体物质含量为5至25%重量，在搅拌下放置 冷却至低于25°C的温度，静置直至沉淀形成，将所得沉淀分离，其由不易溶于水的亲脂性组 分组成；(d)将硫酸铵加至残余的水溶液，用甲基乙基酮或甲基乙基酮与丙酮的混合物萃 取已形成的溶液；(e)将所得的提取物浓缩至固体物质含量为50至70%，用水和乙醇稀释所得浓缩 物，以便获得含有50%重量水和50%重量乙醇、固体物质含量为10%重量的溶液；(f)将铅盐的水溶液加至用这种方法获得的溶液中，直至颜色从褐色变成琥珀色， 将已形成的沉淀分离，或者使用聚酰胺代替铅盐；(g)用沸点为60至100°C的脂肪族或环脂肪族溶剂萃取残余的含水醇溶液，以便 进一步分离烷基酚化合物；(h)将残余的含水醇溶液在减压下浓缩至最高乙醇含量约5%，添加硫酸铵直至 含量为20%重量；(i)用比率为8/2至5/5、优选为6/4的甲基乙基酮和乙醇的混合物萃取所得溶 液；(j)将所得有机相浓缩至固体物质含量为50至70%重量；(k)将乙醇加至用这种方法获得的浓缩物，直至获得至少80%的乙醇含量，然后 将混合物冷却至12°C的最高温度达至少两小时，最后过滤除去不溶物质，回收滤液；(1)于60至80°C的温度、在减压下浓缩并干燥滤液，直至获得水含量低于5%的干 燥提取物， 其特征在于，所述方法包括额外的阶段，所述额外的阶段是使在阶段d、i或k中的 一个阶段所获得的一种有机相流经吸附剂，所述吸附剂由比表面积大于或等于1000m2/g的 活性炭组成。根据本发明，使用本申请所定义的吸附剂可以除去不需要的化合物例如POP，同时 保持活性组分例如黄酮类和萜烯三内酯(银杏内酯和白果内酯)的浓度。POP毒性的变化取决于它们是否为PAH或PCDD/PCDF和PCB。对PCDD/PCDF和 PCB型化合物而言，这就是如何建立“毒性当量(TEQ) ”系统。该加权因子表示相对于2， 3，7，8-TCDD(2，3，7，8-四氯二苯并-ρ-二噁英)的毒性程度(Van den Berg 等人(1998)， Environmental Health Perspectivesl06(12),775)。所谓措辞“基本上不含持久性有机污染物的银杏提取物”是指含有大幅下降的持 久性有机污染物浓度、优选具有如下浓度的任何银杏提取物-每种PAH的浓度低于5μ g/kg，优选1 μ g/kg，优选0. 5 μ g/kg，非常优选低于定 量限(LOQ)，和/或-TEQ (PCDD/PCDF-PCB)低于 10pg/g，优选 1. 5pg/g，非常优选 1. Opg/g。优选，上述方法的特征在于在阶段(b)中将有机溶剂分离至5%重量的最高含量，在阶段(c)中将水溶液用水稀释至15至20%重量的固体物质含量，冷却至约10 至12°C的温度，
在阶段(d)中将硫酸铵加至溶液中以便产生30%重量的含量，用比率为9/1至 4/6、优选为6/4的溶剂萃取已形成的溶液，且在阶段(f)中使用醋酸铅、碱式醋酸铅或硝酸铅或氢氧化铅水溶液。还优选，上述方法的特征在于，在阶段(a)中，在约50至65°C的温度、用丙酮/水 重量比率50/50至65/35和固体/溶剂比率1/6至1/20的含水丙酮或用含水乙醇作为萃 取溶剂萃取银杏叶(优选干叶)，且优选，所用的萃取溶剂是丙酮/水重量比率为约60/40的含水丙酮。还优选，上述方法的特征在于，在阶段(b)中，通过在减压下蒸发除去该提取物的 有机溶剂，直至获得低于5%的最高残余溶剂浓度和约15至30%的固体含量。还优选，上述方法的特征在于，在阶段(C)中，用水稀释残余的浓缩水溶液直至获 得约10至20%重量的固体含量和低于5%的最高残余溶剂浓度，然后在搅拌下使其冷却至 约4-12°C的温度达至少一小时。还优选，上述方法的特征在于，在阶段(d)中，在相对于水溶液体积的30至40%、 优选35%重量硫酸铵的存在下，用重量比率为约6/4的甲基乙基酮/丙酮混合物萃取残余 的水溶液，然后在相分离后回收所述有机相。还优选，上述方法的特征在于，在阶段(f)中，将浓度为约15至20%的碱式醋酸铅 (CH3CO2)2Pb. 2Pb (0H)2[CAS#1335-32-6]水溶液加至在先前阶段(e)中用这种方法获得的溶 液，其中(Pb的量/固体含量)比率为0. 15至0.30、非常优选为0. 18至0.25。还优选，上述方法的特征在于，在阶段(g)中用庚烷萃取所述残余的含水醇溶液。还优选，上述方法的特征在于其包括额外的阶段，所述额外的阶段是使在阶段d 中获得的有机相流经吸附剂。还优选，上述方法的特征在于其包括额外的阶段，所述额外的阶段是使在阶段i 中获得的有机相流经吸附剂。还优选，上述方法的特征在于其包括额外的阶段，所述额外的阶段是使在阶段k 中获得的有机相流经吸附剂。本发明的另一个主题是获得基本上不含持久性有机污染物的银杏叶提取物的方 法，所述方法包括下列阶段(aa)在约40至100°C的温度，用选自含水丙酮或具有少于3个碳原子的低级醇的 萃取溶剂萃取干银杏叶；(ba)从提取物中除去有机溶剂至低于10%的最高残余溶剂浓度；(ca)用水稀释残余的浓缩水溶液直至获得约5至25%重量的固体含量和低于5% 的最高残余溶剂浓度，然后在搅拌下使其冷却至低于25°C的温度达至少一小时，除去用这 种方法形成的沉淀，所得沉淀由亲脂性化合物组成；(da)在硫酸铵的存在下用甲基乙基酮/丙酮混合物萃取残余水溶液，然后在相分 离后，浓缩有机相直至40至60%重量的固体含量；(ea)用含水乙醇和水萃取所得的浓缩物，以使终溶液含有约50%重量水和50% 重量乙醇以及约10-12%的固体含量；(fa)将铅盐的水溶液加至在阶段(e)中用这种方法获得的溶液，其中(Pb的量/ 固体含量)比率为0. 15至0. 3，除去用这种方法获得的铅沉淀；
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(ga)用庚烷萃取残余的含水乙醇溶液，以便除去烷基酚型化合物，将残余的含水 醇溶液在减压下浓缩至低于5%重量的乙醇含量；(ha)在硫酸铵的存在下，用甲基乙基酮和乙醇混合物萃取所得溶液；(ia)在搅拌下将硫酸铵加至在先前阶段获得的有机相，然后在倾析后回收有机 相，然后将其浓缩直至约50-70%重量的固体含量；(ja)将乙醇和水加至用这种方法获得的浓缩物，直至获得10至12%的固体含量 和约75至90%的乙醇含量，残余物为水，然后将混合物冷却至约8-12°C达至少一小时，最 后过滤除去不溶物质，回收滤液；(ka)在减压下浓缩用这种方法获得的滤液，直至获得50至70%重量的固体含量， 在不超过60°C的温度和真空下在烘箱中干燥；和额外的阶段，该额外的阶段是使在先前阶段da、ia或ja中的一个阶段所获得一 种有机相流经吸附剂，所述吸附剂由比表面积大于或等于1000m2/g的活性炭组成。优选，上述方法的特征在于，在阶段(aa)中，在约50至65°C的温度、用丙酮/水重 量比率为50/50至65/35和(干叶/溶剂)比率1/6至1/20的含水丙酮或用含水乙醇作 为萃取溶剂进行干银杏叶的萃取，且更优选，所用的萃取溶剂是丙酮/水重量比率为约60/40的含水丙酮。还优选，上述方法的特征在于，在阶段(ba)中，通过在减压下蒸发除去提取物的 有机溶剂，直至获得低于5%的最大残余溶剂浓度和约15至30%的固体含量。还优选，上述方法的特征在于，在阶段(ca)中，用水稀释残余的浓缩水溶液直至 获得约10至20%重量的固体含量，然后在搅拌下使其冷却至约4-12°C的温度。还优选，上述方法的特征在于，在阶段(da)中，在相对于水溶液体积为30至40%、 优选35%重量的浓度的硫酸铵存在下，用重量比率为5/5至7/3、优选约6/4的甲基乙基酮 /丙酮混合物萃取残余的水溶液。还优选，上述方法的特征在于，在阶段(fa)中，所述铅盐选自醋酸铅、氢氧化铅和 碱式醋酸铅。还优选，上述方法的特征在于，在阶段(fa)中，所述(Pb/固体含量)比率为0. 18 至 0. 25。还优选，上述方法的特征在于，在阶段(fa)中，将浓度为约15至20%的碱式醋酸 铅(CH3CO2)2Pb. 2Pb (0H)2[CAS#1335-32-6]水溶液加至在阶段(ea)中获得的溶液，其中(Pb 的量/固体含量)比率为0. 18至0. 25。还优选，上述方法的特征在于，在阶段(ha)中，在相对于水溶液体积为30至40%、 优选35%重量的％ (重量)硫酸铵存在下，用比率为约6/4重量的甲基乙基酮和乙醇混合 物萃取所得水溶液。还优选，上述方法的特征在于，在阶段(ja)中，添加乙醇和水直至获得约78至 90%、优选78至80%的乙醇含量。还优选，上述方法的特征在于其包括额外的阶段，所述额外的阶段是使在阶段da 中获得的有机相流经吸附剂。还优选，上述方法的特征在于其包括额外的阶段，所述额外的阶段是使在阶段ia 中获得的有机相流经吸附剂。
还优选，上述方法的特征在于其包括额外的阶段，所述额外的阶段是使在阶段ja 中获得的有机相流经吸附剂。优选，上述方法的特征在于，所述吸附剂包括至少一种下列特征-其不包含官能团；-其呈球形(或珠粒形状)；-其比表面积大于或等于1100m2/g。非常优选，上述方法的特征在于，所述吸附剂包括下列特征中的至少两种-其不包含官能团；-其呈球形(或珠粒形状)；-其比表面积大于或等于1100m2/g。而且非常优选，上述方法的特征在于，所述吸附剂为活性炭，其不含官能团，为球 形(或珠粒形状)，最小比表面积大于或等于1100m2/g。而且非常优选，上述方法的特征在于，所述吸附剂的粒径为0. 2至1mm，优选为0. 3 至 0. 9mmο而且非常优选，上述方法的特征在于，所述吸附剂为活性炭，其不含官能团，为直 径0. 4至0. 8mm的球形(或珠粒形状)，最小比表面积大于或等于1200m2/g，其中孔直径为 约8nm且孔体积为约0. 15cm7g。根据本发明，所述吸附剂可以为球形(或珠粒形状)；因此，其具有规则形状。对 本领域技术人员来说，该球形(或“珠形”)不同于具有不规则表面和/或形状的颗粒型吸 附剂，或呈由挤压所得的圆柱形(“丸形”或“棒形”)的吸附剂。根据本发明的吸附剂为活性炭。所述活性炭为天然或合成的，取决于用于制备它 的起始产品的性质。天然来源的活性炭可以由任何富含碳的天然有机物质例如木材、树皮、 椰子壳、橄榄石(olive stone)或油渣制得。合成来源的活性炭可以由任何富含碳的合成 有机物质例如苯乙烯制得，在可控条件下、优选在惰性气氛如氮气和高温下对其进行热解。球形的活性炭可由预制的起始产品珠粒制备。因此，球形的合成活性炭可由预制 的起始产品珠粒制备。优选，根据本发明使用的活性炭为合成活性炭。本发明的另一个主题是基本上不含持久性有机污染物且可根据一种如上所述的 方法而获得的银杏提取物。优选，如上所定义的基本上不含持久性有机污染物的提取物包括-20至30%重量的黄酮糖苷、-2. 5至4. 5%总重的银杏内酯A、B、C和J(总计)、-2.0至4.0%重量的白果内酯、-低于IOppm的烷基酚和低于10%重量的花色素(anthoeyanin)前体；而且非常 优选，-22至26%重量的黄酮糖苷、-2. 5至4. 5%总重的银杏内酯A、B、C和J、-2.0至4.0%重量的白果内酯、-低于Ippm的烷基酚和低于10%重量的花色素前体；
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还优选，如上所定义的基本上不含持久性有机污染物的提取物包括-20至30%重量的黄酮糖苷、-2. 5至4. 5%总重的银杏内酯A、B禾口 C、-2.0至4.0%重量的白果内酯、-低于Ippm的烷基酚和低于10%重量的花色素前体；非常优选，如上所定义的提取物包括以下浓度的持久性有机污染物-每种PAH的浓度低于5μ g/kg，优选1 μ g/kg，非常优选0. 5 μ g/kg，和/或-TEQ(PCDD/PCDF/PCB)低于 10pg/g，优选 1. 5pg/g，而且非常优选，-每种PAH的浓度低于定量限(LOQ)，和/或-TEQ (PCDD/PCDF/PCB)低于 1. Opg/g ；根据本发明的银杏提取物可用作治疗组合物的活性成分或食品添加剂。基于此类 提取物的组合物可以是粉末剂、颗粒剂、片剂或明胶胶囊剂的形式。本发明的另一个主题是如上所定义的提取物在制备用于治疗周围循环障碍或脑 循环障碍、痴呆或痴呆综合征的药物中的用途。本发明的另一个主题是治疗组合物，其含有作为活性成分的如上所定义的提取物 和可药用的赋形剂。除非另有说明，本申请所提及的比率和百分比为重量/重量比率和百分比重量。 当然，本方法的不同阶段的工作温度低于所用有机溶剂的沸点温度，优选比沸点温度低至 少 5°C。实验部分实施例1 银杏提取物的制备在约60°C的温度、将2kg干银杏叶用丙酮/水(60/40重量)萃取两次，每次使用 多达10倍量的溶剂(重量/重量)。通过蒸发除去有机溶剂直至获得固体物质含量为约35%。用水将残余的浓缩水溶液稀释一半直至获得约17%重量的固体含量，然后在搅拌 下使其冷却至约10_12°C的温度达至少一小时，将用这种方法形成的沉淀除去。在35% (重量)硫酸铵的存在下用甲基乙基酮/丙酮混合物(6/4重量)萃取残 余的水溶液，然后，相分离后，再用甲基乙基酮/丙酮混合物(6/4重量)萃取，接着浓缩至 50至60%重量的固体物质含量。用水和乙醇将所得浓缩物稀释至(固体/乙醇/水含量)重量比率为(10/45/45)。 然后将16%的碱式醋酸铅(CH3CO2)2Pb. 2Pb (0H)2[CAS#1335-32-6]水溶液_铅溶液/乙醇溶 液的体积比为16/100-加至用这种方法获得的溶液；通过离心将由此形成的铅沉淀除去。用庚烷将回收的含水乙醇上清液萃取三次，每次用1/3的总体积，以便除去烷基 酚型化合物，然后在减压下将残余的含水醇溶液浓缩至乙醇含量低于5%重量。在35% (重量)硫酸铵的存在下用甲基乙基酮/乙醇混合物(6/4重量)萃取残 余的水溶液，然后，分离各相后，再用甲基乙基酮/丙酮混合物(6/4重量)萃取；合并有机 相，使其流经Lewatit AF5活性炭柱(IOg)。在搅拌下再将20% (重量)硫酸铵加入在先前阶段中获得的有机相，然后，倾析后，回收有机相，然后浓缩至固体物质含量为约50-70%重量。然后将高于90%的乙醇和水以12/78/10的(固体物质含量/乙醇/水)重量比 率加至用这种方法获得的浓缩物，接着历经至少三小时冷却至约8-12°C。然后滤出不溶物 质，在减压下浓缩滤液，然后在真空下于烘箱中干燥，获得高于98%重量的固体物质含量。实施例2 通过流经吸附剂来降低POP浓度制备故意被POP污染的银杏提取物的不同有机溶液，然后使其流经吸附剂。i)银杏提取物溶液的制备用三种不同的溶剂制备标准化银杏提取物(EGb761 )溶液，然后故意被POP污
^fe O1号溶液120g干提取物在1440ml甲基乙基酮/乙醇混合物(6/4重量)中，且含 有22%重量的水；将用这种方法获得的溶液分成2个相等体积。2号溶液60g干提取物在720ml甲基乙基酮/丙酮混合物(6/4重量)中，且含有 20%重量的水；3号溶液60g干提取物在720ml含水乙醇(88%重量)中。不管哪种溶液，所需的污染浓度和定量限如下
加入的污染物所需的污染浓度定量限Pathol.20 μ g/kg< 0.5 μ g/kgPCDD/PCDF200ng/kg< 0. 1 至 0. 4ng/kgPCB200ng/kg< 0. 5 至 30ng/kg*供应商 Supelco 和 Well-Labs对于PAH，所用的污染物如下苯并(a)蒽、窟、苯并菲[a]、苯并(b)荧蒽、苯并(k/ j)荧蒽、苯并(a)芘、茚并(1,2,3-cd)芘、二苯(ah)蒽、苯并(ghi)茈、二苯并(al)芘、二 苯并(ai)芘、二苯并(ah)芘、二苯并(ae)芘、环戊二烯并(cd)芘和5_甲基笼。这些结果 在下表1中示出。对于PCDD/F，所用的污染物如下=2,3,7,8-四 CDF、1，2，3，7，8_ 五 CDF、2，3，4，7， 8-五 CDF、1，2，3，4，7，8-六 CDF、1，2，3，6，7，8-六 CDF、1，2，3，7，8，9-六 CDF、2，3，4，6，7， 8-六 CDF、1，2，3，4，6，7，8-七 CDF、1，2，3，4，7，8，9-七 CDF、八 CDF、2，3，7，8-四 CDD、1，2，3， 7，8-SCDD、1，2，3，4，7，8-7^CDD、1，2，3，6，7，8-7^CDD、1，2，3，7，8，9-T^CDD、1，2，3，4，6，
7，8-七⑶D和八⑶D。这些结果在下表2中示出。对于PCB，所用的污染物如下PCB 77、PCB 81、PCB 105、PCB 114、PCB 118、PCB 123、PCB 126、PCB 156、PCB 157、PCB 167、PCB 169 和 PCB 189。这些结果在下表 3 中示
出οii)使被污染的溶液流经吸附剂使被污染的溶液流经吸附剂Lewatit AF5 (合成活性炭，其不含官能团，为球 形，最小比表面积为1200m2/g，且其至少90 %的颗粒具有0. 4至0. 8mm的粒径，下文称为“AF5”)使溶液流经含有IOg AF5的柱(内径1cm，床高20cm)三次。干提取物与所用吸附剂的重量比率为约6 1。iii)结果所得结果示于下表1、2和3 (数值四舍五入到最多3个小数位)。所用的图标符号如下< 0. 5 表示指示定量限(LOQ)为0. 5且所测浓度低于此限度。ND 表示由于没有一个相应的同源物低于L0Q，所以未测得。TEQ excl.L0Q[a]=计算的TEQ值，只包括定量同源物。TEQ incl.L0Q[b]=计算的TEQ值，包括采用其LOQ值的定量同源物。结果显示，流经吸附剂可降低POP浓度，使其浓度低于定量限。实施例3 参比实施例下面实施例3a和3b例证了不同于上述实施例所用那些的吸附剂和/或溶剂的使 用。干提取物与所用吸附剂的重量比率为约6 1。实施例3a 合成树脂的使用用如上文实施例2中所定义的2号溶液使用合成树脂。该树脂的特性如下;Lewatit vp oc 1163树脂，其不含官能团，基于交联的聚 苯乙烯，为球形，比表面积大于1300m2/g，其中粒径为0. 45至0. 55mm。实验方案(污染，使溶液流经吸附剂)与实施例2所述的方案相同。所得结果示于下表4 (数值四舍五入到最多3个小数位)。这些结果显示，在流经树脂后，约25至70%所加入的PAH残留在提取物中，而流经 吸附剂Lewatit AF5 (参见实施例1)使POP浓度降至低于该定量限的浓度。实施例3b:所用的活性炭与实施例2的活性炭(Lewatit AF5 )相同，使用4号溶液。4号溶液120g干提取物在1440ml正丁醇中，且含有20%重量的水；过滤用这种 方法获得的溶液，将POP加至滤液中，将总体积分成2个相等体积，其中一个体积用作对照， 另一个流经吸附剂Lewatit AF5 。实验方案(污染，使溶液流经吸附剂)与实施例2所述的方案相同。所得结果示于下表5 (数值四舍五入到最多3个小数位)。使用这样吸附剂，结果显示，在流经吸附剂后，约3至9 %所加入的PAH、1至 12 %所加入的P⑶D/P⑶F和27至46 %所加入的PCB残留在提取物中，而流经吸附剂 Lewatit AF5 (参见实施例2)使POP浓度降至低于该定量限的浓度。由此所得的结果显示，流经该活性炭但用正丁醇作为溶剂后，约10至30%所加入 的P⑶D/P⑶F和20至30%所加入的PCB残留在提取物中，而流经该相同吸附剂(参见实施 例2)但用如实施例2中所用的溶剂，使POP浓度降至低于该定量限的浓度。实施例2所用的溶剂，即甲基乙基酮、乙醇、丙酮、水或后者的混合物，具有5 6 的极性指数(PI)(参见Roger Ε. Schimer,Modem Methods ofPharmaceutical Analysis，卷 II，第305页，水极性指数的参考值为9)。正丁醇极性较低，其极性指数为4. 8，即在5 6 的范围之外。在Schimer的研究中，他指出，尽管对于溶剂混合物，溶剂极性与组成不是线性相关，但是线性近似法足以精确用于评估混合物的极性指数。因此，可将混合物的极性指数计 算成组成该混合物的每种溶剂的体积分数与其极性指数的乘积之和。对于溶剂A和B的混合物，其相对于混合物的体积分数为\和纯溶剂A和B的 极性指数分别为Ia和IB，因此该混合物的极性指数为VaIa+VbIb。表1 :PAH的测量
权利要求
获得基本上不含持久性有机污染物的银杏叶提取物的方法，所述方法包括下列阶段(a)在约40至100℃的温度，用含水丙酮、具有1至3个碳原子的含水醇或无水甲醇萃取所述银杏叶；(b)用可在最后蒸馏阶段的过程中添加水的方法，从所述提取物中分离大多数有机溶剂至10％重量的最高含量；(c)用水稀释残余的浓缩水溶液至固体物质含量为5至25％重量，在搅拌下放置冷却至低于25℃的温度，静置直至沉淀形成，将所得沉淀分离，其由不易溶于水的亲脂性组分组成；(d)将硫酸铵加至残余的水溶液，用甲基乙基酮或甲基乙基酮与丙酮的混合物萃取已形成的溶液；(e)将所得的提取物浓缩至固体物质含量为50至70％，用水和乙醇稀释所得浓缩物，以便获得含有50％重量水和50％重量乙醇的溶液，其中固体物质含量为10％重量；(f)将铅盐的水溶液加至用这种方法获得的溶液中，直至颜色从褐色变成琥珀色，将已形成的沉淀分离，或者使用聚酰胺代替铅盐；(g)用沸点为60至100℃的脂肪族或环脂肪族溶剂萃取残余的含水醇溶液，以便进一步分离烷基酚化合物；(h)将残余的含水醇溶液在减压下浓缩至最高乙醇含量为约5％，添加硫酸铵直至含量为20％重量；(i)用比率为8/2至5/5、优选为6/4的甲基乙基酮和乙醇的混合物萃取所得溶液；(j)将所得有机相浓缩至固体物质含量为50至70％重量；(k)将乙醇加至用这种方法获得的浓缩物，直至获得至少80％的乙醇含量，然后将混合物冷却至12℃的最高温度达至少两小时，最后过滤除去不溶物质，回收滤液；(l)于60至80℃的温度、在减压下浓缩并干燥滤液，直至获得水含量低于5％的干燥提取物，其特征在于，所述方法包括组成如下的额外阶段使在阶段d、i或k中的一个阶段所获得的一种有机相流经吸附剂，所述吸附剂由具有大于或等于1000m2/g的比表面积的活性炭组成。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，在阶段(b)中将所述有机溶剂分离至5%重量的最高含量，在阶段(c)中将所述水溶液用水稀释至固体物质含量为15至20%重量，冷却至约10 至12°C的温度，在阶段(d)中将硫酸铵加至溶液中以便产生30%重量的含量，用比率为9/1至4/6、优 选为6/4的溶剂萃取已形成的溶液，且在阶段(f)中使用醋酸铅、碱式醋酸铅或硝酸铅或氢氧化铅水溶液。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，在阶段(a)中，在约50至65°C的温度、用丙酮 /水重量比率为50/50至65/35和固体/溶剂比率为1/6至1/20的含水丙酮或用含水乙醇 作为萃取溶剂萃取所述银杏叶。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于，在阶段(a)中，所用的萃取溶剂是丙酮/水重 量比率为约60/40的含水丙酮。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于，在阶段(b)中，通过在减压下蒸发除去所述提 取物的有机溶剂，直至获得低于5%的最高残余溶剂浓度和约15至30%的固体含量。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于，在阶段(c)中，用水稀释残余的浓缩水溶液，直 至获得约10至20%重量的固体含量和低于5%的最高残余溶剂浓度，然后在搅拌下使其冷 却至约4-12°C的温度达至少一小时。
7.根据权利要求1的方法，其特征在于，在阶段(d)中，在相对于水溶液体积为30至 40%、优选35%重量硫酸铵的存在下，用重量比率为约6/4的甲基乙基酮/丙酮混合物萃取 所述残余的水溶液，然后在相分离后回收所述有机相。
8.根据权利要求1的方法，其特征在于，在阶段(f)中，将浓度为约15至20%的碱式 醋酸铅(CH3CO2)2Pb. 2Pb (OH)2的水溶液加至在先前阶段(e)中用这种方法获得的溶液，其中 (Pb量/固体含量)比率为0. 15至0. 30。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于，所述(Pb/固体含量)比率为0.18至0.25。
10.根据权利要求1的方法，其特征在于，在阶段(g)中，用庚烷萃取所述残余的含水醇 溶液。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述方法包括额外的阶段，所述 额外的阶段是使在阶段d中获得的有机相流经吸附剂。
12.根据权利要求1至10中任一项的方法，其特征在于，所述方法包括额外的阶段，所 述额外的阶段是使在阶段i中获得的有机相流经吸附剂。
13.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述方法包括额外的阶段，所述 额外的阶段是使在阶段k中获得的有机相流经吸附剂。
14.获得基本上不含持久性有机污染物的银杏叶提取物的方法，所述方法特征在于，其 包括下列阶段(aa)在约40至100°C的温度，用选自含水丙酮或具有少于3个碳原子的低级醇的萃取 溶剂萃取干银杏叶；(ba)从所述提取物中除去所述有机溶剂至最高残余溶剂浓度低于10% ； (ca)用水稀释残余的浓缩水溶液，直至获得约5至25%重量的固体物质含量和低于 5%的最高残余溶剂浓度，在搅拌下使其冷却至低于25°C的温度达至少一小时，除去用这种 方法形成的沉淀，所得沉淀由亲脂性化合物组成；(da)在硫酸铵的存在下用甲基乙基酮/丙酮混合物萃取残余水溶液，然后在相分离 后，浓缩有机相直至40至60%重量的固体含量；(ea)用含水乙醇和水萃取所得的浓缩物，以使终溶液含有约50%重量水和50%重量 乙醇以及约10-12%的固体含量；(fa)将铅盐的水溶液加至在阶段(e)中用这种方法获得的溶液，其中(Pb的量/固体 含量)比率为0. 15至0. 3，除去用这种方法获得的铅沉淀；(ga)用庚烷萃取残余的含水乙醇溶液以便除去烷基酚型化合物，将残余的含水醇溶液 在减压下浓缩至乙醇含量低于5%重量；(ha)在硫酸铵的存在下，用甲基乙基酮和乙醇混合物萃取所得溶液； (ia)在搅拌下将硫酸铵加至在先前阶段中获得的有机相，然后在倾析后回收有机相， 然后将其浓缩直至固体含量约50-70%重量；(ja)将乙醇和水加至用这种方法获得的浓缩物，直至获得固体含量为10至12%和乙 醇含量约75至90%，残余物为水，然后将混合物冷却至约8-12°C达至少一小时，最后过滤 除去不溶物质，回收滤液；(ka)在减压下浓缩用这种方法获得的滤液，直至获得50至70%重量的固体含量，在不 超过60°C的温度和真空下在烘箱中干燥；和额外的阶段，是使在先前阶段da、ia或ja中的 一个所获得一种有机相流经吸附剂，所述吸附剂由具有大于或等于1000m2/g的比表面积的 活性炭组成。
15.根据权利要求14的方法，其特征在于，在阶段(aa)中，在约50至65°C的温度、用 丙酮/水重量比率为50/50至65/35和(干叶/溶剂)比率1/6至1/20的含水丙酮或用 含水乙醇作为萃取溶剂进行干银杏叶的萃取。
16.根据权利要求15的方法，其特征在于，在阶段(aa)中，所用的萃取溶剂是丙酮/水 重量比率为约60/40的含水丙酮。
17.根据权利要求14的方法，其特征在于，在阶段(ba)中，通过在减压下蒸发，直至获 得最大残余溶剂浓度低于5%和固体含量约15至30%，进行提取物有机溶剂的除去。
18.根据权利要求14的方法，其特征在于，在阶段(ca)中，用水稀释残余的浓缩水溶 液，直至获得约10至20%重量的固体含量，然后在搅拌下使其冷却至约4-12°C的温度。
19.根据权利要求14的方法，其特征在于，在阶段(da)中，在以相对于水溶液体积为 30至40%、优选35%重量的浓度的硫酸铵存在下，用重量比率为5/5至7/3、优选约6/4的 甲基乙基酮/丙酮混合物萃取所述残余的水溶液。
20.根据权利要求14的方法，其特征在于，在阶段(fa)中，所述铅盐选自醋酸铅、氢氧 化铅和碱式醋酸铅。
21.根据权利要求14或20的方法，其特征在于，所述(Pb/固体含量)比率为0.18至 0. 25。
22.根据权利要求14或20的方法，其特征在于，在阶段(fa)中，将浓度为约15至20% 的碱式醋酸铅(CH3CO2)2Pb.2Pb (OH)2水溶液加至在阶段(ea)中获得的溶液，其中(Pb的量 /固体含量)比率为0. 18至0. 25。
23.根据权利要求14的方法，其特征在于，在阶段(ha)中，在相对于水溶液体积为30 至40%、优选35%重量的硫酸铵存在下，用比率为约6/4重量的甲基乙基酮和乙醇混合物 萃取所得水溶液。
24.根据权利要求14的方法，其特征在于，在阶段(ja)中，添加乙醇和水直至获得约 78至90%的乙醇含量。
25.根据权利要求14至24中任一项的方法，其特征在于，所述方法包括额外的阶段，所 述额外的阶段是使在阶段da中获得的有机相流经吸附剂。
26.根据权利要求14至24中任一项的方法，其特征在于，所述方法包括额外的阶段，所 述额外的阶段是使在阶段ia中获得的有机相流经吸附剂。
27.根据权利要求14至24中任一项的方法，其特征在于，所述方法包括额外的阶段，所 述额外的阶段是使在阶段ja中获得的有机相(滤液)流经吸附剂。
28.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述吸附剂具有至少一种下列特征-其不包含官能团； “其呈球形；-其比表面积大于或等于1100m2/g。
29.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述吸附剂具有下列特征中的至 少两种-其不包含官能团； -其呈球形；-其比表面积大于或等于1100m2/g。
30.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述吸附剂为活性炭，不含官能 团，为球形，最小比表面积大于或等于1100m2/g。
31.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述吸附剂具有0.2至Imm的粒径。
32.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述吸附剂具有0.3至0. 9mm的粒径。
33.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述吸附剂为活性炭，不含官能 团，为直径0. 4至0. 8mm的球形，最小比表面积大于或等于1200m2/g，其中孔直径约Snm且 孔体积约0. 15cm3/g。
34.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，所述吸附剂为合成活性炭。
35.基本上不含持久性有机污染物且根据前述权利要求中任一项所述的方法能够获得 的银杏提取物。
36.根据权利要求35的银杏提取物，基本上不含持久性有机污染物，其包含 -20至30%重量的黄酮糖苷，-2. 5至4. 5%总重的银杏内酯A、B、C和J(总计)、 -2.0至4.0%重量的白果内酯、 -低于IOppm的烷基酚和低于10%重量的花色素前体。
37.根据权利要求36的银杏提取物，基本上不含持久性有机污染物，其包含 -22至26%重量的黄酮糖苷、-2. 5至4. 5%总重的银杏内酯A、B、C和J、-2.0至4.0%重量的白果内酯、-低于Ippm的烷基酚和低于10%重量的花色素前体。
38.根据权利要求35的银杏提取物，基本上不含持久性有机污染物，其包含 -20至30%重量的黄酮糖苷、-2. 5至4. 5%总重的银杏内酯A、B和C、-2.0至4.0%重量的白果内酯、-低于Ippm的烷基酚和低于10%重量的花色素前体。
39.根据权利要求35至38中任一项的银杏提取物，其中每种PAH的浓度低于5μ g/kg， 且 TEQ(PCDD/PCDF-PCB)低于 10pg/g。
40.根据权利要求35至39中任一项的银杏提取物，其中每种PAH的浓度低于1μ g/kg, 且 TEQ(PCDD/PCDF-PCB)低于 1. 5pg/g。
41.根据权利要求35至40中任一项的银杏提取物，其中每种PAH的浓度低于0.5 μ g/ kg，且 TEQ(PCDD/PCDF-PCB)低于 1. 5pg/g。
42.根据权利要求35至41中任一项的银杏提取物，其中PAH的浓度低于定量限(LOQ)， 且 TEQ(PCDD/PCDF-PCB)低于 1. Opg/g。
43.如权利要求35至42中任一项所定义的提取物在制备用于治疗周围循环障碍或脑 循环障碍、痴呆或痴呆综合征的药物中的用途。
44.治疗组合物，其含有作为活性成分的如权利要求35至42中任一项所定义的提取物 和可药用的赋形剂。
全文摘要
本发明涉及制备基本不含持久性有机污染物的银杏提取物的方法。本发明还涉及基本不含有机污染物的银杏提取物，其可以使用本申请的方法获得，以及还涉及其特别在治疗领域中的用途。
文档编号A61K36/16GK101939016SQ200980104422
公开日2011年1月5日 申请日期2009年2月6日 优先权日2008年2月6日
发明者B-P·滕 申请人:益普生制药股份有限公司