因子Xa抑制剂的解毒剂及其与血液凝固剂组合使用的方法

专利名称：因子Xa抑制剂的解毒剂及其与血液凝固剂组合使用的方法
技术领域：
本发明涉及在接受因子抑制剂的抗凝血剂疗法的受试者中与血液凝固剂组合使用因子)(a(fXa)衍生物来预防或减轻流血的方法。本发明还涉及包含所述《a衍生物和血液凝固剂的组合物。所述fXa衍生物具有降低的或没有内在促凝血剂活性，能够结合和 /或中和fXa抑制剂，且不装配成凝血酶原酶复合物。所述血液凝固剂具有促凝血、抗血栓溶解、和/或抗血纤蛋白溶解活性。
背景技术：
抗凝血剂满足了市场上有形成血块倾向的患者，诸如那些具有凝固病症、限于不动时段或正接受医学手术的患者中治疗或预防不期望的血栓形成的需要。然后，抗凝血剂疗法的主要限制之一是与治疗有关的流血风险，及在过量服药的情况中或如果需要紧急手术规程的话，对快速逆转抗凝血活性的能力的限制。如此，非常想要对所有形式的抗凝血剂疗法特异性且有效的解毒剂。出于安全考虑，新抗凝血药物的开发中有抗凝血剂-解毒剂对也是有利的。对于过度抗凝当前可得的抗凝血剂-解毒剂对是肝素-鱼精蛋白和华法林-维生素K。新鲜冷冻血浆和重组因子VIIa(rfVIIa)也已在接受低分子量肝素治疗，患有大创伤或严重出血的患者中用作非特异性解毒剂(Lauritzen，B. et al, Blood, 2005, 607A-608A)。还报告了鱼精蛋白片段(US Patent No. 6，624，141)和小合成肽(US Patent No. 6，200，95 作为肝素或低分子量肝素解毒剂；及凝血酶突变蛋白(US Patent No. 6, 060, 300)作为凝血酶抑制剂的解毒剂。凝血酶原中间体和衍生物已报告为蛭素和合成凝血酶抑制剂的解毒剂(US Patent Nos. 5，817，309和6，086，871)。抗凝血剂疗法的一种有希望的形式，是靶向因子fe(fXa)的，而且事实上，数种直接《a抑制剂当前处于供抗凝血剂疗法中使用的临床开发的不同阶段。一种直接《a抑制剂Xarelt0TM(RiVar0Xaban)已在欧盟和加拿大批准临床用于在矫形手术患者中预防静脉血栓栓塞。这些中的许多是小分子。虽然这些新《a抑制剂显示治疗希望，但是仍然需要特异性且有效的解毒剂。在用这些《a抑制剂治疗的患者中过度抗凝固或需要手术的情况中，可能需要实质性中和所施用fXa抑制剂并恢复正常止血的药剂。当前可得的药剂，诸如重组因子VIIa(rfVIIa)，受到机械限制且对于fXa抑制剂逆转不是特异性的，因此临床医师非常想要改良的替代物。在人体研究中，rfVIIa已用于逆转间接抗凝血酶III依赖性fXa抑制剂诸如Rmdaparinux和Idraparinux的效果 (Bijsterveld, NR et al, Circulation, 2002,106 :2550-2554 ；Bijsterveld, NR et al, British J. of Haematology, 2004 (124) :653-658)。因子 Vlla(fVIIa)的作用机制是与组织因子起作用来将血液循环中存在的因子X(fX)转变成fXa以在患者中恢复正常止血。这种作用模式必然规定，为中和针对fXa抑制剂的活性位点可达到的fXa最高潜在浓度受到 fX的循环血浆浓度的限制。如此，使用rfVIIa来逆转直接fXa抑制剂的效果的潜力受到机械限制。由于fX的循环血浆浓度是150nM，因此通过这种方法生成的fXa的最大量会是 150nM。小分子f)(a抑制剂诸如Rivaroxaban的报告治疗浓度要高(大约600nM，Kubitza D, et al, Eur. J. Clin. Pharmacol.，2005，61 :873-880)于由 rfVIIa 生成的 fXa 的潜在量。 使用rfVIIa来逆转fXa抑制剂所致治疗或超治疗水平的抗凝固因此会提供不当水平的功效。如图4所示，使用rfVIIa在中和因子fci抑制剂Betrixaban的抗凝血活性中具有有限效果(下文描述)。重组fVIIa自50nM至IOOnM显示出剂量响应性解毒剂活性，但效果在 IOOnM至200nM之间变平，指示它的解毒剂效果受到其浓度以外的因素限制。在测试的所有 rfVIIa浓度中，Betrixaban仍显示出对fXa的剂量响应性抑制，直至浓度250nM时约75% 抑制。这项观察结果与fVIIa的提议作用机制一致。这也得到了下述研究的支持，其显示了 rfVIIa自身不能完全逆转Rmdaparinux对凝血酶生成和凝血酶原活化参数的抑制效果 (Gerotiafas, GT, et al, Thrombosis&Haemostasis2204(91) :531-537)。外源活性fXa不能以与rfVIIa相似的方式直接施用于受试者。与在其辅因子组织因子缺失下具有很低的促凝血剂活性的rfVIIa不同，天然《a是一种有力的酶且具有引起血栓形成的潜在风险。如此，使用rfVIIa或活性fXa作为fXa抗凝血剂疗法的解毒剂具有缺点。如此，倘若《Ca抑制剂过量服药或倘若需要恢复正常止血来预防或停止流血，需要不引起不想要的血栓形成且在实质性中和fla抑制剂的抗凝血活性中有效的改良解毒剂。美国专利申请公开文本2009-0098119(通过述及而完整收录)教导了具有降低的或没有内在促凝血活性、能够结合和/或中和fXa抑制剂且不装配成凝血酶原酶复合物的 fXa蛋白衍生物可以是有效的解毒剂，在接受因子fe抑制剂的抗凝血剂疗法的受试者中预防或减轻流血。由于《Ca蛋白衍生物具有降低的或没有内在促凝血活性，因此单独的fXa蛋白衍生物可能需要高剂量来在接受抗凝固疗法的受试者中启动或增强凝固过程以有效预防或停止流血。如此，倘若fXa抑制剂过量服药，需要在实质性中和fXa抑制剂的抗凝血剂活性中，以及在启动凝固过程中有效及高效的改良解毒剂。在此通过述及而完整收录本文中提及的任何和所有出版物、专利、专利申请。发明概述本发明涵盖与另一种血液凝固剂一起施用对因子fe(fXa)抑制剂特异性的解毒剂会产生协同或加性效应，诸如容许一种或两种药剂以亚治疗剂量施用，或由于剂量降低而降低任一药剂的任何潜在副作用。进一步涵盖对《a抑制剂特异性的解毒剂和血液凝固剂或另一种解毒剂诸如肝素的解毒剂的组合使用可导致1)所述特异性解毒剂的有效剂量降低；幻与单独用所述血液凝固剂治疗血液病患者或减轻流血所需要的量相比所述血液凝固剂的量降低；和/或幻所述特异性解毒剂和所述凝固剂二者的潜在副作用降低。现在发现与施用血液凝固剂或另一种解毒剂诸如肝素的解毒剂组合施用fXa蛋白的经修饰衍生物对于在接受fXa抗凝固疗法的受试者中预防或减轻流血是有用的。
在一些实施方案中，fla蛋白的经修饰衍生物不与fXa竞争装配成凝血酶原酶复合物，但改为结合和/或实质性中和抗凝血剂，诸如《a抑制剂。可用作解毒剂的衍生物是降低或消除内在促凝血剂和抗凝血剂活性，同时保留结合抑制剂的能力的经修饰因子fe 蛋白。在一些实施方案中，经修饰衍生物是分离的包含氨基酸序列SEQ ID NO. 12，13或15 的多肽或与SEQ ID NO. 12，13或15具有至少80%同源性的多肽。在一个方面，血液凝固剂具有促凝血、抗血栓溶解、和/或抗血纤蛋白溶解活性。 在另一个方面，血液凝固剂可启动或增强血液凝固。在另一个方面，血液凝固剂可抑制血纤蛋白溶解或血栓溶解。本发明涵盖的血液凝固剂可选自下组凝固因子，与凝固因子有关的多肽，重组凝固因子及其组合。进一步涵盖凝固因子可选自下组血浆衍生因子Vll/VIIa，IX/IXa, X/ Xa, II/IIa，Vlll/VIIIa，V/Va及其组合。进一步涵盖重组凝固因子可选自下组重组因子 Vll/VIIa, IX/IXa, X/Xa, II/IIa, Vlll/VIIIa, V/Va 及其组合。在一个方面，血液凝固剂可以是重组因子Vila。还涵盖的血液凝固剂可以是非特异性抗流血剂。进一步涵盖血液凝固剂可选自下组吸附剂化学药品，止血剂，凝血酶，纤维蛋白胶，去氨加压素，冷沉淀物和新鲜冷冻血浆， 凝固因子浓缩液，活化的或非活化的凝血酶原复合物浓缩液，Feiba Vh，血小板浓缩液及其组合。可用血液凝固因子的更多例子可得自引文Brooker M,Registry of Clotting Factor Concentrates, Eighth Edition, World Federation of Hemophilia, 2008 (在此通过述及而完整收录)。还涵盖的血液凝固剂可选自下组凝血酶可活化的血纤蛋白溶解抑制剂(TAFI)， 蛋白C抑制剂(PCI)，蛋白S抑制剂(PSI)，α-2-抗纤溶酶，氨甲环酸，氨基己酸，抑肽酶及
其组合。进一步涵盖与《Ca衍生物联合施用的其它解毒剂可以是肝素或肝素样药物的解毒剂。在一个实施方案中，其它解毒剂可以是例如但不限于鱼精蛋白或新型水杨酰胺衍生物诸如 PMX60102、PMX60126、PMX60138 和 PMX60100。在一个方面，fXa抑制剂可选自下组fondaparinux，Idraparinux,生物素化的 Idraparinux，依诺肝素(enoxaparin)，片段化蛋白(fragmin)，NAP-5，rNAPc2，组织因子途径抑制剂，肝素，低分子量肝素，DX-9065a, YM-60828, YM-150, Apixaban, Rivaroxaban, Betrixaban, PD-348292，Otamixaban, DU_176b，LY517717, GSK913893 及其组合。本发明的一个方面是因子fe衍生物和血液凝固剂或其它解毒剂包括肝素和肝素样药物的解毒剂和含有它们的组合物用于治疗接受过或正接受因子)(a抑制剂的过度抗凝固疗法的患者的用途。所述方法对于先前曾经施用因子叙抑制剂且然后需要止血(诸如选择性或紧急性手术所需要的)的患者也是有用的。在一个方面，经修饰《a蛋白与天然存在fXa的区别在于它们具有降低的或缺乏内在促凝血剂活性且不会干扰止血中的生理fXa 功能，同时仍能够结合和实质性中和fXa抑制剂。在一个方面，fXa蛋白衍生物在施用血液凝固剂之前施用。在另一个方面，fXa蛋白衍生物在施用血液凝固剂之后施用。在又一个方面，《a蛋白衍生物与血液凝固剂同时施用，即共施用。在另一个方面，经修饰因子蛋白与能够延长因子fe衍生物的血浆半衰期(或循环半衰期)的药剂共施用。在又一个方面，解毒剂与延长其血浆半衰期的部分偶联。还提供了含有因子衍生物和血液凝固剂或另一种解毒剂诸如诸如肝素解毒剂的药物组合物。在一些实施方案中，衍生物是分离的包含氨基酸序列SEQ ID NO. 12，13或 15的多肽或与SEQ ID NO. 12，13或15具有至少80%同源性的多肽。药物组合物任选包含药学可接受载体。在一个方面，本发明提供了包含《Ca衍生物和血液凝固剂或另一种解毒剂的试剂盒。在另一个方面，本发明提供了包含《a抑制剂(用于抗凝血剂用途)和《a抑制剂解毒剂/血液凝固剂(或因子)(a衍生物/血液凝固剂)(供需要实质性中和fXa抑制剂的抗凝血剂活性时使用)的试剂盒。本文中进一步提供了这样的组合物或方法，其可进一步包含分离的多肽的肽偶联物，其包含与刚刚描述的多肽共价或非共价连接的载体。载体可以是脂质体、微团、药学可接受聚合物、或药学可接受载体。在说明书的其余部分可找到本发明别的实施方案。附图简述

图1示意性显示了表1所示人因子X(SEQ ID NO. 1)的域结构，其报告于Leytus et al，Biochem.，1986，25，5098-5102。SEQ ID NO. 1是由本领域已知的表2所示人fX核苷酸序列(SEQ ID NO. 2)编码的人fX氨基酸序列。例如，所述翻译的氨基酸序列报告于Leytus et al,Biochem.，1986，25，5098-5102且可见于GenBank，<http//www. ncbi. nlm. nih. gov/ entrez/viewer. fcgi ？ db = nuccore&id = 89142731〉处的“NM_000504，，。此序列中的氨基酸编号方式基于fX序列。人fX前体(SEQ ID NO. 1)含有前原(pr印ro)-前导序列(SEQ ID NO. 1的氨基酸1至40)，接着是与fX轻链(LC) (SEQ ID NO. 1的氨基酸41至179)对应的序列、在fX分泌期间被消除的RKR三联体(SEQ ID NO. 1的氨基酸180至182)、和含有活化肽(AP) (SEQ ID NO. 1的氨基酸183至234)的fX重链(SEQ ID NO. 1的氨基酸183至 488)和催化域(SEQ ID NO. 1的氨基酸235至488)。图2(SEQ ID NO. 3)显示了成熟人因子X的氨基酸序列。此图中的氨基酸编号方式基于成熟fx序列，自fx轻链的N端开始。因子X作为通过二硫键连接的双链分子在血浆中循环。轻链(LC)具有139个氨基酸(SEQ ID NO. 1的氨基酸41至179)残基且含有 Y -羧基谷氨酸(Gla)丰富域(SEQ ID N0. 3的氨基酸1_45)，包括短芳香族堆叠(AS) (SEQ ID NO. 3的氨基酸40-45)，接着是两个表皮生长因子(EGF)样域(EGF1 =SEQ ID N0. 3的氨基酸46-84，EGF2 =SEQ ID N0. 3的氨基酸85-1 )。重链(HC)具有306个氨基酸且含有52 个氨基酸的活化肽(AP =SEQ ID N0. 3的氨基酸143-194)，接着是催化域(SEQ ID N0. 3的氨基酸195-448)。糜蛋白酶编号方式中的H57-D102-S195的催化三联等同物位于fX序列中的 His236、Asp^2jP kr379，且标有下划线(SEQ ID N0. 3 的氨基酸 236、282 和 379)。图3示意性显示了图2所示成熟人因子X的域结构。此图中的氨基酸编号方式基于成熟fx序列。突出显示了糜蛋白酶消化消除含Gla域的片段(SEQ ID N0. 3的氨基酸 1-44)的切割位点和消除活化肽的fX活化。糜蛋白酶消化《3产生缺少1-44氨基酸残基的无 Gla 域 fXa (SEQ ID NO. 4)。图4显示了在凝血酶生成(表述为相对荧光单位(RFU)测定法(如实施例2所述)中不同浓度的rfVIIa在组织因子存在下对fXa抑制剂Betrixaban (下文有描述)的抗凝血活性的影响。数据显示了 rfVIIa和组织因子的组合在rVIIa浓度高至200nM时不能完全中和fXa抑制剂Betrixaban的抗凝血活性。图5显示了在含有活性fXa和Betrixaban的纯化的系统中其Gla域完整的脱水 fXa逆转Betrixaban所致fXa抑制(空性圆圈)，而单独的脱水fXa具有与活性fXa相比可忽略的促凝血活性(空心三角形)。Ffe发色活性相对于任何抑制剂缺失下的活性fXa (空心圆圈)标准化。这在实施例4中有更加详细的描述。数据显示了脱水《a对《a底物无活性，但保留fXa抑制剂结合能力。图6显示了图5中具有完整Gla域的脱水fXa在血浆凝血酶生成(表述为相对荧光单位(RFU))测定法中是有力的抑制剂(如实施例2所述)。它在约115nM几乎完全抑制凝血酶生成。数据显示了 Gla域没有修饰的脱水fXa不适合于用作fXa抑制剂解毒剂。图7显示了糜蛋白酶消化之前和糜蛋白酶消化15分钟和30分钟之后96孔板形式活性《a的凝固活性的比较。如此图所示，凝固时间(0D405变化)在fla用糜蛋白酶消化15分钟之后显著延迟，而且在fXa消化30分钟后长达20分钟没有观察到凝固。此结果还用于建立脱水fXa的糜蛋白酶消化的条件，因为它在消化期间没有能监测的活性。这在实施例3中有更加详细的描述。图8显示了去Gla型脱水fXa对因子)(a抑制剂Betrixaban的结合亲和力，如实施例4所述。数据显示了通过糜蛋白酶消化脱水fXa以消除含有Gla域的片段(残基1_44) 而制备的去Gla型脱水fXa能够以与天然fXa类似的亲和力(fXa =Ki = 0. 12nM,去Gla型脱水 fXa :Kd = 0. 32nM)结合 Betrixaban。图9显示了在实施例2的凝血酶生成测定法中通过添加解毒剂(去Gla型脱水 fXa)的680nM浓缩液，不同浓度的Betrixaban对抗凝血活性的逆转。在浓度为680nM时， 去Gla型脱水fXa能够产生对fXa活性的实质性完全恢复。图10显示了在以96孔板形式使用aPTT试剂的凝固延长测定法中不同浓度的解毒剂(去Gla型脱水fXa)对250nM Betrixaban的抗凝血活性的逆转(如实施例3所述)。 数据显示了在使用约608ηΜ解毒剂来中和250nM a抑制剂Betrixaban时，凝固时间与贫血小板血浆对照的凝固时间可比。图11显示了在以96孔板形式使用aPTT试剂的凝固延长测定法中563nM解毒剂 (去Gla型脱水fXa)对依诺肝素(0. 3125-1. 25U/mL)的抗凝血活性的影响，表述为标准化后的倍数变化。测定方案描述于实施例3。数据显示了添加563nM解毒剂显著中和低分子量肝素依诺肝素的活性。图12显示了在发色测定法中解毒剂去Gla型脱水fXa对凝血酶(5nM)的活性的影响及50nM Argatroban (—种特异性凝血酶抑制剂)对它的抑制。在浓度高至538nM时， fXa抑制剂的解毒剂对凝血酶活性或特异性抑制剂Argatroban对它的抑制没有可检测的影响。这在实施例14中有更加详细的描述。图13显示了在使用标准凝固计时器的aPTT测定法中不同浓度的解毒剂去Gla型脱水《a对400nM Betrixaban的抗凝血活性的影响。测定方案描述于实施例3。数据显示了 fXa抑制剂的解毒剂实质性逆转400nM Betrixaban对fXa的抑制。解毒剂的EC50估算为约 656nM 及 400nM Betrixaban。图14显示了用于在CHO细胞中表达fi(a三重突变体(SEQ ID NO. 12)的DNA构建物的图。将质粒DNA线性化并转染入CHO dhfr(-)细胞中。使用四氢叶酸(HT)缺陷型培养基加甲氨蝶呤(MTX)来选择细胞。通过ELISA对稳定克隆筛选高蛋白质表达。在无血清培养基中生成《a三重突变体，并通过离子交换和亲和柱的组合来纯化。图中的编号方式基于编码人fX SEQ ID NO. 1的多核苷酸序列。例如，活性位点S419(SEQ ID NO. 1)处的丙氨酸突变等同于成熟人fX的S379(SEQ ID NO. 3)处的突变，其在本申请全文，特别是实施例7中有讨论。用于构建编码r-解毒剂(r-Antidote)三重突变体的多核苷酸的引物列于表21。图15A显示了通过离子交换和亲和力纯化来纯化的r-解毒剂的Western印迹。 还原连接轻链和重链的二硫键后，r-解毒剂重链以与血浆来源fXa的相似的预期分子量迁移。删除fXa突变体的Gla域中的6_39aa，将解毒剂轻链的较低分子量条带的结果与正常FXa比较。图15B和15C显示了通过离子交换和亲和层析接着大小排阻层析纯化的r_解毒剂的 SDS-PAGE 和 Western 印迹。图 16 显示了口服施用单独的 Betrixaban (15mg/kg)或 Betrixaban (15mg/kg)继以静脉内注射(300 μ g，IV)依照实施例1制备的血浆衍生解毒剂(Pd-解毒剂)后小鼠(η =7-10只每组)中的Betrixaban血浆水平。在1. 5小时时间点之前5分钟施用pd_解毒剂，并口服施用Betrixaban之后1. 5,2. 0和4. 0小时时采集小鼠血液样品(0. 5mL)。分析全血INR、Betrixaban和解毒剂血浆水平。对15mg/kg (空心方框)和15mg/kg继以解毒剂注射(空心圆圈)后的小鼠将小鼠血浆中的Betrixaban水平(均值士SEM)作为时间的函数绘图。解毒剂处理组在1.5小时时间点(解毒剂注射后5分钟)的Hi-PD相关性汇总于表13。根据INR测量，单次注射解毒剂导致对功能性Betrixaban的> 50%校正。这在实施例8中有更加详细的描述。图17A和17B显示了用纯化的r-解毒剂进行的小鼠实验的结果(n = 4-10只每组)。比较了口服施用单独的Betrixaban(15mg/kg)或Betrixaban(15mg/kg)继以静脉内注射(300 μ g)r-解毒剂后小鼠血浆中的Betrixaban水平(图17A)和全血INR (图17B)。 显示了每个处理组的均值。如表14汇总的，单次IV注射r-解毒剂导致对离体全血INR的 > 50%校正，证明解毒剂经单次或多次注射或其它方案有效中和《Ca抑制剂。这些结果证明了本发明的《a变体有潜力起通用解毒剂的作用来在具有流血或其它医学紧急事件的患者中逆转fXa抑制剂的抗凝血效果。这在实施例8中有更加详细的描述。图18显示了在96孔浊度变化凝固测定法中r-解毒剂对依诺肝素的抑制效果的逆转。结果与Pd-解毒剂(图11)基本上相似，指示两种《a衍生物具有可比的功能性解毒剂活性。50nM r-解毒剂实质性校正(> 75% ) 1. 25U/mL依诺肝素的抑制效果。测定方法如实施例11所述。图19显示了 r-解毒剂对低分子量肝素(LMWH)的抑制效果的逆转，如人血浆凝固测定法中测试的。图18和19在实施例11中都有讨论。图20显示了 r-解毒剂对Rivaroxaban的抗凝固效果的逆转。这在实施例12中有更加彻底的讨论。图21显示了 r-解毒剂的多核苷酸序列和翻译多肽序列的比对。图22A和22B显示了单次IV注射(1次注射)或两次注射O次注射)r_解毒剂(11 = 5只每组，312邶//200111 r_解毒剂)的小鼠实验的结果。口服施用Betrixaban(15mg/ kg)后继以静脉内注射媒介或r-解毒剂之后比较了血浆中的Betrixaban水平(图22A) (详情见实施例8)。如图22A所示，与媒介对照(对照_1)相比，单次IV注射r-解毒剂将血浆中的Betrixaban水平提高超过8倍，指示解毒剂在体内有效结合Betrixaban的能力。 与单次注射相比，第二次注射解毒剂将Betrixaban水平进一步提高不到2倍，指示小鼠血液中Betrixaban的量有限和解毒剂对其抗凝血效果的逆转。图22B证明了单次和两次注射解毒剂后测量INR随小鼠血浆中解毒剂/Betrixaban比升高而降低。图23显示了在凝血酶生成中rVIIa与r_解毒剂对250nM Betrixaban (—种fXa 抑制剂)的抗凝血活性的组合效果。结果表述为相对于不添加任何抑制剂、rVIIa或r-解毒剂的血浆中的RFU标准化后的相对凝血酶生成活性(％活性)。数据显示了 r-解毒剂独立逆转250nM Betrixaban的抗凝血效果。IOOnMrVIIa与r_解毒剂组合在每一种r_解毒剂浓度进一步提高凝血酶生成活性，而单独的IOOnM rVIIa在r-解毒剂缺失下仅轻微提高凝血酶生成活性。rVIIa在对照血浆中在Betrixaban缺失下也轻微提高凝血酶生成活性。图24A和24B显示了 rVIIa和r_解毒剂(在图中也称作“r_解毒剂”或“解毒剂”) 对1 μ M Rivaroxaban (一种fla抑制剂)的抗凝血活性的组合效果，通过人血浆中的凝血酶原时间(PT)来测量。图24A显示了在Rivaroxaban缺失下，380nM r_解毒剂略微缩短PT， 而2. 2nM rVIIa具有更明显的影响。在Rivaroxaban存在下，添加r_解毒剂(380nM)产生 14%校正5士0. 2sec)，而2. 2nM rVIIa产生46%校正。单一药剂处理(单独的r_解毒剂或rVIIa)不产生对抗凝固的完全逆转。380nM r_解毒剂和2. 2nM rVIIa的组合产生对 Rivaroxaban诱导的抗凝固的完全校正(所得PT = 12sec)。图24B显示了在Rivaroxaban 存在下，添加r-解毒剂(760nM)产生28%校正。760nM r_解毒剂和0. 55nM rVIIa的组合产生对Rivaroxaban诱导的抗凝固的接近完全校正(所得PT = 12sec)。图25显示了人血浆衍生fIX和r-解毒剂(在图中也称作“解毒剂”)对400nM Betrixaban (一种fla抑制剂)的抗凝血活性的组合效果，通过人血浆中的活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)来测量。在Betrixaban缺失下，ΠΧ稍微缩短人血浆中的aPTT。添加 400nM Betrixaban 后，基线 aPTI^25. 5士0. Isec)延长了大约 2 倍(51. 6士0. 4sec)。在 Betrixaban存在下，添加r-解毒剂(1. 14 μ M)产生42%校正，而人血浆衍生fIXQ58nM) 只产生15%校正。如此，单独的fIX不是Betrixaban抗凝固的有效逆转剂。r_解毒剂 (1. 14 μ M)和fIX058nM)的组合足以产生对抗凝血效果的完全体外逆转，达到基线凝固参数条件。图沈显示了 fX与重组解毒剂(r-解毒剂)对125nM Betrixaban的抗凝血活性的组合效果。结果表述为相对于不添加任何抑制剂、fX或r-解毒剂(对照，无FX)的血浆中的凝固时间标准化后的倍数变化。数据显示了 125nMBetriXaban使凝固时间加倍(OnM r-解毒剂，无FX)。添加125nM r_解毒剂实质性逆转Betrixaban的抗凝血效果。170nMfX 在有或无125nM抑制剂的血浆中独立将凝固时间缩短约20%。170nMfX与125nM r-解毒剂的组合进一步校正125nM Betrixaban的抑制效果。发明详述I.定义除非另有说明，本发明的实践会采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，它们在本领域技术范围内。参见例如Sambrook md Russell eds. (2001)Molecular Cloning :A Laboratory Manual,3rd edition ；the series Ausubel et al. eds. (2007)Current Protocols in Molecular Biology ；the series Methods in Enzymology (Academic Press，Inc. , N. Y.) ；MacPherson et al. (1991)PCR 1 :A Practical Approach(IRL Press at Oxford University Press) ；MacPherson et al. (1995)PCR 2 :A Practical Approach ；Harlow and Lane eds. (1999)Antibodies， A Laboratory Manual ；Freshney(2005)Culture of Animal Cells :A Manual of Basic Technique，5th edition ；Gait ed. (1984)Oligonucleotide Synthesis ；U.S. Patent No. 4，683，195 ；Hames and Higgins eds. (1984)Nucleic Acid Hybridization ； Anderson (1999)Nucleic Acid Hybridization ；Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation ；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press (1986))； Perbal (1984)A Practical Guide to Molecular Cloning ；Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Cold Spring Harbor Laboratory)； Makrides ed. (2003)Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells ；Mayer and Walker eds. (1987)Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press，London) ；Herzenberg et al. eds(1996)Weir’ s Handbook of Experimental Immunology ；Manipulating the Mouse Embryo :A Laboratory Manual,3rd edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002))。所有数字(例如pH、温度、时间、浓度、和分子量，包括范围)是近似值，以增量 0. 1(+)或(-)变化。还要理解，虽然没有每次明确说明，但是所有数字前面有术语“约”。还要理解，虽然没有每次明确说明，但是本文所述试剂仅仅是例示性的，而且此类等同物是本领域已知的。如说明书和权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数称谓， 除非上下位另有明确说明。例如，术语“一种药学可接受载体”包括多种药学可接受载体， 包括其混合物。如本文中使用的，术语“包含”意图表示组合物和方法包括所述要素，但不排除其它要素。“基本上由...组成”在用于特定组合物和方法时应表示排除对用于预定用途的组合物有任何本质意义的其它要素。如此，基本上由本文规定的要素组成的组合物不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物和药学可接受载体，诸如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂、等等。 “由...组成”应表示排除其它组分的超过痕量要素和用于施用本发明组合物的实质性方法步骤。由这些转折术语每一项规定的实施方案在本发明的范围内。诊断或治疗的“受试者”是细胞或哺乳动物，包括人。要诊断或治疗的非人动物受试者包括例如鼠(诸如大鼠、小鼠)、犬、诸如猪、兔类(诸如家兔)、家畜、运动用动物、和宠物。术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用，而且在它们的最广义使用，指两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或模拟肽的化合物。亚基可通过肽键来连接。在另一个实施方案中，亚基可通过其它键来连接，例如酯、醚、等。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，而且对蛋白质或肽的序列可包含的氨基酸的最大数目没有做出限制。如本文中使用的，术语 “氨基酸”指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸及D和L两种旋光异构体、氨基酸类似物和模拟肽。天然存在氨基酸的单字母和三字母缩写列于下文。三个或更多个氨基酸的肽通常称作寡肽，如果肽链较短的话。如果肽链较长的话，肽通常称作多肽或蛋白质。
权利要求
1.一种用于在接受因子)(a(fXa)抑制剂的抗凝血剂疗法的受试者中预防或减轻流血的方法，包括对该受试者施用fXa蛋白衍生物和血液凝固剂或肝素解毒剂，其中所述fXa蛋白衍生物结合所述fXa抑制剂且不装配成凝血酶原酶复合物。
2.一种用于在接受《a抑制剂的抗凝血剂疗法的受试者中预防或减轻流血的方法， 包括对该受试者施用分离的包含氨基酸序列SEQ ID NO. 12，13或15的多肽或与SEQ ID NO. 12，13或15具有至少80%同源性的多肽和血液凝固剂或肝素解毒剂。
3.权利要求1的方法，其中所述衍生物直接或间接结合所述《a抑制剂。
4.权利要求3的方法，其中所述衍生物具有降低的或没有促凝血剂活性。
5.权利要求3的方法，其中所述衍生物是Gla缺陷型《Ca蛋白衍生物或去GlaSfXa 蛋白。
6.权利要求3的方法，其中所述衍生物具有经修饰的活性位点。
7.权利要求4的方法，其中所述衍生物至少包含SEQID NO. 3的氨基酸残基46至448 或其等同物。
8.权利要求3的方法，其中所述衍生物至少包含SEQID NO. 3的氨基酸残基46至139 和195至448或其等同物。
9.权利要求3的方法，其中所述衍生物缺少fXa的轻链且含有重链中存在的丝氨酸蛋白酶催化域。
10.权利要求3的方法，其中所述衍生物是包含氨基酸序列SEQID NO. 5的多肽。
11.权利要求3的方法，其中所述衍生物包括催化域，任选经化学或重组修饰以缺少蛋白水解活性但维持结合必需的结构特征，所述域衍生自a.选自下组的哺乳动物蛋白酶血浆激肽释放酶，凝血酶，和胰蛋白酶；或b.细菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶。
12.权利要求3的方法，其中所述衍生物包含氨基酸序列SEQID NO. 7及经修饰轻链或其等同物。
13.权利要求12的方法，其中所述经修饰轻链与野生型人因子fe蛋白的Gla域相比在 Gla域中包含至少一处氨基酸替代、添加、或删除。
14.权利要求3的方法，其中所述衍生物选自下组未羧化的，羧化不足的，和脱羧化的因子)(a蛋白。
15.权利要求3的方法，其中所述衍生物包含的重链为经修饰的SEQID NO. 7或其等同物。
16.权利要求15的方法，其中所述衍生物是通过至少一处选自下组的氨基酸的氨基酸替代而修饰的:Glu216, Glu218, Arg332, Arg347, Lys351，和 Ser379。
17.权利要求3的方法，其中所述衍生物是具有氨基酸序列SEQID NO. 10的去Gla型脱水fXa或其等同物。
18.权利要求3的方法，其中所述衍生物是具有氨基酸序列SEQID NO. 11的去Gla型 fXa-S379A或其等同物。
19.权利要求12的方法，其中所述衍生物具有降低的与ATIII、辅因子fV/fVa和/或 fVIII/fVIIIa的相互作用且包含氨基酸序列SEQ ID NO. 7或其等同物。
20.权利要求19的方法，其中所述衍生物具有氨基酸位置Arg306、Glu310、Arg347、Lys351、Lys414、或Arg4M处的至少一处氨基酸替代。
21.权利要求3的方法，其中所述衍生物在EGF域中具有修饰，所述修饰选自下组删除EGFl域、删除EGF2域、和删除EGFl和EGF2域二者。
22.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述血液凝固剂启动或增强血液凝固或抑制血纤蛋白溶解或血栓形成。
23.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述血液凝固剂具有促凝血、抗血栓溶解、和 /或抗血纤蛋白溶解活性。
24.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述血液凝固剂选自下组凝固因子，与凝固因子有关的多肽，重组凝固因子，及其组合。
25.权利要求对的方法，其中所述凝固因子选自下组血浆衍生因子Vll/VIIa，IX/ IXa, X/Xa, II/IIa, Vlll/VIIIa, V/Va 及其组合。
26.权利要求M的方法，其中所述重组凝固因子选自下组重组因子Vll/VIIa，IX/ IXa, X/Xa, II/IIa, Vlll/VIIIa, V/Va 及其组合。
27.权利要求沈的方法，其中所述重组凝固因子是重组因子Vila。
28.权利要求23的方法，其中所述血液凝固剂是非特异性抗流血剂。
29.权利要求观的方法，其中所述非特异性抗流血剂选自下组吸附剂化学药品，止血剂，凝血酶，纤维蛋白胶，去氨加压素，冷沉淀物和新鲜冷冻血浆，凝固因子浓缩液，活化的或非活化的凝血酶原复合物浓缩液，Feiba Vh，血小板浓缩液及其组合。
30.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述血液凝固剂选自下组凝血酶可活化的血纤蛋白溶解抑制剂(TAFI)，蛋白C抑制剂(PCI)，蛋白S抑制剂(PSI)，α -2-抗纤溶酶， 氨甲环酸，氨基己酸，抑肽酶及其组合。
31.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述肝素解毒剂选自下组鱼精蛋白，PMX 60102，PMX 60126，PMX 60138，PMX 60100, PMX 60056，及其组合。
32.权利要求1的方法，其中所述fla蛋白衍生物以治疗有效或亚治疗有效量施用。
33.权利要求2的方法，其中所述分离的多肽以治疗有效或亚治疗有效量施用。
34.权利要求32或权利要求33的方法，其中所述血液凝固剂或肝素解毒剂以治疗有效或亚治疗有效量施用。
35.权利要求1的方法，进一步包括包含与所述《a蛋白衍生物共价或非共价连接的载体的肽偶联物。
36.权利要求34的方法，其中所述载体选自下组脂质体，微团，药学可接受聚合物和药学可接受载体。
37.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述《a抑制剂选自下组fondaparinux， Idraparinux，生物素化Idraparinux，依诺肝素，片段化蛋白，NAP-5，rNAPc2，组织因子途径抑制剂，肝素，低分子量肝素，DX-9065a, YM-60828, YM-150, Apixaban, Rivaroxaban, Betrixaban, PD-348292，Otamixaban, DU_176b，LY517717, GSK913893 及其组合。
38.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述受试者正经历选自下组的临床大流血事件出血，进入生命器官的流血，需要再手术或新治疗规程的流血和伴有相关明显流血的等于或大于2.0的流血指数。
39.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述受试者正经历选自下组的流血事件持久的或经常的鼻衄，不需要治疗规程的直肠或尿道流血，实质性注射部位血肿，非注射部位处的自发血肿，轻微创伤时发生的血肿，实质性失血和需要无计划输血的流血。
40.权利要求1的方法，其中所述fXa蛋白衍生物在手术之前施用。
41.权利要求2的方法，其中所述多肽在手术之前施用。
42.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述血液凝固剂或肝素解毒剂在手术之前或期间施用。
43.权利要求1的方法，其中所述fla蛋白衍生物在所述血液凝固剂或肝素解毒剂施用之前、之后、或同时施用。
44.权利要求2的方法，其中所述多肽在所述血液凝固剂施用之前、之后、或同时施用。
45.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述受试者是人。
46.一种药物组合物，包含(i)结合《a抑制剂且不装配成凝血酶原酶复合物的《a蛋白衍生物，和(ii)肝素解毒剂或具有促凝血、抗血栓溶解、或抗血纤蛋白溶解活性的血液凝固剂。
47.一种药物组合物，包含(i)分离的包含氨基酸序列SEQ ID NO. 12，13或15的多肽或与SEQ ID NO. 12，13或15具有至少80%同源性的多肽和(ii)肝素解毒剂或血液凝固剂。
48.一种药物组合物，包含(i)分离的包含氨基酸序列SEQ ID NO. 13的双链多肽或与 SEQ ID NO. 13具有至少80%同源性的多肽，和(ii)肝素解毒剂或具有促凝血、抗血栓溶解、或抗血纤蛋白溶解活性的血液凝固剂。
49.权利要求46至48任一项的组合物，其中所述血液凝固剂选自下组凝固因子，与凝固因子有关的多肽，重组凝固因子及其组合。
50.权利要求49的组合物，其中所述凝固因子选自下组血浆衍生因子Vll/VIIa，IX/ IXa, X/Xa, II/IIa, Vlll/VIIIa, V/Va 及其组合。
51.权利要求48的组合物，其中所述重组凝固因子选自下组重组因子Vll/VIIa，IX/ IXa, X/Xa, II/IIa, Vlll/VIIIa, V/Va 及其组合。
52.权利要求46至48任一项的组合物，其中所述血液凝固剂是非特异性抗流血剂。
53.权利要求52的组合物，其中所述非特异性抗流血剂选自下组吸附剂化学药品，止血剂，凝血酶，纤维蛋白胶，去氨加压素，冷沉淀物和新鲜冷冻血浆，凝固因子浓缩液，活化的或非活化的凝血酶原复合物浓缩液，Feiba Vh，血小板浓缩液及其组合。
54.权利要求46-48任一项的组合物，其中所述血液凝固剂选自下组TAFI，PCI,PSI， α -2-抗纤溶酶，氨甲环酸，氨基己酸，抑肽酶及其组合。
55.权利要求46-48任一项的组合物，其中所述肝素解毒剂选自下组鱼精蛋白，PMX 60102，PMX 60126，PMX 60138，PMX 60100, PMX 60056，及其组合。
56.权利要求46-48任一项的组合物，进一步包含药学可接受载体。
57.一种用于在接受fXa抑制剂的抗凝血剂疗法的受试者中预防或减轻流血的方法， 包括对该受试者施用有效量的权利要求46至48任一项的组合物。
58.一种多部分试剂盒，包含a)结合《a抑制剂且不装配成凝血酶原酶复合物的fXa 蛋白衍生物；和b)肝素解毒剂或血液凝固剂。
59.一种多部分试剂盒，包含a)分离的包含氨基酸序列SEQ ID NO. 12，13或15的多肽或与SEQ ID NO. 12，13或15具有至少80%同源性的多肽；和b)肝素解毒剂或血液凝固剂。
60.权利要求58或59的试剂盒，其中所述血液凝固剂选自下组凝固因子，与凝固因子有关的多肽，重组凝固因子及其组合。
全文摘要
本发明涉及靶向因子Xa的抗凝血剂解毒剂，该解毒剂与血液凝固剂或其它肝素解毒剂组合用于在受试者中预防或减轻流血。本发明所述解毒剂具有降低的或没有内在凝血剂活性。本发明公开了正在或将接受因子Xa抑制剂的抗凝血剂疗法的患者中停止或预防流血的方法。
文档编号A61K35/14GK102316893SQ200980154527
公开日2012年1月11日 申请日期2009年11月11日 优先权日2008年11月14日
发明者乌马.辛哈, 卢根民 申请人:博尔托拉制药公司