持续药物递送系统的制作方法

专利名称：持续药物递送系统的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及治疗剂且特别涉及用于延长药物的体内效力的药物递送方法，且更具体地涉及对眼后部的药物递送。相关技术的描述眼后部的疾病，比如年龄相关性黄斑变性(AMD)和糖尿病视网膜病变，正在随着人口老年化影响着越来越多的人。为了这些退行性眼部疾病的有效疗法，需要将治疗剂以足够的浓度递送到眼后部，具体地为视网膜。滴剂的局部递送是将治疗剂施用到眼的最常见的方式，但仅有应用剂量的极小百分比到达眼内组织。由于血-视网膜屏障，全身施用需要大剂量以在眼中达到治疗水平且因此可导致不可接受的副作用。直接注射到眼球中的玻璃体液中是有吸引力的，因为从该部位到达视网膜的屏障是最小的。然而，眼球的穿透可伴随包括感染和视网膜剥离的严重威胁视力的不良事件。由于脉络膜中的血流对治疗剂的清除和视网膜色素上皮细胞对亲水性化合物的严密屏障，眼球外部(例如，结膜下的)的注射不能有效地到达靶组织。一些纳米颗粒和脂质体形式的治疗剂可通过玻璃体内注射而被导入。然而，它们往往通过散射进入眼的光而使视觉模糊。将治疗化合物递送到眼的另外的方法是植入物的应用。例如，两种非可生物降解的眼植入物目前在市场上出售，分别递送更昔洛韦(ganciclovir)和氟轻松 (fluocinolone acetonide)以治疗巨细胞病毒性视网膜炎和葡萄膜炎。这些可实现持续多年的小分子至玻璃体的稳定递送。然而，该方法涉及与植入和移除这些装置的侵入性外科手术有关的风险。作为非可生物降解植入物的改进，需要更少侵入性的步骤、甚至可能无缝合的植入的可生物降解植入物正处于临床研究。将需要提供延长药物对靶组织的可获得性且不具有与频繁用药或视力干扰有关的局限的药物递送系统。最近，诸如AMD的眼病的治疗已通过两个发展而发生巨大变化(1)认识到血管内皮生长因子(VEGF)是疾病中的病原因子，和(2)用于AMD治疗的通过玻璃体内注射而施用的抗VEGF抗体片段，Genentech的雷珠单抗(Ranibizumab) (LUCENTIS )的批准。并且，针对VEGF的全长抗体，比如Genentech的贝伐单抗(Bevacizumab) (AVASTIN ，下文也称作阿瓦斯丁(Avastin))经常标示外使用(off-label)注射入玻璃体中来治疗眼后部疾病。这些新型的治疗选择具有巨大的影响，因为它们是首次在许多患者中改善视力的AMD治疗， 而先前的治疗仅延迟了视力减退。雷珠单抗和贝伐单抗通过与VEGF结合并使其失活而发挥作用。效果的持续时间决定于药物半衰期；通常，较长的半衰期提供较长的持续时间且， 因此，较小频率用药。
由于难于在眼组织中取样，临床药物代谢动力学数据一般局限于血清。在猴中已大量研究雷珠单抗从眼中的消除(Gaudreault等人，Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46 726-733,2005)。雷珠单抗以大约3天的终末半衰期从包括玻璃体和视网膜的所有眼区室中一致清除。玻璃体内注射后的血清半衰期是相似的，(大约3.5天)，而静脉注射后的半衰期为大约0.5天。这表明玻璃体内注射后的血清浓度受从眼的消除速率控制。Lucentis的包装说明书称“…每月500毫克玻璃体内注射雷珠单抗达到优于较不频繁用药的结果”。然而，由于以上指明的玻璃体内注射的附带风险，广泛认可的是，医师将偏爱较不频繁用药， 并且患者将从中受益。此外，虽然使用阳离子复合物的持续的药物递送的方法是有前景的，(例如，参见 Singh 等人，J. Cont. Rel.，32 17-25，1994 ；Singh 等人，J. Cont. Rel.，35 165-179，1995)， 但尚未将其用于身体的局部区域的治疗，比如眼的治疗。例如，Lingnau等人的美国专利第 7，244, 438号公开了用于全身施用的药物制剂，其中阳离子氨基酸与治疗剂物理组合。这种物理组合将不如化学组合的药物组合物适宜用于持续的药物递送。此外，Lingnau等人所公开的阳离子部分的电荷密度将展示不期望的高抗原性，以及不期望的高毒性。此外，诸如聚乙烯亚胺和聚赖氨酸的聚阳离子通常传统地用于非病毒基因递送系统以保护核苷酸治疗剂(例如，DNA和siRNA)不被降解并协助摄入到细胞中。聚阳离子聚合物或脂质和聚阴离子核酸之间的静电复合导致了被称为聚合复合物(polyplex)或脂质复合物(lipoplex)的复合物的形成。聚集的核酸是紧密的且被保护而不受核酸酶的消化。复合物通常从溶液中沉淀，并且当用过量的聚阳离子配制时，能够导致在表面上具有正电荷的小颗粒，该正电荷使颗粒稳定并促进通过胞吞作用摄入到细胞中。其他人已联合了另外的方法是将肽与蛋白质连接以实现靶向递送。例如，已将十-天冬氨酸骨靶向肽与融合蛋白相连接以将缺少的酶直接再引入至患病的骨组织(Enobia Pharma, Montreal, Canada) 0 尚未表明将带电荷的部分形成用于持续的药物应用的原位贮库的用途用于诸如眼的生物组织。并且，蛋白质和肽的受控释放系统的发展涉及另外的蛋白稳定性困难。在制造、架上贮存的压力过程中或在使用过程中由于聚集和变性可能发生完整性和活性的丢失。一般添加赋形剂来解决这些问题，通常导致具有有限的药物载量的制剂。因此，需要在不添加赋形剂下稳定且还具有高药物载量的制剂。基于以上，提供用于眼的治疗的改良的或替代的递送方法和/或药物制剂将是有益的。这样的制剂理想地将以在延长的时段中提供治疗化合物的稳定递送的方式来提高诸如雷珠单抗的治疗化合物的效益。这样的制剂将利用使抗原性或毒性最小化的用于持续递送的阳离子部分。将需要药物与阳离子部分化学组合以增加稳定性，并且同时与现有技术相比具有较少的毒性和抗原性。这样的药物组合物将易于递送且与用于眼治疗的目前的治疗化合物相比需要更少的剂量。参考文献美国专利文件Lingnau等人的美国专利第7，244, 438号其它出版物Chirila Τ. V.禾口 Y. Hong, The Vitreous Humor, in Handbook of Biomaterial
5Properties (玻璃体液，在生物材料性质手册中)，编辑J. Black和G. Hastings，1998， Chapman & Hall，第 125-131 页.Doronina, S. 0.等人· Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy(用于癌症治疗的强效单克隆抗体阿瑞斯他丁轭合物的开发).Nature Biotechnol. 21 :778-782(2003).Ellman G. L. A colorimteric method for determining low concentrations of mercaptans (用于测定低浓度硫醇的比色方法).Arch Biochem Biophys 74 443-450(1958).Gaudreault J.等人.Preclinical pharmacokinetics of Ranibizumab(rhuFabV2)after a single intravitreal administration(单次玻璃体内施用后雷珠单抗(rhuFabV2)的临床前药物代谢动力学)，Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46 726-733(2005).Rosenfeld P. J. Intravitreal Avastin :The low cost alternative to Lucentis ？(玻璃体内阿瓦斯丁 Lucentis的低成本替代物 ), Am. J. Ophth. 142(1) 141-143(2006).Singh M. P.等人· Mathematical modeling of drug release from hydrogel matrices via a diffusion coupled with desorption mechanism(药物通过扩散伴随脱附机制从水凝胶基质释放的数学建模)，J. Cont. Rel, 32,17-25 (1994).Singh M. P.等 Jk . Effect of electrostatic interactions on polylysine release rates from collagen matrices and comparison with model predictions (静电相互作用对聚赖氨酸从胶原基质的释放速率的影响以及与模型预测的比较)，J. Cont. Rel, 35 :165-179(1995).发明_既述本发明公开了包含化学偶联于治疗化合物的带电荷部分的药物组合物，其中带电荷部分被设定与生物组织中具有相反电荷的成分的至少一种类型可逆地相互作用而产生用于延长的药物递送的原位贮库。带电荷部分可以是含有一个或多个电荷的任何化合物， 比如肽、氨基酸组合或类似化合物。该药物组合物可被设定通过注射导入，并可含有靶向含有透明质酸的生物组织(比如眼)的阳离子部分。治疗化合物可以是生物学的，比如抗 VEGF化合物。这样的化合物的例子为雷珠单抗、贝伐单抗、VEGF Trap等。还公开了用于制造药物组合物的方法。该方法包括将带电荷的部分化学偶联于治疗化合物，其中带电荷部分被设定与人体中具有相反电荷的成分的至少一种类型相互作用来产生用于延长的药物递送的原位贮库。带电荷部分包括氨基酸残基，且治疗化合物可以是抗VEGF化合物，比如雷珠单抗、贝伐单抗或VEGF Trap0偶联是由化学方法或遗传方法实现的共价键。还公开了治疗人类的方法。该方法包括将含有化学偶联于治疗化合物的带电荷部分的药物组合物导入到人体中，其中带电荷部分被设定与人体中具有相反电荷的成分的至少一种类型相互作用以产生用于延长的药物递送的原位贮库。导入可通过将药物组合物注射入人体的任何部分来实现。还可将药物导入到人体的任何部分，比如眼、关节中的滑液、 脑、皮肤、骨、软骨或癌性区域。
在本发明的另一方面，利用重组DNA技术来制造治疗剂，其中治疗剂是以含有治疗活性区域和带电荷肽区域的融合蛋白形式。治疗区域和带电荷区域的组合对生物组织提供了药物的持续的递送。本发明的其它方面包括与以上所描述的装置和系统相对应的方法。附图简述本发明具有其它优势和特征，其将从参照附图的以下本发明的详细描述和随附的权利要求书中更加明显，其中图la-c显示了依照本发明的两个实施方案的药物组合物的形成。图2显示了药物组合物与身体成分的体内相互作用。图3显示了依照本发明的一个实施方案的示例性结构单元(building block)。图4显示了对于含有500 μ g/mL透明质酸的溶液，作为总聚赖氨酸浓度的函数的结合的和游离的22kDa聚赖氨酸的浓度。图5显示了对于含有250 μ g/mL透明质酸的溶液，作为总聚赖氨酸浓度的函数的结合的和游离的22kDa聚赖氨酸的浓度。图6显示了如实施例2和实施例3中所描述的22kDa聚赖氨酸的溶液中，结合的聚赖氨酸与透明质酸的毫克比例。图7显示了对于含有500 μ g/mL透明质酸的溶液，作为总聚赖氨酸浓度的函数的结合的和游离的3kDa聚赖氨酸的浓度。图8展示了对于实施例2、实施例3和实施例4中所描述的3kDa聚赖氨酸和22kDa 聚赖氨酸的溶液，结合的聚赖氨酸与透明质酸的毫克比例。图9展示了肽-阿瓦斯丁轭合物与非轭合的阿瓦斯丁的累积递送。

图10显示了四个示例性肽-阿瓦斯丁轭合物与非轭合的阿瓦斯丁的递送速率。图11展示了在肽-阿瓦斯丁轭合物和非轭合的阿瓦斯丁的运输研究过程中，作为时间的函数的供体中的残留分数。详述虽然详细描述含有许多细节，这些不应被解释为是限制本发明的范围，而仅是示出本发明的不同实施例和方面。应理解的是，本发明的范围包括以上未详细讨论的其它实施方案。可在本文所公开的本发明的产物和方法的排列、操作和细节作出对于本领域技术人员明显的多种其它修饰、改变和变化，而不背离本文所描述的本发明的精神和范围。本发明是将治疗化合物递送到眼后部的持续递送剂型。具体地，本发明公开了通过将保留部分与现有的治疗化合物共价连接或通过从头生成一种含有带电荷部分的新型治疗化合物来形成的药物组合物。保留部分的存在降低了药物从靶标组织清除的速率，提供了持续的药物递送。如图la-c，药物组合物DC通过以降低已知的治疗化合物从靶组织到血液循环的清除速率的方式修饰该药物而形成。示例性的治疗化合物是雷珠单抗。当雷珠单抗用作示例性的化合物时，任何能够从提高的半衰期受益且适于使用本文所描述的方法来配制的治疗化合物可从本发明中受益。具体地，如图Ia中所示，将一个或多个保留部分100与治疗化合物200偶联以形成图Ib和图Ic中所见的药物组合物DC。保留部分通常为阳离子。然而，保留部分可以是阴离子且与生物组织中阳离子成分的至少一种类型可逆地结合。在优选的实施方案中，保留部分是阳离子部分。阳离子部分通常包括由至少一种阳离子结构单元形成的一个或多个电荷且被设定与眼组织的成分可逆地结合以形成原位贮库，所述眼组织比如玻璃体液和视网膜。当然，具有适于可逆地结合治疗组合物的除眼组织外的组织将是适合的递送靶标。可逆结合减慢了药物组合物从玻璃体到视网膜以及随后到体循环的质量运输，导致了治疗化合物的提高的半衰期。治疗化合物从贮库的再补充延长治疗的效力至较长的持续时间，因此，降低了玻璃体内注射的频率和与其相关的威胁视力的不良事件和不适感。作为修饰已知的治疗化合物的替代方式，治疗化合物可从头制备，其包括与生物组织的带电荷成分可逆地结合的部分。无论是修饰现有的治疗化合物，或是利用重组DNA 或其它技术设计新型治疗化合物，本发明提出了与避免非特异结合的设计蛋白的常规实践相反的实践；所述常规实践即，鉴定常规蛋白药物且对其开发以获得与受体的特异性结合。 本发明通过修饰治疗化合物以提高非特异结合而利用了治疗剂与生物组织的非特异结合。本发明的药物组合物，无论是化学修饰的或利用重组技术表达的，具有结合生物组织的能力。可通过使用治疗量的药物利用切除的组织进行结合实验来评估结合。换言之， 利用导入到与在体内天然发生的大小相等的组织或组织成分中(例如，4.5mL人玻璃体液中透明质酸的量)的治疗剂量来评估结合。可选地，用于评估目的的剂量的多少以及组织或组织成分的大小可成比例地减少。在存在或不存在膜时平衡和离心以分离大分子成分之后，可测量上清液中游离化合物的浓度。还可通过诸如自旋标记和电子自旋共振(ESR)光谱的其它技术或使用平衡透析来评估结合。高离子强度(如，1.5M NaCl)下测量的重复将释放静电结合化合物并提供化合物总浓度的测量。可选地，化合物的总浓度从制备流程中是已知的。然后从先前所描述的测量中计算结合分数；即，(总的-游离的)/总的。理想地，非特异结合的优选的量(即，当使用治疗量的药物时的结合分数)为至少15%，更优选地，非特异结合的量为至少25 %。示例性地通过玻璃体内注射，药物组合物被导入到诸如眼的身体区室中。玻璃体液(VH)含有若干玻璃体成分，比如胶原、糖胺聚糖和非胶原结构蛋白。这些玻璃体成分中的许多成分是带负电荷的(阴离子)。如图2中所示，一旦被注射到眼中，阳离子(艮口， 带正电荷的)药物组合物通过与诸如糖胺聚糖(例如，乙酰透明质酸，也称作透明质酸，硫酸软骨素和硫酸乙酰肝素)的阴离子(即，带负电荷的)玻璃体成分的静电相互作用与玻璃体结合。此外，其它眼组织，比如内界膜和外界膜和神经视网膜中的光感受器间基质 (interphotoreceptor matrix)，富含糖胺聚糖且也将会与本发明中所描述的药物组合物发生静电相互作用。因此，在本发明中，玻璃体作为原位贮库行使作用。与同等剂量的不含阳离子部分的治疗化合物(例如，雷珠单抗)相比，由于玻璃体消除速率的降低，玻璃体内的药物浓度减少的更慢。如图2中所示出的，没有阳离子部分时，起始注射(A)的药物相对快地消除(B)。含有阳离子部分时，起始注射(C)的药物在较长的持续时间后仍处于治疗浓度(D)。这是由于治疗化合物的至少某部分通过阳离子部分与玻璃体成分可逆地结合的事实所造成的。此外，由于药物组合物与玻璃体成分结合，治疗化合物在玻璃体内更加浓缩。 因此眼的其它部分(例如，视网膜)中的治疗化合物的浓度低于玻璃体内的浓度。诸如视网膜的区域中的浓度与玻璃体内的游离药物而非总药物的浓度更密切相关。预期这将相对于没有阳离子部分的治疗化合物降低视网膜中治疗化合物的最大浓度。因此，由于结合的药物组合物再补充了进入到体循环中的游离药物组合物，该药物制剂在视网膜中提供了治疗化合物的持续的浓度。按这种方式，当治疗化合物是雷珠单抗时，本文所公开的持续的药物递送制剂在与未修饰的雷珠单抗的递送相比延长的时间中在AMD位点使VEGF失活，因此提供了最少化玻璃体内注射的所需益处。 接下来讨论制造方法，通过将至少一种阳离子部分，例如，带正电荷的(阳离子的)氨基酸的“尾”序列(在下文中也称为尾)，添加至诸如雷珠单抗的治疗化合物而形成药物组合物。治疗化合物示例性地为含有H链和L链的免疫球蛋白Fab (免疫球蛋白结合抗原的部分)片段，具有连接到H链的端部的单独的肽(图lb)或通过两个还原的半胱氨酸部分连接的两个肽(图Ic)。将阳离子部分与片段组合的过程是通过化学方法(例如，通过分别通过羟基琥珀酰亚胺偶联或马来酰亚胺偶联与片段的α-氨基部分或还原的半胱氨酸反应而将肽添加到雷珠单抗；分别参见图Ib和Ic)或通过遗传方法(例如，构建其中肽与Fab H链序列的C末端相融合的融合蛋白；参见图lb)来实现。
在化学方法的情况下，将肽沿H链和L链化学连接到位点。合成肽可被连接到治疗蛋白的不同位点上。除N末端和C末端外，可通过可及的赖氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸和天冬氨酸、其它潜在反应性氨基酸以及寡糖的氧化的碳水化合物部分的侧链来连接。肽与蛋白的轭合是在与肽分开合成然后组合的蛋白上进行的。在这种情况下，肽可通过连接至侧链，或通过分支合成的肽的使用而在治疗蛋白的氨基酸序列中形成分支点。可选地，可将肽位点特异性地添加至治疗蛋白的天然二硫键(胱氨酸，或还原后的半胱氨酸)。此外， 由于Fab分子中的二硫键的数目是有限的且反应显示是有效率的，可使用按化学计量的添加。除Fab分子外，可利用相似的方法通过肽“尾”的添加而对全长的单克隆抗体进行修饰。通过本领域熟知的任何适宜方法将尾共价连接至治疗化合物。治疗蛋白上优选的连接位点是氨基基团和巯基基团。通常，治疗化合物上的氨基基团(H链或L链的N末端 α-氨基基团或赖氨酸的氨基基团)与尾的羧基末端通过诸如N-羟基琥珀酰亚胺的基团组合以形成酰胺键。可选地，可使用琥珀酰亚胺琥珀酸酯、琥珀酰亚胺戊二酸酯或琥珀酰亚胺碳酸酯以与胺形成更不稳定的酯键。所得的不稳定的键被眼中和其它组织中天然发现的酯酶裂解。可裂解的酯键合经常用于前药，比如地塞米松(dexamethasone)磷酸钠。治疗化合物上的巯基基团也可用作连接的位点。用还原剂(二硫苏糖醇，三(2-羧乙基)磷化氢)可还原二硫键而生成游离的半胱氨酸，随后进行巯基与间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺衍生的肽尾的反应。对于诸如酯的可裂解连接，可添加额外的部分以提供空间阻碍而减缓且达到所需的转化动力学。除连接化学以外，可通过调节阳离子尾的长度和组成而改变治疗化合物的释放的动力学且因此改变尾对生物组织中的带电荷成分的结合亲和力。以下的实施例示出了阳离子肽与诸如阿瓦斯丁的治疗化合物通过使用诸如间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBQ的反应性端部在合成的肽尾的N末端的轭合。实施例不应认为是限制性的。实施例1阳离子肽“尾”与贝伐单抗(阿瓦斯丁 )的轭合以下示例性的马来酰亚胺衍生的阳离子肽是由Hybio (中国深圳)定制合成的(MBS)-KGSKGSKGSKGSK-NH2(MBS) -KGKSKGKSK-NH2
(MBS) -KGSKGSK-NH2(MBS) -KGKSK-NH2其中K=赖氨酸G =甘氨酸S =丝氨酸MBS = N-末端间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯NH2 = C-末端酰胺每个肽含有由1-2个中性氨基酸的柔性间隔基而分隔的3个或5个赖氨酸基团， 以获得电荷的更优间隔来匹配透明质酸中的重复二糖单元上存在的电荷的空间排列(参见图 3)。阿瓦斯丁获自 Genentech，Inc.，(South San Francisco,CA) ；二硫苏糖醇(DTT)、 N-乙酰半胱氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、5，5' -二硫二 O-硝基苯甲酸)(DTNB)，和所有其它化学品获自 Sigma (St. Louis, MO)。阿瓦斯丁的化学还原所用的方法以Doronina等人Q003)所描述的方法为依据。将阿瓦斯丁(5mg)以 5mg/mL在50mM pH 8. 0的硼酸盐中与IOmM DTT 一起在37°C下孵育30分钟以还原二硫键。 利用含ImM ETDA的磷酸缓冲盐水平衡的Econo 10G柱子(BioRad)回收不含过量DTT的还原蛋白。利用DTNB分析(Ellman 1958)确定DTT处理的阿瓦斯丁(以ang/mL约;3mg)中游离硫醇的存在。与间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)衍生肽的轭合在使用之前，将MBS肽溶于水中以制成20mM贮存液。将MBS-肽(16uL)添加到 1. 6mL的还原的阿瓦斯丁中，(MBS肽为阿瓦斯丁的20x摩尔过量)。在4°C将混合物孵育1 小时以允许MBS-肽与阿瓦斯丁上游离的硫醇反应。1小时后，利用过量的N-乙酰半胱氨酸(62πιΜ，15μυ猝灭反应，在4°C下持续10分钟，并且利用Dulbecco氏磷酸缓冲盐水平衡的Econo 10G柱子回收不含过量的肽的肽-阿瓦斯丁轭合物。然后利用Micro BCA测定 (Pierce Thermo Scientific, Rockford, IL,目录号23235)来测定所回收的阿瓦斯丁的量 (1. 4mg/mL,大约2. 5mg)。这种化学还原方案目的为仅从链间二硫键生成游离的硫醇。如果所有的游离的硫醇都参与轭合，则每个阿瓦斯丁分子轭合有8个肽。在遗传方法的情况下，将每个片段一个或两个肽连接至H链和L链的其中一个或两个的末端。可选地，可通过设计并生产重组融合蛋白而将肽从头加入到治疗蛋白中，在所述重组融合蛋白中使用了编码融合至蛋白的肽的基因以表达融合蛋白。设计该融合蛋白而使肽可连接到蛋白的N末端或C末端，或使肽嵌入在蛋白的内部序列中。在这种情况下，肽与治疗蛋白共线并可以单拷贝或串联重复的形式存在。阳离子尾被设定与期望的组织靶点无特异性地结合。然而，可设定肽的长度和序列以对诸如透明质酸的特定成分具有最优的结合亲和力。肽的长度可以为2-30个氨基酸， 且可含有丰富的碱性残基(Arg、Lys, His)。如果需要的话，可将不参与乙酰透明质酸结合的氨基酸残基(例如，甘氨酸，丝氨酸)添加至序列以为保留肽上的电荷提供合适的间隔。多种阳离子结构单元可用于配制具有多价阳离子保留部分的治疗化合物。这样的结构单元包括在生理条件下带正电荷的氨基酸，包括那些天然存在的氨基酸，比如赖氨酸、 组氨酸和精氨酸。可将阳离子部分设定为在氨基酸的组成和空间排列方面模拟乙酰透明质酸结合蛋白(比如⑶44)。多种其它化学部分可用于保留阳离子部分。这些包括含有用以形成基因递送中的聚合复合物和脂质复合物的聚合物结构单元的聚阳离子，比如聚乙烯亚胺、聚酰胺胺、精胺、DOTAP和用含咪唑侧基衍生的聚合物。即，在非病毒基因治疗系统中使用的聚阳离子对于本发明也是可应用的。如前面在背景部分中所述的，非病毒基因递送系统中使用诸如聚乙烯亚胺和聚赖氨酸的聚阳离子以保护核酸治疗剂(例如，DNA和siRNA) 不受降解并协助摄入到细胞中。就本发明的优选的实施方案而言，方法旨在促进阳离子部分形成分子分散的，可溶蛋白的原位贮库，该蛋白由于与生物组织形成可逆的、非特异的结合而降低了消除速率。多种阴离子结构单元可用于构建阴离子保留部分。例子包括带负电荷的氨基酸，比如天冬氨酸和谷氨酸，或其它带电荷的化学物质，比如二膦酸盐(例如，邦罗力(boniva)禾口 actenol)。其它可用的结构单元包括可生物降解的化学物质，比如聚酯聚[α-(4_氨基丁基)-L-羟基乙酸]和聚(β_氨基酯)。另外，结构单元可含有其它类型的多价阳离子，比如多价金属离子钙和铁。在一个实施方案中，使用了至少一种2-30个赖氨酸残基的阳离子部分，更优选地为3-10个赖氨酸残基。阳离子结构单元的每次添加赋予了与生物组织中阴离子成分的额外的静电相互作用。提高结构单元的数目，从而提高了相互作用的数目，将提高结合强度， 具有强于线性的关系。因此阳离子部分具有的阳离子结构单元少于全部固定所需的阳离子结构单元，从而复合在时段中是可逆的，而实现治疗剂量的持续的速率。同时，阳离子部分将包括低抗原性和低毒性的电荷密度。以下的实施例示出了提高与生物组织中的阴离子成分(示例性地表示为透明质酸)结合的阳离子结构单元(示例性地表示为氢溴酸聚-L-赖氨酸)的数目的优势。实施例不应被认为是限制性的。实施例2含有72个以上赖氨酸基团/链的氢溴酸聚L-赖氨酸与透明质酸的结合本实验测量了氢溴酸聚L-赖氨酸与透明质酸(HA)的结合。氢溴酸聚L-赖氨酸获自Sigma(P7890)，本文表示为22Κ pLys。基于粘度测量，该样品具有15，000-30，OOODa 的分子量范围，对应于72-144个赖氨酸基团/链。来自人脐带的透明质酸钾也购自Sigma(H1504)。HA具有大约3，500, OOODa的分子量。人玻璃体含有 100-400 μ g/mL 的透明质酸。(Τ. V. Chirila 和 Y. Hong,The Vitreous Humor, in Handbook of Biomaterial Properties (玻璃体液，在生物材料性质手册中)，编辑，J. Black 和 G. Hastings，1998，Chapman & Hall，第 125-131 页.)。其具有与人血菜大致相似的电解质组成。利用购自Sigma的Dulbecco氏磷酸缓冲盐水￠866 制备所有检测溶液。利用不同量的22K pLys和恒量的500 μ g/mL的透明质酸钾制备一系列的样品。 在室温下平衡这些样品，持续至少15分钟。使用具有50kDa分子量截留的离心过滤装置 (Amicon Ultra-4 Ultracel_50K，Millipore)来分离溶液中的游离pLys与结合透明质酸的pLys。这些在设定为4的医用离心机(IEC Model CL)中进行至少10分钟。通过三硝基苯磺酸(TNBQ分析测量滤出物中游离pLys的浓度。在96孔中运行样品并在Molecular Dynamics VersaMax平板读取仪上在420nm处读数。
检测无透明质酸的含37. 5 μ g/mL的22K pLys的溶液以验证pLys将穿过50kDa 丽截留的膜。滤出物中的PLys的浓度为35. 5 μ g/mL。结果表明此方法足以将游离pLys 与结合HA的pLys分离。还包括含500 μ g/mL的HA的溶液(无pLys)作为对照。本样品的滤出物的TNBS 信号低于最低标准(1 μ g/mL pLys)且与对于空白DPBS所获得的值相近。因此，所检测的透明质酸中无蛋白杂质。图4显示了对于含500 μ g/mL透明质酸的溶液，所测量的作为总pLys浓度的函数的游离的22K pLys的浓度。通过从总pLys浓度中减去游离的pLys浓度而计算结合HA的 PLys的量。在生理电解质浓度下，大多数的22K pLys与透明质酸结合。实施例3pLys与较低浓度的透明质酸的结合因为实施例3中的方法受到22K pLys的沉淀的限制，所以制备了用于结合较低浓度的250 μ g/mL透明质酸钾的样品，以将结果扩展至pLys/HA的更高比率。图5显示了对于含有250 μ g/mL透明质酸的溶液，作为总pLys浓度的函数的结合的和游离的22K pLys的浓度。图6展示了来自实施例2和实施例3的数据。每毫克HA所结合的pLys的量取决于每毫克HA的pLys的总量。在22K pLys的量高于0. 65mg每毫克HA时，透明质酸是2 pLys饱和的。实施例4较低分子量的pLys与透明质酸的结合用实施例1中所描述的方法用较低分子量的聚L-赖氨酸进行结合实验。氢溴酸聚L-赖氨酸获自Sigma(P0879)，在本文表示为I pLys。该样品基于粘度测量具有 1，000-5000Da的分子量，对应于5- 个赖氨酸基团/链。溶液含有0、250或500 μ g/mL透明质酸钾。本实验中包括不含透明质酸的含有31. 3 μ g/mL的I pLys的对照。滤出物中的 PLys的浓度为31. 8 μ g/mL，表明游离的I pLys应该易于和HA以及与HA结合的I pLys 分离。图7显示了对于含有500 μ g/mL透明质酸的溶液，所测量的作为总pLys浓度的函数的游离的: pLys的浓度。通过从总pLys浓度中减去游离的pLys浓度而计算与HA结合的PLys的量。在生理电解质浓度下，透明质酸的溶液中大多数的I pLys是游离的。图8示出了来自实施例2、实施例3和实施例4的数据叠加。对于I pLys和2 pLys,每毫克HA所结合的pLys的量取决于每毫克HA的pLys的总量。对于22K pLys,饱和水平高于0. 65mg pLys每毫克HA，而对于pLys，饱和水平仅约为0. 06mg pLys每毫克 HA。这些数据证明增加赖氨酸部分的数目提高了与代表生理条件的缓冲液中的透明质酸结合的聚赖氨酸的量。带电荷部分可包括任何结构或构成。例如，它们可以是线性的、分支的或树状的。 它们可在部分与治疗化合物的连接位置上含有中性的柔性间隔基以协助保留部分结构单元的电荷和生物组织的相反电荷之间的近接。类似地，其可有利地在结构单元之间包括中性的柔性间隔基以实现结构单元上的电荷与生物组织上的相反电荷的最优空间匹配。例如，当葡糖醛酸部分上的羧基基团解离时，透明质酸是带负电荷的。如图3中所示，这些羧基基团在每个重复的二糖单元上出现一次。因为二糖单元的长度大于肽中的氨基酸单元的长度，不带电荷的柔性间隔基实现了正电荷和负电荷之间更佳的空间匹配。优选的柔性间隔基的例子是不具有庞大的或强烈相互作用的侧链的中性氨基酸，比如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的片段。从玻璃体至视网膜的药物递送速率取决于从生物组织中的阴离子成分脱附的速率和通过玻璃体的质量运输速率。药物通过扩散过程和对流过程的组合到达视网膜，对流过程涉及与睫状体的房水的产生有关的水压所驱动的水流。药物消除速率强烈取决于药物的大小，对于小分子扩散起更重要的作用，对于大分子，对流起支配作用。带电荷的保留部分的存在将减缓扩散和对流的速率。并且，如果与质量运输的时间长度相比脱附慢的话则可进一步延长递送。从原位贮库释放的动力学可通过调节保留部分的组成和长度和与每个分子所连接的保留部分的数目来改变结合亲和力而调整。这将继而影响脱附速率并将降低扩散和对流的速率。以下的实施例示出了诸如肽-阿瓦斯丁的阳离子肽轭合的治疗化合物与透明质酸的结合。这些实施例不应被认为是限制性的。实施例5非轭合的阿瓦斯丁与透明质酸的不结合利用阿瓦斯丁即无轭合建立了用于从与透明质酸结合的肽-阿瓦斯丁轭合物测定肽-阿瓦斯丁轭合物的游离浓度的方法。因为离心过滤装置没有将允许150kDa蛋白通过的孔径，所以使用具有0. 03um孔径的聚碳酸酯膜(Whatman，NucIepore径迹刻蚀膜，目录号 110602)的平衡透析槽(equilibrium dialysis cell,Harvard Apparatus)。槽具有可交换部件，当保持距膜表面的深度恒定时，具有通过改变面积而实现的250 μ L或500 μ L室容积。通过将已知量的DPBS中的阿瓦斯丁充注供给室，将DPBS充注接受室而进行实验。 对于这些实验，供给室和接受室具有相等的体积。允许溶液平衡表1中指定的时间量。然后从室中移除溶液并进行通过蛋白分析(Micro BCA)测量来分析阿瓦斯丁浓度。大约2天后，接受室中阿瓦斯丁的浓度在供给室中的浓度的大约25%内。因此，当供给室和接受室具有相等的体积时，需要高于两天的平衡时间来测量与供给溶液平衡的游离蛋白。第二个实验包括含有阿瓦斯丁和透明质酸的供给溶液。从具有和没有透明质酸的供给溶液获得了相似的结果，表明无论透明质酸是否存在游离蛋白具有相似的浓度。换言之，结果表明透明质酸结合的阿瓦斯丁的量接近0。表1.阿瓦斯丁与透明质酸的结合
实验平衡时间阿瓦斯丁浓HA浓度供给侧阿瓦斯丁接受侧阿瓦斯丁接受/(小时)度(\i§JmL)(pg/mL)浓度(负载的％)浓度(负栽的％)供给144500056%44%78%246250058%42%73%
1权利要求
1.一种药物组合物，其包含偶联于治疗化合物的带电荷部分，其中所述带电荷部分被设定与生物组织中具有相反电荷的成分的至少一种类型相互作用以产生用于延长的药物递送的原位贮库。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述带电荷部分是阳离子的且所述具有相反电荷的成分是阴离子的。
3.如权利要求2所述的药物组合物，其中所述阴离子成分是透明质酸。
4.如权利要求2所述的药物组合物，其中阳离子部分被设定与糖胺聚糖相互作用。
5.如权利要求2所述的药物组合物，其中阳离子部分包含阳离子氨基酸。
6.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述带电荷部分是阴离子的且所述具有相反电荷的成分是阳离子的。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其中阴离子部分包含阴离子氨基酸。
8.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述带电荷部分具有一个或多个电荷。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述带电荷部分具有至少三个电荷。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其中所述带电荷部分含有至少一个间隔基。
11.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述间隔基位于所述治疗化合物和所述带电荷部分之间的偶联位点。
12.如权利要求11所述的药物组合物，其中所述间隔基位于所述带电荷部分的电荷之间。
13.如权利要求1所述的药物组合物，其中至少两个带电荷部分偶联于治疗化合物。
14.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述生物组织包含糖胺聚糖。
15.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述生物组织是眼组织。
16.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述治疗化合物是抗VEGF化合物。
17.如权利要求16所述的药物组合物，其中所述抗VEGF化合物是雷珠单抗、贝伐单抗或 VEGF iTrap 之一。
18.如权利要求1所述的组合物，其中所述治疗化合物具有至少2，000道尔顿的分子量。
19.如权利要求1所述的组合物，其中所述偶联使用稳定的共价键实现。
20.如权利要求19所述的药物组合物，其中所述偶联使用马来酰亚胺激活的肽与游离硫醇的反应性实现。
21.如权利要求1所述的组合物，其中所述偶联使用化学上不稳定的共价键实现。
22.如权利要求21所述的组合物，其中不稳定的键是酯键合。
23.一种用于制造药物组合物的方法，其包括将带电荷部分偶联于治疗化合物，其中所述带电荷部分被设定与人体中具有相反电荷的成分的至少一种类型相互作用以产生用于延长的药物递送的原位贮库。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述带电荷部分是阳离子的且所述具有相反电荷的成分是阴离子的。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述带电荷部分是阴离子的且所述具有相反电荷的成分是阳离子的。
26.如权利要求23所述的方法，其中所述带电荷部分包括氨基酸残基。
27.如权利要求23所述的方法，其中所述治疗化合物是抗VEGF化合物。
28.如权利要求沈所述的方法，其中所述抗VEGF化合物是雷珠单抗、贝伐单抗或VEGF Trap 之一。
29.如权利要求23所述的方法，其中所述偶联通过化学方法来实现。
30.如权利要求23所述的方法，其中所述偶联通过重组DNA技术来实现。
31.如权利要求23所述的方法，其中所述偶联使用稳定的共价键来实现。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述偶联使用马来酰亚胺激活的肽与游离硫醇的反应性来实现。
33.如权利要求23所述的方法，其中所述偶联使用化学上不稳定的共价键来实现。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述不稳定的键是酯键。
35.一种治疗人类机体的方法，其包括将包含偶联于治疗化合物的带电荷部分的药物组合物导入到人类机体中，其中所述带电荷部分被设定与人类机体中的具有相反电荷的成分的至少一种类型可逆地结合以产生用于延长的药物递送的原位贮库。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述带电荷部分是阳离子的且所述具有相反电荷的成分是阴离子的。
37.如权利要求35所述的方法，其中所述带电荷部分是阴离子的且所述具有相反电荷的成分是阳离子的。
38.如权利要求35所述的方法，其中所述导入包括将所述药物组合物注射入机体的任何部分。
39.如权利要求35所述的方法，其中所述药物组合物被导入到眼中。
40.如权利要求35所述的方法，其中所述药物组合物被导入到所述机体中的选自关节中滑液、脑、皮肤、软骨或癌性区域的一个或多个位置。
41.一种药物组合物，其包括含有净正电荷的治疗蛋白部分，其中所述药物组合物表现出对生物组织的非特异性结合，且所述生物组织具有阴离子成分。
42.如权利要求41所述的药物组合物，其中所述非特异性结合是至少25%。
43.如权利要求41所述的药物组合物，其中所述非特异性结合是至少15%。
44.一种药物组合物，其包括含有净负电荷的治疗蛋白部分，其中所述药物组合物表现出对生物组织的非特异性结合，其中所述生物组织具有阳离子成分。
全文摘要
公开了包含偶联于治疗化合物的带电荷部分的药物组合物。带电荷部分被设定与生物组织中具有相反电荷的成分的至少一种类型相互作用以产生用于延长的药物递送的原位贮库。生物组织可以是眼组织或含有带电荷成分的任何组织。此外，公开了治疗人类机体的方法。该方法是为了将含有偶联于治疗化合物的带电荷部分的药物组合物导入到人类机体中。可通过注射来导入。还公开了制造包含偶联于治疗化合物的带电荷部分的药物组合物的方法。
文档编号A61K39/395GK102215875SQ200980146057
公开日2011年10月12日 申请日期2009年10月15日 优先权日2008年10月16日
发明者凯瑟琳·科根·法瑞纳斯, 史蒂文·M·查姆 申请人:凯瑟琳·科根·法瑞纳斯, 史蒂文·M·查姆