用于减少大分子在生理条件下聚集的方法和制剂的制作方法

专利名称：用于减少大分子在生理条件下聚集的方法和制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及针对皮下施用大分子而言通过减少生理条件下的聚集使注射部位处炎症最小化的方法。
背景技术：
在过去二十年中，重组DNA技术已经导致作为生物分子、尤其蛋白质的药物的数目明显增加。生物分子药物的增加已经导致药物制剂领域的新挑战。高剂量的蛋白质治疗药如抗体可以通过静脉内输注递送至患者，但是这种药物施用途径是不方便的，并且如可能的话，通常优选配制该蛋白质治疗药用于皮下注射。然而，用于皮下注射的药物溶液的体积比静脉内输注体积小得多，从而蛋白质必然以更高的浓度存在。在每毫升数十毫克的高的治疗性蛋白质浓度上，维持治疗性蛋白质稳定溶解持续延长的时间段是重要的。高浓度的蛋白质溶液增加了有利于聚集的蛋白质-蛋白质相互作用的可能性；防止聚集已经变成蛋白质药物配制的重要事项。聚集造成许多问题，包括活性蛋白的生物利用率减少，药物代谢动力学改变和不想要的免疫原性。(Frokjaer，S.和Otzen，D. Ε.，Nat. Rev. Drug. Discov. 4 :298_306 (2005) Jiskoot, W.禾口 Crommelin， D. J. A. ，EJHP Practice 12 20-21(2006))。防止聚集仍主要是经验性的，因为聚集过程的分子细节总体上未知。常见策略是添加稳定剂至蛋白质溶液。常使用的稳定剂包括糖、盐、游离氨基酸如L-精氨酸和L-谷氨酰胺(Golovanov，Α. P.等人，J. Am. Chem. Soc. 126 :8933_8939 (2004))、多元醇(Singh， S.和 Singh，J.，AAPS Pharm. Sci. Tech 4 1-9 (2003) ；Mishra, R.等人，J. Biol. Chem. 280 15553-15560(2005))、聚乙二醇(PEG)和可以减少蛋白质-蛋白质相互作用的其他聚合物，如聚山梨酯(polysorbates)或泊洛沙姆(Frokjaer和Otzen，见上文；Lee，R. C.等人， Ann. Biomed. Eng. 34 1190-1200 (2006) ； (Nema, S. ^A, PDAJournal of Pharmaceutical Science and Technology 51:166-171(1997))。PVP是基本上由线性聚合的1-乙烯基-2-吡咯烷酮(乙烯基吡咯烷酮)组成的合成聚合物，其聚合度导致具有各种分子量的聚合物。聚乙烯吡咯烷酮的同义词包括PVP、聚 (1-乙烯基-2-吡咯烷酮)、聚维酮和Kollidon。PVP是生物学惰性的并且口服和局部用途径无毒。分子量低于25000道尔顿的PVP通过肾小球滤过作用从体循环中移除并且因此预期不在身体中堆积。PVP已经在制药工业中广泛用作片剂包衣助剂并且在眼用和局部用制品中用作增黏剂。PVP也已经最初作为血浆增容剂用于肠胃外施用并且随后在可注射制剂(例如，抗生素、激素、镇痛药)中用来产生黏度。这些制剂限于通常小于500道尔顿的小分子化合物或小蛋白如激素。含有PVP的当前可用药品包括Bicillin C-R (Wyeth) ,Wyci 11 in (Wyeth) 和PfiZerpenTM(PfiZer)，它们均含有小分子青霉素G，以及非常低浓度(彡0. 6% )的PVP。 Depo-SubQ Provera 104 (Pharmacia and Upjohn)含有 5% PVP 连同小分子醋酸甲羟孕酮。Bexxar (Glaxo Smith Kline)含有放射性标记的抗CD20抗体连同4. 4-6. 6% PVP。在 Bexxar的例子中，PVP特异地用作放射防护剂以减少放射性标记的抗体因所附着放射性同位素而自辐射分解(美国专利号5，961，955和美国专利号6，338，835)。PVP和聚乙二醇也被生物化学家用来沉淀溶解的蛋白质(美国专利号 5，525，519)。CD20抗原(也叫做人B-淋巴细胞限制的分化抗原，Bp35)是位于前B(pre_B)淋巴细胞和成熟B淋巴细胞上的分子量大约35kD的疏水性跨膜蛋白(Valentine等人J. Biol. Chem. 264(19) :11282_11287 (1989)；和 Einfeld 等人 EMBO J. 7 (3) :711_717 (1988))。该抗原也在大于90%的B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)上表达(Anderson等人Blood 63(6) 1424-1433(1984))，但是不存在于造血干细胞、原B (pro-B)细胞、正常浆细胞或其他正常组织上(Tedder等人J. Immunol. 135(2) :973_979 (1985))。人们认为CD20调节细胞周期启动和分化的活化过程中的早期步骤(Tedder等人，见上文)并且可能作为钙离子通道发挥作用(Tedder 等人 J. Cell. Biochem. 14D :195(1990))。鉴于⑶20在B细胞淋巴瘤中表达，该抗原已经成为治疗此类淋巴瘤的有用治疗靶。例如，作为针对人CD20抗原的基因工程嵌合鼠/人单克隆抗体(可商业地获自 Genentech, Inc.，南旧金山，加利福尼亚州，美国和F. Hoffmann-La Roche AG，巴塞尔，瑞士)，利妥昔单抗(RITUXAN 、MABTHERA )抗体用于治疗患有复发或难治性低等级或滤泡性、⑶20阳性、B细胞非霍奇金淋巴瘤的患者。利妥昔单抗是在1998年4月7日发表的美国专利号5，736，137 (Anderson等人)中和美国专利号5，776，456中称作“C2B8” 的抗体。指出用于治疗NHL的其他抗CD20抗体包括与放射性同位素钇-90连接的鼠抗体 Zevalin (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA)和作为与 1-131 缀合的另一种完整鼠抗体的 Bexxar (Corixa，WA)。CD20也是用于治疗自身免疫病的有用靶抗原。利妥昔单抗也已经在多种其中B 细胞及自身抗体似乎在疾病病理生理学方面发挥作用的非恶性自身免疫病中进行研究， 包括Edwards等人，Biochem Soc. Trans. 30 824-828 (2002)。已经报道利妥昔单抗潜在地减轻例如以下疾病的体征和症状类风湿性关节炎(RA) (Leandro等人，Ann. Rheum. Dis. 61 883-888(2002) ；Edwards 等人，Arthritis Rheum.，46 (增刊 9) :S46(2002) ；Stahl 等人，Ann. Rheum. Dis.，62(增刊 1) :0P004(2003) ；Emery 等人，ArthritisRheum. 48(9) S439(2003))、狼疫(Eisenberg, Arthritis. Res. Ther. 5 157-159(2003) ；Leandro 等人 Arthritis Rheum. 46 :2673_2677(2002) ;Gorman 等人，Lupus，13 :312_316(2004))、免疫性血小板减少性紫癜(D' Arena 等人，Leuk. Lymphoma 44:561-562(2003) ；Stasi 等人，Blood, 98 952-957(2001) ；Saleh 等人，Semin. Oncol, 27 (Supp 12) :99_103 (2000)； Zaia 等人，Haematolgica, 87 189-195 (2002) ；Ratanatharathorn 等人，Ann. Int. Med.， 133 :275-279 (2000))、单纯红细胞再生障碍性贫血(Auner 等人，Br. J. Haematol, 116 725-728(2002))；自身免疫性贫血(Zaja 等人，Haematologica 87 189-195 (2002)(印刷错误出现在 Haematologica 87:336(2002)中)、冷凝集素病(Layios 等人，Leukemia, 15:187-8(2001) ；Berentsen 等人，Blood, 103 2925-2928 (2004) ；Berentsen 等人， Br. J. Haematol,115 :79_83(2001) ；Bauduer, Br.J. Haematol,112 1083-1090(2001)； Damiani 等人，Br. J. Haematol, 114 :229_234 (2001))，严重胰岛素抵抗 B 型综合征 (Cou 等人，N. Engl. J. Med.，350 :310_311 (2004)、混合冷球蛋白血症(DeVita 等人， Arthritis Rheum. 46 增刊 9 :S206/S469 (2OO2))、重症肌无力(Zaja 等人，Neurology, 55 1062-63(2000) ；Wylam 等人，J. Pediatr. , 143 :674_677 (2003))、韦格纳肉芽肿病(Specks 等人，Arthritis&RheumatismAA 2836-2840 (2001))、难治性寻常天疱疫(Dupuy 等人， Arch Dermatol.，140 :91_96 (2004))、皮肌炎(Levine，Arthritis Rheum.，46(增刊 9) :S 1299(2002))、Sjogren 综合征(Somer 等人，Arthritis&Rheumatism, 49 :394_398 (2003))、 活动性II型混合性冷球蛋白血症(Zaja等人，Blood，101 :3827_3834 (2003))、寻常性天疱疫(Dupay 等人，Arch. Dermatol, 140 91-95 (2004)),自身免疫肾病(Pestronk 等人， J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 74 :485_489 (2003))、肿瘤预兆性视性眼阵挛-肌阵挛综合征(Pranzatelli 等人 Neurology60(增刊 1)Ρ05· 128 :Α395(2003))和复发-缓解型多发性硬化(RRMS). Cross等人(摘要)在“美国多发性硬化研究与治疗委员会第八届年会中”的《来自MS中利妥昔单抗II期试验的初步结果》，20-21 (2003))。本发明提供了用于防止大分子如抗体在生理条件下聚集的方法和制剂。本发明的方法在制备治疗性蛋白质(如本说明书中所述的抗CD20抗体)的制剂方面提供优势。这些优势包括制备皮下注射用制剂的能力，所述能力会引起治疗性抗体的生物利用率增加和注射部位处炎症减少，以及从下文显而易见的额外优势。发明概述PVP和聚乙二醇被生物化学家用来沉淀溶解的蛋白质(美国专利号5，525，519)。 我们的研究结果，即分子量范围2000至54000道尔顿的PVP确实抑制蛋白质的聚集和絮凝，因而改善其溶解度，这是出乎意料的并且因此是PVP的新用途。我们还已经开发了新的体外筛选方法，该方法包括使用具有定义的分子量(MW)截止值和定制释放介质 (customized releasemedia)的透析管，所述的定义的分子量截止值和定制释放介质均模拟注射部位处的生理条件。本发明提供了用于通过添加5%至20%具有2000至54000道尔顿分子量范围的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)减少大分子如蛋白质在生理条件下聚集并抑制其絮凝的方法。聚集和絮凝因添加PVP而显著减少也与大鼠中皮下注射部位处炎症的显著减少相关。本发明还提供了皮下施用大分子(如蛋白质)期间使注射部位处炎症最小化的方法，所述方法通过添加5%至20%具有2000至54000道尔顿分子量范围的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)至该皮下制剂。在本发明的多个实施方案中，大分子是抗体。在本发明的其他实施方案中，该抗体是治疗性抗体或诊断性抗体。在本发明的多个实施方案中，大分子是抗CD20抗体。在本发明的某些实施方案中，抗CD20抗体是人源化抗体。在本发明的某些实施方案中，抗CD20抗体包含来自表1的变体A、B、C、D、F、G、H或I之一。本发明还提供方法和制剂，其中抗⑶20抗体包含选自由 SEQ ID NO :1-15组成的组中的氨基酸序列。在本发明的其他实施方案中，该抗体包含SEQID NO 1的轻链可变结构域和SEQ ID NO 2的重链可变结构域，或者SEQID NO 3的轻链可变结构域和SEQ ID NO :4的重链可变结构域，或者SEQID NO :3的轻链可变结构域和SEQ ID NO :5的重链可变结构域。本发明还提供方法和制剂，其中所述抗体包含SEQ ID N0:6的全长轻链和SEQID N0:7、SEQ ID NO :8或SEQ ID NO 15的全长重链。本发明还提供方法和制剂，其中所述抗体包含SEQ ID NO :9的全长轻链和SEQ ID NO 10,SEQ ID NO =IUSEQ ID N0:12、SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 14 的全长重链。在其他方面，本发明提供了用于皮下施用大分子(如蛋白质)的药物制剂，其包含5%至20%具有2000至54000道尔顿分子量范围的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在一些实施方案中，本发明提供了用于皮下施用抗体的药物制剂，其包含处于10mg/ml至200mg/ml浓度范围的抗体和5%至20%具有2000至54000道尔顿分子量范围的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。 在某些实施方案中，该抗体浓度范围是从30-150mg/ml。在其他实施方案中，该抗体浓度范围是从100-150mg/ml。在某些实施方案中，PVP的浓度是10%。在某些实施方案中，PVP的分子量范围是从7000-11000道尔顿。在一个具体的实施方案中，本发明提供了用于皮下施用抗体的药物组合物，其包含100mg/ml的人源化2H7抗体和10%具有7000-11000道尔顿分子量范围的PVP。在其他实施方案中，该药物组合物还包含30mM乙酸钠；5%二水合海藻糖；和0. 03%聚山梨酯20，pH 5. 3。本发明还提供任意的以上制剂，其包含由表1中所列的任意抗体组成的人源化抗 ⑶20抗体。本发明还提供制剂，其中抗⑶20抗体包含选自由SEQ ID N0:l_15组成的组中的氨基酸序列。在本发明的其他实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO :1的轻链可变结构域和SEQ ID NO 2的重链可变结构域，或者SEQ ID NO 3的轻链可变结构域和SEQ ID NO 4 的重链可变结构域。本发明还提供方法和制剂，其中所述抗体包含SEQ ID NO :6的全长轻链和SEQ ID N0:7、SEQ ID NO :8或SEQ ID NO 15的全长重链。本发明还提供方法和制剂， 其中所述抗体包含SEQ ID NO 9的全长轻链和SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO 14 的全长重链。本发明还提供了治疗表达CD20的B细胞癌的方法，其包括施用在药物制剂中表1 人源化抗⑶20抗体的任一种，其中所述的药物制剂包含5%至20%具有2000至54000道尔顿分子量范围的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。CD20阳性B细胞癌优选地是B细胞淋巴瘤或白血病。在具体实施方案中，使用包含结合人CD20(hCD20)的人源化2H7抗体和其功能性片段的制剂来治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)、惰性NHL(包括复发惰性NHL和利妥昔单抗不应的惰性NHL)、淋巴细胞主型霍奇金病(LPHD)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在具体实施方案中，使用包含人源化CD20结合抗体、尤其来自表1的变体A、B、 C、D或H、或其功能性片段的制剂来治疗上文所列的CD20阳性B细胞癌。本发明也提供了治疗自身免疫病的方法，包括施用在药物制剂中治疗有效量的表 1的人源化2H7抗体至患有所述自身免疫病的患者，所述的药物制剂包含5%至20%具有 2000至54000道尔顿分子量范围的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在具体的实施方案中，自身免疫病选自由类风湿性关节炎(RA)和幼年型类风湿性关节炎组成的组，并且RA患者是氨甲蝶呤(Mtx)不充分应答者和TNF α-拮抗物不充分应答者、利妥昔单抗不应性患者或复发患者。在一个实施方案中，RA患者是相对于另一种抗CD20治疗性抗体而言难治或复发的。 在其他实施方案中，自身免疫病选自由系统性红斑狼疮(SLE)，包括狼疮肾炎；多发性硬化 (MS)，其包括复发-缓解型多发性硬化(RRMS)；韦格纳病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、 多发性硬化、银屑病、IgA肾病、IgM多发性神经病、重症肌无力、ANCA相关血管炎、糖尿病、 Reynaud综合征、Sjogren综合征、视神经脊髓炎(NMO)和肾小球肾炎组成的组。在具体的实施方案中，使用包含人源化CD20结合抗体、尤其来自表1的变体A、B、C、D或H、或其功能性片段的制剂来治疗上文所列的自身免疫病。在治疗前述疾病的方法的某些实施方案中，患有所述疾病的受试者或患者是灵长类动物，优选地是人。本发明还提供了在注射时于患者的注射部位处改善或维持水性皮下制剂中抗体的增溶作用或使该抗体沉淀最小化的方法，包括添加5%至20%具有2000至54000道尔顿分子量范围的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)至水性皮下制剂。本发明还提供了增加待皮下施用的抗体的生物利用率的方法，包括添加5%至 20%具有2000至54000道尔顿分子量范围的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)至包含该抗体的水性皮下制剂。本发明还提供了评价赋形剂减少抗体或其他大分子在生理条件下聚集的能力的体外透析方法，包括将含有和不含有试验赋形剂的该大分子的制剂针对模仿生理条件的试验介质在37°C伴随恒定搅拌的情况下透析；对改变的介质溶液采样；并且测量外观，如样品的浊度和释放介质中存在的蛋白质的量由诸多方法如UV光谱扫描法测量，其中在含有试验赋形剂的测定法中与缺少赋形剂的对照相比，释放介质中增加的蛋白质浓度和减少的浊度指示该试验赋形剂减少大分子聚集的能力。在具体实施方案中，该介质涉及改良的 PBS溶液，如其含有167mM钠，140mM氯化物，17mM磷酸盐，4mM钾。在该方法的具体实施方案中，透析管具有1百万道尔顿分子量截止值。在该方法的其他具体的实施方案中，使用UV 光谱测定法测量试样中的蛋白质浓度和浊度。在该方法的其他实施方案中，该方法包括对改变的释放介质和透析管内部的溶液检查沉淀，其中与缺少赋形剂的对照相比，在含有试验赋形剂的透析管中的沉淀减少指示试验赋形剂减少大分子聚集的能力。附图简述

图1显示2H7在生理条件下的聚集。在37°C将150mg/ml的2H7透析入PBS持续2曰。图2显示用来评价赋形剂对生理条件下2H7聚集的影响的体外透析模型。在37°C 用220ml的改良PBS溶液(167mM钠，140mM氯化物，17mM磷酸盐，4mM钾)填充250ml玻璃罐。将6cm长度的12mm透析管在一端夹住，充以大约Iml试样，排出过多的空气，并且将该管的另一端夹至封盖上。这个罐置于37 °C，伴以恒定搅拌。图3显示对照在体外透析模型中的行为特征。2H7和rhuMab⑶Ila均在图2中所示的模型中测试。在2. 5、6、12、24、33和48小时时间点测量释放入PBS溶液的蛋白质的累积百分数。图4显示低分子量PVP (重均MW 9K道尔顿)和高分子量PVP (重均MW 1. 2百万道尔顿)对2H7在体外模型中释放的影响。图5显示5%-20%低分子量PVP (重均丽9K道尔顿)对2H7在体外模型中释放的影响。图5显示具有从2K至1. 5M的分子量范围的PVP对2H7在体外模型中释放的有效性。实施方案详述动词“聚集”的多种形式指各个蛋白质分子或复合物缔合以形成聚集物的过程。 “聚集物”是包含蛋白质的分子或复合物的高分子装配物。聚集可以进行至形成可见沉淀物的程度。这种可见沉淀物的形成在本文中也称作“絮凝作用”。可以测定大分子沉淀物的相对量，例如，通过与目视对照比较。验定沉淀的额外方法是本领域已知的并且在下文描述，例如，实施例2中详述的体外透析方法或实施例3中描述的体内模型。术语“生物利用率”指药物或其他物质在施用后于生理活性部位处被吸收或变得可用的程度或速率。大分子的生物利用率可以通过本领域已知的体内药物代谢动力学方法分析。术语“大分子”指具有至少10000道尔顿分子量的分子，并且可以包括蛋白质，如抗体。术语“赋形剂”或“药用赋形剂”指可以减少大分子聚集的化合物。赋形剂可以包括糖、盐、游离氨基酸如L-精氨酸和L-谷氨酰胺、多元醇、聚乙二醇(PEGs)和其他聚合物， 如聚山梨酯、泊洛沙姆或PVP。术语“PVP”指实质上由线性聚合的1-乙烯基-2-吡咯烷酮(乙烯基吡咯烷酮)组成的聚合物，其聚合度导致具有各种分子量的聚合物。聚乙烯吡咯烷酮的同义词包括PVP、 聚(1-乙烯基-2-吡咯烷酮)、聚维酮和Kollidon。术语“治疗性抗体”指在治疗疾病中使用的抗体。治疗性抗体可以具有多种作用机制。治疗性抗体可以结合并中和靶的正常功能。例如，阻断癌细胞存活所需要的蛋白质的活性的单克隆抗体引起该癌细胞的死亡。另一种治疗性单克隆抗体可以结合并激活靶的正常功能。例如，单克隆抗体可以与细胞上的蛋白质结合并触发凋亡信号。最终，如果单克隆抗体与仅在患病组织上表达的靶结合，则毒性有效载荷(有效药物)如化疗药物或放射药物与该单克隆抗体的缀合可以产生用于特异性递送该毒性有效载荷至患病组织的药物， 从而减少对健康组织的伤害。术语“诊断性抗体”指作为疾病的诊断试剂使用的抗体。诊断性抗体可以结合至与特定疾病特异性相关或显示在该疾病中表达增加的靶结合。诊断性抗体可以例如用来检测来自患者的生物学样品中的靶或用于对患者中的疾病部位(如肿瘤)诊断性成像。“CD20”抗原是分子量大约35kD的非糖基化的跨膜磷蛋白，其存在于来自外周血或淋巴样器官的大于90% B细胞的表面上。⑶20在早期前B细胞发育期间表达并且维持直至浆细胞分化；它不存在于人干细胞、淋巴样先祖细胞或正常浆细胞上。CD20存在于正常B细胞以及恶性B细胞二者上。文献中⑶20的其他名称包括“B-淋巴细胞限制的分化抗原”和 “Bp35”。CD20 抗原在例如，Clark 和 Ledbetter，Adv. Can. Res. 52 :81_149 (1989) 和 Valentine 等人 J. Biol. Chem. 264(19) :11282_11287 (1989)中描述。术语“抗体”在最广泛的意义上使用并且具体地涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展示出想要的生物学的活性或功能。本发明的人源化⑶20结合抗体的生物学活性将至少包括该抗体与人⑶20结合， 更优选地与人和其他灵长类动物(包括食蟹猴、猕猴、黑猩猩)的CD20结合。所述抗体以不高于1 X ΙΟ"8的Kd值、优选不高于1 X ΙΟ"9的Kd值结合⑶20，并且与不用这种抗体治疗的适宜阴性对照相比时，能够在体内杀死或耗尽B细胞，优选地至少20%。B细胞耗尽可以是ADCC、CDC、凋亡或其他机制中一种或多种机制的结果。在本文疾病治疗的一些实施方案中，优于其他效应子功能或机制的特定的效应子功能或机制可能是想要的，并且优选人源化2H7的某些变体以实现那些生物学功能，如ADCC。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；双体(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子； 和从抗体片段形成的多特异性抗体。“Fv”是含有完整抗原识别及结合部位的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。贡献用于抗原结合的氨基酸残基并向该抗体赋予抗原结合特异性的6个高变环(分别来自H和L链的3个环) 源自这两个结构域的折叠。然而，甚至单个可变结构域(或仅包含3个抗原特异性⑶R的半个Fv)具有识别并结合抗原的能力，虽然以比完整结合部位更低的亲和力进行。如本文中所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均一的抗体群体获得的抗体， 即，该群体包含的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除在该单克隆抗体产生期间可以出现的可能变体之外，此类变体通常以微小的量存在。这种单克隆抗体一般包括了包含结合某靶的多肽序列的抗体，其中通过以下方法获得靶结合的多肽序列，所述方法包括从多个多肽序列中选择单个靶结合的多肽序列。例如，该选择方法可以是从多个克隆(如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的汇集物)选择独特克隆。应当理解可以进一步改变所选择的靶结合序列，例如旨在改善对该靶的亲和力、旨在人源化靶结合序列、旨在改善其在细胞培养中的产生、旨在降低其体内免疫原性、旨在产生多特异性抗体等，并且应当理解包含所述改变的靶结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体制备物也是有利的，在于它们一般不混杂其他免疫球蛋白。修饰语“单克隆”指示该抗体的特征为从基本上均一的抗体群体获得，并且不得解释为通过任何具体方法产生该抗体。例如，根据本发明待使用的单克隆抗体可以由多项技术(包括，例如，杂交瘤方法(例如，Kohler 等人，Nature, 256 495(1975) ；Harlow ^ X, Antibodies :A Laboratory Manual, (Cold Spring HarborLaboratory Press,第 2 版.1988) ；Hammer ling 等人，在《单克隆抗体禾口 T 细胞杂交瘤》第 563-681 页(Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hybridomas563_681)， (Elsevier, N. Y.，1981))、重组DNA方法(见，例如，美国专利号4，816，567)、噬菌体展示技术(见，例如，Clackson 等人，Nature, 352 :624_628 (1991) ；Marks 等人，J. MoI Biol, 222 581-597(1991) ；Sidhu 等人，J. MoIBiol. 338(2) :299_310 (2004) ；Lee 等人， J. Mol. Biol 340(5) 1073-1093 (2004) ；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34) 12467-12472(2004)；和 Lee 等人 J. Immunol. Methods 284(1-2) 119-132 (2004))和用于在具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中产生人或人样抗体的技术(见，例如，WO 1998/24893 ；WO 1996/34096 ；W01996/33735 ；WO 1991/10741 Jakobovits 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 2551 (1993) Jakobovits 等人，Nature, 362 :255-258 (1993) ；Bruggemann 等人，Year in Immuno. ,7 33(1993)；美国专利号 5，545，806 ；5，569，825 ；5，591，669 (均属于 GenPharm) ；5，545，807 ；W01997/17852 ；美国专利号 5，545，807 ；5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ；和 5，661，016 ；Marks 等人，Bio/Technology, 10 :779_783 (1992) ；Lonberg 等人，Nature, 368 :856_859 (1994)； Morrison, Nature,368 812-813 (1994) ；Fishwild 等人，Nature Biotechnology,14 845-851(1996) ；Neuberger, NatureBiotechnology,14 826 (1996)；禾口 Lonberg 禾口 Huszar,Intern. Rev. Immunol, 13 :65_93(1995)产生。本发明的⑶20结合抗体的“功能性片段”是这些片段，它们保持与⑶20以与衍生这些片段的完整全长分子基本上相同的亲和力结合，并且显示生物学活性，包括如体外或体内测定法(如本文中所述的那些测定法)耗尽B细胞。术语“可变的”指抗体之间可变结构域的某些节段在序列方面很大不同的事实。 V结构域介导抗原结合并定义特定抗体针对其特定抗原的特异性。然而，变异性在涵盖可变结构域的110个氨基酸范围内并非均勻地分布。相反，V区由15-30个氨基酸的叫做构架区(FR)的相对不变动的区段组成，所述的区段被具有极端变动性的叫做“高变区”的各自长9-12个氨基酸的较短区域隔开。天然重链和轻链的可变结构域各自包含大体上采取 β -折叠构型的由3个高变区连接的4个FR，所述FR形成连接环并且在一些情况下形成该折叠结构的部分。每条链中的高变区被FR密切接近地固定在一起，并且在高变区来自其他链的情况下，有助于抗体的抗原结合部位的形成(见Kabat等人，免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences of Proteinsof Immunological Interest),第 5 版· Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。 ’H胃g丰勾直接参与抗体与抗原结合，但是展示出多种效应子功能，如使抗体参与抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。在本文中使用时，术语“高变区”指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“⑶R”的氨基酸残基(例如，&中的约第24-34位(Li)、第 50-56位(L2)和第89-97位(L3)残基和Vh中的约第31-35B位(Hl)、第50-65位(H2)和第 95-102位(H3)残基(Kabat等人，免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunologicallnterest),第 5 版· Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD. (1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如Vl中的第26-32 (Li) 位、第50-52 (L2)位和第91-96 (L3)位残基和Vh中的第26-32 (Hl)位、第52A-55 (H2)位和第 96-101 (H3)位残基(Chothia 和 Lesk J. MoI. Biol. 196 :901_917 (1987))。如本文中所提及，“共有序列”或共有性V结构域序列是从已知人免疫球蛋白可变区序列的氨基酸序列的比较中衍生的人工序列。基于这些比较，制备了编码V结构域氨基酸和人H链亚组III V结构域的重组核酸序列，其中所述的V结构域氨基酸是从人κ衍生的序列的共有区。该共有V序列没有任何已知的抗体结合特异性或亲和力。“嵌合”抗体(免疫球蛋白)具有重链和/或轻链部分，所述的部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，同时所述链的其余部分与衍生自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体以及这种抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们展示想要的生物学活性(美国专利号4，816，567 ；和Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 =6851-6855 (1984)) 如本文中所用的人源化抗体是嵌合抗体的亚类。非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合抗体。就大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者或受体抗体)，其中受者的高变区残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的具有所希望特异性、亲和力和能力的高变区残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR) 残基被相应的非人残基替换。另外，人源化抗体可以包含在受体抗体中或在供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能如结合亲和力。通常地，人源化抗体会基本上包含至少1个、并且一般2个可变结构域的全部，在所述的可变结构域中全部或基本上全部的高变环与非人免疫球蛋白的那些高变环对应并且全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白序列的那些FR区，虽然所述FR区可以包括一个或多个改善结合亲和力的氨基酸置换。FR中这些氨基酸置换的数目一般在H链中不多于6，并且在L链中不多于3。人源化抗体任选地也会包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fe)，一般是人免疫球蛋白的部分恒定区。对于进一步细节,见Jones等人，Nature 321 :522-525(1986) ；Reichmann等人， Nature 332 :323-329(1988)；和 Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992)。“补体依赖性细胞毒作用”或“CDC”指在补体存在下裂解靶细胞。经典补体途径的活化因补体系统第一组分(Clq)与(适宜亚类的)结合至其对应抗原的抗体结合而启动。为评估补体活化，可以进行CDC测定法，例如，如feizzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods 202 :163(1996)中描述。除非另外说明，本说明书和权利要求书中免疫球蛋白重链的恒定结构域中残基的编号按照如Kabat等人，免疫学感兴趣的蛋白质的序列Gequences of Proteins of Immunological Interest),第 5版.Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)中的EU index进行，所述文献通过引用的方式明确并入本文中。“如Kabat中那样的EUindex”指人IgGlEU抗体的残基编号法。V区的残基根据Kabat 编号法编号，除非专门指出顺序编号系统或其他编号系统。CD20抗体包括“C2B8”，现在叫做“利妥昔单抗”(“RITUXAN ”)(美国专利号5，736，137)；从IDEC Pharmaceuticals, Inc.可商业获得的命名为“Y2B8”或“替伊莫单抗”(ZEVALIN )的钇-[90]标记2B8鼠抗体(美国专利号5，736，137 ；2B8于1993年 7月22日以保藏号HBl 1388保藏于ATCC)；鼠IgGh “Bi ”，也叫做“托西莫单抗”，任选地用 131I标记以产生“131I-B1”或“碘1131托西莫单抗”抗体(BEXXAR , GlaxoSmithKline，也见美国专利号 5，595，721)；鼠单克隆抗体“1F5” (Press 等人 Blood 69(2) :584-591(1987) 和其变体，包括“构架贴补的”或人源化1F5 (W0 2003/002607, Leung, S. ；ATCC保藏物HB-96450)；鼠2H7抗体和嵌合2H7抗体(美国专利号5，677，180)；人源化2H7 (TO 2004/056312 (Lowman 等人)和如下所述)；HuMAX-CD20 完全人抗体(Genmab，Denmark ； 见，例如，Glennie 禾口 van de Winkel, Drug Discovery Today 8:503—510(2003)禾口 Cragg 等人，Blood 101 :1045-1052(2003)) ；WO 2004/0；35607 CTeeling 等人)中所描述的人单克隆抗体；US 2004/0093621 (Shitara等人)中所描述的具有与Fc区结合的复杂N-糖苷连接的糖链的抗体；⑶20结合分子如AME系列抗体，例如，WO 2004/103404(Watkins等人，应用分子进化论(Applied MelecularEvolution))中所描述的AME-133 抗体；A20抗体或其变体如嵌合或人源化A20抗体(分别为cA20、IMMU-106a.k.a hA20 (US 2003/0219433、 US2005/0025764 ；Immunomedics)；和从国际白细胞分型会议(InternationalLeukocyte Typing Workshop)可获得的单克隆抗体 L27，G28-2,93-1B3, B-Cl 或 NU-B2 (Valentine 等人，引自《白细胞分型III》(Leukocyte TypingIII) (McMichael编著，第440页，牛津大学出版社(1987))。本文中的优选CD20抗体是人源化、嵌合或人CD20抗体，更优选地是人源化2H7抗体、利妥昔单抗、嵌合或人源化A20抗体(Immunomedics)和HuMAX-⑶20 人⑶20 抗体(Genmab)。
“分离的”抗体是已经被鉴定并且从其自然环境的组分中分离的和/或回收的一种抗体。其自然环境的杂质组分是可能干扰该抗体的诊断性或治疗性用途的物质，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质性或非蛋白质性溶质。在优选的实施方案中，将该抗体纯化 (1)至以重量计大于95%的抗体，如Lowry法所测定，并且最优选地以重量计大于99%，纯化( 至通过转杯测序仪(spinning cup sequenator)获得至少15个N端残基或内部氨基酸序列的程度或纯化C3)至通过还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选使用银染的 SDS-PAGE所确定的均一性。分离的抗体包括重组细胞内部在原位的抗体，因为该抗体的自然环境的至少一种组分将不存在。然而，一般将通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。本发明的组合物和方法本发明提供了用于皮下施用大分子(如蛋白质)的药物组合物，其包含5%至 20%具有2000至M000道尔顿分子量范围的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在一些实施方案中， 本发明提供了用于皮下施用抗体的药物制剂，其包含处于30mg/ml至200mg/ml浓度范围的抗体和5%至20%具有2000至54000道尔顿分子量范围的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在某些实施方案中，该抗体浓度范围是从10-150mg/ml。在其他实施方案中，该抗体浓度范围是从 100-150mg/ml。在某些实施方案中，PVP的浓度是10%。在某些实施方案中，PVP的分子量范围是从7000-11000道尔顿。在一个具体的实施方案中，本发明提供了用于皮下施用抗体的药物组合物，其包含100mg/ml的人源化2H7抗体和10%具有7000-11000道尔顿分子量范围的PVP。在其他实施方案中，该药物组合物还包含30mM乙酸钠；5%二水合海藻糖；和 0. 03%聚山梨酯 20，pH 5. 3。在多个实施方案中，本发明提供了包含人源化2H7抗体(在本文中也称作hu2H7) 的药物组合物。在具体实施方案中，人源化2H7抗体是表1中所列的抗体。表1-人源化抗⑶20抗体及其变体
权利要求
1.皮下施用大分子期间使注射部位处炎症最小化的方法，包括添加5%至20%具有 2000至54000道尔顿分子量范围的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)至含有该大分子的制剂。
2.权利要求1所述的方法，其中大分子是蛋白质。
3.权利要求2所述的方法，其中蛋白质是抗体。
4.权利要求3所述的方法，其中抗体是治疗性抗体。
5.权利要求3所述的方法，其中抗体是诊断性抗体。
6.权利要求3所述的方法，其中抗体是抗CD20抗体。
7.权利要求6所述的方法，其中抗体包含表1中所示的抗体变体A、B、C、D、F、G、H或I。
8.权利要求6所述的方法，其中抗体包含选自由SEQID NO :1_15组成的组中的氨基酸序列。
9.权利要求6所述的方法，其中抗体包含SEQID NO :1的轻链可变结构域和SEQ ID NO 2的重链可变结构域。
10.权利要求6所述的方法，其中抗体包含SEQID NO :3的轻链可变结构域和SEQ ID NO 4的重链可变结构域。
11.权利要求6所述的方法，其中抗体包含SEQID NO :3的轻链可变结构域和SEQ ID NO 5的重链可变结构域。
12.权利要求6所述的方法，其中抗体包含SEQID NO :6的全长轻链和SEQ ID NO 7 的全长重链。
13.权利要求6所述的方法，其中抗体包含SEQID NO :6的全长轻链和SEQ ID NO 15的全长重链。
14.权利要求6所述的方法，其中抗体包含SEQID NO :9的全长轻链和SEQ ID NO 10的全长重链。
15.权利要求6所述的方法，其中抗体包含SEQID NO :9的全长轻链和SEQ ID NO 11的全长重链。
16.权利要求6所述的方法，其中抗体包含SEQID NO :9的全长轻链和SEQ ID NO 12的全长重链。
17.权利要求6所述的方法，其中抗体包含SEQID NO :9的全长轻链和SEQ ID NO 13的全长重链。
18.权利要求6所述的方法，其中抗体包含SEQID NO 9的全长轻链和SEQ ID NO 14 的全长重链。
19.用于皮下施用抗体的药物制剂，其包含处于10mg/ml至200mg/ml浓度范围的抗体和5%至20%具有2000至54000道尔顿分子量范围的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
20.权利要求19所述的制剂，其中抗体以30mg/ml至150mg/ml的浓度范围存在。
21.权利要求19所述的制剂，其中抗体以100mg/ml至150mg/ml的浓度范围存在。
22.权利要求19所述的制剂，其中PVP的浓度是10%。
23.权利要求19所述的制剂，其中PVP的分子量范围是从7000-11000道尔顿。
24.权利要求19所述的制剂，其包含100mg/ml的人源化2H7抗体和10%具有 7000-11000道尔顿分子量范围的PVP。
25.权利要求24所述的制剂，其中人源化2H7抗体包含表1中所示的抗体变体A、B、C、 D、F、G、H 或 I。
26.权利要求24所述的制剂，其还包含30mM乙酸钠；5%二水合海藻糖；和0.03%聚山梨酯 20，pH 5. 3。
27.权利要求26所述的制剂，其中人源化2H7抗体包含表1中所示的抗体变体A、B、C、 D、F、G、H 或 I。
28.治疗CD20阳性B细胞癌的方法，包括施用在药物制剂中治疗有效量的表1的人源化2H7抗体至患有该癌症的患者，所述的药物制剂包含5%至20%具有2000至54000道尔顿分子量范围的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
29.权利要求28所述的方法，其中⑶20阳性B细胞癌是B细胞淋巴瘤或白血病。
30.权利要求29所述的方法，其中⑶20阳性B细胞癌选自由非霍奇金淋巴瘤(NHL)、 复发惰性NHL和利妥昔单抗难治的惰性NHL、淋巴细胞主型霍奇金病(LPHD)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)组成的组。
31.权利要求29所述的方法，其中人源化2H7抗体是来自表1的变体A、B、C、D或H。
32.治疗自身免疫病的方法，包括施用在药物制剂中治疗有效量的表1的人源化2H7抗体至患有所述自身免疫病的患者，所述的药物制剂包含5%至20%具有2000至54000道尔顿分子量范围的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
33.权利要求32所述的方法，其中自身免疫病选自由类风湿性关节炎(RA)和幼年型类风湿性关节炎，包括氨甲蝶呤(Mtx)不充分应答者和TNF α-拮抗剂不充分应答者；系统性红斑狼疮(SLE)，包括狼疮肾炎；多发性硬化(MS)，包括复发-缓解型多发性硬化(RRMS)； 韦格纳病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化、银屑病、IgA肾病、IgM多发性神经病、 重症肌无力、ANCA相关血管炎、糖尿病、Reynaud综合征、Sjogren综合征、视神经脊髓炎 (NMO)和肾小球肾炎组成的组。
34.权利要求33所述的方法，其中人源化2H7抗体是来自表1的变体A、B、C、D或H。
35.在注射时于患者的注射部位处改善或维持水性皮下制剂中抗体的溶解或使该抗体沉淀最小化的方法，包括添加5%至20%具有2000至54000道尔顿分子量范围的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)至该水性皮下制剂。
36.权利要求35所述的方法，其中抗体是表1中所示的人源化抗CD20抗体变体A、B、 C、D、F、G、H 或 I。
37.增加待皮下施用的抗体的生物利用率的方法，包括添加5%至20%具有2000至 54000道尔顿分子量范围的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)至包含该抗体的水性皮下制剂。
38.权利要求37所述的方法，其中抗体是表1中所示的人源化抗CD20抗体变体A、B、 C、D、F、G、H 或 I。
39.用于评价赋形剂减少抗体或其他大分子在生理条件下聚集的能力的体外透析方法，包括(a)将含有和不合有试验赋形剂的该大分子的制剂针对改良PBS溶液(167mM钠，140mM 氯化物，17mM磷酸盐，4mM钾)在37°C伴随恒定搅拌的情况下透析；(b)从改良PBS溶液取出试样；和(C)测量试样中的浊度和试样中存在的蛋白质的量，其中在含有试验赋形剂的测定法中与缺少赋形剂的对照相比，样品中增加的蛋白质浓度和减少的浊度指示试验赋形剂减少大分子聚集的能力。
40.权利要求39所述的方法，其中制剂在具有1百万道尔顿分子量截止值的透析管中透析。
41.权利要求39所述的方法，其中使用UV光谱测定法测量试样中的蛋白质浓度和浊度。
42.权利要求39所述的方法，还包括对改良的PBS溶液和透析管内部的溶液目视检查沉淀，其中与缺少赋形剂的对照相比，在含有试验赋形剂的透析管中的沉淀减少指示试验赋形剂减少大分子聚集的能力。
全文摘要
本发明提供了用于通过添加5％至20％具有2000至54000道尔顿分子量范围的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)减少大分子如蛋白质在生理条件下聚集并抑制其絮凝的方法。本发明还提供了在皮下施用大分子期间使注射部位处炎症最小化的方法。在进一步的方面，本发明提供了用于皮下施用大分子的药物制剂和治疗CD20阳性癌症或自身免疫病的方法，所述方法包括施用在本发明药物制剂中的人源化抗CD20抗体。本发明还提供了评价赋形剂减少抗体或其他大分子在生理条件下聚集的能力的体外透析方法。
文档编号A61K39/00GK102281902SQ200980154665
公开日2011年12月14日 申请日期2009年11月16日 优先权日2008年11月17日
发明者A·瓦卡恩卡尔, B·洛博, H-C·马勒, P·哥德巴赫, R·L·黄, S·洛, Y·J·王 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司