专利名称：降低大分子在生理条件下聚集的方法和配方的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过降低大分子在生理条件下的聚集，使皮下施用大分子的注射位点处炎症最小化的方法。
背景技术：
在过去20年间，重组DNA技术已导致药物数量的显著增加，所述药物是生物分子，特别是蛋白质。生物分子药物的增加导致了对药物配方的新挑战。可以通过静脉内灌注将高剂量的蛋白质治疗剂(如抗体)递送给患者，但该药物施用途径是不方便的，在可以的条件下，一般优选的配制蛋白质治疗剂进行皮下注射。然而，皮下注射的药物溶液处于比静脉灌注小得多的体积，使得蛋白质必然以更高的浓度存在。在每毫升数十毫克的高治疗性蛋白质浓度下，保持治疗性蛋白质在延长的时间段内稳定溶解是重要的。蛋白质的高浓度溶液增加了有利于聚集的蛋白质-蛋白质相互作用的可能性；防止聚集已成为蛋白质药物配方的主要命题。聚集导致大量的问题，包括降低的活性蛋白生物利用率、改变的药物动力学和不需要的免疫原性(Frokjaer，S.和Otzen，D. Ε.，Nat. Rev. Drug. Discov. 4 298-306(2005) Jiskoot, W.和 CrommeIin，D. J. A.，EJHP Practice 12:20-21(2006))。防止聚集仍然大量是经验主义的，因为一般尚不清楚聚集过程的分子细节。典型的策略是向蛋白质溶液中添加稳定剂。常用的稳定剂包括糖、盐、游离的氨基酸如L-精氨酸和 L-谷氨酰胺(Golovanov，Α. P.等，J. Am. Chem. Soc. 126 :8933-8939 Q004))、多元醇(Singh, S.和 Singh, J.，AAPS Pharm. Sci. Tech 4 :1-9(2003) ；Mishra, R.等，J. Biol. Chem. 280 :15553-1556(K2005))、聚乙二醇(PEG)和可降低蛋白质-蛋白质相互作用的其他聚合物，例如聚山梨醇酯或泊洛沙姆(Frokjaer和Otzen，见上文；Lee，R. C.等，Ann. Biomed. Eng. 34 1190-1200 (2006) ；Nema,S. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 51 :166-171(1997))。环糊精(CD)是环状的寡糖，具有以α-(1，4)糖苷键连接的D-吡喃葡萄糖单位。 CD是通过淀粉酶、环糊精转葡糖基酶的作用从玉米或其他淀粉中生产的。最常见的天然存在的环糊精是α-环糊精、β-环糊精和Y-环糊精，分别由6、7和8个吡喃葡萄糖单位组成。作为天然的环糊精，环糊精尤其具有低的水溶性，已合成出大量具有改善的溶解度和其他物理化学特性的衍生物。可商购的CD衍生物包括甲基化CD、2-羟丙基化CD、乙酰化 ⑶、分支的⑶和磺丁基⑶。环糊精的同义词包括Cavitron、环状寡糖、cycloamulose和环葡聚糖(综述参见 Loftsson，Τ.，和 Brewster，Μ. Ε.，J. Pharm. Sci. 85 :101-(1996) ；Uekama, K.等，Chem. Rev. 98 :2045-2076(1998) ；Irie, Τ.禾口 Uekama，K. ，Advanced Drug Delivery Reviews 36 :101-123(1999)；和 kjetli，J.，PureApp 1. Chem. 76 1825-1845 (2004)) 环糊精的分子量小于25000道尔顿，因而可以通过肾小球滤过从体循环中移除，预期不会积累在体内。已普遍记载了天然环糊精缺少毒性以及大量的制药相关性衍生物，例如羟丙基-β -CD和磺丁基-β -CD (Uekama等，见上文Jz jetli，见上文)。环糊精的形状为截短的锥形，其中内部是疏水的而外部是亲水的。疏水空腔提供了可以包括合适大小的非极性化合物并形成复合物的环境。CD及其衍生物已用作低水溶性药物的助溶剂。例如，含羟丙基β-CD的伊曲康唑(Sporanox )是溶解的，而含磺丁基醚β -⑶的甲磺酸齐拉西酮(Geodon )是溶解的。⑶的其他用途包括药物稳定性、口味遮蔽和吸附必需油类。目前可获得的含环糊精的药物产品包括Sp0ran0XTM(Janssen， Belgium)、Prostavasin (0no, Japan ；Schwarz, Germany) >Prostandin 500 (Ono, Japan)、 Geodon (Pfizer， USA) 、 VFEND (Pfizer, USA) 、MitoExtra Mitozytrex (Novartis, Switzerland)和 Voltaren (Novartis，Switzerland)。还参见 & jetli (见上文)的表 1。 这些配方都限于小分子化合物。大的药物分子如肽和蛋白质也可以形成含环糊精的复合物。与CD复合的肽类药物的改善的生物利用率被认为是部分由于CD对细胞外流泵的抑制效应造成的(Challa， R.等，AAPS Pharm. Sci. Tech. 6 :E329-357 (2005))。蛋白质和肽稳定化的机制在性质上也与小分子药物的情况不同。当CD可以与小分子药物形成包涵复合物时，CD表现出结合蛋白质或肽的暴露于溶剂的特定氨基酸残基(Aachmann，F. L.等，ProteinEngineering 16 905-912(2003))。最大益处通常在低的环糊精浓度下获得，且所述益处通常只是部分的浓度依赖性的。例如，0. 5% HP-β -环糊精最佳的抑制IL-2的聚集(Loftsson和Brewster, 见上文)。以约2-6%存在的⑶改善了人生长激素的溶解度，其中α和γ型⑶比β型 CD 的效率低若干倍(Otzen, D. Ε.等，Protein Sci. 11 :1779-1787 (2002))。⑶20抗原(也称为人B-淋巴细胞限制性分化抗原，Bp35)是具有约35kD分子量的疏水性跨膜蛋白，分布在前B淋巴细胞和成熟的B淋巴细胞上(Valentine等，J.Biol. Chem. . 264(19) :11282-11287(1989)；禾口 Einfeld 等，EMBO J. 7 (3) :711-717 (1988))。抗原还在多于90%的B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)上表达(Anderson等，Blood 63(6) 14M-1433 (1984))，但未见于造血干细胞、原B细胞、正常的血清细胞或其他正常的组织 (Tedder等，J. Immunol. 135(2) :973-979 (1985))。CD20被认为调控细胞周期起始和分化的激活过程中的早期步骤(Tedder等，见上文)，并可能作为钙离子通道发挥功能(Tedder 等，J. Cell. Biochem. 14D :195(1990))。考虑到CD20在B细胞淋巴瘤中的表达，该抗原已作为治疗此类淋巴瘤的有效治疗靶。例如，用于治疗患复发型或难愈型低度或滤泡状的、CD20阳性的、B细胞非霍奇金淋巴瘤的患者的利妥昔单抗(RITUXAN 、MABTHERA )抗体，所述抗体是遗传改造的嵌合小鼠/人单克隆抗体，针对人⑶20抗原(可从Genentech，Inc. , South SanFrancisco, California,U. S.H和 F. Hoffmann-La Roche AG,Basel, Switzerland 商购)。 利妥昔单抗是在1998年4月7日出版的美国专利号5，736，137 (Anderson等)和美国专利号5，776，456中被称作“C2B8”的抗体。其他提示用于NHL治疗的抗⑶20抗体包括小鼠抗
in ，该抗体与放射性同位素钇-90 连接(IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA), 以及Bexxar ，这是与1-131缀合的另一种完全的小鼠抗体(Corixa，WA)。CD20也是用于治疗自身免疫病的有效靶抗原。也在多种非恶性自身免疫功能障碍中研究了利妥昔单抗，其中B细胞和自身抗体在疾病的病理学中看来发挥了作用，包括 Edwards 等，Biochem Soc. Trans. 30 :824-8 Q002)。已报道利妥昔单抗潜在的减轻了例如类风湿关节炎(RA) (Leandro 等，Ann. Rheum. Dis. 61 :883-888(2002)； Edwards φ, Arthritis Rheum. ,46(Suppl. 9) :S46(2002) ；Stahl φ, Ann. Rheum. Dis., 62 (Suppl. 1) :0P004Q003) ;Emery 等，Arthritis Rheum. 48 (9) :S439 (2003))、狼疮(Eisenberg, Arthritis.Res. Ther. 5 157-159(2003) ；Leandro 等，Arthritis Rheum. 46 2673-2677 (2002) ；Gorman 等，Lupus, 13 :312-316 (2004))、免疫性血小板减少性紫癜 (D' Arena 等，Leuk. Lymphoma 44 :561-562(2003) ；Stasi 等，Blood, 98 :952-957(2001)； Saleh 等，Semin. Oncol, 27 (Supp 12) :99-103(2000) ；Zaia φ, Haematolgica, 87 189-195 (2002) ；Ratanatharathorn 等，Ann. Int. Med.，133 :275-279 (2000))、单纯红细胞再生障碍(Auner等，Br. J.Haematol，116 :725-7^0002))、自身免疫性贫血 (Zaja 等，Haematologica 87 :189-195 Q002)(错字勘误表出现在 Haematologica 87: 336(2002)中))、冷凝聚素病(Layios 等，Leukemia, 15 :187-8(2001) ；Berentsen 等， Blood,103 :2925-2928(2004) ；Berentsen 等，Br. J.Haematol，115 :79-83 (2001)； Bauduer, Br. J. Haematol, 112 :1083-1090(2001) ；Damiani 等，Br. J. Haematol, 114 229-234(2001))、严重的抗胰岛素性 B 型综合征(Coll 等，N. Engl. J. Med.，350 310-311(2004)),混合型冷球蛋白血症(DeVita 等，Arthritis Rheum. 46Suppl. 9 S206/S469(2002)),重症肌无力(Zaja 等，Neurology，δ5 1062-63(2OOO) ;Wylam ^f, J. Pediatr. , 143 :674-677 (2003)), Wegener 氏肉芽肿(Specks 等，Arthritis & Rheumatism 44 J836_284(K2001))、难愈型寻常天疱疫(Dupuy 等，Arch Dermatol, 140 91-96 (2004))、皮肌炎(Levine，Arthritis Rheum.，46 (Suppl. 9) :S1299 (2002))、干燥综合征(Somer 等，Arthritis & Rheumatism，49 :394-398 (2003)),活性 II 型混合型冷球蛋白血症(Zaja 等，Blood，101 :3827-38340003))、寻常天疱疮(Dupay 等，Arch. Dermatol, 140 :91-95(2004))、自身免疫性神经病(Pestronk 等，J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 74 :485-489 (2003))、副癌性斜视眼阵挛-肌阵挛综合征(Pranzatelli 等，Neurology 60 (Suppl. 1)Ρ05· 128 :A395 (2003))和复发性缓解型多发性硬化(RRMS) (Cross 等(摘要)，“Preliminary results from a phase II trial of Rituximab in MS" EighthAnnual Meeting of the Americas Committees for Research andTreatment in Multiple Sclerosis, 20-21 (2003))的体征和症状。本发明提供了用于在生理条件下阻止大分子(例如抗体)聚集的方法和配方。本发明的方法提供了在制备治疗性蛋白质配方中的优势，例如本说明书所述的抗CD20抗体。 这些优势包括制备皮下注射用配方的能力，所述配方可提供增加的治疗性抗体的生物利用率，并减少注射位点的炎症，以及根据下文详述而显而易见的其他优势。发明概述环糊精已被生物化学家用作低水溶性药物的助溶剂。我们出人意料地发现不同类型的环糊精(例如，磺丁基醚、羟丙基Y、羟丙基β)能抑制蛋白质特别是抗体的聚集和絮凝，因为抗体是高水溶性。因此，环糊精抑制高浓度抗体的聚集和絮凝的这一发现代表了环糊精的新用途。我们还发展了新的体外筛选方法，所述方法包括使用具有限定分子量(MW) 截留的透析管，以及专门的释放溶液，两者都模拟注射位点的生理条件。本发明提供了在生理条件下降低大分子(例如蛋白质)聚集和抑制絮凝的方法，通过添加2%至30%环糊精(⑶)，其中所述环糊精选自羟丙基β (ΗΡ-β)、羟丙基 Y (HP-γ)和磺丁基醚(SBE)环糊精。在大鼠中，通过添加⑶而显著降低的聚集和絮凝也与皮下注射位点处的炎症的显著降低相关。本发明进一步提供了使皮下施用大分子(例如蛋白质)的过程中注射位点处的炎症最小化的方法，通过向皮下配方中添加2%至30% ΗΡ-β环糊精、HP-γ环糊精或SBE环糊精。在本发明的各个实施方案中，大分子是抗体。在本发明的进一步的实施方案中，抗体是治疗性抗体或诊断抗体。在本发明的各个实施方案中，大分子是抗CD20抗体。在本发明的某些实施方案中，抗CD20抗体是人源化抗体。在本发明的某些实施方案中，抗CD20抗体包含表1中的变体A、B、C、D、F、G、H或I之一。本发明进一步提供了方法和配方，其中所述抗⑶20抗体包含选自SEQ ID NO :1-15的氨基酸序列。在本发明的进一步的实施方案中，抗体包含SEQ ID NO :1的轻链可变结构域和SEQ ID NO :2的重链可变结构域，或SEQ ID NO :3的轻链可变结构域和SEQ ID NO :4的重链可变结构域，或SEQ ID NO :3的轻链可变结构域和SEQ ID NO: 5的重链可变结构域。本发明进一步提供了方法和配方，其中抗体包含SEQ ID N0:6的全长轻链和SEQ ID NO 7,SEQ ID NO :8或SEQ ID NO 15的全长重链。本发明进一步提供了方法和配方，其中抗体包含SEQ ID NO :9的全长轻链和SEQ ID NO 10,SEQ ID NO =IUSEQ ID NO: 12、SEQ ID NO :13 或 SEQ ID NO: 14 的全长重链。在另一方面，本发明提供了用于皮下施用大分子(例如蛋白质)的药物配方，包含2%至30%的ΗΡ-β环糊精、ΗΡ-γ环糊精或SBE环糊精。在一些实施方案中，本发明提供了用于皮下施用抗体的药物配方，包含浓度为10mg/ml至200mg/ml的抗体，和2%至 30%的ΗΡ-β环糊精、ΗΡ-γ环糊精或SBE环糊精。在某些实施方案中，抗体的浓度范围是 30-150mg/ml。在进一步的实施方案中，抗体的浓度范围是100-150mg/ml。在某些实施方案中，药物配方包含浓度为5%至30%的ΗΡ-β环糊精。在某些实施方案中，药物配方包含浓度为5%至20%的HP-Y环糊精。在某些实施方案中，药物配方进一步包含浓度为50mM 至200mM的精氨酸琥珀酸。在某些实施方案中，药物配方包含浓度为2%至9%的SBE环糊精。在某些实施方案中，药物配方包含浓度为约100mg/ml的抗体，和浓度为15%至30%的 HP-β环糊精。在某些实施方案中，药物配方包含浓度为约150mg/ml的抗体，和浓度为约 30%的ΗΡ-β环糊精。在某些实施方案中，药物配方包含浓度为约150mg/ml的抗体，和浓度为约10%的HP-Y环糊精。在某些实施方案中，药物配方进一步包含浓度为50mM至200mM 的精氨酸琥珀酸。在具体的实施方案中，药物配方包含浓度为100mg/ml至150mg/ml的人源化2H7抗体，浓度为15%至30%的HP- γ环糊精，以及浓度为50mM至IOOmM的精氨酸琥珀酸。在进一步的实施方案中，药物组合物进一步包含30mM醋酸钠；5%二水合海藻糖；和 0. 03%聚山梨醇酯20，pH 5. 3。本发明进一步提供了包含人源化抗CD20抗体的任意上述配方，所述抗体由表1列举的任意抗体组成。本发明进一步提供了这样的配方，其中所述抗CD20抗体包含选自SEQ ID NO :1-15的氨基酸序列。在本方面的进一步的实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO 1 的轻链可变结构域和SEQ ID NO 2的重链可变结构域，或SEQ ID NO 3的轻链可变结构域和SEQ ID NO :4的重链可变结构域。本发明进一步提供了方法和配方，其中抗体包含SEQ ID NO 6的全长轻链和SEQ ID NO :7、SEQ IDNO :8或SEQ ID NO 15的全长重链。本发明进一步提供了方法和配方，其中抗体包含SEQ ID NO :9的全长轻链和SEQ ID NO 10、SEQ IDNO 11、SEQ ID N0:12、SEQ ID NO :13 或 SEQ ID NO 14 的全长重链。本发明进一步提供了治疗表达CD20的B细胞癌症的方法，包括以药物配方施用表 1的任一种人源化抗⑶20抗体，所述配方包含2%至30% HP-β环糊精、HP-Y环糊精或 SBE环糊精。CD20阳性的B细胞癌优选是B细胞淋巴瘤或白血病。在具体的实施方案中，包含与人CD20 (hCD20)结合的人源化2H7抗体及其功能性片段的配方被用于治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)、缓慢生长的NHL，包括复发性缓慢生长的NHL和利妥昔单抗-难愈性缓慢生长的NHL、淋巴细胞为主的霍奇金氏病(LPHD)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在具体的实施方案中，包含人源化CD20结合抗体(尤其是表1的变体A、B、 C、D或H)或其功能性片段的配方，被用于治疗上文列举的CD20阳性的B细胞癌。本发明还提供了治疗自身免疫病的方法，包括向患自身免疫病的患者施用药物配方中的治疗有效量的表1之人源化2H7抗体，所述配方包含2%至30%的HP-β环糊精、 HP-Y环糊精或SBE环糊精。在具体的实施方案中，自身免疫病选自类风湿关节炎(RA)和幼年类风湿关节炎，并且RA患者是氨甲喋呤(Mtx)-不充分应答者和TNF α拮抗剂不充分应答者、利妥昔单抗-难愈型或复发型患者。在一个实施方案中，RA患者对另一种抗CD20 治疗性抗体是难愈型或复发型的。在其他实施方案中，自身免疫病选自系统性红斑狼疮 (SLE)包括狼疮肾炎、多发性硬化(MS)包括复发缓解型多发性硬化(RRMS)、韦格纳氏病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、 自身免疫性血小板减少症、多发性硬化、牛皮癣、IgA肾病、IgM多发性神经病、重症肌无力、 ANCA相关性脉管炎、糖尿病、Reynaud氏综合征、干燥综合征、视神经脊髓炎(NMO)和肾小球肾炎。在具体的实施方案中，包含人源化CD20结合抗体(尤其是表1的变体A、B、C、D或 H)或其功能性片段的配方，被用于治疗上文列举的自身免疫病。在上述疾病的治疗方法的某些实施方案中，患病的受试者或患者是灵长类，优选人。本发明进一步提供了在注射后改善或维持在患者的注射位点的含水皮下配方中的抗体之溶解度的方法，或最小化所述抗体在所述配方中沉淀的方法，包括向含水的皮下配方中添加2%至30%的HP-β环糊精、HP-γ环糊精和SBE-环糊精。在某些实施方案中， 所述药物配方包含浓度为5%至30%的HP-β环糊精。在某些实施方案中，所述药物配方包含浓度为5%至20%的HP-Y环糊精。在某些实施方案中，所述药物配方进一步包含浓度为50mM至200mM的精氨酸琥珀酸。在某些实施方案中，所述药物配方包含浓度为2%至 9%的SBE环糊精。本发明进一步提供了增加待皮下施用的抗体的生物利用率的方法，包括向包含抗体的含水的皮下配方中添加2%至30%的HP-β环糊精、HP- γ环糊精和SBE-环糊精。在某些实施方案中，所述药物配方包含浓度为5%至30%的HP-β环糊精。在某些实施方案中，所述药物配方包含浓度为5%至20%的HP-γ环糊精。在某些实施方案中，所述药物配方进一步包含浓度为50mM至200mM的精氨酸琥珀酸。在某些实施方案中，所述药物配方包含浓度为2%至9%的SBE环糊精。本发明进一步提供了用于评估在生理条件下，赋形剂降低抗体或其他大分子聚集的能力的体外透析方法，包括在37°C和持续搅拌的条件下，针对模拟生理条件的测试基质透析含或不含测试赋形剂的大分子配方；取样修饰的基质溶液；和通过例如UV光度计扫描的方法，测量样品的外观如混浊度和在释放溶液中存在的蛋白质的量，其中，相比缺少赋形剂的对照，在含有测试赋形剂的测定中，释放溶液中增加的蛋白质浓度和减少的混浊度是测试赋形剂降低大分子聚集的能力的指标。在具体的实施方案中，基质涉及修饰的PBS 溶液，例如含有167mM钠、140mM氯化物、17mM磷酸盐、4mM钾。在方法的具体实施方案中，透析管具有1百万道尔顿的截留分子量。在方法的进一步的具体实施方案中，使用UV分光光度计测量测试样品中的蛋白质浓度和混浊度。在方法的进一步的具体实施方案中，方法包括目测修饰的释放溶液和在透析管中的溶液的沉淀，其中，相比缺少赋形剂的对照，在含有测试赋形剂的透析管中减少的沉淀是测试赋形剂降低大分子聚集的能力的指标。
附图简介
图1显示了 2H7在生理条件下的聚集。在37°C下，在PBS中将150mg/ml的2H7透析2天。图2显示了用于评估赋形剂对2H7在生理条件下的聚集的作用的体外透析模型。 在37°C下，用220ml修饰的PBS溶液(167mM钠、140mM氯化物、17mM磷酸盐、4mM钾)装入 250ml玻璃罐中。在一端夹闭长度为6cm的12mm透析管，装入约Iml的测试样品，去除过多的空气，并将管的另一端夹住至密封。将罐子置于37°C下，持续搅拌。图3显示了对照在体外透析模型中的行为。在如图2显示的模型中测试2H7和 rhuMab CDlla0在2. 5、6、12、24、33和48小时的时间点测量释放到PBS溶液中的蛋白质累积百分比。图4显示了 2-9% SBE-环糊精对2H7在体外模型中的释放的作用。图5显示了 5-20% HP- γ环糊精对2Η7在体外模型中的释放的作用。图6显示了 5-20% HP-β环糊精对2Η7在体外模型中的释放的作用。图7显示了 HP- γ环糊精和精氨酸琥珀酸对2Η7在体外模型中的释放的作用。实施方案的详述动词“聚集”的各种形式指单个蛋白质分子或复合物联合形成聚集物的过程。“聚集物”是包含蛋白质分子或复合物的多聚装配体。聚合可以进行至形成可见沉淀的程度。 此类可见沉淀的形成在本文中也称为“絮凝”。可以确定大分子沉淀的相对量，例如，通过与可视对照比较。测定沉淀的其他方法是本领域已知的，并描述在下文中，例如在实施例2中详细描述的体外透析方法，或实施例 3中描述的体内模型。术语“生物利用率”指在施用后，在生理学活性位点处的药物或其他物质吸收或成为可利用的程度或速率。可以通过本领域已知的体内药物动力学方法测定大分子的生物利用率。术语“大分子”指具有至少10000道尔顿的分子量的分子，并可包括蛋白质，例如抗体。术语“赋形剂”或“制药赋形剂”指可以降低大分子聚集的化合物。赋形剂可以包括糖、盐、游离的氨基酸如L-精氨酸和L-谷氨酰胺、多元醇、聚乙二醇(PEG)和其他聚合物，如聚山梨醇酯、泊洛沙姆或聚乙烯吡咯烷酮。术语“环糊精”(或“⑶”)指具有用α _(1，4)糖苷键连接的d-吡喃葡萄糖单位的环状寡糖。最常见的天然存在的环糊精是α-环糊精、β-环糊精和Y-环糊精，分别由 6、7和8个吡喃葡萄糖单位组成。环糊精的同义词包括Cavitron、环状寡糖、cycloamulose 和环葡聚糖。术语“环糊精”在本文中可以进一步包括环糊精衍生物，包括但不限于甲基化 ⑶、2-羟丙基化⑶、乙酰化⑶、分支的⑶和磺丁基⑶。
术语“治疗性抗体”指用于治疗疾病的抗体。治疗性抗体可具有各种作用机制。治疗性抗体可结合和中和靶的正常功能。例如，阻断癌细胞存活所需的蛋白质的活性的单克隆抗体导致所述细胞死亡。另一种治疗性单克隆抗体可结合并激活靶的正常功能。例如， 单克隆抗体可以结合细胞上的蛋白质，并触发细胞凋亡的信号。最后，如果单克隆抗体结合仅在疾病组织上表达的靶，则所述单克隆抗体与毒性负载(效应剂)如化疗剂或放射活性剂的缀合可以产生用于特异性递送毒性负载至疾病组织的试剂，降低对健康组织的损害。术语“诊断抗体”指用作疾病的诊断试剂的抗体。诊断抗体可结合靶，该靶与具体疾病特异性相关，或在具体疾病中表现出增加的表达。诊断抗体可用于例如检测患者的生物学样品中的靶，或用于患者中的疾病位点如肿瘤的诊断性成像。“CD20”抗原是具有约35kD分子量的非糖基化的跨膜磷蛋白，可见于外周血或淋巴器官中多于90%的B细胞的表面。⑶20在早期前B细胞发育的过程中表达，并保留到血浆细胞分化；在人干细胞、淋巴祖细胞或正常的血浆细胞中未发现⑶20。⑶20存在于正常B 细胞以及恶性B细胞上。⑶20在文献中的其他名称包括“B-淋巴细胞-限制性分化抗原” 和 “Bp;35”。CD20 抗原描述在例如 Clark 和 Ledbetter，Adv. Can. Res. 52 :81-149 (1989)以及 Valentine 等，J. Biol. Chem. 264(19) :11282-11287(1989)中。术语“抗体”以广义使用，并特异性的覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和表现出理想的生物学活性或功能的抗体片段。本发明的人源化⑶20结合抗体的生物学活性可至少包括结合人⑶20的抗体， 更优选的结合人和其他灵长动物(包括食蟹猴(cynomolgus monkey)、恒河猴(rhesus monkey)、黑猩猩)⑶20的抗体。抗体可以以不高于lxlO—8的Kd值，优选不高于约lxlO—9的 Kd值结合CD20，当相比未用此类抗体处理的恰当的阴性对照时，优选能够在体内杀死或消减B细胞至少20%。B细胞消减可以是ADCC、⑶C、凋亡或其他机制的一种或多种的结果。 在本文的疾病治疗的一些实施方案中，相对于其他，具体的效应子功能或机制是理想的，而优选人源化2H7的某些变体来实现这类生物学功能，例如ADCC。“抗体片段”包括全长抗体的一部分，一般是其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；双抗体、线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。“Fv”是最小抗体片段，含有完整的抗原识别和结合位点。该片段由一条重链和一条轻链可变区结构域的二聚体以紧密的、非共价连接组成。从上述两个结构域的折叠发出六个超变环(H和L链各3个环)，贡献负责抗原结合的氨基酸残基，并产生抗体的抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或只包含对抗原特异性的3个CDR的一半Fv)也具有识别和结合抗原的能力，虽然是以比完整结合位点低的亲和力。术语“单克隆抗体”在本文中指来自基本同质的抗体群体的抗体，即，包含所述群体的独特抗体是相同的和/或结合相同的表位，除非在生产所述单克隆抗体的过程中出现的可能的变体，此类变体一般以极小的量存在。此类单克隆抗体典型的包括含有结合靶的多肽序列的抗体，其中所述靶结合多肽序列是通过这样的过程获得的，所述过程包括从多个的多肽序列中选择单个的靶结合多肽序列。例如，选择过程可以是从多个克隆，例如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的池中选择唯一的克隆。应该理解，可以进一步改善所选定的靶结合多肽序列，例如，改善与靶的亲和力、将靶结合序列人源化、改善它在细胞培养中的生产、降低它在体内的免疫原性、产生多特异性抗体，等，并且包含所述改变的靶结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体都针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性以外，单克隆抗体制品的优势还在于它们通常未被其他的免疫球蛋白污染。定语“单克隆”表示从基本同质的抗体群体中获得的抗体的特征，但不视为必须通过任何特定的方法生产所述抗体。例如，可以通过多种技术制造根据本发明使用的单克隆抗体，包括例如杂交瘤方法(例如，Kohler等，Nature, 256 495 (1975) ；Harlow 等，Antibodies :A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第 2 版，1988) ；Hammerling 等，in :Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hybridomas563-681 (Elsevier, N. Y.，1981))、重组 DNA 方法(见例如，美国专利号 4，816，567)、噬菌体展示技术(见例如，Clackson 等，Nature, 352 :624-628(1991) ；Marks 等，J. MoI. Biol.，222 :581-597(1991) ；Sidhu 等，J. MoI. Biol. 338 :299-310(2004) ；Lee 等，J. Mol. Biol. 340(5) :1073-1093(2004) ；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34) 12467-12472(2004)；和 Lee 等，J. Immunol. Methods 284(1-2) 119-132 Q004))，以及用于在动物中生产人或人样抗体的技术，所述动物具有部分或全部的编码人免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因座或基因(见例如，WO 1998/24893 ；WO 1996/34096 ；WO 1996/33735 ； W01991/10741 Jakobovits 等，Proc. Natl. Acad. ki. USA，9O :2551 (1993) Jakobovits 等， Nature, 362 :255-258(1993) ； Bruggemann 等，Year inlmmuno.，7 :33(1993)；美国专利号 5，545，806 ；5，569，825 ；5，591，669 (均属于 GenPharm) ；5，545，807 ；WO 1997/17852 ；美国专利号 5，545，807 ；5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 和 5，661，016 ；Marks 等， Bio/Technology,10 :779-783(1992) ；Lonberg 等，Nature，368 :856-859(1994) ；Morrison, Nature，368 :812-813(1994) ；Fishwild 等，Nature Biotechnology, 14 :845-851 (1996)； Neuberger, NatureBiotechnology, 14 826 (1996)；禾口 Lonberg 禾口 Huszar, Intern. Rev. Immunol,13 :65-93(1995))。本发明的CD20结合抗体的“功能性片段”是这样的片段，所述片段保留了以与其来源的完整全长分子基本相同的亲和力与CD20结合，并表现出包括消减B细胞在内的生物学活性，如通过例如本文所述体外或体内测定所测量的。术语“可变”指这样的事实，即可变结构域的某些片段的序列在抗体之间广泛的不同。V结构域介导抗原结合，定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，在可变结构域的 110-氨基酸范围内，可变性不是均等分布的。反而V区由相对不变的、称为框架区的15-30 个氨基酸的骨架组成，其中由分别长9-12个氨基酸的、称为“超变区”的高度变化的较短区域分隔。天然重链和轻链的可变结构域分别包含4个FR，大部分采用片层构象，由3个超变区连接，形成环状连接，并且在一些情况下形成部分的片层结构。每条链的超变区通过FR密切的保持在一起，并且与另一条链的超变区一起负责抗体的抗原结合位点的形成(JaL7 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD. (1991)) 。’gtlSf 1 参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，例如在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中的抗体参与作用。术语“超变区”当用于本文中时指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。超变区一般包含来自“互补决定区”或“⑶R”的氨基酸残基(例如，八中围绕大约残基M_34(L1)、 50-56 (L2)和 89-97 (L3)的，以及 Vh 中围绕大约残基 31-35B (HI)、50_65 (H2)和 95-102 (H3) 的(Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))禾口 / 或来自“超变环”的残基(例如，VL中的残基洸-32 (Li)、50-52 (L2)和91_96(L3)的，以及 VH 中的残基 26-32 (HI)、52A_55 (H2)和 96-101 (H3) (Chothia 和 Lesk J. MoI. Biol. 196 901-917(1987))。如本文中所指的，“共同序列”或共同的V结构域序列是这样的人工序列，所述人工序列源自已知的人免疫球蛋白可变区序列的氨基酸序列的比较。基于这类比较，制备了编码V结构域氨基酸的重组核酸序列，所述V结构域氨基酸是源自人K和人H链亚族III V 结构域的共同的序列。共同的V序列不具有任何已知的抗体结合特异性或亲和力。“嵌合的”抗体(免疫球蛋白)具有一部分的重链和/或轻链与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，同时链的剩余部分与源自另一种物种或属于另一种抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要所述片段表现出理想的生物学活性(美国专利号4，816，567 ；和Morrison等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855 (1984))。本文中使用的人源化抗体是嵌合抗体的子集。非人(例如小鼠)抗体的“人源化”形态是嵌合抗体，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。就绝大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受方或受体抗体)，其中受方的超变区残基被具有理想的特异性、亲和力和能力的来自非人物种(例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)的超变区残基(供体抗体)替换。在一些情况下，通过相应的非人残基替换人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基。此外，人源化抗体可以包括未见于受方抗体或供体抗体中的残基。产生这类修饰以进一步改进抗体性能，例如结合亲和力。一般而言，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个，通常2个可变结构域，其中所有的或基本上所有的超变环对应于非人免疫球蛋白的超变环，而所有的或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的FR区，虽然FR区可能包括一个或多个改善结合亲和力的氨基酸取代。FR中这类氨基酸取代的数量典型的在H链中不超过6个，而在L链中不超过3个。人源化抗体任选的还将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，典型的是人免疫球蛋白的Fe。关于进一步的细节， 参见 Jones 等，Nature 321:522-525(1986) ；Reichmann 等，Nature332 :323-329 (1988)；禾口 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992)。“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在存在补体的条件下靶细胞的溶解。经典补体通路的激活是由补体系统的第一成分(Clq)与(恰当亚类的)抗体的结合启动的，所述抗体结合其关联抗原。为了评估补体激活，可实施CDC测定，例如fezzano-Santoro等， J. Immunol. Methods 202 :163(1996)中所述。在本说明书和权利要求全文中，除非另外指出，免疫球蛋白重链恒定区残基的编号是 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunologicallnterest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)巾白勺 EU*弓|，i亥文献通过引用明确整合到本文中。“Kabat中的EU索弓丨”指人IgGl EU抗体的残基编号。V 区的残基是根据Kabat编号来编号的，除非具体的指出了次序或其他编号系统。
CD20抗体包括“C2B8”，现称为“利妥昔单抗”(“RITUXAN ”)(美国专利号5，736，137)；钇-[90]-标记的2B8小鼠抗体，名为“Y2B8”或“替伊莫单抗”(ZEVALIN ),可商购自 IDEC Pharmaceuticals, Inc.(美国专利号 5，736，137 ； 2B8用登录号HBl 1388于1993年6月22日保藏在ATCC)；小鼠IgG2a “Bi”，也称为“托西莫单抗”，任选用131I标记，产生“131I-B1”或“碘1131托西莫单抗”抗体(BEXXAR ， GlaxoSmithKline，还参见美国专利号5，595，721)；小鼠单克隆抗体“ 1F5”(Press等， Blood 69(2) :584-591(1987))及其变体，包括“框架区修补(framework patched) ” 或人源化 1F5(W0 2003/002607，Leung, S. ；ATCC 保藏 HB-96450)；小鼠 2H7 和嵌合的 2H7 抗体 (美国专利号5，677，180)；人源化2H7(W0 2004/056312 (Lowman等)以及如下文所提出的)；HuMAX-CD20 ，完全的人抗体(Genmab, Denmark ；见例如 Glennie 和 van de Winkel, Drug Discovery Today 8 :503-510(2003)以及 Cragg 等，Blood 101 :1045-1052(2003))； 在TO2004/035607中提出的人单克隆抗体(Teeling等)；具有复杂的N-糖苷键连接的糖链与US 2004/0093621 (Siitara等)所述Fc区结合的抗体；CD20结合分子，如AME 系列的抗体，例如 WO 2004/103404(Watkins 等，Applied Molecular Evolution)中提出的AME-133 抗体；A20抗体或其变体，如嵌合的或人源化的A20抗体(分别是cA20、 IMMU-106a. k. a. hA20 (US 2003/0219433、US 2005/0025764 ；Immunomedics))；和可购自 International Leukocyte Typing Workshop W 3 ^ # L27> G28-2>93-lB3> B-Cl 或 NU-B2 (Valentine 等，In =Leukocyte Typing III (McMichael 编著，第 440 页，Oxford University Press (1987))。本文中优选的CD20抗体是人源化的、嵌合的或人的CD20抗体， 更优选的，人源化的2H7抗体、利妥昔单抗、嵌合的或人源化的A20抗体(Immunomedics)和 HuMAX-CD20 人 CD20 抗体(Genmab)。“分离的”抗体是已鉴别和分离和/或从其天然环境的组分中移出的抗体。其天然环境的污染组分是干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，可能包括酶、激素和其他的蛋白质的或非蛋白质的溶质。在优选的实施方案中，抗体可以纯化(1)至按抗体重量计大于95%， 如Lowry方法确定的，最优选按重量计大于99%，(2)至足以通过转杯式测序仪获得N端或中部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或C3)至使用考马斯蓝或优选的银染，在还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE中为同质的程度。分离的抗体包括重组细胞内原位的抗体， 因为抗体的天然环境的至少一种组分是不存在的。然而，通常通过至少一步纯化步骤制备分离的抗体。发明的组合物和方法本发明提供了用于皮下施用大分子，例如蛋白质的药物组合物，包含2%至30% 的ΗΡ-β环糊精、ΗΡ-γ环糊精或SBE-环糊精。在一些实施方案中，本发明提供了用于皮下施用抗体的药物配方，包含浓度范围为10mg/ml至200mg/ml的抗体，和2%至30%的HP-β 环糊精、ΗΡ-γ环糊精或SBE-环糊精。在某些实施方案中，抗体的浓度范围是30-150mg/ ml。在进一步的实施方案中，抗体的浓度范围是100-150mg/ml。在某些实施方案中，所述药物配方包含浓度为5%至30%的HP-β环糊精。在某些实施方案中，所述药物配方包含浓度为5%至20%的HP-γ环糊精。在某些实施方案中，所述药物配方进一步包含浓度为 50mM至200mM的精氨酸琥珀酸。在某些实施方案中，所述药物配方包含浓度为2%至9% 的SBE-环糊精。在某些实施方案中，所述药物配方包含浓度为约100mg/ml的抗体和浓度为15%至30%的HP-β环糊精。在某些实施方案中，所述药物配方包含浓度为约150mg/ml 的抗体和浓度为约30%的HP-β环糊精。在某些实施方案中，所述药物配方包含浓度为约 150mg/ml的抗体和浓度为约10%的ΗΡ-γ环糊精。在某些实施方案中，所述药物配方进一步包含浓度为50mM至200mM的精氨酸琥珀酸。在具体的实施方案中，所述药物配方包含浓度范围为100mg/ml至150mg/ml的人源化2H7抗体，浓度为15%至30%的HP-γ环糊精， 和浓度为50mM至IOOmM的精氨酸琥珀酸。在进一步的实施方案中，所述药物配方进一步包含30mM醋酸钠；5% 二水合海藻糖；和0.03%聚山梨醇酯20，pH 5. 3。在各个实施方案中，本发明提供了包含人源化2H7抗体(在本文中也称为hu2H7) 的药物组合物。在具体的实施方案中，人源化2H7抗体是表1列举的抗体。表1——人源化抗⑶20抗体及其变体
权利要求
1.使皮下施用大分子的过程中注射位点处的炎症最小化的方法，包括向含有大分子的配方加入2%至30%的环糊精。
2.权利要求1的方法，其中所述环糊精选自HP-β环糊精、HP-Y环糊精和SBE-环糊精。
3.权利要求2的方法，其中所述配方含有5%至30%的ΗΡ-β或ΗΡ-γ环糊精。
4.权利要求3的方法，其中所述配方含有5%至30%的ΗΡ-β环糊精。
5.权利要求3的方法，其中所述配方含有5%至20%的HP-γ环糊精。
6.权利要求5的方法，其中所述配方进一步包含50mM至200mM的精氨酸琥珀酸。
7.权利要求2的方法，其中所述配方含有2%至9%的SBE环糊精。
8.权利要求1的方法，其中所述大分子是蛋白质。
9.权利要求8的方法，其中所述蛋白质是抗体。
10.权利要求9的方法，其中所述抗体是治疗性抗体。
11.权利要求9的方法，其中所述抗体是诊断性抗体。
12.权利要求9的方法，其中所述抗体是抗CD20抗体。
13.权利要求12的方法，其中所述抗体包含表1中所示的抗体变体A、B、C、D、F、G、H或I。
14.权利要求12的方法，其中所述抗体包含选自SEQID NO :1-15的氨基酸序列。
15.权利要求12的方法，其中所述抗体包含SEQID NO 1的轻链可变结构域和SEQ ID NO 2的重链可变结构域。
16.权利要求12的方法，其中所述抗体包含SEQID NO :3的轻链可变结构域和SEQ ID NO 4的重链可变结构域。
17.权利要求12的方法，其中所述抗体包含SEQID NO :3的轻链可变结构域和SEQ ID NO 5的重链可变结构域。
18.权利要求12的方法，其中所述抗体包含SEQID NO 6的全长轻链和SEQ ID NO 7 的全长重链。
19.权利要求12的方法，其中所述抗体包含SEQID NO :6的全长轻链和SEQ ID NO 15的全长重链。
20.权利要求12的方法，其中所述抗体包含SEQID NO :9的全长轻链和SEQ ID NO 10的全长重链。
21.权利要求12的方法，其中所述抗体包含SEQID NO :9的全长轻链和SEQ ID NO 11的全长重链。
22.权利要求12的方法，其中所述抗体包含SEQID NO :9的全长轻链和SEQ ID NO 12的全长重链。
23.权利要求12的方法，其中所述抗体包含SEQID NO :9的全长轻链和SEQ ID NO 13的全长重链。
24.权利要求12的方法，其中所述抗体包含SEQID NO :9的全长轻链和SEQ ID NO 14 的全长重链。
25.用于皮下施用抗体的药物配方，包含浓度范围在10mg/ml至200mg/ml的抗体，和 2%至30%的环糊精。
26.权利要求25的配方，其中环糊精选自HP-β环糊精、HP-γ环糊精和SBE-环糊精。
27.权利要求沈的配方，其中配方含有5%至30%的HP-β或HP-γ环糊精。
28.权利要求27的配方，其中所述配方含有5%至30%的ΗΡ-β环糊精。
29.权利要求27的配方，其中所述配方含有5%至20%的HP-Y环糊精。
30.权利要求四的配方，其中所述配方进一步包含50mM至200mM精氨酸琥珀酸。
31.权利要求沈的配方，其中所述配方含有2%至9%的SBE环糊精。
32.权利要求25的配方，其中所述抗体存在的浓度范围在30mg/ml至150mg/ml。
33.权利要求25的配方，其中所述抗体存在的浓度范围在100mg/ml至150mg/ml。
34.权利要求27的配方，包含100mg/ml的人源化2H7抗体和15%至30%的HP-β环糊精。
35.权利要求27的配方，包含150mg/ml的人源化2H7抗体和30%的HP-β环糊精。
36.权利要求27的配方，包含150mg/ml的人源化2H7抗体和10%的HP-γ环糊精。
37.权利要求36的配方，其中所述配方进一步包含50mM至200mM的精氨酸琥珀酸。
38.权利要求37的配方，其中所述人源化2H7抗体包含表1中所示的抗体变体A、B、C、 D、F、G、H 或 I。
39.权利要求37的配方，进一步包含30mM醋酸钠；5%二水合海藻糖；和0.03%聚山梨醇酯 20，pH 5. 3。
40.权利要求39的配方，其中所述人源化2H7抗体包含表1中所示的抗体变体A、B、C、 D、F、G、H 或 I。
41.权利要求27的配方，其中所述配方包含浓度范围在100mg/ml至150mg/ml的表1 中所示的人源化2H7抗体变体A，15% -30%的HP-γ环糊精，和50mM至IOOmM精氨酸琥珀酸。
42.治疗CD20阳性B细胞癌的方法，包括向患癌症的患者施用治疗有效量的表1的人源化2H7抗体，所述抗体在包含2%至30%的环糊精的药物配方中，其中环糊精选自ΗΡ-β 环糊精、HP- γ环糊精和SBE-环糊精。
43.权利要求42的方法，其中⑶20阳性B细胞癌是B细胞淋巴瘤或白血病。
44.权利要求43的方法，其中CD20阳性B细胞癌选自非霍奇金淋巴瘤(NHL)、复发性缓慢生长的NHL和利妥昔单抗-难愈性缓慢生长的NHL、淋巴细胞占主要的霍奇金氏病 (LPHD)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
45.权利要求42的方法，其中人源化2Η7抗体是表1的变体Α、B、C、D或H。
46.治疗自身免疫病的方法，包括向患自身免疫病的患者施用治疗有效量的表1的人源化2Η7抗体，所述抗体在包含2%至30%的环糊精的药物配方中，其中环糊精选自ΗΡ-β 环糊精、HP- γ环糊精和SBE-环糊精。
47.权利要求46的方法，其中自身免疫病选自类风湿关节炎(RA)和幼年类风湿关节炎，包括氨甲喋呤(Mtx)-不充分应答者和TNF α拮抗剂不充分应答者、系统性红斑狼疮 (SLE)包括狼疮肾炎、多发性硬化(MS)包括复发缓解型多发性硬化(RRMS)、韦格纳氏病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、 自身免疫性血小板减少症、多发性硬化、牛皮癣、IgA肾病、IgM多发性神经病、重症肌无力、 ANCA相关性脉管炎、糖尿病、Reynaud氏综合征、干燥综合征、视神经脊髓炎(NMO)和肾小球肾炎。
48.权利要求46的方法，其中人源化2H7抗体是表1的变体A、B、C、D或H。
49.对注射在患者的注射位点后的含水的皮下配方中的抗体，改善或维持所述抗体在所述配方中的溶解，或最小化所述抗体在所述配方中沉淀的方法，包括向含水的皮下配方中添加2%至30%的环糊精，其中所述环糊精选自ΗΡ-β环糊精、HP-Y环糊精和SBE-环糊精。
50.权利要求49的方法，其中抗体是表1所示的人源化抗⑶20抗体变体Α、B、C、D、F、 G、H 或 I。
51.增加将皮下施用的抗体的生物利用率的方法，包括向包含抗体的含水的皮下配方中添加2%至30%的环糊精，其中所述环糊精选自HP-β环糊精、HP-Y环糊精和SBE-环糊精。
52.权利要求51的方法，其中抗体是表1所示的人源化抗⑶20抗体变体A、B、C、D、F、 G、H 或 I。
53.用于评估在生理条件下，赋形剂降低抗体或其他大分子聚集的能力的体外透析方法，包括(a)在37°C和持续搅拌的条件下，针对修饰的PBS溶液(167mM钠、140mM氯化物、17mM 磷酸、4mM钾)透析含或不含测试赋形剂的大分子配方；(b)去除修饰的PBS溶液的测试样品；和(c)测量测试样品的混浊度和存在的蛋白质的量，其中，相比缺少赋形剂的对照，在测定中含有测试赋形剂的样品中增加的蛋白质浓度和减少的混浊度是测试赋形剂降低大分子聚集的能力的指标。
54.权利要求53的方法，其中配方在具有1百万道尔顿的截留分子量的透析管中进行透析。
55.权利要求53的方法，其中使用UV分光光度计测量测试样品中的蛋白质浓度和混浊度。
56.权利要求53的方法，进一步包括目测修饰的PBS溶液和在透析管中的溶液的沉淀， 其中，相比缺少赋形剂的对照，在含有测试赋形剂的透析管中减少的沉淀是测试赋形剂降低大分子聚集的能力的指标。
全文摘要
本发明公开了在生理条件下通过添加某些环糊精(CD)而降低大分子(例如蛋白质)聚集和抑制絮凝的方法。本发明进一步提供了使皮下施用大分子和用于所述施用的药物配方的过程中注射位点处的炎症最小化的方法。本发明进一步提供了治疗CD20阳性的癌症或自身免疫病的方法，包括施用本发明药物配方中的人源化抗CD20抗体。本发明还提供了用于评估在生理条件下，赋形剂降低抗体或其他大分子聚集的能力的体外透析方法。
文档编号A61K39/00GK102281903SQ200980154664
公开日2011年12月14日 申请日期2009年11月16日 优先权日2008年11月17日
发明者B·洛博, R·黄, S·洛, Y·J·王 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司