含有抗癌剂和对l1cam的活性和表达具有抑制作用的物质的抗癌组合物的制作方法

专利名称：含有抗癌剂和对l1cam的活性和表达具有抑制作用的物质的抗癌组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗癌组合物，所述的组合物含有抑制LlCAM活性或表达的抑制剂和抗癌剂。更具体地，本发明涉及一种抗癌组合物，所述的组合物含有作为LlCAM活性抑制剂的对LlCAM有特异性的抗-LlCAM的抗体或作为LlCAM表达抑制剂的抑制LlCAM表达的寡核苷酸，和选自顺钼，吉西他滨，5-氟尿嘧啶和紫杉醇的抗癌剂，其中所述的组合物比两种物质中的任何一种的单独给药都显示出更好的增效治疗效果，并且因此可以有效地治疗癌症，特别是治疗表达LlCAM的癌症。
背景技术：
Ll细胞黏附分子(LlCAM)是一种整合细胞膜糖蛋白，它属于可以介导细胞表面上细胞与细胞之间黏附的细胞黏附分子(CAMs)的免疫球蛋白超家族，分子量是220kDa。 LlCAM最初在神经细胞中被发现并已知执行神经移植，神经轴突生长和细胞迁移的功能。已知LlCAM在正常组织和神经组织中进行表达，并且最近在多种类型的癌细胞中检测到它。已经报道了 LlCAM和多种癌症之间的关系。例如，报道了 LlCAM在例如黑素瘤，成神经细胞瘤，卵巢癌和结肠癌的多种肿瘤中进行表达(Takeda，et al.，J. Neurochem. 66 2338-2349,1996 ；Thies et al, Eur.J. Cancer,38 :1708-1716,2002 ；Arlt et al. , Cancer Res. 66 :936-943,2006 ；Gavert et al.，J. Cell Biol. 168 :633-642,2005)。还发现 LlCAM 作为裂解产物和膜结合的形式在细胞外分泌(Gutwein et al. , FASEP J. 17(2) :292-4, 2003)。近年来，LlCAM作为在癌细胞生长中起重要作用的一种分子(Primiano，et al.， Cancer Cell. 4(1) :41-53 2003)被研究并在癌症治疗中作为新靶^)04. 6. 17提交的 US2004/0115206 Al)出现。目前，已经发现LlCAM的抗体能抑制卵巢癌细胞的生长和转移 (Arlt, et al.，Cancer Res. 66 :936-943. 2006)。第117 号EP专利申请和第2004/0259084号美国专利申请公开了一种卵巢癌或子宫内膜癌的诊断和预后方法，其特征在于，确定病人样本中的LlCAM水平，这是基于LlCAM的存在能指示卵巢癌或子宫内膜癌的存在或是这种癌症的潜在的易患病的体质， 上述申请还公开了一种治疗病人的卵巢癌或子宫内膜癌的方法，所述的方法包括将足量的 LlCAM抗体或其共轭到细胞毒素药物的片段给药给病人。但是，上述提到的专利仅仅公开了 LlCAM蛋白是血清或组织中对卵巢癌或子宫内膜癌有特异性的标记物。第2004/0115206号美国专利申请公开了一种使用特异性地结合到LlCAM的抗体， 用于诱导例如乳腺癌，结肠癌和子宫颈癌的癌细胞的细胞凋亡的试剂，所述的抗体对细胞凋亡的用途，和含有所述的LlCAM抗体的药物组合物。如在这一专利中所述的，可以通过将癌细胞与足以在癌细胞中用于抑制细胞生长或诱导细胞凋亡的有效量的抗-LlCAM的抗体接触抑制细胞生长并细胞凋亡。第PCT/EP2005/008148号国际专利申请公开了一种在卵巢癌和子宫内膜癌中过表达的LlCAM蛋白，用于抑制LlCAM表达的药物组合物，和使用这种组合物用于预防和治疗卵巢癌和子宫内膜癌的方法。这一专利公开的药物组合物含有抑制卵巢和子宫内膜癌的功能并阻断癌细胞转移和生长的抗-LlCAM抗体或其衍生物，因此实现了癌症的治疗。最近，第10-2007-0084868号KR专利申请公开了小鼠免疫胆管癌细胞系以获得单克隆抗体(A10-A;3)，这一抗体被确定可以特异性地识别L1CAM，LlCAM被确定在胆管癌细胞表面进行表达，LlCAM的表达速度和胆管癌病人的存活率之间的相关性的统计分析显示具有高LlCAM表达速度的胆管癌病人的死亡率远远高于具有低LlCAM表达速度的胆管癌病人的死亡率，这证明了 LlCAM是胆管癌的预后不良因子，并且体外和体内动物试验结果证实 LlCAM的抗体显示出了对胆管癌细胞的生长，转移或侵袭的抑制活性，这显示出LlCAM对胆管癌的有效的诊断和治疗效果。大量近期的研究报道了 LlCAM通过C2-神经酰胺，星形孢菌素，顺钼和组织缺氧抑制卵巢癌的凋亡(Stoeck A.et al Gynecol Oncol. 2007 ； 104 (2) :461-469)，并且使用顺钼治疗的卵巢和胰腺癌细胞中LlCAM有所增加。但是，这些现有技术都没有公开能抑制LlCAM作用的抗体与抗癌剂的联合给药使癌症的治疗效果增效的内容。在此使用的术语“抗癌剂”通常指作用于癌细胞的多种代谢路径并对癌细胞显示出细胞毒素或抑制细胞生长的效果的药物。根据它们的作用机理和化学结构，目前开发的抗癌剂被分成抗代谢剂，植物生物碱，异构酶抑制剂，烷基化剂，抗肿瘤抗生素，激素制剂和其它药物。抗癌剂具有不同的细胞内靶，阻断细胞的DNA的复制，转录和翻译并抑制对细胞存活重要的蛋白的作用。这种对细胞内靶的作用通过并发的坏疽或凋亡过程导致细胞的凋亡。这些抗癌剂作用的机理不仅对癌细胞有特异性，还对正常细胞有特异性，因此在服用抗癌剂时，不可避免的引起了正常组织的损坏(即，毒性)。但是，癌细胞和正常细胞代谢之间存在巨大的差异。因此，抗癌剂对癌组织更具毒性。这种抗癌剂的选择毒性可以进行临床的化疗。具有较高治疗指数的抗癌剂被认为是安全的，因为它们消灭了癌细胞而没有给正常组织带来毒性。目前，已经开发了约50种的抗癌剂，使用的抗癌剂的类型根据癌症的类型和特点可以改变并且抗癌剂可以单独给药或与其它治疗癌症的化疗结合给药。最常用的抗癌剂是 DNA烷基化剂(例如，环磷酰胺和异环磷酰胺)，抗代谢剂(例如，甲氨蝶呤)，叶酸抑制剂， 嘧啶抑制剂(例如，5-氟尿嘧啶)，微管抑制剂(例如，长春新碱，长春碱和紫杉醇)，DNA嵌插剂(例如，阿霉素和顺钼)，激素药物(例如，三苯氧胺和氟他胺)等等。在1968年开发的顺钼作为抗癌剂具有细胞毒性并已知与DNA双链共轭并因此连接到相邻的DNA上以阻止DNA链的分离并因此抑制了细胞分裂。顺钼是最广泛使用的抗癌剂，特别是在用于例如卵巢癌，睾丸癌和脑癌和颈部癌症的实体癌的治疗中。但是， 由于内在或外在因素，对顺钼具有耐受性的癌症来说，顺钼的使用受到限制(Andrews， P. A. and Howell, SB. (1990)Cancer cells. ；Kelley, s. 1. and Rozencweig, M(1989)Eur. J. Clin. Oncol. 25 :1135-1140 ；Perez, R. P. et al. (1990)Pharmacol. Ther. 48 :19-27 ；和 Timmer-Bosscha, H. et al. (1992)Br. J. Cancer 66:227-238)。因此，通过顺钼和抵抗诱导因子的抑制剂的结合给药的治疗方式是需要的。已知作为核苷类似物的吉西他滨(2’ -脱氧-2’，2’ - 二氟胞嘧啶)是一种抗癌剂，它通过DNA合成抑制细胞增殖并用于例如膀胱癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，胆管癌和胰腺癌的实体癌的治疗中。尽管临床出众的疗效，使用的吉西他滨的浓度非常有限，这是因为例如贫血症，白血球减少症，嗜中性白血球减少症，肝酶升高，呕吐和发热的严重副作用的存在。因此，需要一种结合的药物，其中吉西他滨的含量应尽可能的低并且可以改进它的治疗效果。已知作为细胞毒素抗代谢剂的5-氟尿嘧啶是用于治疗例如胃癌，乳腺癌，脑癌和颈部癌症的实体癌的抗癌剂，特别地，它被广泛地与其它抗癌剂进行结合使用。具体地， 当5-氟尿嘧啶与甲酰四氢叶酸的钾盐或亚叶酸结合给药时，已知5-氟尿嘧啶在治疗实体 ■中t匿当.双(Malet-martino Metal. Clinical studies of three oral prodrugs of 5-fluorouracil (Capecitabine, UFT, S-l) :A review. 0ncologist2002 ;4(4)228—323)。 但是，5-氟尿嘧啶仅仅适用于静脉给药，因为当它口服给药时，显示有细胞毒素和低生物效价。此外，在显示出对二氢嘧啶脱氢酶(DPD)有强烈活性的病人的治疗中，由于85%或更多的5-氟尿嘧啶被DPD酶失活，5-氟尿嘧啶受到了限制。因此，对5-氟尿嘧啶和其它抗癌剂的结合给药以改进5-氟尿嘧啶的疗效存在需求(Ma let-martino M等)。多西紫杉醇(Taxol )和紫杉醇，其衍生物是用于治疗实体癌或高转移性恶性肿瘤的抗癌剂，第0253738号EP专利和第92/09589号国际公布专利申请公开了一种制备多西紫杉醇的方法。使用的多西紫杉醇的用量是60到300mg/m2，根据病人个体差异可以改变。通常，每小时或更长时间以60到100mg/m2的含量静脉给药多西紫杉醇持续三周(Textbook of Medical Oncology, Franco Cavelli et al.，Martin Dunitz Ltd.， p. 4623(1997))。大量的临床研究显示出多西紫杉醇在治疗乳腺癌中的疗效，并且在一次或两次试验后观察到了这一疗效。发现多西紫杉醇的作用模式是增加微管合成并抑制微管的解聚合作用。

发明内容
技术问题为了开发出具有作为抗癌剂潜在效果的活性成分而所进行的大量研究中，本发明人发现通过使用对LlCAM活性或表达有抑制作用的抑制剂和现有的抗癌剂相结合的抗癌剂显示出了相当出众的效果，它们中的每一种都可以单独使用。本发明基于这一发现而完成。技术方案根据本发明的一个方面，提供了一种含有对LlCAM活性或表达有抑制作用的抑制剂和抗癌剂的抗癌组合物，与它们中的每一种的单独给药进行比较，所述的抗癌组合物显示出了增效的治疗效果，并因此对于治疗表达LlCAM的癌症是有效的。有益效果当服用根据本发明的含有对LlCAM活性或表达有抑制作用的抑制剂和抗癌剂的抗癌组合物时，LlCAM活性或表达的抑制剂和在其中含有的抗癌剂可同时，分别或连续组合使用。结果，与通过这些物质中的每一种的单独给药的药物效果进行对照，所述的组合物在抑制癌细胞的生长和凋亡中显示出了相当大的有效的且明显的效果，因此，在治疗癌症，特别是在已知的LlCAM表达的癌症的例如卵巢癌，子宫内膜癌，子宫颈癌，乳腺癌，结肠癌， 黑素瘤，成神经细胞瘤，胆管癌，肺癌和胰腺癌的多种癌症的治疗中特别有效。


本发明的上述和其它目的，特点和其它优点将结合附图由下面的详细说明变得更加容易地理解，其中图1 (A)显示了在表达LlCAM的胆管癌细胞系(SCK)中的抑制细胞增殖活性的分析结果，其服用了 LlCAM的抗体(A10-A3)，顺钼，或A10-A3和顺钼的组合物，和图I(B)显示了在表达LlCAM的胆管癌细胞系(SCK)中的诱导细胞凋亡活性的分析结果，其服用了 LlCAM 的抗体(A10-A;3)，顺钼，或A10-A3和顺钼的组合物；图2显示了服用了 mlgG，LlCAM的抗体(A10-A3)，顺钼，或A10-A3和顺钼的组合物的小鼠组(n = 10)中和在感染有表达LlCAM的胆管癌细胞系(SCK)的小鼠异种移植物模型中的肿瘤生长；图3 (A)和3 (B)显示了服用LlCAM的抗体(Α10-Α3)，吉西他滨，或Α10-Α3和吉西他滨的组合物之后的表达LlCAM的胆管癌细胞系(SCK)和卵巢癌细胞系(SK-0V3)中的抑制细胞增殖活性的分析结果；图4(A)和4(B)显示了服用LlCAM的抗体(Α10-Α3)，5_氟尿嘧啶，或Α10-Α3和 5-氟尿嘧啶的组合物之后的表达LlCAM的胆管癌细胞系(SCK)和卵巢癌细胞系(SK-0V3) 中的抑制细胞增殖活性的分析结果；图5 (A)显示了表达LlCAM的细胞系和对照组的细胞系中mRNA和蛋白水平的对照结果，其中在表达LlCAM的胆管癌细胞系(SCK)中的LlCAM的表达使用对LlCAM有特异性的siRNA进行抑制；图5(B)显示了在细胞系中通过顺钼的共同给药和对照组的细胞系中细胞增殖的活性抑制，其中在表达LlCAM的胆管癌细胞系(SCK)中的LlCAM的表达使用对LlCAM有特异性的siRNA进行抑制；和图5(C)显示了在细胞系中通过顺钼的共同给药和对照组的细胞系中对细胞凋亡的活性抑制，其中在表达LlCAM的胆管癌细胞系(SCK)中的LlCAM的表达使用对LlCAM有特异性的siRNA进行抑制。
具体实施例为了实现上述目的，根据一个方面，本发明涉及一种抗癌组合物，包括下面的成分 (a)和(b)作为活性成分可同时，分别或连续使用(a) LlCAM活性或表达的抑制剂；和(b)抗癌剂。在一个实施例中，本发明组合物可以含有(a)LlCAM活性的抑制剂。优选地，LlCAM 活性的抑制剂是抗LlCAM的抗体，其特异性地识别已知作为癌细胞表面抗原或表面分泌抗原的L1CAM。这一抗体包括所有的单克隆抗体，它的嵌合抗体和人源化抗体。新抗体和现有技术中已知的抗体落入本发明的抗体的范围中，它们可以通过现有技术中已知的方法进行制备。例如，本发明的组合物中含有的抗体可以通过用于制备单克隆抗体的已知方法或用于嵌合和人源化单克隆抗体的已知方法简单地进行制备。例如，可以使用来自免疫动物的 B淋巴细胞通过制备杂交瘤进行单克隆抗体的制备(Koeher and Milstein，1976，Nature,256 :495)，或通过噬菌体显示技术进行制备。本发明不限于上述的制备方法。使用噬菌体显示技术的抗体库是这样一种方法，抗体基因直接从B淋巴细胞获得而不用制备杂交瘤在噬菌体表面表达抗体。噬菌体显示技术的使用避免了通过B细胞的永生化生成单克隆抗体带来的有关的常见的问题。常见的噬菌体显示技术包括1)将具有随机序列的寡核苷酸掺入对应噬菌体外壳蛋白PlII (或pIV)的N-末端的基因位点；2) 表达含有部分天然外壳蛋白和由具有随机序列的寡核苷酸编码的多肽的融合蛋白；3)处理结合到寡核苷酸所编码的多肽上的受体；4)使用具有低pH值或键合竞争力(bonding competitiveness)的分子对结合到所述的受体的肽-噬菌体粒子进行洗脱力)通过淘选方法对宿主细胞中被洗脱的噬菌体进行扩增；6)重复上述过程以获得需要的水平；和7)确定通过淘选方法选择的噬菌体克隆的DNA序列中具有活性肽的序列。因此，LlCAM特异性的抗LlCAM可以使用噬菌体显示技术进行制备，其中结合到LlCAM的抗体由人类抗体库通过淘选方法进行筛选，或用LlCAM蛋白的免疫鼠形成人类抗体库，或制备杂交瘤以制备结合到LlCAM的抗体。更具体地，所述的抗体是公开在第10-0756051号韩国专利和/或第10-2008-0018149号韩国专利申请中的抗LlCAM的抗体，并且A10-A3抗体可以根据已知文献中公开的方法进行制备，并优选通过具有KCTC 10909BP的登录号的杂交瘤进行筛选和制备。所述杂交瘤于2006年2月20日保藏在位于韩国大田的韩国典型培养物保藏中心(KRIBB)并指定保藏号为KCTC10909BP。只要抗体具有LlCAM的结合特异性，它们就包括具有两条全长度的重链和两条全长度的轻链的完整形式和抗体分子的功能性抗原片段的形式。在此使用的术语“抗体分子的功能性抗原片段”指保留至少一种抗原结合功能的片段，并且它们的例子包括Fab， F(ab，)，F(ab' )2，Fv 等等。在另一个实施例中，抗癌组合物可以包括(a)LlCAM表达的抑制剂。当它在表达 LlCAM的癌细胞中的表达水平被LlCAM表达的抑制剂抑制时，介导癌细胞生长和转移的 LlCAM的作用减少，因此能够治疗癌症。LlCAM表达的抑制剂优选选自由siRNA，shRNA和反义寡核苷酸组成的组，并较优选的是含有5 ‘ -GCCAATGCCTACATCTACGTT-3 ‘(序列号ID No. 1)序列的 siRNA。在此使用的术语“siRNA”指具有20个核苷酸大小的小核苷酸分子，它介导RNA的干扰或基因的沉默。在此使用的术语“shRNA”指短发夹状RNA，其中siRNA靶序列的正和反义序列被设置成中间插入由5到9碱基构成的环状结构。目前，已经研究了 RNA的干扰 (RNAi)现象可应用于以基因水平控制蛋白表达的方法中。通常，通过特异性地结合到具有与靶基因互补的序列的mRNA，siRNA已经显示出了对蛋白表达的抑制。根据本发明的组合物中含有的siRNA可以通过直接化学合成(Sui G. et. al, (2002)Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520)或使用体外转录合成进行制备 (Brummelkamp T R et al.，(2002) Science 296 :550-553)，但是本发明不限于这些方法。此外，设计shRNA以克服siRNAs的缺点，包括生物合成高成本和转染低效率，导致RNA干扰效果持续时间短。shRNAs可使用整合到细胞中的腺病毒，慢病毒或质粒表达带菌系统由RNA 聚合酶III基的启动子进行表达。已知shRNA通过存在于细胞中的siRNA操作酶(Dicer 或RNase III)被转变成具有已知结构的siRNA并然后诱导靶基因的沉默。在此使用的术语“反义”指具有核苷酸碱基和亚单元与亚单元主链的序列的低聚物，从而通过Watson-Crick碱基配对，使反义低聚物与RNA中的靶序列杂交以生成RNA 低聚物的异源双链体，通常在靶序列中具有mRNA。所述的低聚物可以具有与靶序列互补的精确序列或接近互补的序列。这些反义的低聚物可以阻断或抑制mRNA的翻译，和/或修饰 mRNA的过程以产生mRNA的剪接变体。因此，本发明的反义低聚物是与LlCAM基因的mRNA 互补的反义低聚物。此外，本发明的组合物含有与(a)结合给药的抗癌剂(b)。在此使用的术语“抗癌剂”通常指用于治疗癌细胞的已知的药物，它们作用于癌细胞的多种代谢路径并在癌细胞中显示出细胞毒性或抑制细胞生长的效果，并包括迄今为止的所有的抗癌剂，包括抗代谢剂，植物生物碱，异构酶抑制剂，烷基化剂，抗肿瘤抗生素，激素制剂和其它药物。本发明的组合物中含有的并显示出对LlCAM的活性或表达有抑制效果的抗癌剂优选是顺钼系列，例如顺钼，卡钼和庚钼，吉西他滨，5-氟尿嘧啶和例如多西紫杉醇和它的衍生物(紫杉醇)的紫杉醇系列。特别优选的抗癌剂是顺钼。这些抗癌剂可以通过已知方法制备或商业获得。在本发明中，LlCAM活性或表达的抑制剂和抗癌剂可以同时结合给药，或所述的物质和所述的抗癌剂可以分别同时或连续给药，或间隔分别给药。在非同时给药的情况下，例如，两种活性成分交替给药，或一种连续给药而另一种然后给药。本发明的组合物不限于于此，只要它含有作为活性成分的LlCAM活性或表达的抑制剂和抗癌剂，并且可以是药物的任何类型。例如，含有两种活性成分的组合或单一制剂的形式提供所述的组合物。在此使用的术语“组合制剂”指在一种配方中含有两种或多种活性成分的混合物的制剂，而在此使用的术语“单一制剂”指在一种配方中含有一种活性成分的制剂。根据药物和药效特性，可以制备并将以确定的配方形式进行组合所述的活性成分。在本发明中，以单一制剂提供的含有两种活性成分的治疗剂是指组合的药物，其中每种单一制剂可以被单独使用。在两种活性成分以单独的剂型提供的情况下，所述的制剂可以是含有所述的两种成分的试剂盒的形式。此外，本发明的抗癌组合物可以每日或间歇给药并可以每日一次或多次进行给药。在以单一制剂形式提供两种活性成分中的每一种的情况下，其给药次数可以是相同的或不同的。本发明的抗癌组合物可以单独配制或与下述的适合的药物可接受的载体或赋形剂结合进行配制。配方的例子包括例如软胶囊，硬胶囊，片剂，糖浆的口服配方，注射配方和外用配方。所述的药物可接受的载体可以包括用于例如无菌溶剂，片剂，糖衣片和胶囊的配方中的已知的标准药物载体。通常，所述的载体包括的赋形剂如聚乙烯吡咯烷酮，糊精，淀粉，牛奶，糖，特定类型的粘土，凝胶，硬脂酸盐，滑石，植物油(例如，食用油，棉籽油，椰子油，杏仁油或花生油)，油脂例如中性脂肪酸甘油酯，矿物油，凡士林，动物脂和油，纤维素衍生物(例如，微晶纤维素，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素或甲基纤维素)和其它已知的赋形剂。所述的载体还可以包括抗氧化剂，湿润剂，粘性稳定剂，风味剂，增色剂和其它成分。可以根据已知的方法配制含有所述载体的组合物。此外，药物组合物可以对癌症治疗有效的药量进行给药。可以使用标准临床技术优化常规剂量和(a)和(b)成分的比例。
在另一发明，本发明涉及一种使用所述的抗癌组合物治疗癌症的方法。具体地，本发明的治疗方法包括将有效药量的抗癌组合物给药于病人。所述的抗癌组合物可以肠道外注射，皮下注射，腹腔注射，肺腔注射或鼻腔注射给药。对于局部治疗， 如果需要，组合物可以使用包括病灶内给药的适合方法进行给药。肠道外注射包括肌内，静脉，动脉，腹腔和皮下途径。优选的给药方式包括静脉，皮下，皮层，肌内和点滴注射。如上所述的，根据多种因素可以改变物质的剂量，并且包括口服和肠道外注射途径的给药途径还可以根据病人的年龄，服药周期，体重，疾病的严重性，病人的感觉和共同给药的类型进行确定。此外，物质可以分别同时，连续或间歇进行给药。在另一方面，本发明涉及抗癌组合物用于制备治疗癌症的药物的用途。具体地，由本发明的组合物治疗的癌症的例子包括但不限于，胆管癌，子宫内膜癌，子宫颈癌，乳腺癌，结肠癌，卵巢癌，黑素瘤，成神经细胞瘤，肺癌和胰腺癌。治疗癌症的药物的制备可以通过上述方法和现有技术中已知的技术进行。在另一方面，本发明涉及抗癌组合物在治疗癌症中的用途。具体地，由本发明的组合物治疗的癌症的例子包括但不限于，胆管癌，子宫内膜癌，子宫颈癌，乳腺癌，结肠癌，卵巢癌，黑素瘤，成神经细胞瘤，肺癌和胰腺癌。在一方面，本发明的发明人给表达LlCAM的癌细胞施用抑制LlCAM作用的单克隆抗体(A10-A3)，和顺钼，吉西他滨或5-氟尿嘧啶，以证实当抗LlCAM的抗体和抗癌剂结合给药给癌细胞时，与它们中的每一种单独给药进行对照，癌细胞的增殖被更有效地抑制了。因此，证实了共同给药显示了 80%或稍低的对癌细胞增殖的抑制，这显示出与单独给药进行对照，共同给药显示出了有效的增效疗效。此外，为了破坏表达LlCAM的胆管癌细胞系中的 LlCAM的表达，细胞用对LlCAM有特异性的siRNA进行转染，培养并然后进行细胞增殖和细胞凋亡试验。结果看到当胆管癌细胞系中的LlCAM的表达被抑制时，顺钼抑制了细胞增殖并促进诱导细胞凋亡。当服用了根据本发明的含有LlCAM活性或表达的抑制剂和抗癌剂的抗癌组合物时，与它们单独给药对照，所述的组合物显示出有效的增效治疗效果，因此在治疗多种癌症中非常有效，特别是例如卵巢癌，子宫内膜癌，子宫颈癌，乳腺癌，结肠癌，黑素瘤，成神经细胞瘤，胆管癌，肺癌和胰腺癌的表达LlCAM的癌症中。下面，本发明将参考下面的例子进行详细地说明。这些例子仅仅是说明本发明而不能解释为限制本发明的范围和精神。实例例1.癌细胞的培养在37°C，5% C02的恒温箱中使用下面的含有10%的胎牛血清(Gibco Co. Ltd.) 培养基培养癌细胞系。SCK (胆管癌细胞系)和SK-0V3(卵巢癌细胞系)使用DMEM培养基进行培养(Well GENE Co. Ltd.)。SCK细胞系从Dr. Daegon Kim(Me dical School,Chonbuk National University)获得，而卵巢癌细胞系从ATCC购买。例2. LlCAM的抗体和顺钼的共同给药对癌细胞增殖的抑制和凋亡的增效效果为了证实当抑制LlCAM作用的单克隆抗体(A10-A3)和顺钼共同给药给表达LlCAM 的癌细胞时细胞增殖比与它们中的每一种单独给药更有效地被抑制了，进行细胞增殖试
验。 9
用作抗LlCAM的抗体的A10-A3抗体的制备方法公开于第10-2008-0018149号韩国专利申请。各自的癌细胞在每孔中含有3mL的培养液的6孔板上以2 X 105细胞/孔的密度进行培养。所述的细胞单独使用顺钼或A10-A3(10yg/ml)或结合使用二者进行处理，然后在37°C的C02反应器中培养72小时。收集所述的细胞，使用0. 2%的台盼蓝溶液计数凋亡的和活细胞，并以百分比表示活细胞占总细胞的数量。因此，可以看到，单独使用顺钼或Α10-Α3(10μ g/ml)处理的组显示出对癌细胞增殖的30-50%的抑制，而结合使用顺钼和 A10-A3(10yg/ml)处理的组显示出对癌细胞增殖的80% (最大值)的增效的抑制效果(图 1㈧)。此外，为了证实当LlCAM的抗体(A10-A3)和顺钼共同给药于表达LlCAM的癌细胞时诱导的细胞凋亡比它们中的每一种单独给药更有效而进行了细胞凋亡试验。这一试验利用了当细胞凋亡时DNA成为片段这一原理。各自的癌细胞系在含有100 μ 1的培养液的96 孔板上以2X104细胞的密度进行培养，顺钼或Α10-Α3(10 μ g/ml)单独或结合进行给药并培养M小时。M小时之后，培养液被丢弃，所述的细胞用PBS缓冲液进行冲洗并与细胞溶解液(RIPA缓冲液)在37°C反应30分钟。DNA特异性生物素结合到所述的细胞溶液中，将 20 μ 1所获得的溶液转移到含有链酶亲和素的96孔板上，将80 μ 1的免疫试剂与其进行反应，在405mm的OD测定获得的物质的吸光率。结果显示，当A10-A3和顺钼结合给药时，与每种单独给药进行对照，显示出细胞凋亡明显地增加(图1(B))。结果表明LlCAM抗体和顺钼的共同给药改进了癌细胞的治疗效果。例3. A10-A3和顺钼共同给药对小鼠动物模型中的癌生长的抑制效果从日本SLC，Animal Inc.的中央试验室购买裸鼠Balb/c nu/nu。小鼠6到8周大，体重 18 至Ij 22g 并在 Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology 的试验室中适应1周。将SCK细胞(3X107)皮下移种到40只小鼠中，并在一周后当生长到肿瘤块具有100到200mm3的大小时，随机将它们分成四组。以10mg/kg的剂量，每周三次将A10-A3给药给小鼠。以:3mg/kg的剂量，每周两次将顺钼给药给小鼠。作为对照组，代替A10-A3，以相同的含量将mlgG给药，并代替顺钼，以相同的含量将盐水给药。每周三次进行裸鼠的体重和肿瘤的测量。结果，单独服用A10-A3或顺钼的组显示出了 30%的对增殖的抑制，而结合服用A10-A3和顺钼的组显示出了 70%或更高的对增殖的明显优越的抑制(图 2)。例4. LlCAM抗体和吉西他滨的共同给药对癌细胞增殖的抑制效果的分析与A10-A3或吉西他滨的单独给药进行对照，使用与例2相同的方式分析 A10-A3和吉西他滨的共同给药是否更加有效地抑制细胞增殖。结果看到在吉西他滨或 A10-A3(10yg/ml)单独给药的组显示了 20-25 % (胆管癌，SCK)或20-40 % (卵巢癌， SK-0V3)的癌细胞的增殖抑制，而共同给药显示了 40-60%的增加的癌细胞的增殖抑制(图 3㈧)。结果显示出LlCAM抗体和吉西他滨的共同给药改进了对癌细胞的治疗效果。例5. LlCAM抗体和5_氟尿嘧啶的共同给药对癌细胞增殖的抑制效果的分析与A10-A3或5_氟尿嘧啶的单独给药进行对照，使用与例2相同的方式分析 A10-A3和5-氟尿嘧啶的共同给药是否更加有效地抑制细胞增殖。结果看到在5-氟尿嘧啶或A10-A3(10yg/ml)单独给药的组显示了 20-40% (胆管癌，SCK)或20-30% (卵巢癌， SK-0V3)的癌细胞的增殖抑制，而共同给药组显示了 40-50%的增加的癌细胞的增殖抑制 (图 4)。结果显示出LlCAM抗体和5_氟尿嘧啶的共同给药改进了对癌细胞的治疗效果。例6-1.通过逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测LlCAM的mRNA表达为了破坏胆管癌细胞系(SCK)中LlCAM的表达，细胞用对LlCAM有特异性的 siRNA (5 ‘ -GCCAATGCCTACATCTACGTT-3 ‘，序列号 ID No. 1)和对 LlCAM 有非特异性的 siRNA(5‘ -CAGTCGCGTTTGCGACTGG-3‘，序列号 ID No. 2)进行转染，然后培养 72 小时。为了分离被培养的胆管癌细胞的所有RNA，细胞使用Iml的trizol试剂(Invitrogen，Inc.) 在室温下进行处理5分钟。将0. 2ml的三氯甲烷添加到细胞中，混合物剧烈震荡15次并在室温下反应3分钟。获得的溶液在4°C，HOOOrpm离心15分钟，将400 μ 1的上清液转移到另一个试管中并将相同剂量的异丙醇添加到剩余液中并将混合物在室温下反应10分钟。反应溶液在4°C，HOOOrpm离心15分钟，将上清液丢弃，并且剩余液用75%的乙醇冲洗。将oligo (d)T，dNTP, RNase抑制剂和逆转录酶添加到2ug的RNA中进行萃取并且混合物在 42°C反应 1 小时合成 cDNA。cDNA 在 30sec/95°C，30sec/56°C和 30sec/72°C 的条件下使用LlCAM引物，dNTP和Taq聚合酶进行PCR30次，然后72°C进行PCRlO分钟。结果，与使用对LlCAM非特异性的siRNA处理的对照组进行对照，用对LlCAM有特异性的siRNA处理的组显示出对LlCAM表达的总数量的减少(图5 (A)的上面)。例6-2.使用Western blotting检测LlCAM的蛋白表达为了破坏胆管癌细胞系(SCK)中的LlCAM的表达，细胞用对LlCAM有特异性的 siRNA (5 ‘ -GCCAATGCCTACATCTACGTT-3 ‘，序列号 ID No. 1)和对 LlCAM 有非特异性的 siRNA (5 ‘ -CAGTCGCGTTTGCGACTGG-3 ‘，序列号ID No. 2)进行转染，然后培养72小时，并使用Western blotting检测蛋白水平。为了分离用siRNA处理的细胞系的总蛋白，所述的细胞系用500μ 1的细胞裂解液(RIPA缓冲液)进行处理，获得的蛋白在10%的SDS-PAGE中进行分离，转移到硝化纤维膜上并进行Western blotting检测。所述的硝化纤维膜在含有 5%的脱脂牛奶的PBST(PBS+0. 吐温20)缓冲液中反应1小时并使用PBST缓冲液冲洗两次或多次。将抗LlCAM的抗体(A10-A3)作为主要抗体添加到反应过的硝化纤维膜，然后反应2小时。用PBST缓冲液冲洗获得的膜5次并与抗小鼠IgG辣根过氧化物酶HRP(1 5000S igma)反应1小时。反应溶液用PBST缓冲液冲洗5次并用作为检测试剂的增强型化学发光试剂(ECL) (Amersham biosciences)进行着色。结果，与使用对LlCAM非特异性的s iRNA 处理的对照组进行对照，用对LlCAM有特异性的siRNA处理的组显示出对表达的蛋白总数量的减少(图5(A)的下面)。例6-3.抑制LlCAM表达的siRNA和抗癌剂的共同给药对细胞增殖抑制和细胞凋亡诱导的效果分析为了破坏表达LlCAM的胆管癌细胞系(SCK)中的LlCAM的表达，细胞用对LlCAM 有特异性的 siRNA (5 ‘ -GCCAATGCCTACATCTACGTT-3 ‘，序列号 ID No. 1)和对 LlCAM 有非特异性的siRNA (5 ‘ -CAGTCGCGTTTGCGACTGG-3 ‘，序列号ID No. 2)进行转染，然后培养72小时。然后，与例2中相同的方式进行细胞增殖和细胞凋亡试验。如图5(B)和5(C)中所示的，当在胆管癌细胞系(SCK)中LlCAM的表达被抑制时，顺钼的细胞增殖抑制和细胞凋亡诱导的效果得到了改进。这些结果显示出，除了抑制LlCAM作用的抗体和抗癌剂的共同给药， 抑制LlCAM表达的siRNA和抗癌剂的共同给药同样也显示出了对癌症治理的增效疗效。工业实用性当服用根据本发明的含有LlCAM活性或表达的抑制剂和抗癌剂的抗癌组合物时， 对LlCAM活性或表达具有抑制剂效果的物质和在其中含有的抗癌剂可同时，分别或连续结合使用。结果，与通过这些物质中的每一种的单独给药的药物效果对照，所述的组合物显示出了对癌细胞的生长和凋亡相当有效的，明显的效果，因此所述的组合物用于治疗癌症是特别有用的，特别是已知表达LlCAM的多种癌症，例如，卵巢癌，子宫内膜癌，子宫颈癌，乳腺癌，结肠癌，黑素瘤，成神经细胞瘤，胆管癌，肺癌和胰腺癌。虽然本发明的优选实施例已经通过举例的方式被公开了，但是本领域的技术人员将意识到，在不背离所附的权利要求中所公开的本发明的范围和精神下，各种修改，添加和替代都是可行的。关于国际承认的用于专利目的的微生物保藏的布达佩斯条约国际表格原始保藏的受理根据7. 1条颁布的致洪孝贤韩国忠南314-923孔珠市盘浦面里乡南585_权利要求
1.一种抗癌组合物，所述的组合物包括下列(a)和(b)成分作为活性成分，所述的(a) 和(b)成分可同时，分别或顺序使用(a)LlCAM活性或表达的抑制剂；和(b)抗癌剂，其中LlCAM活性的抑制剂选自由对LlCAM有特异性的抗LlCAM抗体或其抗原结合片段，和抗LlCAM抗体的变体或其抗原结合片段组成的组，并且LlCAM表达的抑制剂是抑制 LlCAM表达的寡核苷酸，和所述的抗癌剂选自顺钼，吉西他滨，5-氟尿嘧啶，多西紫杉醇和紫杉醇。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的抑制LlCAM表达的寡核苷酸选自由反义寡核苷酸，编码LlCAM基因的siRNA和shRNA组成的组。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的抗LlCAM抗体是A10-A3抗体，它是由登录号KCTC 10909BP杂交瘤分泌的。
4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述的siRNA具有序列SEQID NO :1。
5.根据权利要求1到4中任何一项所述的组合物，其中所述的抗癌剂是顺钼。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的组合物抑制癌细胞的生长或杀死癌细胞。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的癌症选自由胆管癌，子宫内膜癌，子宫颈癌，乳腺癌，结肠癌，卵巢癌，黑素瘤，成神经细胞瘤，肺癌和胰腺癌组成的组。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的(a)和(b)成分中的每一种被配制成单独剂型。
9.一种治疗癌症的方法，所述方法包括将根据权利要求1所述的抗癌组合物进行给药。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述的癌症选自由胆管癌，子宫内膜癌，子宫颈癌，乳腺癌，结肠癌，卵巢癌，黑素瘤，成神经细胞瘤，肺癌和胰腺癌组成的组。
11.根据权利要求1所述的组合物用于制备治疗癌症的药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述的癌症选自由胆管癌，子宫内膜癌，子宫颈癌，乳腺癌，结肠癌，卵巢癌，黑素瘤，成神经细胞瘤，肺癌和胰腺癌组成的组。
13.根据权利要求1所述的组合物用于治疗胆管癌，子宫内膜癌，子宫颈癌，乳腺癌，结肠癌，卵巢癌，黑素瘤，成神经细胞瘤，肺癌或胰腺癌中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种抗癌组合物，所述的组合物含有抗癌剂和对L1CAM的活性或表达具有抑制作用的物质；更具体地，本发明涉及一种抗癌组合物，所述的组合物含有对L1CAM有特异性的抗-L1CAM的抗体，它作为抑制L1CAM的活性的物质；抑制L1CAM产生的寡核苷酸，它作为抑制L1CAM的表达的物质；和作为抗癌剂的物质，所述物质选自顺铂，吉西他滨，5-氟尿嘧啶和紫杉醇。根据本发明的组合物具有的益处是可同时，分别或顺序地组合使用对L1CAM的活性或表达具有抑制作用的物质和抗癌剂，从而证实所述的组合物比这些物质的单独使用在癌细胞的抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡方面具有更有力且更明显的药物疗效，因此使得所述的组合物对于癌症治疗是非常有用的。
文档编号A61K39/395GK102325547SQ200980154594
公开日2012年1月18日 申请日期2009年11月27日 优先权日2008年11月27日
发明者尹炫镐, 李重屷, 洪孝贞, 闵正基 申请人:韩国生命工学研究院