用于天疱疮的含有抗Fas配体抗体的药物的制作方法

专利名称：用于天疱疮的含有抗Fas配体抗体的药物的制作方法
用于天疱疮的含有抗Fas配体抗体的药物描述本发明涉及人Fas配体(也称为⑶95L或ApolL，并且在下文中缩写为i^isL)的拮抗剂的用途，更具体地涉及抗i^asL人源化抗体用于预防和/或治疗与角质形成细胞棘层松解(keratinocyte acantholysis)相关的皮肤病，特别地用于预防和/或治疗天疱疮的用途。天疱疮是因抗桥粒蛋白(桥粒芯糖蛋白，dsg)的自身抗体而引起的特征在于角质形成细胞粘着丧失的自身免疫大疱皮肤病状。天疱疮具有世界范围的分布，发病率为大约每年每100. 000人1至5例，并且女性居多。天疱疮的特征在于在称为棘层松解的过程中集拢的基底上角质形成细胞的粘着的丧失。天疱疮的发病机制正在进行大范围修正，这主要因为，除了抗桥粒芯糖蛋白抗体外，一组新的抗胆碱能受体抗体也可诱导棘层松解(Kalish，2000)。此外，已证明单独的空间位阻不能解释抗原-抗体结合后水疱的形成(Kitajima，2002)。此外，已显示桥粒的形成不受与天疱疮结合的天疱疮自身抗体(PVIgG)抑制，然而桥粒联接在用PvIgG处理后对到 36小时分离。在该时期中，一系列由PVIgG触发的信号转导步骤发生。这些观察结果表明细胞凋亡在天疱疮中的作用。事实上，天疱疮是由于细胞粘着的缺乏而引起的疾病(Payne AS等人，1978)并且细胞凋亡可伴随细胞分离发生(Marconi 等人，2004)。此类观念可通过在损伤的天疱疮皮肤中检测细胞凋亡来完全确认。特别地， 棘层松解细胞表达细胞凋亡的主要标志物(Wang X等人，2004)。更有趣地，还发现TUNEL 标记的细胞核与疱顶连接，这表明分离前凋亡细胞在损害周围的皮肤中的存在。此外，在损伤的边缘，在其中未看见细胞-细胞接触的破坏的区域中检测到表达Ig的凋亡细胞和激活的胱天蛋白酶-8 (Wang X等人，2004)。这些数据明确地证明在天疱疮中，细胞凋亡在棘层松解之前在角质形成细胞中发生。细胞凋亡在细胞动态平衡的调控中起着基本作用并且参与许多病理生理学过程。 细胞凋亡可跟随细胞间的分离(Rezgui等人，2000 ；Bergin等人，2000)和细胞-基质相互作用的丧失(Giancotti 和 Ruoslahti，1999)。Fas (或Fas 是TNF-受体超家族的成员，其在与Fas配体(FasL)结合后，在许多细胞系统中触发细胞凋亡(Sharma等人，2000)。Fas-FasL诱导的细胞凋亡的细胞内信号转导通过募集许多衔接分子例如FADD (Fas相关死亡结构域)和FLICE (FADD样ICE，胱天蛋白酶8)(其反过来被FLIP(FLICE抑制蛋白)抑制(Juo等人，1998))来起作用。Fas-FasL 相互作用参与几种免疫炎症和感染性病状例如AIDS (Bahr等人，1997)和系统性红斑狼疮 (Kovacs等人，1997)的病理机制。特征在于牵涉!^as-FasL途径的皮肤疾病(Cutaneous disease)包括急性移植物抗宿主病、中毒性表皮坏死松解和黑素瘤(Wehrli等人，2000)。 此外，已报导在用PVIgG和用抗!^asR处理的培养的角质形成细胞中观察到棘层松解样损伤，而PvIgG在损伤形成之前数小时诱导FasR、FasL和胱天蛋白酶_8在细胞膜上的聚簇 (Wang X等人，2004)。此外，已报导胱天蛋白酶_1样抑制剂在天疱疮小鼠模型中显著阻止水疱形成(Li等人，2006)。综合起来，这些数据表明1 sL和外源性(extrinsic)细胞凋亡途径在棘层松解背后的机制中起至关重要的作用。无论天疱疮自身抗体的性质是什么， 对PVIgG的暴露在棘层松解之前许多小时上调几个促细胞凋亡基因包括!^asL的表达。此外，静脉内IgG(IVIgG)预防角质形成细胞中PvIgG诱导的!^asL和细胞凋亡的上调。IVIgG 还在体内阻止棘层松解和细胞凋亡(Arredondo J等人，2005)。在不进行治疗的情况下，寻常天疱疮的死亡率达到100%。需要早期系统性治疗来控制天疱疮，但系统性治疗的副作用是主要的难题。治疗包括施用皮质类固醇、包含金的药物、抗炎药物氨苯砜(dapsone)或抑制免疫系统的药物(例如硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、环孢菌素、环磷酰胺或霉酚酸酯(mycophenolate mofetil))。天疱疮的最常见疗法目前是需要终身施用并且可引起严重副作用的类固醇。大多数天疱疮患者死于此类副作用。一些抗生素也是有效的，特别是米诺环素和多西环素(doxycycline)。偶尔使用静脉内免疫球蛋白 (IVIg)。血浆去除术是通过其从血液中除去含有抗体的血浆并且用静脉内液体或捐献的血浆进行替换的方法。除了系统性药物外，血浆去除术也可用于减少血流中抗体的量。许多新型分子也在开发中霉酚酸酯、PI-O拟4、PRTX-100、抗-CD20是作用于T和B细胞的免疫抑制药物。目前的死亡率仍然在5至25%的范围中；感染是死亡的最经常原因，长期免疫抑制治疗(主要地皮质类固醇)是仍然引起高死亡率的一个重要因素。免疫球蛋白可产生一些短期改善，但似乎不诱导持续的好转，并且其成本使得其长期使用不切实际。在血浆去除术的使用中还存在几个限制。用泼尼松或其他免疫抑制剂进行抑制并且接受血浆去除术的患者处于因败血症导致猝死的更高风险中。此外，治疗非常昂贵，并且 2周的住院期是进行治疗所必需的。因此，由于因败血症导致猝死的风险和高花费，只在其中患者明显处于即将死于疾病本身的风险中的最难医治(refractory)的情况下使用血浆去除法。本发明的目的是提供天疱疮的治疗剂。阻断!^asL的新型药物的开发将使得能够完全阻止细胞分离和皮肤损伤的形成。总地来说，本发明涉及通过施用!^asL拮抗剂来治疗与角质形成细胞棘层松解相关的皮肤病。I^asL拮抗剂可选自抗i^asL抗体，特别地人源化抗!^asL抗体或人抗!^asL抗体、Fas表达的核酸效应分子例如反义分子或能够进行RNA干扰的分子例如siRNA分子、可溶性Fas受体分子、拮抗型i^asL突变蛋白以及抑制Fas-FasL相互作用的低分子量化合物。 i^asL拮抗剂阻止角质形成细胞凋亡和随后细胞间分离(棘层松解)。因此，FasL拮抗剂特别适用于预防和/或治疗天疱疮，例如用于预防和/或治疗皮肤粘膜天疱疮。本发明涉及含有至少一种抑制!^asL的生物学效应的化合物的药剂。本文中使用的表述“抑制I^asL的生物学效应的化合物”涉及可完全或至少基本上抑制或中和i^asL的生物学效应的所有化合物。例如，抑制或中和效应可基于抑制i^asL与其天然受体的结合， 从而抑制所引起的信号传递。这可以例如通过使用结合i^asL本身的抗体或模拟Fas的可溶性受体或拮抗型I^asL突变蛋白，从而阻断!^asL与细胞受体的结合来获得。用siRNA干扰Fas或!^asL表达将阻断i^as/i^asL系统。FasL拮抗剂治疗可以是单一疗法或与适用于治疗天疱疮或其他皮肤病(特别地如上所述的疾病)的其他药剂组合提供。例如，FasL拮抗剂与类固醇的联合治疗可使得类固醇剂量显著减少。
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在本发明的特别优选的实施方案中，提供了天疱疮的治疗剂，其包含抗人Fas配体的抗体或其活性片段作为活性成分。抗体优选是嵌合、人源化或人抗i^asL抗体或抗原结合片段或衍生物，例如重组单链抗体。需要时，可将抗体缀合至效应分子，例如细胞生长抑制、细胞毒性和/或放射性化合物。根据本发明的适用于治疗与角质形成细胞棘层松解相关的皮肤病，特别地天疱疮的优选的人源化抗体描述于WO 1997/002290A1 ("Anti-Fas ligand antibodies and assay method using the same antibody”)或WO 1998/010070 Al("Humanized immunoglobulin reacting specifically with Fas Ligand or active fragments thereof and region inducing apoptosis originating in Fas Ligand humanized antibodies，，)中，其内容通过引用合并入本文。根据本发明的适合用于治疗与角质形成细胞棘层松解相关的皮肤病，特别地天疱疮的另外的优选的人抗体描述于US 7，262, 277 ("Antagonistic Anti-hFas ligand human antibodies and fragments thereof”)中，其内容也通过弓I用合并入本文。人或人源化抗体具有优于用于人治疗的小鼠抗体和在一些情况下嵌合抗体的至少3个潜在有利方面1)因为效应物部分是人，所以其可更好地与人系统的其他部分相互作用；2)人免疫系统不会将人源化抗体的构架区或C区识别为外源的，从而抗这样的注射抗体的抗体应答将低于抗完全外源的小鼠抗体或部分外源的嵌合抗体的应答；幻注射的人源化抗体将可能具有与天然发生的人抗体的半衰期更相似的半衰期，从而允许以更小的剂量和更低的频率施用。另外的优选的!^asL拮抗剂是包含Fas受体的细胞外可溶性部分的可溶性!^asR分子或具有竞争性或非竞争性拮抗活性的修饰的拮抗型i^asL分子。此类分子抑制FasL/hsR 相互作用，因为i^asL结合可溶性受体类似物或拮抗型!^asL分子结合天然受体，从而减少或完全消除生物活性i^asL与天然受体的结合。在使用SiRNA的治疗过程中，Fas和/或！^认蛋白或RNA水平的分析可用于在治疗受试者中确定治疗类型和疗程。Fas和/或！^认蛋白或RNA水平的监控可用于预测治疗结果以及确定调节与性状、状况或疾病相关的某些!^s 和/或!^asL蛋白的水平和/或活性的化合物和组合物的功效。在特别优选的方面，本发明涉及下列物质用于制造药剂的用途(i)特异于人Fas配体蛋白(FasL)的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，其中重链的互补决定区(CDR) 的氨基酸序列是(B1)CDR Hl :Asn Tyr Trp lie Gly (SEQ ID NO 1),(Id1)CDR H2 :Tyr Leu Tyr Pro Gly Gly Leu Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly(SEQ ID NO :2)，(C1)CDR H3 :Tyr Arg Asp Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr (SEQ ID NO :3)或(Cl1)通过置换SEQ ID NO :1、2和/或3的1、2或3个氨基酸衍生的序列和/或轻链的互补决定区(CDR)的氨基酸序列是(a2)CDR Ll :Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Gly (SEQ ID NO :4)，(b2) CDR L2 :Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO :5)，(C2)CDR L3 :Phe Gln Ser Asn Tyr Leu Pro Leu Thr (SEQ ID NO :6)或
(d2)通过置换SEQ ID NO :4、5和/或6的1、2或3个氨基酸衍生的序列或(ii)识别与抗体⑴相同的人!^asL上的表位的抗体或其抗原结合片段，所述药剂用于预防和/或治疗与角质形成细胞棘层松解相关的皮肤病，特别地天疱疮。在第二特别优选的方面，本发明涉及下列物质用于制造药剂的用途(i)特异于人Fas配体蛋白(FasL)的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中单克隆抗体由登录号为FERM BP-5045的杂交瘤细胞产生或是从其衍生的抗体或抗体片段，或(ii)识别与(i)的抗体相同的人!^asL的表位的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述药剂用于预防和/或治疗与角质形成细胞棘层松解相关的皮肤病，特别地天疱疮。在第三特别优选的方面，本发明涉及下列物质用于制造药剂的用途(i)特异于人Fas配体蛋白(FasL)的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，其中重链的互补决定区(CDR) 的氨基酸序列是(B1)CDR Hl :Glu Tyr Pro Met His(SEQ ID NO :7)，(Id1)CDR H2 :Met lie Tyr Thr Asp Thr Gly Glu Pro Ser Tyr Ala Glu Glu Phe Lys Gly(SEQ ID NO :8)，(C1)CDR H3 :Phe Tyr Trp Asp Tyr Phe Asp Tyr (SEQ ID NO :9)或(Cl1)通过置换SEQ ID NO :7、8和/或9的1、2或3个氨基酸衍生的序列，和/或轻链的互补决定区(CDR)的氨基酸序列是(Ei2)CDR Ll :Arg Ala Ser Gln Asp lie Ser Asn Tyr Leu Asn(SEQ ID NO 10),(b2) CDR L2 :Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser (SEQ ID NO :11)，(C2)CDR L3 :Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp Thr (SEQ ID NO :12)或(d2)通过置换SEQ ID NO :10,11和/或12的1、2或3个氨基酸衍生的序列或(ii)识别与抗体⑴相同的人!^asL上的表位的抗体或其抗原结合片段，所述药剂用于预防和/或治疗与角质形成细胞棘层松解相关的皮肤病，特别地天疱疮。在第四优选的方面，本发明涉及下列物质用于制造药剂的用途(i)特异于人Fas配体蛋白(FasL)的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中单克隆抗体由在登录号FERM BP-5533、FERM BP-5534和/或FERM BP-5535下的杂交瘤细胞产生或是从其衍生的抗体或抗体片段，或(ii)识别与(i)的抗体相同的人!^asL的表位的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述药剂用于预防和/或治疗与角质形成细胞棘层松解相关的皮肤病，特别地天疱疮。在特别优选的实施方案中，本发明涉及包含US 7，262, 277(其内容通过引用合并入本文)中描述的轻链可变区和/或重链可变区的抗i^asL人抗体或其抗原结合部分的用途。特别地，根据本发明的适用于治疗与角质形成细胞棘层松解相关的皮肤病的优
6选抗!^asL人抗体包含轻链可变区且进一步包含重链可变区，所述轻链可变区包含具有 US7J62，277(通过引用合并入本文)的SEQ ID NO 2中显示的序列的多肽，所述重链可变区包含具有US 7，沈2，277(通过引用合并入本文)的SEQ ID NO 10或18中显示的序列的多肽。更特别地，本发明涉及US7J62，277(通过引用合并入本文)中描述的抗hFas人抗体3E1 (由登录号为ATCC PTA-4017的杂交瘤细胞产生)和/或4G11 (由登录号为ATCC PTA-4018的杂交瘤细胞产生)用于制造药剂的用途，所述药剂用于预防和/或治疗与角质形成细胞棘层松解相关的皮肤病，特别地天疱疮。在另外的优选方面，本发明涉及下列物质用于制造药剂的用途(i)特异于人Fas配体蛋白(FasL)的单克隆人抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，其中重链的互补决定区 (CDR)的氨基酸序列是(B1)CDR Hl :Arg His Gly lie Thr(SEQ ID NO :13)或(Ei2)CDR Hl :Ser His Gly lie Ser (SEQ ID NO :14)，(Id1)CDR H2 :Trp lie Asn Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Val Gln Gly(SEQ ID NO :15)或(b2)CDR H2 :Trp lie Asn Ala Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly (SEQ ID NO :16)，(C1)CDR H3 :Glu Thr Met Val Arg Gly Val Pro Leu Asp Tyr (SEQ ID NO :17)或(C2)CDR H3 :Glu Thr Met Val Arg Gly Val Pro Cys Asp Tyr (SEQ ID NO :18)， 或(Cl1)通过置换SEQ ID NOs 13，14，15，16，17和/或18的1、2或3个氨基酸衍生的序列，和/或轻链的互补决定区(CDR)的氨基酸序列是(Ei3)CDR Ll :Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala (SEQ ID NO 19),(b3) CDR L2 :Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr (SEQ ID NO :20)，(C3)CDR L3 :Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr (SEQ ID NO :21)或(d3)通过置换SEQ ID NO :19,20和/或21的1、2或3个氨基酸衍生的序列，或(ii)识别与抗体⑴相同的人!^asL上的表位的抗体或其抗原结合片段，所述药剂用于预防和/或治疗与角质形成细胞棘层松解相关的皮肤病，特别地天疱疮。在最后另外的优选方面，本发明涉及下列物质用于制造药剂的用途(i)特异于人Fas配体蛋白(FasL)的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中单克隆抗体由在登录号ATCC PTA-4017和/或ATCC PTA-4018下的杂交瘤细胞产生或是从其衍生的抗体或抗体片段，或(ii)识别与(i)的抗体相同的人!^asL的表位的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述药剂用于预防和/或治疗与角质形成细胞棘层松解相关的皮肤病，特别地天疱疮。登录号为ATCC PTA-4017和ATCC PTA-4018的杂交瘤细胞已于2002年1月29日保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgina 20110—2209(USA))。可将本发明的药剂与可药用的载体一起以药物组合物的形式提供。优选，通过注射或输注，例如静脉内、动脉内、皮下、腹膜内，或通过其他合适的方法施用药物组合物。可局部或全身性地施用组合物。优选，全身性地施用组合物。适用于本发明的药物组合物以达到期望的目的的有效量包含活性剂。取决于施用途径，本发明的药剂的有效剂量可在0. 1 μ g至lOOmg，直至大约Ig的总剂量的范围内。可以每天，例如一次或数次，或每2至4天一次，每周一次或每2周一次施用药物组合物。可以以由一次或数次药剂施用组成的单个治疗周期或以各自由一次或数次药剂施用组成的数个治疗周期施用药剂。各治疗周期可具有1天直至数周、数月或甚至数年的持续时间。因此，根据本发明，还可将药剂与至少一种有效地抗与角质形成细胞棘层松解相关的皮肤病，特别地抗天疱疮的另外的疗法一起用于联合治疗。可单独地或与其他免疫抑制药物，特别地与类固醇组合(以减少它们的剂量和/或使它们的慢性副作用降至最低) 使用药剂。当组合使用时，优选在每月一次的基础上施用药剂。当单独使用时，优选在取决于个体情况的时间范围内连续施用药剂。此外，通过下列实施例更详细地解释本发明。
实施例我们首先通过TUNEL染色在来自冷冻切片(来自未治疗的天疱疮患者)中的损害周围的皮肤的表皮中评估细胞凋亡的存在。通过共聚焦扫描激光显微镜检查分析荧光样品。在来自损害周围的表皮的基底上层中，与正常皮肤相比，大部分角质形成细胞是凋亡的 (图 1)。为了确认天疱疮损伤中的细胞凋亡，我们使用福尔马林固定的和石蜡包埋的活检组织并且检测胱天蛋白酶-3的活性形式。按照厂商说明书，使用UltraVision LP Detection System AP Polymer and Fast Red Chromogen(Lab Vision Corporation, CA, USA)进行染色方案。在萘酚磷酸基质(naphthol phosphate substrate)中用i^ast Red片剂获得可视化。在天疱疮样品中，我们发现胱天蛋白酶-3片段位于水疱的顶部和底部，一些细胞在损害周围的表皮中呈阳性(图2)。该结果似乎表明角质形成细胞死亡在导致棘层松解的角质形成细胞分离之前发生。由于凋亡的角质形成细胞在天疱疮中丰富地出现，因此我们想要探究天疱疮血清是否能够在正常人角质形成细胞中诱导细胞凋亡。为此，将角质形成细胞涂板在腔室玻片中并且在无血清培养基(KGM)中进行培养直至预汇合。然后将细胞培养在角质形成细胞基本培养基中，通过加入25%的来自未治疗的患者或用全身性皮质类固醇治疗的患者的血清处理48小时。来自健康受试者的血清用作对照。通过原位TUNEL染色评估细胞凋亡。在随机选择的视野中评估大约100个细胞，计数TUNEL阳性细胞的百分比。来自天疱疮但非健康受试者或经历类固醇治疗的患者的血清在人角质形成细胞中诱导细胞凋亡(图3A-B)。由于i^as/i^isL系统也在皮肤水平上参与许多细胞凋亡过程(Wehrli等人，2000)， 因此我们利用双位酶免疫测定(ELISA)来测量来自天疱疮患者的血清中!^asL的水平。利用在450nm处的吸光度根据重组人!^asL标准蛋白测定血清浓度。！^asL水平在来自未治疗
8的患者的血清中非常高，但在来自用皮质类固醇治疗的患者的血清中或来自健康受试者的血清中低于检测极限。来自HBV患者的血清用作阳性对照(图4A)。在一个患者中，！^asL 水平随全身性类固醇治疗而逐渐降低(图4B)。由于i^asL以极高的量包含在天疱疮血清中，我们观察其相应受体(cognate rec印tor) !^asR的表达。为此，我们使用福尔马林固定和石蜡包埋的活检组织。按照厂商说明书，禾丨J用UltraVision LP Detection System AP Polymer and Fast Red Chromogen(Lab Vision Corporation, CA,USA)进行染色方案。在萘酚磷酸基质中用i^ast Red片剂获得可视化。虽然i^asR只在正常皮肤的基底角质形成细胞中表达，但在活性天疱疮损伤中，在基底和基底上细胞中都检测到i^asR。甚至更吸引人地，在皮肤粘膜天疱疮(mucocutaneous pemphigus, PMC)中，FasR似乎在整个表皮层中和甚至在水疱形成之前表达(图5)。FasL是胱天蛋白酶_8激活的外源性细胞凋亡途径的主要触发者之一。因此，我们想要评估该途径是否在天疱疮细胞凋亡中起作用。为此，用抗i^asL中和抗体或胱天蛋白酶-8抑制剂预处理患者血清，然后将其加至角质形成细胞培养物。在KGM中培养角质形成细胞，并且用天疱疮血清或用来自未治疗的患者的血清处理所述细胞。用抗i^asL中和抗体 (2. 5mg/ml，进行30分钟)或胱天蛋白酶_8抑制剂Z-IETD-FMK (100 μ Μ，进行30分钟)预处理血清。利用TUNEL染色评估细胞凋亡。抗!^asL中和抗体或胱天蛋白酶-8抑制剂的添加部分地阻止了天疱疮血清诱导的角质形成细胞的凋亡(图6)。此外，如图6中处理角质形成细胞并且为其提供抗!^asL抗体或无关免疫球蛋白。 然后将细胞在RIPA缓冲液中勻浆以进行Western印迹分析。用抗人胱天蛋白酶_8或抗b 肌动蛋白抗体温育膜。通过扫描激光光密度测定法定量放射自显影图上的条带的相对强度。结果显示，与未处理细胞相比，胱天蛋白酶-8在用天疱疮血清处理的角质形成细胞中被显著激活，然而胱天蛋白酶切割被使用抗！^认抗体的预处理部分抑制(图7)。综合起来，这些数据表明天疱疮血清通过由hs/i^sL系统触发的外源性细胞凋亡途径诱导角质形成细胞的凋亡。最近的研究已显示，在细胞凋亡过程中胱天蛋白酶靶向上皮粘着连接中的钙粘蛋白-连环蛋白粘着复合物的组分(Weiske等人，2001)。为了评估hs/i^sL诱导的细胞凋亡途径是否也负责桥粒分离，我们在1. 8mM CaCl2存在的情况下用天疱疮血清(进行或未进行治疗的)处理于KGM中培养的汇合的角质形成细胞72小时。使用抗Dsgl和抗Dsg3抗体通过Western印迹分析来自培养物的蛋白质提取物。β肌动蛋白用作内部对照。我们发现天疱疮血清可切割Dsgl和Dsg3。特别地，来自未治疗的患者但非来自经历类固醇治疗的患者的血清显著地切割Dsgl和Dsg3。(图8)。最重要地，用不断增加量的!^asL (0. 1、10、lOOng/ml)对角质形成细胞进行的72小时的处理，以剂量依赖性方式切割dsg。使用抗Dsgl和抗Dsg3抗体通过Wfestern印迹分析来自培养物的蛋白质提取物。肌动蛋白用作内部对照。这些剂量与天疱疮血清中检测到的那些相一致(图9)。鉴于!^asL在天疱疮的发病机制中发挥重要作用，我们已测试抗!^asL抗体(Ν0Κ2， 由杂交瘤细胞系Ν0Κ2(登录号FERM ΒΡ-5045)产生的抗体)。用1.单独的KGM ;2.抗 FasL(N0K2,15μ g/ml)Ab ；3. FasL(50ng/ml) ；4. FasL+抗 FasL Ab 处理培养在含有 1. 8mM CaCl2的KGM中的汇合的角质形成细胞，进行72小时。我们提供了抗!^asL Ab (N0K2)阻止!^tsL诱导的dsg切割的证据。我们还显示抗!^asL Ab (N0K2)抑制胱天蛋白酶-8-诱导的细胞凋亡(

图10A)。图IOB显示抗i^sL(N0K2)Ab阻止!^tsL诱导的细胞间分离，即棘层松解。为了进一步确认！^认的中心作用，我们已使用其他抗i^asL抗体(F918-7-3，由具有登录号FERM BP-5533的杂交瘤细胞系产生的抗体；F918-7-4，由具有登录号FERM BP-5534的杂交瘤细胞系产生的抗体；F919-9-18，由具有登录号FERM BP-5535的杂交瘤细胞系产生的抗体)。用单独的KGM;重组i^SL(50ng/ml)；以1 1稀释在KGM中的杂交瘤培养基；FasL+以不同的稀释度在KGM中稀释的杂交瘤培养基处理培养在含有1. 8mM CaCl2 的KGM中的汇合的角质形成细胞，进行72小时。我们提供了抗!^asL抗体以剂量依赖性方式阻止!^asL诱导的dsg3切割(图IlA和图11B)，从而抑制胱天蛋白酶-8诱导的细胞凋亡激活(图11A)的证据。图IlC显示来自杂交瘤细胞系FERM BP-5535的培养基中含有的 FasL Ab阻止!^tsL诱导的细胞间分离，即棘层松解。为了研究外源性细胞凋亡途径是否负责dsg切割，我们用胱天蛋白酶-8抑制剂 Z-IETD-FMK(100 μ Μ，进行30分钟)或用抗!^asL (Ν0Κ2，15g/ml)Ab预处理汇合的角质形成细胞。然后，将细胞与健康或未处理的天疱疮血清一起温育72小时。使用抗Dsg3抗体和抗胱天蛋白酶_8Ab通过Wfestern印迹分析来自培养物的蛋白质提取物。纽蛋白(Vinculin) 用作内部对照。(图12A)。图12B显示细胞分离(即棘层松解)被抗!^asL Ab或胱天蛋白酶-8抑制剂阻止。这些结果表明抑制i^asL或胱天蛋白酶-8-激活的细胞凋亡途径阻止了胱天蛋白酶-8的激活和dsg的切割，从而阻止了棘层松解。为了也评估人抗!^asL抗体(人抗体3E1，由登录号为ATCCPTA-4017的杂交瘤细胞系产生(抗体PTA-4017)，和人抗体4G11，由登录号为ATCC PTA-4018的杂交瘤细胞系产生(抗体PTA-4018))的作用，将人角质形成细胞培养在KGM (1. 8nM CaCl2)中，并用单独的或与不同稀释度的PTA-4017和PTA-4018抗体组合的重组!^asL (50ng/ml)进行处理。已在图10-12中测试的抗!^asL人源化抗体BP-5035和BP-5045用作对照。图13A显示，单独的!^tsL切割Dsg3并激活胱天蛋白酶8，而人抗体PTA-4017和PTA-4018以及人源化抗体 BP-5035和BP-5045都阻止该效应(western印迹)。图证实，单独的!^asL诱导细胞间分离和棘层松解，而不同浓度的人抗!^asL抗体PTA-4017和PTA-4018阻止该效应。总之，我们已显示!^asL通过激活胱天蛋白酶_8介导的外源性细胞凋亡途径和Dsg 切割发挥双重活性。与我们的工作一致，Wang和同事(Wang等人，2004)已表明细胞凋亡可能是棘层松解现象的原因。他们显示PV-IgG和抗Fas受体抗体(抗i^asR)以相似的方式体外诱导损伤，从而引起⑴可溶性i^asL的分泌；(2)!^1^&认(可溶性的和细胞膜的)、 Bax和p53蛋白的升高的细胞量；(3)细胞Bcl_2的水平的降低；(4)胱天蛋白酶8的富集以及胱天蛋白酶1和3的激活；(5) FasL和!^asR与胱天蛋白酶8在膜死亡诱导信号复合物 (death-inducing signaling complex,DISC)中的共聚集。因此，Fas介导的死亡信号转导途径似乎参与损伤形成。良好建立的动物模型已长期且广泛地用于研究天疱疮。PVIgG至新生小鼠内的被动转移诱导了细胞分离和大疱的形成。该模型已用于评估细胞凋亡和i^asL在天疱疮的发病机制中的参与。我们在新生C57BL/6N Crl小鼠中皮下注射从患者血清中纯化的 PVIgG(5mg/g/BW)。用从健康个体的血清纯化的IgG(NIgG)处理的正常新生小鼠将用作对照。在注射后20小时杀死动物。苏木精-伊红染色显示水疱只在用PVIgG处理的小鼠中产生，但不在用正常人IgG 处理的小鼠中产生(图14A)。通过TUNEL或通过胱天蛋白酶-3的激活只在用PVIgG处理的小鼠中检测到细胞凋亡(图14B)。为了评估!^asL在体内的作用，用PVIgG或PVIgG+抗!^asL抗体(MFL3克隆，特异于小鼠)处理小鼠。在PVIgG注射后3小时施用抗i^sL(40 μ g/小鼠)，抗!^asL在小鼠中阻止了水疱形成，如通过H&E染色显示的。此外，抗！^认处理的小鼠中裂缝(cleft)的长度显著减小(图15)。总之，我们已显示!^asL通过激活胱天蛋白酶_8_介导的外源性细胞凋亡途径和 Dsg切割发挥双重活性。最重要地，阻断!^asL在体外和体内保护免受棘层松解。参考文献Aoudjit F and Vuori K:Matrix attachment regulates FAS-induced apoptosis in endothelial cells :a role for c—FLIP and implications for anoikis. J Cell Bioll52 :633-643,2001Arredondo J et al Am J Pathol 167 :1531-1544,2005Bahr GM,Capron A,Dewulf J,Nagata S,Tanaka M,Bourez JM,Mouton Y. Elevated serum level of Fas ligand correlates with the asymptomatic stage of human immunodeficiency virus infection. Blood 90 :896-898,1997Bergin E, Levine JS, Koh JS, Lieberthal W:Mouse proximal tubular cell-cell adhesion inhibits apoptosis by a cadherin-dependent mechanism. Am J Physiol Renal Physiol 278 :F758_F768，2000Du, Z.，et al.，Biochem. Biophys. Res. Commun.，1996226，595-600Frisch SM :Evidence for a function of death-receptor-related, death-domain-containing proteins in anoikis. Current Biol 9 :1047-1049,1999Frisch SM, Francis H !Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. J Cell Biol 124 :619-626,1994Frisch SM, Screaton RA :Anoikis mechanisms. Curr Opin Cell Bioll3 555-562,2001Giancotti FG, Ruoslahti E :Integrin signaling. Science 285:1028-1032, 1999Gniadecki R, Jemec GBE, Thomsen BM, Hansen M-Relationship between keratinocyte adhesion and death :anoikis in acantholytic diseases. Arch Dermatol Res 290 :528-532,1998Grossman J, Walther K, Artinger M, Kiessling S, Scholmerich J :Apoptotic signaling during initiation of detachment-induced apoptosis( " anoikis " ) of primary human intestinal epithelial cells. Cell Growth & Diff 12:147-155,2001Jolles S, Hughes J, Whittaker S :Dermatological uses of high-dose intravenous immunoglobulin. Arch Dermatol 134 :80-86,1998Juo P,Kuo CJ,Yuan J,Blenis J :Essential requirement for caspase-8/FLICE in the initiation of the Fas-induced apoptotic cascade. Curr Biol 8:1001-1008,
111998Kalish RS :pemphigus vulgaris :the othher half of the story. J Clin Invest 106:1433-1435,2000Kitajima Y :Mechanisms of desmosome assembly and disassembly.Clin Exp Dermatol. 27 :684-90,2002Kovacs B，Liossis SN, Dennis GJ, Tsokos GC-Increased expression of functional Fas ligand in activated T—cells from patients with systemic lupus erythematosus. Autoimmunity 25 :213-221,1997Lee, J.，et al. Endocrinology, 1997，138，2081—2088Li N,Zhao M，Liu ZiDiaz LA :Pathogenic role of apoptosis in experimental pemphigus. J Invest Dermatol 126:173 Abstract，2006Marconi A，Atzei P，Panza C，Fila C，Tiberio R，Truzzi F，Wachter T， Leverkus M，Pincelli C :FLICE/caspase_8 activation triggers anoikis induced by β1 integrin blockade in human keratinocytes. J Cell Sci 117 :5815-5823,2004Marconi A，Vaschieri C，Zanoli S，Giannetti A，Pincelli C Nerve growth factor protects human keratinocytes from ultraviolet—B—induced apoptosis.J Invest Dermatol 113 :920-927,1999Nishimura S，Adachi M，Ishida T，Matsunaga T，Uchida H，Hamada H，Imai K Adenovirus-mediated transfection of caspase-8 augments anoikis and inhibits peritoneal dissemination of human gastric carcinoma cells. Cancer Res 61: 7009-7014,2001Of Connel 1, J.，et al. J. Exp. Med.，，184，1075—1082，1996Payne AS Curr Opin Cell Biol 16 :536-543,2004Pincelli C，Haake AR, Benassi L，Grassilli E，Magnoni C，Ottani D， Polakowska R， Franceschi C， Giannetti A Autocrine nerve growth factor protects human keratinocytes from apoptosis through its high affinity receptor(trk) :a role for bcl-2. J Invest Dermatol 109 :757_764，1997Queen et al. , Proc. Natl. Acad. Sci.USA 86(1989)，10029，and Verhoeyan et al.，Science 239 (1988)，1534Reed JC :Mechanisms of apoptosis. Am J Pathol 157 :1415-1430Rezgui SS, Honore S， Rognoni J-B, Martin P_M， Penel C:Up_regulation of α 2 β 1 integrin cell-surface expression protects A431 cells from epidermal growth factor-induced apoptosis. Int J Cancer 87 :360-367,2000Rytomaa M，Martins LM, Downward J Involvement of FADD and caspase_8signalling in detachment-induced apoptosis. Current Biol 9:1043-1046，
1999Sharma K，Wang RX，Zhang LYiYin DL,Luo XY，Solomon JC，Jiang RF，Markos K， Davidson W,Scott DW,Shi YF :Death the Fas way !regulation and pathophysiology of Fas and its ligand. Pharmacol Ther. 88 :333-347,2000Tiberio R，Marconi A,Fila C，Fumelli C，Pignatti M，Krajewski S，GiannettiA，Reed JC,Pincelli C :Keratinocytes enriched for stem cells are protected from anoikis via an integrin signaling pathway, in a Bcl_2 dependent manner. FEBS Letters 26318 :1-6,2002Turley，J.M.，et al. Cancer Res.，1997，57，881-890Viard I，Wehrli P，Bullani R，Schneider P，Holler N，Salomon D，Hunzinker T，Saurat J-H, Tschopp J，French L !Inhibition of toxic epidermal necrolysis by blockade of Fas with human intravenous immunoglobulin. Science282 :490-493,1998Wang X. et al :Possible apoptotic mechanism in epidermal cell acantholysis induced by pemphigus vulgaris autoimmunoglobulins Apoptosis 2004 ； 9 :131-143Wehrli P，Viard I，Bullani R，Tschopp J，French LE. Death receptors in cutaneous biology and disease. J Invest Dermatol 115 :141-148,2000Weiske J,Schoneberg T,Schroder W,Hatzfeld M，Tauber R,Huber 0 :The fate of desmosomal proteins in apoptotic cells. J Biol Chem276 :41175-41181,2001Yang，Y.，et al.，J. Exp. Med.，1995，181，1673-1682Yu, W. et al. Cancer Res.，1999，59，953-961
1权利要求
1.下列物质用于制造药剂的用途(i)特异于人Fas配体蛋白(FasL)的单克隆人抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，其中所述重链的互补决定区 (CDR)的氨基酸序列是(B1)CDR Hl :Arg His Gly lie Thr (SEQ ID NO :13)或 (Ei2)CDR Hl :Ser His Gly lie Ser (SEQ ID NO 14),(Id1)CDR H2 :Trp lie Asn Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Val Gln Gly (SEQ ID NO :15)或(b2)CDR H2 :Trp lie Asn Ala Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly(SEQ ID NO :16)，(C1)CDR H3 :Glu Thr Met Val Arg Gly Val Pro Leu Asp Tyr(SEQ ID NO :17)或 (C2)CDR H3 :Glu Thr Met Val Arg Gly Val Pro Cys Asp Tyr (SEQ ID NO :18)，或者 (Cl1)通过置换SEQ ID而13、14、15、16、17和/或18的1、2或3个氨基酸而衍生的序列，和/或所述轻链的互补决定区(CDR)的氨基酸序列是(Ei3)CDR Ll :Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala (SEQ ID NO :19)，(b3)CDR L2 :Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr(SEQ ID NO :20)，(C3)CDR L3 :Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr(SEQ ID NO :21)，或(d3)通过置换SEQ ID NO :19,20和/或21的1、2或3个氨基酸而衍生的序列或( )抗体或其抗原结合片段，其识别的人i^asL上的表位与抗体(i)所识别的相同， 所述药剂用于预防和/或治疗与角质形成细胞棘层松解相关的皮肤病。
2.下列物质用于制造药剂的用途(i)特异于人Fas配体蛋白(FasL)的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体由登录号为ATCC PTA-4017和/或ATCC PTA-4018的杂交瘤细胞产生或是从其衍生的抗体或抗体片段，或( )单克隆抗体或其抗原结合片段，其识别的人i^asL的表位与⑴的抗体所识别的相同，所述药剂用于预防和/或治疗与角质形成细胞棘层松解相关的皮肤病。
3.权利要求1或2的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段选自部分或完全人源化的抗体、部分或完全人源化的单链抗体或其片段。
4.权利要求1至3的任一项的用途，其中所述皮肤病与细胞凋亡途径的激活和/或桥粒芯糖蛋白的切割相关。
5.权利要求1至4的任一项的用途，其中所述皮肤病是天疱疮。
6.前述权利要求的任一项的用途，其与至少一种有效地抗所述皮肤病的另外的疗法一起用于联合治疗中。
7.权利要求6的用途，其与至少一种另外的免疫抑制药物，特别地与至少一种另外的类固醇组合。
全文摘要
本发明涉及FasL拮抗剂，例如抗人Fas配体(也称为CD95L或Apo1L，并且在下文中缩写为FasL)的人源化抗体用于预防和/或治疗与角质形成细胞棘层松解相关的皮肤病，特别地用于预防和/或治疗天疱疮的用途。
文档编号A61K39/395GK102405234SQ200980154517
公开日2012年4月4日 申请日期2009年12月14日 优先权日2008年12月12日
发明者A·马科尼, C·平切利 申请人:平切尔有限责任公司