重组鼻病毒载体的制作方法

专利名称：重组鼻病毒载体的制作方法
重组鼻病毒载体
背景技术：
当一种新型流感病毒亚型出现而全人类对其没有或几乎没有免疫力时，就会出现 流感大流行。20世纪期间，流感大流行造成全世界范围内上百万人死亡、社会混乱和严重 的经济损失。流感专家们认为可能会发生另一次大流行，但却不知道什么时候会发生。在 大流行爆发时全世界作好准备的水平将决定该疾病对公共卫生和经济的影响。至今，世界 卫生组织(WHO)估计，在很短的时间内全球将会有至少数亿次门诊、2500多万次住院和数 百万死亡。在2003年时突出了这些担忧，当时在很多亚洲国家，家禽中禽H5W病毒达到了 兽疫流行水平，然后传播到了欧洲和非洲。幸运的是，迄今其向人类的传播已受到限制，记 录有246次感染，其伴随着高死亡率，总计144人死亡，如(世界卫生组织(WHO)网站)2006 年9月14日报道。常规的流感疫苗设计为引起针对流感病毒血凝素蛋白(HA)的中和抗体应 答。由于HA蛋白中不断的抗原性漂移，所以必须每年改变疫苗组成以匹配预期的循环 (circulating)病毒株。这种疫苗方法对大流行而言是不可取的，因为大流行病毒株的分离 和鉴定以及合适疫苗的构建和生产需要很长时间。控制或预防流感大流行的一种更有效的 方法设想开发“通用”疫苗，其能够引起针对新近鉴定的高度保守性流感病毒免疫决定簇的 保护性免疫。这种疫苗应该提供跨各种A型流感病毒株的广泛保护。此外，这种疫苗可全 年生产，可储存，和/或全年都可给药。血凝素(HA)的蛋白水解切割位点附近的19-25个氨基酸序列是保守的A型流感 病毒表位(Bianchi 等，J. Virol. 79 :7380-7388, 2005 ；Mundy 等，Science 303 1870-1873， 2004)。成熟的流感病毒HA由两个亚基HA1和HA2组成，这两个亚基通过蛋白水解切割自前 体 HA。获得(Chen 等，Cell 95 :409-417,1998 ；Skehel 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 72 93-97,1975)。基于晶体学数据(Gamblin 等，Science303 1838-1842，2004 ;Stevens 等， Science 303 1866-1870，2004)，确定了切割位点形成突出的暴露于溶剂的环。切割时新形 成的HA2 N-末端主导融合肽，后者介导病毒与细胞膜融合。HAtl切割对病毒感染性(Klenk 等，Virology 68 :426-439,1975 ；Klenk 等，Virology 68 :426-439,1975)和致病性(Klenk 等，Trends Microbiol. 2 :39-43,1994 ；Steinhauer, Virology 258 :1-20,1999)是关键 的。因为功能约束，所以表位是极其高度保守的，因此可引起广泛的交叉保护应答(Bianchi 等，J. Virol. 79 :7380-7388, 2005)。与脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)的外膜蛋白复合体缀合的B 型流感病毒的HAtl肽在Balb/c小鼠中引起保护性免疫应答(Bianchi等，J. Virol. 79 7380-7388,2005)。人和禽类的A型流感和B型流感HAtl序列的比对如下所示。在对超过700 株的印度尼西亚和越南的A型人流感病毒株和A型禽流感病毒株研究中证实了该区的保守 性(Smith等，Virology 350 :258_268，2006)。观察到某些突变，但它们主要发生在切割位 点的上游(在以下比对中由箭头指出)(Smith等，Virology 350 :258_268，2006)。B型流感 HAcJ太的系统丙氨酸扫描诱变阐明了三个残基R6、F9和F15(比对中的方框)，其作为结合 三种保护性HAcT特异性单克隆抗体的最关键的残基(Bianchi等，J. Virol. 79 =7380-7388,2005)。在所有禽类和人的A型流感和B型流感株中这些残基都是保守的(见下面；SEQ ID NO 1-8)。
人 HlNx 人/禽H2Nx 人 H3Nx 人 H5N1 禽 H5N1 禽 H6Nx 禽/马/人H7Nx 禽/人/猪H9Nx 人B型
HA2
IGAIAq
F
IE66WTGMVD (SEQ ID NO: 1) ,…Q.…(SEQ ID NO: 2)
N. .Ε. . . . (SEQ ID NO: 3) ...Q. . . . (SEQ ID NO: 4) ...Q. . . . (SEQ ID NO: 4) (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:6) (SEQ ID NO:7) (SEQ ID NO:8)
.......I.
,N. .E.LI. ....S.L.A ....E..IA已证明流感病毒基质蛋白M2是疫苗开发的有效靶标(DeFilette等，Virology 337 :149-161,2005)。M2是A型流感病毒的一种97个氨基酸的跨膜蛋白(Lamb等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 78 :4170-4174,1981 ；Lamb 等，Cell 40 :627-633,1985)。成熟的蛋 白形成同源四聚体(Holsinger 等，Virology 183 :32-43,1991 ；Sugrue 等，Virologyl80 617-624，1991)，其具有可被pH诱导的离子通道活性(Pinto等，Cell 69 :517-528,1992 ； Sugrue等，Virology 180 =617-624,1991)。M2四聚体在受感染细胞的质膜中高密度表达， 并且也以低频率整合到成熟病毒颗粒膜中(Takeda等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 100 14610-14617，2003 ；Zebedee 等，J. Virol. 62 :2762-2772,1998)。在 A 型流感病毒中，M2 N 末端M个氨基酸的胞外域(M2e)高度保守(Fiers等，Virus Res. 103 173-176，2004)。 ICe与Ml (这种病毒中最保守的蛋白(Ito等，J.Virol· 65 :5491-5498,1991))的遗传关系 所致的约束以及天然感染期间M2e特异性抗体的缺少可以解释M2e的高度保守性(Black 等，J. Gen. Virol. 74 (Pt. 1) 143-146，1993)。如利用NCBI流感数据库的序列得到的以下比对所示，禽流感H5W病毒的Mk似 乎向着在典型的人HI、H2和H3病毒中发现的共有序列进化，表明利用“人”流感Mk表位 的广泛保护(包括针对新型禽病毒的保护)是一种可能(见下面，SEQ ID NO 9-12)。人HlNlMSLLTEVETPIRNEffGCRCNDSSD(SEQ ID NO 9)人H5N1 2001-2006 MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD(SEQ ID N0:10)人H5N1 1997-2000 MSLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID N0:11)禽H5N1 1983-1998 MSLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID N0:12)基于对分离自印尼和越南的人和鸟类的800株H5H1毒株序列的分析，最近报道了 H5N1 M2e 向着 Hmi I\Ce 序列进化的现象(Smith 等，Virology 350 :258_268，2006)。抗人 Mk单克隆抗体(Mab)有效地识别进化的禽^Ce肽EVETPTRN(SEQ ID N0:13)，但不识别其 “前驱物” EVETLTRN(SEQ ID NO 14) (Liu 等，Microbes Infect. 7 171-177，2005)。这是重 要的，因为之前已发现某些“禽流感样”变化会降低人M2e特异性单克隆抗体提供的保护的 有效性。有趣的是，Mk中某些“禽流感样”氨基酸变化降低了人Hmi病毒在小鼠中的致病 性(Zharikova 等，J. Virol. 79 :6644-6654,2005)。WHO已强调“在不同国家同时发生不同威胁水平的大流行潜在的事件，正如2004
5年加拿大的H7N3和亚洲的H5W禽流感爆发”的可能性。如以下比对中所示，M2e H7N7 与H5W的“人源化”变体仅相差一个氨基酸。已证明H7N7亚型可在物种间传播的能力 (Koopmans 等，Lancet 363 :587_593，2004)，并且对人类可为致死性的(Fouchier 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 101 1356-1361，2004)。还显示其它病毒株(H9N2)也能够感染家禽 并传播到人类中(Cameron 等，Virology278 :36-41,2000 ；Li 等，J. Virol. 77 :6988-6994, 2003 ；Wong 等，ChestU9 :156-168,2006)(见下面，SEQ ID NO :9 禾口 15-18)。人HlNlMSLLTEVETPIRNEffGCRCNDSSD(SEQ ID NO 9)禽/ 马 H7N7MSLLTEVETPTRNGWECRCSDSSD(SEQ ID NO 15)禽H9Nx 1966-1996 MSLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID NO :16)禽H9Nx 1997-2004 MSLLTEVETHTRNGWGCRCSDSSD(SEQ ID NO :17)人H9N2 1999-2003 MSLLTEVETLTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID NO :18)已显示基于M2e的重组蛋白疫苗可引起针对同源和异源A型流感病毒攻击的保 护性免疫应答(Fiers 等，Virus Res. 103 173-176，2004 ；Sl印ushkin 等，Vaccine 13 1399-1402,1995)。最近利用缀合于钥孔血蓝蛋白和脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白的Mk 肽的研究表明不仅在小鼠中而且在雪貂和恒河猴中都具有良好的免疫应答(Fan等， Vaccine22 =2993-3003,2004) 在小鼠中证明脂质体M2e疫苗抗H1、H5、H6和H9 A型流感 病毒的保护作用(Fan 等，Vaccine 22 :2993-3003,2004) 用于流感免疫原的有效递送系统对于开发针对流感病毒感染的疫苗例如大流行 疫苗为重要的。发明概述本发明提供包括流感病毒HAtl免疫原在内的鼻病毒载体(活的或灭活的)。这种 载体在人类中可以是非致病性的，例如人鼻病毒14(HRV14)。除了 HAtl序列外，所述鼻病毒 载体可任选包括一种或多种Mk肽。这些肽(HAtl和/或M2e)可插入到例如选自以下的中 和免疫原的位点中中和免疫原I (NimI)、中和免疫原II (NimII)(例如在第158位和160位 氨基酸之间)、中和免疫原III(NimIII)和中和免疫原IV(NimIV)，或这些位点的多于一种 中。另外，所述肽可任选在一端或两端上侧接接头序列。本发明还提供药物组合物或免疫原组合物，所述组合物包括本文所述的鼻病毒载 体和药学上可接受的载体或稀释剂。这种组合物任选可包括一种或多种佐剂和/或一种或 多种其它活性成分(例如，与HAtl和/或M2e序列融合的乙肝病毒核心蛋白，和/或包括HAtl 肽在内的鼻病毒载体和包括Mk肽在内的鼻病毒载体)。本发明还包括在受试者(例如人受试者)中诱导对流感病毒的免疫应答的方法， 其中给予所述受试者如本文所述的药物组合物。所述受试者可以未患有感染，但有发展流 感病毒感染的风险，或所述受试者可以被流感病毒感染。所述组合物可例如经鼻内途径给 予。本发明还包括本文所述载体和组合物在用于如本文所述诱导免疫应答的方法中的用 途，及所述载体和组合物在制备用于例如本文所述那些用途的药物中的用途。本发明还提供制备如本文所述的药物组合物的方法，所述方法包括将如本文所述 的鼻病毒载体和药学上可接受的载体或稀释剂(及任选如本文所述的其它组分)混合。另外，本发明提供核酸分子，该核酸分子编码或对应于本文所述的鼻病毒载体的 基因组(以DNA或RNA形式)。
本发明进一步包括包含如本文所述的一种或多种插入的流感病毒HAtl免疫原的 NimII 肽。本发明提供产生鼻病毒载体(例如HRV14载体)的方法，所述鼻病毒载体包括一 种或多种流感病毒HAtl免疫原(和任选的其它免疫原，例如Mk免疫原)。这些方法包括以 下步骤(i)产生基于感染性cDNA克隆的重组鼻病毒载体文库，所述感染性cDNA克隆含有 插入的流感病毒HAtl免疫原序列，和(ii)从文库中选择重组病毒，所述病毒(a)在传代时 保留插入序列，并且(b)被针对插入序列的抗体中和。在这些方法中，插入的流感免疫原序 列可在选自NimI、NimII、NimIII和NimIV的位置插入。另外，所述插入的序列可任选在一 端或两端上侧接随机接头序列。本发明还包括用于培养如本文所述的鼻病毒载体的方法，所述方法包括在诸如 HeLa或MRC-5等细胞中传代所述载体。另外，本发明包括如本文所述的鼻病毒载体，所述鼻病毒载体包含如本文所述的 一种或多种免疫原。本发明提供几种益处。例如，在本发明活载体情况下，利用这种活载体系统递送诸 如HAtl等免疫原提供以下优势，包括(i)仅用单剂疫苗即可引起非常强烈和持久的抗体应 答的能力，和(ii)与亚单位疫苗或灭活疫苗相比，具有更大的制备可缩扩性(即成本较低 的情况下可获得更多剂量)。因此，在发生大流行的情况下，用活疫苗在相对短的时期内就 可免疫接种多得多的人。此外，本发明的HRV载体可鼻内递送，引起全身性和粘膜两方面的 免疫应答。使用HRV14提供了另外的优势，因为该病毒为非致病性的，并且很少在人群体中 发现该病毒(Andries 等，J. Virol. 64 :1117-1123,1990 ；Lee 等，Virus Genes9 :177-181, 1995)，这减少了在疫苗接受者中预先存在的抗载体免疫力的可能性。另外，感染人所需的 HRV的量非常小(1个组织培养物感染剂量(TCID5tl) (Mvolainen-Kopra，“人鼻病毒的分子 流行病学(Molecular Epidemiology of Human Rhinoviruses)，” 国家公共卫生研究院出 版物，2Λ006，Helsinki，芬兰，2006)，这对于基于HRV的疫苗生产成本有效性而言是有利 的特征。根据下文的发明详述、附图和权利要求，本发明的其它特征和益处将为显而易见 的。附图简述

图1图示了 HRV14的病毒颗粒(上图)和基因组(下图)。人鼻病毒14 (HRV14)衣 壳具有假-T = 3 (P =幻二十面体对称性(isochedralsymmetry)，由60个拷贝的病毒蛋白 VP1、VP2、VP3和VP4组成，其中VP4蛋白位于RNA-衣壳界面处(Rossmann等，Nature 317 145-153,1985)。VP1-3蛋白形成一个峡谷，其包含细胞受体(细胞内粘附分子1 (ICAM-I)) 的受体结合位点(Colonno等，J. Virol. 63 =36-42,1989)。在所述峡谷边缘的表面鉴定到 三种主要的中和免疫原性(Nim)位点NimI (AB)、NimII和Nimlll，其为中和抗体的结合位 点(Sherry 等，J. Virol. 57 =246-257,1986)。在 Chimera 程序中基于 HRV14 的晶体结构用 NimI特异性mAbl7(蛋白质数据库#1RVF)形成了 HRV14颗粒的重建。图2如下所述(A)本研究中产生的HRV14-M2e构建体(SEQ IDNO 19-21)。使用 HRV14 cDNA克隆的衍生物(即质粒pWRl)构建iCe-插入突变体。(B)由HRV14-NimII_XXX17 AA(Arnold 等，J. Mol. Biol. 177 :417-430,1984)和 HRV14-NimII-XXX23AA(Arnold 等，US2006/0088549 Al)病毒文库以及衍生自pWRl的野生型HRV14产生的噬斑。如本文所讨 论和其它数据(图3和4)所支持，构建体#1不产生噬斑，表明随机接头策略是在HRV中工 程改造新表位的有效手段。分图(C)显示本发明的HRV14-iCe(17AA)、HRV14-HAQ(19AA)和 HRV14-M2el6HA012 构建体(SEQ ID NO :22-24)。图3显示Mk插入物在不同的HRV14-M&构建体中的稳定性。用引物对 Pl-upl00Fw、VPl-dwn200Rv (绿色)或 14FAflII_1730Rv (红色)RT-PCR 扩增含插入物的片 段，分别产生“PCR B”(绿色)或“PCR A”(红色)DNA片段。用B10I消化这些片段。显示 了第 2、3、4 代 HRV14H\Ce 嵌合体和第 4 代 HRV 14-NimII-XXX17M 和 HRV 14-NimII-XXX17AA 病毒文库的琼脂糖凝胶电泳结果。两个酶切片段(箭头所示)代表含有插入物的病毒。图4显示NimII位点处23个氨基酸的ICe插入物对HRV14受体结合域的可能位 阻。如图中所示，没有接头的插入物可以从NimII位点伸出，几乎伸到峡谷的对侧(即NimI 位点处)。该屏障可有效地阻断受体进入到峡谷中。N末端接头可改变该插入物的位置(箭 头所示方向)，打开通往峡谷的通路。在Accelrys Discovery Studio (AccelrysSoftware, Inc)中创建了 HRV14-NimII-iCe(23个氨基酸)的VP1-VP4亚基分子模型。这表明我们能 够根据有效的结构数据和建模软件将新表位工程改造到HRV14中。图 5 显示用抗-M2e Mab 14C2 (Abeam, Inc ;Cat# ab5416)的 HRV14、 HRV14-NimII-XXX23AA文库和HRV14-NimII-XXX17AA文库的噬斑减少中和试验(PRNT)。结 果证明，两种文库均有效中和，但不能中和载体病毒(HRV14)。从这些结果中也可明显看出 两种文库的纯度(没有野生型污染)。图6显示在攻击之前已免疫小鼠中的M2e特异性IgG抗体应答(合并的样品)。 终点效价(End point titer) (ET)显示在相关组标题之后。括号中显示相应免疫接种的时 间(d0和d21分别表示第0天和第21天)。图7显示在攻击之前已免疫小鼠中的HRV14特异性IgG抗体应答(合并的样品) (A)用1、2或3剂量的HRV14-M&(17AA)病毒免疫接种的组；和⑶用1或2剂量的亲代 HRV14病毒免疫接种的组。图8显示已免疫的小鼠中各自的Mk特异性IgG抗体应答。图9显示如表4中所述免疫接种的小鼠中Mk特异性抗体同种型IgGl和IgGh (A)IgGl ELISA (组中合并样品)；(B) IgG2a ELISA (组中合并样品)；(C)图A和B的标题; ⑶第4组(红色；第1和第3组数据)和第7组(绿色；第2和第4组数据)小鼠的各血 清样品(稀释度1 2，700)中的M2e-特异性IgGl (圆点)和IgGh(菱形)的水平(见 表4)。图10显示如表4所述中免疫接种的小鼠中Mk特异性抗体的IgG2b同种型。㈧ 用Mk肽的ELISA(组中合并样品)；⑶在抗Mk特异性肽的ELISA中检测的第4组(红 色)和第7组(绿色)小鼠中的各血清样品(稀释度1 2，700)(见表1)。图11显示如表4中所述免疫接种的小鼠中IgGl、IgG^i* IgG2b同种型的似6特 异性抗体(上图)。图12显示用A型流感病毒株PR8攻击后28天所有组的存活率。图13显示用A型流感病毒株PR8攻击后28天所有组的发病率(图13A)；第4组 (图13B)和第7组(图13C)的各小鼠体重。
图14显示在攻击之前已免疫接种的小鼠中的ICe(A-D)和HAtl(E)特异性IgG抗 体应答(合并的样品)(各组见表5)。图15显示用A型流感病毒株PR8致死性攻击后21天期间所有组的发病率(B ；体 重的百分数)和死亡率仏；存活％)。图16显示用小鼠抗-HRVH-NimIV1ffiv6血清的HRV14和HRV6的噬斑减少中和测验 (PRNT)结果。这些数据用作NimIV1ffiv6在HRV14衣壳背景中的免疫显性的证据，表明了用于 插入外源表位的新位点。图17图示了 HRV14病毒体蛋白中的插入位点。将ICe或HAtl引入到NimI、NimII、 NimIII和NimIV中的所示位点。XXXiCe表示本文所述的]\Ce文库(SEQ ID NO :25-28)。图18提供人鼻病毒14(HRV14)的序列信息。通过翻译所示核酸序列(SEQ ID NO 29)的629-7168位核苷酸获得所编码的氨基酸序列(SEQ ID NO :30)。图19提供质粒图谱和关于插入到HRV14的NimII位点的19个氨基酸的HA序列 (SEQ ID NO 77)和 CMVHRV 14MGM19aaHAGQ 全序列(SEQ ID NO 78)的序列信息。图20提供质粒图谱和关于HRV14H\Cel7aa的Pl区氨基酸序列(SEQ ID NO 79) 及NimII HRV14中M2el7aa的质粒序列(SEQ IDNO 80)的序列信息。图21提供质粒图谱和关于M2e 23位氨基酸(突变的)序列(SEQ IDNO 81)、 HRV14-M2e23aa 的 Pl 区氨基酸序列(SEQ ID NO 82)及 NimIIHRVH 中 M2e23aa 的质粒序 列(SEQ ID NO 83)的序列信息。图22提供质粒图谱和关于HRV14-M2el6aa_HA012aa的Pl区氨基酸序列(SEQ ID NO 84)及 NimII HRV14 中 HA012_M2el6 的质粒序列(SEQ ID NO 85)的序列信息。图23提供构建体图谱和关于HRV14-iCe (17AA)嵌合体的VP4-VP1 (结构区)(SEQ ID NO 86) R HRV14-M2e (23AA)嵌合体的 VP4-VP1 (结构区)(SEQ ID NO 87)的序列信息。发明详述本发明提供通用(大流行)流感疫苗，该疫苗基于利用人鼻病毒(HRV)作为载体 进行流感病毒决定簇的有效递送和呈递。如下文所进一步描述，根据本发明，流感病毒血凝 素(HA)的蛋白水解切割位点(HAtl)和流感病毒基质蛋白2的胞外域(M2e)是可包括在通 用流感(A型流感)疫苗中的两种表位。因此，本发明疫苗包括含有一种或多种基于HAtl免 疫原的载体，并可任选与基于M2e的免疫原联合使用，后者可与基于HAtl的免疫原处于同一 个组合物中；连接基于HAtl的免疫原(直接或间接，例如通过接头)或与基于HAtl的免疫原 处于不同的组合物中。本发明疫苗组合物可用于预防或治疗流感病毒感染(包括流感大流 行的情况)的方法中。本发明还包括如本文所述的载体，所述载体包括如下文进一步阐述 的其它免疫原。以下进一步阐述本发明载体、疫苗、组合物和方法。HRV 载体本发明载体基于人鼻病毒，例如非致病血清型人鼻病毒14(HRV14)。图1图示了 HRV14病毒颗粒和基因组结构，显示了病毒结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)和非结构蛋白 (P2-A、P2-B、P-2C、P3-A、3B(VPg)、3C禾口 3D)以及HRV14 中主要中和免疫原位点(Nim =NimI, NimII、NimIII 和 NimIV)的位置。可用于本发明的HRV14分子克隆的实例是pWR3.沈(美国典型培养物保藏中心 ATCC 号:VRMC-7 )。下文进一步描述了该克隆，Lee 等，J. Virology 67(4) :2110-2122,1993也详细描述了该克隆(也可参见SEQ ID NO : 和30)。HRV14的其它来源也可用于 本发明(例如ATCC登录号VR284 ；也可参见GenBank登录号L05355(1993年6月11日)禾口 K02121(2001 年 1 月 2 日)及其其它所列形式；Stanway 等，Nucleic Acids Res. 12(20) 7859-7875，1984 ；和 Callahan 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 82 (3) :732-736,1985)。除 HRV14之外，其它人鼻病毒血清型也可用于本发明。如本领域已知，存在超过100种这样的 血清型，任何这些血清型均可用于例如以与HRV14同样的方式衍生感染性克隆。因此，虽然 本文根据HRV14进行了描述，但本发明也适用于其它鼻病毒血清型及其变体(例如包括天 然存在或人工的序列差异的变体，这些差异基本上不影响病毒特性，或提供减毒作用；还包 括一个或多个(例如1-100、2-75、5-50或10-35个)保守氨基酸取代的变体)。根据本发明，可将抗原序列在不同位点插入HRV载体，如下文进一步所述。在一个 实例中，将所述序列插入到一种血清型例如HRV14的NimII位点。NimII (中和免疫原II) 是HRV14中的免疫显性区，包括VPl的第210位氨基酸和VP2的第156、158、159、161和162 位氨基酸(Savolainen-Kopra，“人鼻病毒的分子流行病学(MolecularEpidemiology of Human Rhinoviruses)，”国家公共卫生研究院出版物，2/2006，Helsinki，芬兰，2006)。在 下文描述的一个具体实例中，将所述序列插入到VP2的第158和160位氨基酸或第158和 162位氨基酸之间。也可在NimII位点内的其它位置插入。例如，可在VP2的第156、158、 159、161或162位，或VPl的第210位或其组合中的任意位置插入。除非另外指出，否则提 及本文插入部位通常是指插入羧基端至所示的氨基酸，插入也可与如本文所述的缺失一起 进行。可进行插入的其它位点(单独或与在其它位点(例如NimII位点)的插入联合) 包括NimI(A和B)、NimIII和NimlV。因此，可在例如以下位置插入VP1的第91和/或95 位(NimIA)、VPl 的第 83、85、138 和 / 或 139 位(NimIB)和 / 或 VPl 的第 287 位(NimIII) (参见例如图17)。NimIV位于VPl羧基末端区中，位于包含以下序列的区域中，该序列表示 HRV14 VPl 的第 274-289 位氨基酸NTEPVIKKRK⑶IKSY (SEQ ID NO :28)。可插入到该 NimIV 位点或其它HRV血清型的相应区。该区内的任何氨基酸之间的插入均包括在本发明中。因 此，本发明包括例如在以下氨基酸之间的插入274和275 ；275和276 ；276和277 ；277和 278 ；278 和 279 ；279 和 280 ；280 和 281 ;281 和 282 ；282 和 283 ；283 和 284 ；284 和 285 ；285 和观6 ；286和观7 ；287和观8 ；以及288和观9。除这些插入外，本发明还包括该区域中一 个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸缺失的插入。因此，例如，本发明包括 在以下氨基酸之间的插入274和276 ；275和277 ；276和278 ；277和279 ；278和280 ；279 和 281 ；280 和 282 ；281 和 283 ；282 和 284 ；283 和 285 ；284 和 286 ；285 和 287 ；286 和 288 ； 287和观9 ；288和四0 ；以及289和四1。可在所示氨基酸的任一侧或两侧进一步以插入代 替例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸的缺失。使用分子生物学的标准方法构建本发明载体，下文在HRV14的NimII中包含插入 的载体的情况中例述该方法。此外，如下文所进一步讨论，利用本领域技术人员已知的方 法，本发明载体可以以活病毒形式给予，或可通过例如福尔马林灭活或紫外线处理在给予 之前进行灭活。所述载体的方法可任选在氨基端和/或羧基端在HRV载体序列和插入的流感序列 之间包含接头序列。这些接头序列可用于为插入的序列提供柔性，使插入的序列能够以可引起免疫应答的方式呈递插入的表位。下文提供了此类接头序列的实例。可用例如如本文 所述的本发明文库筛选方法来鉴定与特定插入物一起使用的接头序列。简言之，在该方法 中，构建在鉴定有效的接头序列所需的区域中具有各种长度的随机序列的文库。检测文库 产生的病毒的生存力和插入序列的免疫原性以鉴定有效接头。可用标准方法例如通过在细胞培养物中传代来培养本发明病毒。例如，可在诸如 MRC-5细胞或HeLa细胞等细胞中对病毒进行培养并纯化。异源肽本发明的病毒载体可用来递送任何具有预防或治疗价值的肽、蛋白质或其它基于 氨基酸的免疫原。例如，本发明载体可用来诱导针对插入到HRV蛋白中的任何基于蛋白的 抗原的免疫应答(预防性或治疗性)。本文所用预防和防止包括将本发明免疫原性的组合 物给予未受病原体感染的受试者，而插入到本发明载体的肽或蛋白质源自所述病原体。如 果所述受试者在给药后受到所述病原体的感染，那么将本发明组合物给予所述受试者可防 止或基本上防止有症状感染的发展。因此，所述给药可使受试者免疫系统能够防止或基本 上防止感染进展到例如有症状阶段。治疗性给药包括对已经受插入肽或蛋白所源自的病原 体感染的受试者给药。这种受试者可表现出感染症状。这些术语同样适用于肿瘤相关抗原 的情况。例如，可对未患肿瘤(或未被诊断为患有肿瘤)的患者进行预防性或防止性给药， 这种给药可诱导免疫应答以对抗在所述受试者中发展的任何肿瘤。可在已经诊断有肿瘤的 患者中进行涉及给予肿瘤相关抗原的治疗性治疗。本发明载体可各自包括插入序列的单个表位。或者，可以将多个表位在单个位点 (例如作为多表位，其中不同的表位可以任选被柔性接头隔开，例如在以下实例中所述的一 个或多个氨基酸的聚甘氨酸段)或不同位点(例如不同的Nim位点)或其任何组合处插 入到所述载体中。所述不同的表位可来源于病原体的单一的种、毒株或血清型(或其它来 源)，或者可来源于不同的种、毒株、血清型和/或属。所述载体可包括多个肽，例如，包括如 本文所列肽的多个拷贝或如本文所列肽的组合。作为实例，所述载体可包括HAtl和M2e序 列，或人和禽HAtl和/或M2e肽(和/或其共有序列；和/或例如本文所述的其它肽)。可用于本发明的免疫原可来源于诸如病毒、细菌和寄生虫等致病原(infectious agent)。此类致病原的具体实例是流感病毒，包括感染人的流感病毒(例如A、B和C毒株) 以及禽流感病毒。来自流感病毒的免疫原的实例包括得自以下的免疫原血凝素(HA ；例如 H1-H16中的任一种或其亚基)(HAtl或HA亚基HAl和H/^)、M2 (例如M2e)、神经氨酸酶(NA ； 例如N1-N9中的任一种)、Ml、核蛋白(NP)和B蛋白。可包含在本发明载体中的序列实例是流感病毒肽，包括血凝素前体蛋 白切害U 位点(HA。)(A/H1 株的 NIPSIQSRGLFGAIAGFIE(SEQ IDNO :31)、A/H3 株的 NVPEKQTRGIFGAIAGFIE (SEQ ID NO 32)和 B 型流感病毒株的 PAKLLKERGFFGAIAGFLE (SEQ ID NO 33)) ο 这种肽的两个具体实例包括RGIFGAIAGFI (SEQ ID NO 34)和 NVPEKQTQGIFGAIAGFI(SEQ ID NO 35)。在其它实例中，基于HAtl的疫苗包括其它免疫原序列(例如流感病毒M2e序列)， 或与其它免疫原(例如流感病毒M2e) —起给予。在本说明书各处提供这种序列的实例，并 提供在表6-9中。这种序列的具体实例包括以下MSLLTEVETPIRNEffGCRCNDSSD (SEQ ID NO 9)；
MSLLTEVETPTRNEWECRCSDS SD (SEQ ID NO 10)；MSLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD (SEQ ID NO 11) ；EVETPTRN (SEQ ID NO: 13); SLLTEVETPIRNEffGCRCNDSSD(SEQ ID NO :36)；和 SLLTEVETPIRNEWGCR(SEQ ID NO :37)。可 用于本发明的其它Mk序列包括来自B型流感病毒BM2蛋白的胞外域的序列(共有序列 MLEPFQ ；SEQ ID NO 38)和来自 H5m 禽流感病毒的 I\Ce 肽(MSLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD ； SEQ ID NO :11)。以下为可用于本发明的联合HAtl和I\Ce序列的实例SLLTEVETP IRNEWGSE RGIFGAIAGFIE(SEQ ID NO :39)。在包括不止一种免疫原的疫苗情况下，多种免疫原可包括在相同或不同的递送载 体中，例如本发明基于HRV的载体。本发明载体可与其它类型的载体和/或亚单位疫苗联 合给予，所述其它类型载体例如基于乙肝病毒核心的载体，如本文另外所述(亦参见例如 美国专利号7, 361,352)。流感病毒中的保守肽的其它实例可在本发明中与基于HAtl的疫苗联用，并包括 B型流感病毒的保守NBe肽(共有序列MNNATFNYTNVNPISHIRGS ;SEQ ID NO :40)。可用 于本发明的流感病毒肽的其它实例以及可衍生这些肽的蛋白(例如通过片段化和/或产 生类似物；参见以下)描述于 US 2002/0165176、US 2003/0175290, US2004/0055024、US 2004/0116664、US 2004/0219170,US 2004/0223976、US 2005/0042229、US 2005/0003349、 US 2005/0009008、US2005/0186621、美国专利号 4，752，473、美国专利号 5，374，717、 U. S. 6，169，175、美国专利号6，720，409、美国专利号6，750，325、美国专利号6，872，395、 WO 93/15763、WO 94/06468、WO 94/17826、W096/10631、WO 99/07839、WO 99/58658、WO 02/14478,W02003/102165,WO 2004/053091、W0 2005/055957 和表 6-9 (以及其中引用的参 考文献)，其内容均通过参考纳入本文。另外，可从公开获得的数据库中选择流感病毒的保 守的免疫性/保护性T和B细胞表位(参见例如Bui等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 104 246-251，2007，及增补表)。本发明还可利用来自在线IEDB资源的任何肽，例如包括Bui等 (见上文)中描述的保守性B和T细胞表位在内的流感病毒表位。来自其它人/兽病原体的保护性表位，例如来自寄生虫(例如疟疾)、其它致病性 病毒(例如人乳头瘤病毒(HPV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV ；例如gag)、 丙肝病毒(HCV))和细菌(例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、艰难梭菌 (Clostridium difficile)和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的表位，也可与本发明基 于HAtl的疫苗联合，或在缺乏基于HAtl的肽下用本发明载体给予。这些和其它病原体的各种 合适表位为本领域已知。例如，可使用来自乳头瘤病毒L2蛋白的交叉保护性表位/肽，其 诱导针对不同HPV基因型起保护作用的广谱交叉-中和抗体，所述表位/肽为例如包括例 如HPV16病毒L2蛋白的第1-88位氨基酸、第1_200位氨基酸或第17-36位氨基酸的肽(W0 2006/083984 Al ；QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV ；SEQ ID NO :41)。可用于本发明中的其它病原体 以及来自这些病原体中的免疫原和表位的实例提供于WO 2004/053091、WO 03/102165、WO 02/14478和US 2003/0185854，其内容均通过参考纳入本文。下表1中列出了可从其中得到免疫原的病原体的其它实例，这种免疫原的具体实 例包括下表2中列出的免疫原。此外，表3中提供了可插入本发明载体中的表位的具体实 例。如表3中所示，用于本发明载体的表位可以是B细胞表位(即中和表位)或T细胞表 位(即T辅助细胞和细胞毒性T细胞特异性表位)。
本发明载体可用来递送除病原体来源的抗原之外的免疫原。例如，所述载体可用 来递送肿瘤相关抗原，以用于抗癌免疫疗法。本领域已知许多肿瘤相关抗原，并且可将其按 照本发明给予。癌症(和相应的肿瘤相关抗原)的实例如下黑素瘤(NY-ES0-1蛋白(准确 地讲是位于氨基酸位置157-165的CTL表位)、CAMEL、MART1、gplOO、酪氨酸相关蛋白TRPl 和2及MUC1)；腺癌(ErbB2蛋白)；结肠直肠癌(17_lA、791Tgp72和癌胚抗原)；前列腺癌 (PSA1和PSA3)。热激蛋白(hspllO)也可用作这种免疫原。在本发明的另一实例中，可以使用外源序列，其编码诱导变态反应的抗原的表位， 期需对所述抗原产生免疫应答。另外，本发明载体可包括配体，所述配体用于使递送肽例 如抗原的载体靶向被给予所述载体的受试者的特定细胞(例如包括所述配体的受体的细 胞)。如下阐述了可作为免疫原包括在本发明载体中的病原体、肿瘤和变应原相关肽及 其来源的其它实例。这些肽免疫原可彼此和/或与本文所述其它肽(例如HAtl和/或M2e 相关序列，例如本文所述的那些序列)联合使用。本发明包括包含这些载体的组合物以及 使用所述载体诱导针对所述免疫原的免疫应答的方法。因此，例如，除上述免疫原外，本文 所述载体还可包含一种或多种免疫原，所述一种或多种免疫原(例如病毒靶向抗原)源自 一种或多种病毒或引发针对一种或多种病毒的免疫应答，所述病毒包括例如dsDNA病毒 (例如腺病毒、疱疹病毒、埃巴病毒(Epstein Barr virus)、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹 病毒2型、人单纯疱疹病毒8型、人巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、痘病毒)；ssDNA病毒 (例如细小病毒、乳头瘤病毒(例如 El、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、BPV1、BPV2、BPV3、BPV4、 BPV5 禾口 BPV6 (载于 Papillomavirus and Human Cancer,由 H. Pfister 编辑(CRC Press, Inc. 1990)) ；Lancaster 等，Cancer Metast. Rev.第 6653-6664 页，1987 ；Pfister 等，Adv. Cancer Res. 48 :113-147,1987)) ；dsRNA病毒(例如呼吸道肠道病毒)；⑴ssRNA病毒(例 如小RNA病毒、科萨奇病毒、甲肝病毒、脊髓灰质炎病毒、披膜病毒、风疹病毒、黄病毒、丙肝 病毒、黄热病毒、登革病毒、西尼罗病毒)；(-)ssRNA病毒(例如正粘病毒、流感病毒、弹状 病毒、副粘病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、弹状病毒、狂犬病毒)；ssRNA-RT病毒 (例如逆转录病毒、人免疫缺陷病毒(HIV))；和dsDNA-RT病毒(例如嗜肝DNA病毒、乙肝病 毒)。免疫原还可源自上面未列出但本领域技术人员可得到的其它病毒。对于HIV，免疫原可选自任何HIV分离物。如本领域所熟知，现在将HIV分离物分 类为不相关联的遗传亚型。已知HIV-I包含至少10个亚型(A、B、C、D、E、F、G、H、J和K)。 已知HIV-2包括至少5个亚型(A、B、C、D和E)。B亚型与全世界男性同性恋者及静脉注射 药物使用者中的HIV流行有关。大部分HIV-I免疫原、适应实验室的分离物、反应物和经作 图的表位属于B亚型。在撒哈拉以南非洲、印度和中国这些新的HIV感染发生率高的地区， HIV-I B亚型仅为少部分感染的原因，而HIV-I C亚型似乎是最常见的感染亚型。因此，在 某些实施方案中，选择来自HIV-I B和/或C亚型的免疫原可为所期望的。在单一免疫组合 物中包括来自多种HIV亚型(例如HIV-IB和C亚型、HIV-2 A和B亚型或HIV-I和HIV-2 亚型的组合)的免疫原可为所期望的。例如，适合的HIV免疫原包括ENV、GAG、POL、NEF以 及其变体、衍生物和融合蛋白。免疫原(例如细菌靶抗原)亦可源自一种或多种细菌种类(spp·)，或引发 针对一种或多种细菌种类的免疫应答，所述细菌种类包括例如芽孢杆菌(Bacillus
13spp.)(例如炭疽杆菌(Bacillus anthracis))、博德特氏菌(Bordetella spp.)(例 如百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis))、疏螺旋体(Borrelia spp.)(例如布 氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi))、布鲁氏菌(Brucella spp.)(例如流产布鲁氏 lil (Brucella abortus) > ^ ^fJ # ^ |1| (Brucella canis) > ^/K #, ^ # K |1| (Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(Brucella suis))、弯曲杆菌(Campylobacter spp.)(例如 空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni))、衣原体(Chlamydia spp.)(例如肺炎衣原体 (Chlamydia pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis))、梭菌(Clostridium spp.)(例如肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰 难梭菌、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani))、 棒杆菌(Corynebacteriumspp.)(例如白喉棒杆菌(Corynebacterium diptheriae))、 肠球菌(Enterococcus spp.)(例如獎肠球菌(Enterococcus faecal is)、屎肠球菌 (enterococcus faecum))、埃希氏菌(例如大肠杆菌)、弗朗西丝氏菌(Francisella spp.) (例如土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis))、嗜血菌(Haemophilus spp.) (例如流感嗜血菌(Haemophilus influenza))、螺杆菌(Helicobacter spp.)(例如幽门 螺杆菌)、军团菌(Legionella spp.)(例如侵肺军团菌(Legionella pneumophila))、钩 端螺旋体(Leptospira spp.)(例如问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans))、禾丨J斯 特氏菌(Listeriaspp.)(例如单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes))、 分枝杆菌(Mycobacterium spp.)(例如麻疯分枝杆菌(Mycobacterium 1印rae)、结核 分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))、枝原体(Mycoplasma spp.)(例如月市炎枝 原体(Mycoplasma pneumoniae))、奈瑟氏球菌(Neisseriaspp.)(例如淋病奈瑟氏球 菌(Neisseria gonorrhea)、脑膜炎奈瑟氏球菌)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)(例 如铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、立克次氏体(Rickettsia spp.)(例如立 氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii))、沙门氏菌(Salmonella spp.)(例如伤寒沙 门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhinurium))、志贺氏菌 (Shigella spp.)(例如索氏志贺氏菌(Shigella sonnei))、葡萄球菌(Staphylococcus spp.)(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、凝固酶阴性葡萄 球菌(coagulasenegative staphylococcus)(例如美国专利号 7，473，762))、链球 菌(Streptococcus spp.)(例如无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、月市炎链球 菌(Streptococcus pneumoniae)、酉良胺链球菌(Streptococcuspyrogenes))、密螺方宠 体(Treponema spp.)(例如苍白密螺旋体(Tr印onemapallidum))、弧菌(Vibrio spp.) (例如霍乱弧菌(Vibrio cholerae))和耶尔森氏菌(Yersinia spp.)(鼠疫耶尔森氏菌 (Yersinia pestis))。免疫原还可来自上面未列出但本领域技术人员可获得的其它细菌种 类或引发针对所述细菌种类的免疫应答。 免疫原(例如一种或多种寄生虫靶抗原)还可源自一种或多种寄生虫生物 体(spp.)或引发针对所述寄生虫生物体的免疫应答，所述物种包括例如钩口线虫 (Ancylostoma spp.)(例如十二 指肠钩 口线虫(A. duodenale))、异尖线虫(Anisakis spp.)、似引蛔线虫(Ascarislumbricoides)、结肠肠袋虫(Balantidium coli)、多节绦 虫(Cestoda spp.)、臭虫(Cimicidae spp.)、华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)、矛形双腔吸虫(Dicrocoelium dendriticum)、牛双腔吸虫(Dicrocoelium hospes)、阔节裂头 绦虫(Diphy 1 lobothrium latum)、龙线虫(Dracunculus spp·)、棘球绦虫(Echinococcus spp.)(例如细粒棘球绦虫(E. granulosus)、多房棘球绦虫(E. multilocularis))、痢疾内 变形虫(Entamoeba histolytica)、蠕形住肠线虫(Enterobius vermicularis)、片形吸虫 (Fasciola spp.)(例如肝片形吸虫(F. hepatica)、F. magna、大片形吸虫(F. gigantica)、 杰氏片形吸虫(F. jacksoni))、巴氏姜片吸虫(Fasciolopsis buski)、贾第虫(Giardia spp.)(蓝氏贾第虫(Giardia lamblia))、颚 口线虫(Gnathostoma spp.)、膜壳绦虫 (Hymenolepis spp.)(例如短小啮壳绦虫(H. Nana)、缩小膜壳绦虫(H. diminuta))、利 什曼虫(Leishmania spp.)、罗阿罗阿线虫(Loa Ioa)、次睾吸虫(Metorchis spp.) (M. conjunctus、白& _ 口及 & (M. albidus)) > M ^H IS. P ^ ^ (Necator americanus)、 狂蝇(Oestroidea spp.)(例如马蝇)、蟠尾丝虫(Onchocercidae spp.)、后睾吸虫 (Opisthorchis spp.)(例如麝猫后睾吸虫(0. Viverrini)、猫后睾吸虫(0. Felineus)、 0. guayaquilensis 和犬后睾吸虫(0. noverca))、疟虫(Plasmodium spp.)(例如恶性疟原 ji, (P. falciparum)) > Protofasciola robusta> Parafasciolopsis fasciomorphae> Jl 1 并殖吸虫(Paragonimus westermani)、裂体吸虫(Schistosoma spp.)(例如孟氏裂体吸 虫(S. mansoni)、日本裂体吸虫(S. japonic·)、湄公河裂体吸虫(S. mekongi)、埃及裂体吸 虫(S. haematobium))、欧洲刺猬旋宫绦虫(Spirometra erinaceieuropaei)、粪类圆线虫 (Strongyloidesstercoralis)、带缘虫(Taenia spp.)(例如牛带缘虫(T. saginata)、猪 带绦虫(T. solium))、弓首线虫(Toxocara spp.)(例如犬弓首线虫(T. canis)、猫弓首线 虫(T. cati))、弓浆虫(Toxoplasma spp.)(例如鼠弓浆虫(T. gondii) )、Trichobilharzia regenti、旋毛形线虫(Trichinella spiralis)、人鞭虫(Trichuris trichiura)、恙虫菌 (Trombiculidae spp· )、Ifl虫(Trypanosomaspp.)(Tunga penetrans)禾口 / 或王
氏吴策线虫(Wuchereriabancrofti)。免疫原还可源自上面未列出但本领域技术人员可获 得的其它寄生虫生物或引发针对所述寄生虫生物的免疫应答。 免疫原(例如肿瘤靶抗原)可源自肿瘤靶抗原或引发针对所述抗原的免疫应答。 术语肿瘤靶抗原(TA)可包括肿瘤相关抗原(TAA)和肿瘤特异性抗原(TSA)两者，其中癌 细胞是抗原的来源。TA可为在肿瘤细胞表面上以高于在正常细胞上观察到的量表达的抗 原，或为在胎儿发育时期在正常细胞上表达的抗原。TSA通常为对肿瘤细胞独特的且不在 正常细胞上表达的抗原。按照其表达模式、功能或遗传来源，通常将TA分为5类癌-睾 丸(CT)抗原(即MAGE、NY-ESO-1)；黑素细胞分化抗原(例如Melan A/MART-1、酪氨酸 酶、gplOO)；突变抗原(例如MUM-1、p53、CDK-4)；过表达的‘自身’抗原(例如HER-2/ neu、p53)；和病毒抗原(例如HPV、EBV)。合适的TA包括例如gplOO (Cox等，Science 264 :716-719,1994)、MART-I/MeIan A(Kawakami 等，J. Exp. Med.，180 :347-352,1994)、 gp75 (TRP-I) (Wang 等，J. Exp. Med.，186 :1131-1140，1996)、酪氨酸酶(Wolfel 等，Eur. J. Immunol. ,24 :759-764,1994)、NY-ESO-I (WO 98/14464 ；WO 99/18206)、黑素瘤蛋白多糖 (Hellstrom 等，J. Immunol.，130 1467-1472，1983)、MAGE 家族抗原(例如 MAGE_1、2、3、4、 6 禾口 12;Van der Bruggen 等，Science254 1643-1647，1991 ；美国专利号 6，235，525)、BAGE 家族抗原(Boel 等，Immunity 2 :167-175,1995) ,GAGE 家族抗原(例如 GAGE-U2 ；Van den Eynde 等，J. Exp. Med. 182 =689-698,1995 ；美国专利号 6，013，765)、RAGE 家族抗原(例如RAGE-I ；Gaugler 等，Immunogenetics44 :323-330,1996 ；美国专利号 5，939，526)、N-乙酰 氨基葡萄糖转移酶-V (Guilloux 等，J. Exp. Med. 183 :1173-1183,1996)、pl5 (Robbins 等， J. Immunol. 154 :5944-5950,1995)、β -联蛋白(Robbins 等，J. Exp. Med.，183 :1185-1192， 1996)、MUM-I (Coulie 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 92 :7976-7980,1995)、细胞周期 蛋白依赖性激酶 _4(CDK4) (Wolfel 等，Science 269 :1281-1284,1995), p21_ras (Fossum 等，Int. J. Cancer56 :40-45,1994)、BCR-abl (Bocchia 等，Blood 85 :2680-2684,1995)、 p53 (Theobald 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92 :11993-11997, 1995)、pl85HER2/ neu(erb-Bl ；Fisk 等，J. Exp. Med.，181 :2109-2117，1995)、表皮生长因子受体(EGFR) (Harris 等，Breast Cancer Res. Treat，29 :1-2，1994)、癌胚抗原(CEA) (Kwong 等，J. Natl. Cancer Inst. ,85 :982-990,1995)；美国专利号 5，756，103、5，274，087、5，571，710、 6, 071, 716,5, 698, 530,6, 045, 802 ；EP 263933 ；EP 346710 JPEP 784483、癌相关突变粘 蛋白(例如 MUC-I 基因产物 Jerome 等，J. Immunol.，151 :1654-1662,1993)、EBV 的 EBNA 基因产物(例如 EBNA-I ；Rickinson 等，Cancer Surveys 13 :53_80，1992)、人乳头瘤病毒 的 E7、E6 蛋白(Ressing 等，J. Immunol. 154 =5934-5943,1995)、前列腺特异性抗原(PSA ； Xue 等，The Prostate 30 :73_78，1997)、前列腺特异性膜抗原(PSMA ；Israeli 等，Cancer Res. 54 :1807-1811,1994)、独特型表位或抗原，例如免疫球蛋白独特型或T细胞受体独 特型(Chen 等，J. Immunol. 153 :4775-4787,1994) ；KSA (美国专利号 5，348，887)、驱动蛋 白 2 (Dietz,等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 275 (3) :731-738, 2000)、HIP-55、TGF β -1 抗凋亡因子(Toomey 等，Br. J. Biomed. Sci. 58(3) 177-183，2001)、肿瘤蛋白 D52 (Bryne 等，Genomics 35 :523-532,1996)、HlFT、NY-BR-I (TO 01/47959)、NY-BR-62、NY-BR-75、 NY-BR-85、NY-BR-87和NY-BR-96 (ScanIan，M.鉴定人肿瘤抗原的血清学和生物信息学方 ^去(Serologic and Bioinformatic Approaches tothe Identification of Human Tumor Antigens),载于 Cancer Vaccines2000, Cancer Research Institute, New York, NY)禾口 / 或胰腺癌抗原(例如美国专利号7，473，531的SEQ ID NO :1-288)。免疫原还可源自包括 上面未列出但本领域技术人员可获得的TA或引发针对所述TA的免疫应答。
如本领域技术人员可确定为合适的，插入本发明载体中的肽或蛋白大小的长度范 围可以例如为3-1000个氨基酸，例如5-500个、10-100个、20-55个、25-45个或35-40个 氨基酸。因此，例如，长度范围为7-45、10-40、12-30和15-25个氨基酸的肽可用于本发明。 包括在本发明载体中的肽可包括如本文所指出并提及的完全序列或片段，所述片段包括能 够诱导所需免疫应答的一个或多个表位。这种片段可包括例如来自这些肽内的2-50、3-40、 4-30,5-25或6-20个氨基酸片段。此外，所述肽可包括在任一个末端或两个末端上截短或 延长例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11-20等个氨基酸的序列(例如插入附加的/重复的免 疫显性/辅助表位)，包括例如天然存在的邻接序列(例如在流感病毒(或其它来源)基因 组中所述肽与之邻接的序列)，或合成的接头序列(亦参见下文)。因此，所述肽在一个或两 个末端上可包括例如1-25、2-20、3-15、4-10或4-8个氨基酸的序列。作为具体实例，所述肽 在氨基末端和/或羧基末端可包括1-3个氨基酸的接头序列。所述肽或蛋白的截短可去除 了例如在已知结构域/免疫结构域内或结构域之间的免疫学上不重要或干扰性序列；或可 缺失整个不需要的结构域；这种修饰可在21-30、31-50、51-100、101-400等个氨基酸范围 内。所述范围亦包括例如20-400、30-100和50-100个氨基酸。此外，所述序列可包括在所述肽内和/或在所述肽的任一末端或两个末端的例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基 酸(例如1-50、3-40、5-30、8-25、10-20或12-15个氨基酸)的缺失或取代。上述序列的所有 这种可能的肽片段都包括在本发明中。因此，除本文所列举及提及的具体肽序列(及其截 短和延长)外，本发明还包括所述序列的类似物。这种类似物包括例如与参考序列具有至 少80^^90^^95%或99%同一性的序列或其片段。用标准方法和软件可进行同一性百分 比的确定，所述软件为例如遗传学计算机组序列分析软件包GequenceAnalysis Software Package of the Genetics Computer Group), Universityof Wisconsin Biotechinology Center, 1710 University Avenue ,Madison 的 WI 53705、BLAST 或 PILEUP/PRETTYBOX 程序。 这些软件程序通过将同一性的程度分配至各种取代、缺失或其它修饰来匹配同一性或相似 性序列。所述类似物在各种实例中可包括保守氨基酸取代。保守取代通常包括在以下组内 的取代甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨 酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；及苯丙氨酸和酪氨酸。在例如本文所述的那些标准免疫学测定和动物模型系统中，可检测本文所述的片 段及类似物的免疫原性。当用于免疫接种方法时，可以将本发明载体作为初次预防药物给予有被特定病原 体(例如流感病毒)感染风险的成人或儿童。所述载体也可以用作二次药物，用于通过激 发针对肽抗原所来源的病原体(或其它来源)的免疫应答来治疗受感染受试者。在进行抗 癌免疫接种的情况下，可将疫苗给予有患癌风险的受试者或已罹患癌症的受试者。除人受 试者外，本发明方法还可涉及给予非人动物(例如家畜，例如牛、猪、马、绵羊、山羊，和鸟类 (例如鸡、火鸡、鸭或鹅)及宠物(domestic animal)，包括狗、猫和鸟)。为了免疫接种应用，可任选使用本领域技术人员已知的佐剂。根据给药途径选择 佐剂。对于鼻内给药，可用几丁质微粒(CMP) (Asahi-Ozaki等，Microbes and Infection 8 :2706-2714,2006 ;0zdemir等，Clinical and Experimental Allergy 36 :960-968,2006 ; Strong等，Clinicaland Experimental Allergy 32 :1794-1800，2002)。适用于经由粘膜途 径(例如鼻内或口腔途径)给药的其它佐剂包括大肠杆菌的不耐热毒素(LT)及其突变衍 生物。对于灭活病毒而言，可用肠胃外佐剂，包括例如铝化合物(例如氢氧化铝、磷酸铝或 羟基磷酸铝化合物)、脂质体制剂、合成佐剂例如QS21、胞壁酰二肽、单磷酰脂A或聚磷嗪。另外，可将具有佐剂活性的编码细胞因子的基因插入载体中。因此，可将编码细胞 因子例如GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-13或IL-5的基因与外源抗原基因一起插入，以产生导 致增强的免疫应答的疫苗，或将免疫性调节至更特异地针对细胞、体液或粘膜应答。或者， 可借助众所周知的手段(例如直接接种、裸DNA、在病毒载体中等)与重组疫苗病毒分开地 同时或序贯地递送细胞因子。本发明的病毒可与其它免疫接种方法联用。例如，所述病毒可与含有相同或不同 抗原的亚单位疫苗联合给药。本发明的组合方法可包括本发明的病毒与所述抗原的其它 形式(或其它抗原)共同给药(co-administration)。例如，可使用包括肝炎病毒核心蛋 白或灭活的完整或部分病毒在内的亚单位形式或递送载体。在一个这种实例中，可使用 在大肠杆菌中产生的表面上含有Mk肽的乙肝病毒核心颗粒(HBc-Mk ；Fiers等，Virus Res. 103 :173-176,2004 ；WO 2005/055957 ；US 2003/0138769 Al ；US 2004/0146524A1 ；US2007/0036826 Al))。在另一个这种实例中，使用含有HAcJ太的乙肝病毒核心颗粒。可用于制备这种颗 粒的乙肝病毒核心序列包括全长序列以及截短序列(例如羧基端截短序列，在例如第149、 150、163或164位氨基酸处截短；参见例如美国专利号7，361，352)。可将流感病毒序列插 入到HBc序列中或在HBc序列的任一端插入。例如，可将序列插入到HBc的主要免疫显性 区(MIR)，其位于HBc的约75-83位氨基酸处。至iOR区的插入可在该区的任何氨基酸之间 (例如 75-76、76-77、77-78、78-79、79-80、80-81、81-82 或 82-83)，或可存在于该区中缺失 (例如1、2、3、4、5、6或7个氨基酸)的位置(例如在HBc序列的78和82位氨基酸之间插 入B型流感病毒序列)中。在另一实例中，在HBc蛋白的氨基端进行插入。或者，本发明载体可与其它方式(例如亚单位或HBc方式)以初免-加强 (prime-boost)策略联用，其中本发明载体或所述其它方式用作初免，然后所述其它方式用 作加强，或相反。另外，本发明包括将本发明载体既用作初免剂又用作加强剂的初免-加强 策略。因此，这种方法可包括先给予本发明载体，初次给药一周或多周、一月或多月、一年或 多年之后可进行后续的一次或多次(例如，1、2、3或4次)给药。利用标准方法可将本发明载体作为活疫苗、减毒活疫苗或灭活疫苗给予受试者。 活疫苗可例如用本领域技术人员已知方法鼻内给予(参见例如Grtoberg等，Am. J. Respir. Crit. Car. Med. 156 :609_616，1997)。在鼻内给药的情况下，可以滴鼻剂形式给予或通过吸 入气溶胶或喷雾制剂给予载体。病毒可以是冻干形式或溶解在生理相容性溶液或缓冲液例 如盐水或水中。可使用如例如《雷明顿药物科学(Remington，sPharmaceutical Sciences))) (第 18版)，A. Gennaro主编，1990,MackPublishing Company，Easton，PA中所述的标准制备 和配制方法。另外，合适的剂量和给药方案的确定可容易地由本领域技术人员确定。本领域 技术人员可容易确定合适的剂量和给药方案。作为实例，剂量范围可以是例如IO3-Kfpfu/ 剂，但也可低至一个TCID50。有利地，可以单剂形式给予疫苗，但如果本领域技术人员认为 需要的话也可进行加强免疫。至于灭活疫苗，可用例如福尔马林或UV处理杀死病毒，以约 IO8Pfu/剂(例如在灭活前确定)，任选与合适的佐剂(例如几丁质或突变LT ；见上文)一 起鼻内给予。在另一实例中，还可通过肠胃外途径(例如通过皮下给药)任选与合适佐剂 (例如铝佐剂，例如氢氧化铝)给予灭活疫苗。这种方法中，给予多于1剂(例如2-3齐IJ) 可为有利的。本发明部分地基于以下实验实施例。实验实施例I. HRV14-NimII-M2e 嵌合体的构建我们已构建了 HRV14 NimII-M2e重组病毒。如抗ICe单克隆抗体能够中和该重组 病毒的感染性所表明，已显示该病毒在病毒体表面上表达M2e。构建了三种类型的HRV14_iCe构建体(图2A)。1.携带在VP2的第159位和160位氨基酸(NimII位点)之间插入的M2e的23个 氨基酸的 HRV14-NimII-23AA ；2. HRV14-NimII-XXX23AA文库。这组构建体(质粒文库)类似于第一个构建体，但 存在与肽融合的3个氨基酸的随机N末端接头。用5’(直接)引物(含有编码接头氨基酸 的9个随机核苷酸)由Mk序列产生该随机接头；和
3. HRV14-NimII-XXX17AA文库。用与第一个构建体相同的方式产生该文库，但该文 库含有缩短的Mk肽，该肽只含有M2e的开头17个氨基酸。为有利于克隆至HRV14感染性克隆中，我们通过将pWR3. 26感染性克隆的pUC 质粒骨架替换为P^载体(Novagen)的骨架来对PWR3. 26感染性克隆进行修饰(Lee等， J. Virol. 67 =2110-2122,1993)，以产生质粒pffRl (图2)。病毒文库#2和#3的噬斑形态与 HRV14亲本的不同(图2B)。这些文库的噬斑大小似乎与野生型相似，但噬斑不透明。构建 体#1转染时不形成噬斑。为监测所构建病毒的遗传稳定性，我们通过沉默诱变在Mk序列中部插入了 BioI 酶切位点。从含有突变Mk基因的病毒中获得的RT-PCR片段被B10I切割，但自野生型 HRV14产生的相应DNA产物未被消化(图3)。HRV14-NimII_23AA嵌合构建体(#1)产生有 生存力但相当不稳定的病毒。如图3所示，仅在第2代可检测到“PCR A”片段的两个B10I 消化产物，但在以后各代未检测到。相反，文库(#2)和(#3)稳定保留了 Mk插入物从Hl HeLa细胞中的第4代病毒文库中获得的“PCR B”片段被B10I完全消化(图3)。构建体#1 的不稳定性可能是由于插入的肽与受体结合域的位阻干扰造成(图4)，如在构建体#2和 #3中，简并接头的存在可能削弱了这种位阻干扰。随机的N末端接头可能已经改变了肽的 方向，使其离开含有受体结合域的峡谷，从而使病毒有效结合到其受体(图4)。我们用抗]\Ce单克隆抗体(14C2 MAb, Abeam, Inc. Cat# ab5416)进行了病毒文库 的中和研究。病毒中和也可用作表明文库纯度(即不存在野生型HRV14)的工具。噬斑减 少中和试验(PRNT)证明Mab 14C2对两个文库均具有极高的特异性和中和能力(图5)。显示两个文库均极易被抗M2e Mab中和(图5)，而对照病毒(pWRl)即使在单克 隆抗体的最低稀释度1 10下也未被中和。在约1 2，000，000的抗体稀释度(14C2的 储液浓度是lmg/ml)下，两个文库均观察到50%的中和。这种重组病毒的有效中和表明， HRV14的NimII中呈递的Mk肽处于合适的构象，易于被抗体识别。II.稳定的HRV14-NimII-]\Ce重组体的鉴定在Hl HeLa细胞中传代4代之后，各文库中选择6个独立的克隆进行噬斑纯 化，再过4代之后，通过序列测定对携带的插入物进行表征。各文库产生一个显性和稳 定复制的病毒克隆。分离自HRV14-NimII-XXX23AA文库的所有病毒均具有相同的插 入序列 GHTSLLKEVETPIRNEWGSRSNDSSD (SEQ ID NO 42)，GHT 作为 N 末端接头，而来自 HRV14-NimII-XXX17AA 文库的所有病毒具有相同的序列 QPASLLTEVETPIRNEWGSR(SEQ ID NO 43), QPA作为N末端接头。携带23个氨基酸的插入物的所有可存活克隆在第7位氨基 酸处具有酪氨酸至赖氨酸的取代(在M2e外源插入物中是第4位)。携带17个氨基酸的 插入物的克隆均含有野生型Mk序列。这些结果表明可分离到遗传稳定的重组HRV-Mk病 毒。在进一步的体内研究中，用腹膜内给药途径评估HRV14-iCe(17AA)提供抗A型流感病 毒株PR8的保护作用的潜能。III. HRV14-M2e 和 HRVH-HAtl 重组体的体内研究A.体内试验#1 腹膜内免疫接种1.试验设计第0天，用在500 μ L体积中与100 μ g佐剂(氢氧化铝)混合的5. 0xl06pfu的蔗 糖纯化的HRV14-iCe(17AA ；参见表4的注脚(4))、1. 3xl07pfu的亲本HRV14，或作为阴性对照的模拟物(PBS)，通过腹膜内给予初免9周龄雌性Balb/c小鼠(8只小鼠/组)，然后在第 21天加强免疫。作为对照，使用了携带3个Mk拷贝的重组乙肝病毒核心颗粒(本文亦称 为HBc-3XiCe VLP)。后者单独或与HRV14-M&或HRV14联合用于初免/加强免疫(表4)。 为了验证保护作用，第35天用4 LD5tl的流感A/PR/8/34(HlNl)病毒攻击所有的小鼠。监测 发病率和死亡率21天。为了检测针对所携带肽的血清抗体，接种前(基线)和第33天分 别对小鼠取血。通过在涂覆有合成的Mk肽的微量滴定板中进行规定的ELISA，测定血清中 M2e特异性抗体的效价。测定了 Mk特异性总IgG、Ig2a和Ig2b的效价。2.结果a.免疫原性i.在已免疫接种的动物中的总IgG用合并的血清样本(图6)以及单独的动物样本(图7)测量了各组中M2e特异性 抗体的效价。合并样本的结果(图6)显示，用携带17个氨基酸的Mk序列的重组HRV14 初免并用乙肝病毒核心-Mk重组病毒样颗粒(VLP)加强免疫，与用2剂乙肝病毒核心-Mk VLPdOyg/剂)引发的抗体水平相同(终点效价(ET) = 218,700)。用HRV14-M& (17AA) (第4组；ET = 218，700)与用HRV14载体(第6组；ET = 2，700)初免相比，用乙肝病毒核 心-Mk VLP加强接种引发的Mk特异性应答高约100倍。因此，HRV14-M&的初免作用仅 依赖于Mk插入物而不依赖于载体。基于Arnold等US 2006/0088549 Al的假设，109pfu HRV14的免疫接种剂量约相 当于IOyg蛋白。我们粗略地估计，1免疫剂量的重组HRV-Mk病毒代表IOng蛋白。考虑 到分子量的差异性和重组乙肝病毒核心颗粒中亚基的多样性，我们推测1免疫接种剂量的 HBc-M2e所含的M2e蛋白为HRV-iCe的大约10，000倍。用HRV载体的相当的抗体水平可能 支持用较低廉的生产方法的更具免疫原性的呈递系统。]\Ce抗体水平与HRV14H\Ce(17AA)的剂量数成反比。实际上，3剂HRV14H\Ce (17AA) 病毒(第1组)引起了最低的Mk特异性应答(ET = 2. 700)，而2剂方案引起10倍的更 高的应答(第2组；ET = 24，300)，并且1剂方案引起的应答为2剂的3倍(第5组；ET = 72，900)。为验证该关系是否由抗-载体免疫引起，我们独立地检测了对HRV14载体的所有 组的免疫应答(图7)。所有3种类型的HRV14-M&(17AA)给药(1、2或3剂)均显示相当 的HRV14-特异性应答水平(ET = 72，900)(图7A)。这说明抗-载体免疫不是引起对Mk 免疫应答降低的原因，并说明1剂的给药可为足够的。对单独血清样本的M2e特异性ELISA分析(图8)检测到与用合并的样本所示相 同的组内差异如在两个血清稀释度(1 300和1 2，700)所示，第4组和第7组的各小 鼠中的平均抗体水平显著高于所研究的任何其它组。ii.在已免疫接种的动物中抗体的IgG2a、IgG2b和IgGl亚型已证明Mk接种小鼠中的显性M2特异性抗体同种型是IgG2b，还有一些 IgG2a(Jegerlehner 等，J. Immunol. 172(9) :5598-5605,2004) 已证明这两种同种型是小 鼠中抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)最重要的介导物(Denkers等，J. Immunol. 135 :2183， 1985)，据认为这也是Mk依赖性保护的主要机制。在本研究中，我们检测了合并组和单独 的血清样本中的IgGl、IgG2a和IgG2b同种型效价。在所有组中，第4组(HRV14-iCe(17AA)初免/乙肝病毒核心-MkVLP加强免疫)和第7组(乙肝病毒核心-Mk VLP初免和加强免疫)显示最高效价的IgGl、IgG2a抗体 (图9)。第7组的IgGl效价显著高于第4组(图9A和9D)，而IgGh效价在第4组中较高 (图9B和9D)，而第7组动物的IgG2b效价高于第4组(图10)。图11显示了已免疫接种 小鼠中的IgGh同种型的M2e特异性抗体。b.发病率和死亡率用PR8毒株攻击之后，监测小鼠的发病率和死亡率观天。如图12所示，与本研究 中所有其它组别相比，第4组显示出最高的存活率(80%)，而第7组与阴性对照(PBS)没有 显著差别。第4组的发病率也为最低体重变化比所有其它组别显著地较不剧烈(图13A、 B)。因此，HRV14-iCe(17AA)病毒在小鼠中具有高度免疫原性和保护性。这与传统 重组蛋白方案和初免-加强免疫方案中两者的组合相当。后者与单独的重组蛋白相比 显示明显不同的免疫应答2剂重组乙肝病毒核心-Mk VLP引发显性IgGl抗体亚型，而 用HRV14-iCe(17AA)初免并用乙肝病毒核心VLP加强免疫产生作为显性同种型的 IgG2a,已证明其对ADCC为重要的。此外，后一组别与所有其它各组相比都显示出最高的保 护作用。重要的是，注意到因为HRV不在小鼠中复制，在该模型中接种HRV-Mk重组体是和 合适的肠胃外佐剂联合进行的，并模拟了用灭活疫苗免疫接种。在人中可使用两种选择活 的重组HRV14-M&病毒疫苗和/或与经批准的肠胃外佐剂例如氢氧化铝(也见上文)共同 给予的灭活疫苗(例如福尔马林灭活)。B.体内试验#2.鼻内免疫接种1.用于免疫接种的病毒该体内研究中，用鼻内给药途径，评估单一插入变体HRV14-M& (17AA)、 HRVH-HA0 (19AA)或其混合物以及双重插入构建体HRV14_iCe (16AA) -HA0 (12AA)提供 抗A型流感病毒株PR8的致死攻击的保护的潜能。HRV14-iCe(17AA)序列如上所述。 HRV14-HA0(19AA)在 NimII 中含有插入物 NVPEKQTQGIFGAIAGFIE (SEQ ID N0:44)，其在 VP2 的159和160位氨基酸(NimII位点)之间插入。该插入物与A型流感病毒的HAtl序列相 同，但有一个突变氨基酸(置换R8Q)。后一构建体没有侧翼接头(图2C)。第三个构建体 在修饰的 NimII 位点中携带 SLLTEVETPIRNEWGSERGIFGAIAGFIE(SEO ID NO :39)插入序列。 后一插入序列由Mk序列的16个氨基酸(下划线)和A型流感/H3的H/^序列的12个氨 基酸(粗体)组成。这两个序列被1个氨基酸接头(E)分开。该第三构建体的插入位点 (NimII)经过修饰VP2的160-162位的3个氨基酸被脯氨酸取代(图2C)。显示病毒生长 可与HRV14相当，经过9次连续传代稳定保留插入物。2.试验设计本动物实验的目的是检查鼻内给予1剂量的重组鼻病毒嵌合体(含或不含佐剂) 是否引发可与2剂量HBC-3XM& VLP相比拟的针对A型流感/PR/8/34 (HlNl)株致死攻击 的保护性免疫应答。实验设计示于表5中。简言之，第0天，用HBc-Mk VLP(第1和第2组)、 HRV14-M2e (17AA)(第 3 禾P 第 4 组)、HRV14 (第 5 组)、HRVH-HA0 (19AA)(第 6 组)、与 HRV14-M2e (17AA)混合的 HRVH-HA0 (19AA)(第 7 禾Π 第 8 组)或 PBS 对照(第 9 组)或HRV14-M2e (16AA) -HA0 (12AA)，通过鼻内给药免疫接种9周龄雌性Balb/c小鼠(10只小鼠/ 组)。第1、3、5、6、7和13组给予5yg的大肠杆菌的不耐热毒素(LT)佐剂，而第2、4和8 组不给予佐剂(表幻。给予体积为50 μ 1。在第21天通过鼻内给予50 μ 1给药体积中的 10 μ g HBc-3XM2e及LT佐剂加强免疫第1和2组。为了验证另一佐剂(几丁质)，经由鼻内途径用50 μ 1给药体积中的与25μ g的 几丁质混合的 HBc-M2e VLP (第 10 组)、HRV14_M2e (17AA)(第 11 组)或 HRV14 (第 12 组) 免疫接种小鼠。在第21天通过鼻内给予50 μ 1给药体积中的10 μ gHBc-3XM2e及同样佐剂 加强免疫第10组。为了证明保护作用，第35天用4 LD5tl的流感A/PR/8/;34(HlNl)病毒攻击所有小鼠。 监测发病率和死亡率21天。为了检测针对所携带肽的血清抗体，接种前(基线)和第33天 分别对小鼠取血。通过在涂覆有合成的M2e和HAtl肽的微量滴定板中进行规定的ELISA，测 定血清中Mk和HAtl特异性抗体的效价。测定了 Mk特异性总IgG、Ig2a和Ig2b的效价。3.结果a.免疫原性i. ICe和HAtl特异性抗体的效价用合并的血清样本测量各组的抗体Mk效价(图14A-D)。1剂携带17个氨基酸 的Mk肽的重组HRV14引发的总IgG水平与2剂乙肝病毒核心-Mk重组VLP所引发的相 当(10 μ g/剂)(终点效价(ET)对于HBc-M2e和1剂HRV14_M2e (17AA)分别为218，700和 72，900 ；(图14A))。在基于HBc和HRV的疫苗提供的保护作用中佐剂(LT)起着显著作用 在没有LT的组中的免疫应答平均为LT组的1/10。几丁质佐剂组显示为M2e应答的小于 1/100-1/1000。HRV14-M2e病毒量减少至1/2 (第7组)使得总IgG效价降为1/3 (第7组; ET = 24，300 对比组 3 的 72，900)。1 剂量 HRV14H\Ce 产生第二高水平的 IgG2a(图 14C ；ET = 72，900 对比 HBcH\Ce 的 218. 700)。2剂量的乙肝病毒核心-M2e VLP表现出最高IgG2b(图14B)和IgGl (图14D) 效价。用单独的血清样品测量了 6、7和13组的抗体HAtl效价(图14E)。各组的终点 效价的几何平均值总计如下第6组(含LT的HRVH-HAtl(IgAA))为4750 ；第7组(含 LT 的 HRV14-HA。(19AA)与 HRV14_M2e (17AA)的混合物)为 1440 ；和第 13 组(含 LT 的 HRV14-M2e (16AA) -HA0 (12AA))为9200。第13组中的最高HAtl应答可解释为存在A/H3的野 生型HAtl序列，而第6和7组中的重组嵌合体携带HAc^J割位点(R8Q)的突变型。先前已证 明HAtl的第8位的精氨酸残基对于保护作用至关重要，还证明其为保护性单克隆抗体的三 个结合位点之一 (Bianchi 等，J. Virol. 79 =7380-7388, 2005)。第 7 和 13 组 M2e 合并样品 的效价示于图14E中的方框区，以突出第13组的Mk应答为低的(ET = 2700 ；与第5组的 ET = 7，200 比较；HRV14-M2e 不含佐剂)，这表明 HRV14-M2e (16AA) -HA0 (12AA)嵌合体中的 Mk表位为非免疫原性的(很可能是由于其不能很好地暴露于病毒表面)。因此，应该将该 变体的高免疫原性/保护作用(参见以下)归因于HAtl而不是Mk表位。b.发病率和死亡率用PR8毒株致死性攻击之后监测小鼠的发病率21天(图15B)。1剂HRV14-M& (第 3组)或！！欣^^加丨化々々)-·^^々々)(第13组)提供的针对疾病的保护作用与2剂HBc-MkVLP(第1组)所提供的相当。这些组的所有小鼠幸存于致死攻击(图15A)。考虑到这两 组间的免疫原性差异(参见上文)，强有力地表明这两组中的保护作用由不同的表位提供 第 3 组(HRV14-M2e)是由 ICe 提供，而第 13 组(HRV1(16AA)-HAtl (12AA))是由 HA。提{共。1剂量携带突变的HAtl切割位点的HRV14(第6组)表现出高发病率，与HRV14对 照第5组中存活2只小鼠相似。这与较低的(75%)存活率相关。1剂量HRV14-iCe(17AA) 和HRVH-HAtl (19AA)病毒混合物(第7组)显示的发病率比HRV14_iCe (17AA)组的稍高一 些，这与免疫剂量中的病毒量减半相关联(图15B)。然而，第7组的所有小鼠100%受到针 对致死流感攻击的保护作用。后者的保护作用应该归因于M2e而不是HAtl表位，因为如上 所述，2剂量HRV14-HAq(19AA)(第6组)产生75%的存活率。佐剂在保护中起着显著作用“无佐剂”组中的所有小鼠都在攻击后第9-10天死 亡(图15A)。LT提供比几丁质更好的保护HRV14-M&(17AA) +几丁质(第11组)中的所 有小鼠死亡，而2剂量的HRV-3XM&VLP+几丁质(第10组)产生80%的保护(图15A)。因此，我们证明，1剂量携带HAtl或Mk通用保护性表位的HRV14重组嵌合体当经 由鼻内途径给予时提供了针对致死的A型流感攻击的100%保护作用。这种保护作用与经 由同样途径给予2剂量的HBC-3XM& VLP提供的保护作用相当。IV.流感小鼠攻击模型可用合适的病毒株在小鼠流感攻击模型中检测疫苗候选物的保护功效。本文所述 研究中所用的原型流感攻击毒株是适合于小鼠的毒株A/PR/8/34(HlNl)。该病毒获自美国 典型培养物保藏中心(目录号VR-1469，批号2013488)，并通过在Balb/c小鼠中连续传代 适应体内生长。为了小鼠传代，鼻内接种病毒，3天后制备肺组织勻浆。该勻浆在其它小鼠 中被盲传至5代。然后另外传代用于制备肺勻浆等分试样，用作攻击储液。为了攻击小鼠，鼻内递送50μ L体积病毒。接种时麻醉小鼠以抑制咽反射，使病毒 的传至肺中。用致死剂量病毒感染的小鼠体重快速减轻，大多数在接种后7-9天死亡。适 应小鼠的A/PR/8/34病毒的中值致死剂量(LD5tl)在成年Balb/c小鼠中测定为7. 5噬斑形 成单位(pfu)。图16显示了典型的保护实验的结果。10小鼠组别用氢氧化铝佐剂假免疫 接种(sham-immunized)或用混合有氢氧化铝的10 μ g流感Mk肽免疫原免疫接种。所述 免疫原由表达Mk肽的乙肝病毒核心蛋白VLP组成。以3周间隔免疫接种小鼠两次，4周后 用4 LD5tl适应小鼠的A/PR/8/34病毒鼻内攻击。攻击后第10天假免疫接种组所有小鼠均 死亡，而免疫组只有1只小鼠死亡。两组中攻击后均出现体重减轻，但假免疫接种组中体重 减轻更多。可类似地使其它流感病毒株适应于在小鼠肺中生长。在某些情况下，病毒株可不 经过体内适应即可使用，或者即使经过肺内连续传代也不具有足够的致病性。这种情况下， 我们不测量发病率和死亡率，而是测量病毒在肺和鼻甲组织中的复制。攻击后3天收获组 织，在Iml组织培养基中超声波破碎，用噬斑试验或TCID5tl测定滴定病毒的浓度。除了上述攻击模型外，本发明还包括使用动物模型系统，例如由Bartlett等， Nature Medicine 14(2) 199-204，2008所述的动物模型系统。在一个实施例中，本发明可 采用小鼠(例如BALB/c小鼠)表达小鼠-人细胞间粘附分子-1 (ICAM-I)嵌合体，所述嵌 合体可根据Bartlett所述的方法产生。如本领域已知，ICAM-I是90%的人鼻病毒的细胞受体，人鼻病毒不结合小鼠ICAM-I。如Bartlett所教导，在转基因小鼠中，人鼻病毒结合嵌 合体，所述嵌合体包含人ICAM-I的鼻病毒结合的胞外域1和2。这提供了用于研究活鼻病 毒载体(例如本文所述载体)的有用系统。因此，本发明包括在这种小鼠模型中筛选并检 测疫苗候选物。表1.可从其中获得表位/抗原/肽的病原体实例的列表
权利要求
1.一种包含流感病毒HAtl抗原的鼻病毒载体。
2.权利要求1的鼻病毒载体，其中所述鼻病毒载体对人无致病性。
3.权利要求2的鼻病毒载体，其中所述鼻病毒载体是人鼻病毒14(HRV14)。
4.权利要求1-3任一项中的鼻病毒载体，其中所述鼻病毒载体还包含M2e肽。
5.权利要求1-4任一项中的鼻病毒载体，其中将所述流感病毒HAtl抗原在选自以 下的中和免疫原位点或在这些位点的不止一处插入中和免疫原I(Niml)、中和免疫原 II (NimII)、中和免疫原III(NimIII)和中和免疫原IV(NimIV)。
6.权利要求5的鼻病毒载体，其中将所述流感病毒!1^抗原插入到中和免疫原 II(NimII)位点。
7.权利要求6的鼻病毒载体，其中将所述流感病毒HAtl抗原插入到MmII的第158位 和第160位氨基酸之间。
8.权利要求1-7任一项中的鼻病毒载体，其中所述流感病毒HAtl抗原在一端或两端上 侧接接头序列。
9.权利要求1-8任一项中的鼻病毒载体，其中所述鼻病毒载体是活的。
10.权利要求1-8任一项中的鼻病毒载体，其中所述鼻病毒载体是灭活的。
11.一种含有权利要求1-10中任一项的鼻病毒载体和药学上可接受的载体或稀释剂 的药物组合物。
12.权利要求11的药物组合物，其还包含佐剂。
13.权利要求11或12的药物组合物，其还包含一种或多种其它活性成分。
14.权利要求11-13中任一项的药物组合物，其还包含与Mk和/或HAtl序列融合的乙 肝病毒核心蛋白。
15.权利要求11-14中任一项的药物组合物，其包含含有HAcJi的鼻病毒载体和含有 Mk肽的鼻病毒载体。
16.一种在受试者中诱导对流感病毒的免疫应答的方法，所述方法包括给予所述受试 者权利要求11-15中任一项的药物组合物。
17.权利要求16的方法，其中所述受试者未患有流感病毒感染但具有患流感病毒感染 的风险。
18.权利要求16的方法，其中所述受试者患有流感病毒感染。
19.权利要求16-18中任一项的方法，其中将所述组合物鼻内给予所述受试者。
20.权利要求16-19中任一项的方法，其中所述受试者是人。
21.一种制备药物组合物的方法，所述方法包括使权利要求1-10中任一项的鼻病毒载 体和药学上可接受的载体或稀释剂混合。
22.—种编码或对应于权利要求1-10中任一项的鼻病毒载体的基因组的核酸分子。
23.—种包含插入的流感病毒HAtl抗原的NimII肽。
24.一种产生包含流感病毒HAtl抗原的鼻病毒载体的方法，所述方法包括以下步骤(i)产生基于感染性cDNA克隆的重组鼻病毒载体文库，所述感染性cDNA克隆包含插入的流感病毒HAtl抗原序列，和( )从所述文库中选择重组病毒，所述重组病毒(a)在传代时保留插入序列，并且 (b)被针对所述插入序列的抗体中和。
25.权利要求M的方法，其中所述鼻病毒载体是人鼻病毒14(HRV14)。
26.权利要求M或25的方法，其中所述插入的流感抗原序列在选自NimI、NimII、 NimIII和NimIV的位置插入。
27.权利要求对-26中任一项的方法，所述方法还包括插入流感病毒Mk序列。
28.权利要求对-27中任一项的方法，其中所述插入的流感病毒HAtl抗原序列在一端或 两端上侧接随机接头序列。
29.一种培养包含流感病毒HAtl抗原的鼻病毒载体的方法，所述方法包括在HeLa或 MRC-5细胞中传代所述载体。
30.一种如本文所述的包含如本文所述的免疫原的鼻病毒载体。
全文摘要
本发明提供鼻病毒载体、相应的组合物及方法，所述鼻病毒载体可用于递送免疫原，例如流感病毒免疫原。
文档编号A61K39/125GK102089003SQ200980120179
公开日2011年6月8日 申请日期2009年3月27日 优先权日2008年3月27日
发明者H·克利恩索斯, K·卡尔宁, M·吉尔-莫罗尼, Y·颜 申请人:赛诺菲巴斯德生物制剂公司