专利名称：硫醇基官能化试剂及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及官能化试剂以及利用它们修饰蛋白质和多肽的方法。本发明还涉及通过本发明方法制备的官能化多肽的用途。更具体而言，本发明应用与偶联伴侣(coupling partner)共价连接的官能化试剂，所述官能化试剂包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环。典型地，所述偶联伴侣(例如聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团)能够改变多肽的性质。
背景技术：
现有技术中已知，可使聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)聚合物与治疗性多肽共价连接，该过程称为聚乙二醇化(PEG化)。通常典型地使用包含官能团(例如羟基、巯基、胺基或羧酸基团)的衍生物使多肽与PEG分子的反应性衍生物反应来进行PEG化。在 PEG化反应中，PEG分子的反应性官能团与多肽中存在的氨基酸的氨基、羧基或硫醇基基团或者与多肽的反应性N-末端或C-末端形成稳定的共价键。一般而言，PEG化反应需要使用反应性交联剂，例如马来酰亚胺。然而，还已知PEG化是相对不受控制的反应，主要是因为使用反应性交联剂，并且因为PEG分子可以多种不同的方式与多肽中存在的多个官能团反应，从而产生不均一的产物。这意味着所得PEG化多肽可具有直链或支链结构和/或可具有可变数量的与每个多肽偶联的PEG分子。该反应还受诸如蛋白质类型和浓度、反应时间、温度和pH值的因素的影响，所有这些因素均对反应最终产物有影响。一般而言，进行PEG化以影响多肽(尤其是静脉内施用的那些)的药代动力学或免疫学特性。特别地，可对多肽进行改变以改善其稳定性、生物半衰期、水溶性和免疫学特性。认为对多肽进行PEG化使其质量增加(例如增加20-50kDa)意味着其更不容易通过肾脏排泄，因此在体内存在更长时间。此外，认为PEG化多肽被保护而不受内源性酶的降解。 这也有助于延长其体内半衰期。还认为延长体内半衰期和提高多肽药物效力可导致降低患者需要的多肽的频率或剂量，从而有助于降低针对多肽的免疫反应。PEG化还可有助于提高疏水性多肽的水溶性。然而，虽然PEG化多肽的特性是所期望的(尤其是对于治疗性多肽而言)，但是在 PEG化反应中缺乏控制仍然是一个问题，因为这常常得到一系列具有多种不同特性的产物。 此外，因为多肽是复杂分子，所以难以使用保护基来控制反应的位点和/或程度，例如这在小分子化学中是可能的。多肽糖基化是翻译后修饰的天然形式，其改变多肽的结构和功能。从本质上来说， 糖基化是由导致不同类型糖基化多肽的位点特异性修饰的酶促过程介导的。在N-连接的糖基化中，聚糖与天冬酰胺侧链的酰胺氮相连，在0-连接的糖基化中，聚糖与丝氨酸和苏氨酸侧链的羟基氧相连。其它形式的糖基化包括与丝氨酸的羟基氧相连的糖胺聚糖、其中聚糖与神经酰胺相连的糖脂、不与蛋白质或脂质相连的透明质酸、以及通过聚糖连接使蛋白质与脂质相连的GPI锚定蛋白。
现有技术中存在的普遍问题是糖基化常添加到真核细胞中的多肽上，而很少添加到在常用治疗性多肽重组表达的原核宿主中表达的多肽上。在原核宿主中产生的多肽缺少糖基化可导致所述多肽被识别为异物或者意味着它们具有不同于其天然形式的其它特性。 难以通过基因工程在多肽的非天然糖基化位点上进行糖基化以试图将这用于调节多肽特性也是一个问题。WO 88/05433公开了用于制备多肽与信号产生或细胞毒性化学实体之缀合物的交联剂。所述交联剂由一系列含氮芳香杂环化合物组成，特别是2-、3_或4-乙烯基吡啶和乙烯基嘧啶，所述信号产生或细胞毒性化学实体可通过所述交联剂中存在的活化酯取代基与所述含氮芳香杂环化合物相连。缀合反应在于使所述试剂的乙烯基与多肽中存在的硫醇基反应。WO 88/0M33中公开的化合物均包含吸电子取代基作为所述含氮芳香杂环的官能团。 还应当注意的是，WO 88/0M33未提供任何表明利用交联剂使信号产生或细胞毒性化学实体与多肽相连的实施例。WO 2005/024041描述了用于蛋白质组学方法中的对两个或更多个细胞群中蛋白质加质量标签的方法。该加标签方法包括使一个群中的半胱氨酸残基与2-乙烯基吡啶反应，而另一个群中的半胱氨酸残基与CV4烷基取代的2-乙烯基吡啶反应，从而产生具有可通过质谱区分之质量的加标签蛋白质。Banas 等人(Biochimica et Biophysica Acta, 957 (2) 178—84，1988)研究了大肠杆菌(E. coli)磷酸果糖-1-激酶半胱氨酸残基的反应性，利用乙烯基吡啶、溴代丙酮酸酯和二硫代硝基苯甲酸来确定多肽中存在的6个半胱氨酸残基的相对反应性。Fullmer (Analytical Biochemistry, 142(2) :336_9，1984)描述了改进肽中氨基酸组成分析的方法，特别是半胱氨酸和色氨酸鉴定的方法。改进之一采用4-乙烯基吡啶来保护二硫键还原断裂之后肽中存在的一半半胱氨酸残基，因为所产生的半胱氨酸衍生物对酸水解稳定。现有技术中在改善用偶联伴侣(如PEG分子和聚糖基团)衍生化多肽方面仍然存在问题。
发明内容
概括而言，本发明涉及用例如聚(亚烷基二醇)分子和聚糖基团的部分对多肽进行官能化的化合物及其使用方法。该化学是基于包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的官能化试剂之上的，所述乙烯基取代基能够与多肽中天然存在的或被引入其中的一个或更多个硫醇基反应，例如通过使用一个或更多个半胱氨酸残基的硫醇基。一般而言，所述官能化试剂与聚(亚烷基二醇)分子(例如聚乙二醇(PEG)分子)或聚糖基团共价连接，因此所述乙烯基与多肽中硫醇基之间的反应使得所述多肽与所述聚(亚烷基二醇)分子和/或所述聚糖基团共价连接。因此，在一个方面中，本发明提供了这样的方法，其包括使具有至少一个反应性硫醇基的多肽与包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的官能化试剂反应，所述乙烯基取代基能够与多肽中至少一个硫醇基反应，其中所述官能化试剂与聚(亚烷基二醇)分子和/ 或聚糖基团共价连接，以便所述官能化试剂的乙烯基取代基与所述多肽的硫醇基反应，从而使所述聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团与所述多肽共价连接。
在另一个方面中，本发明提供了对具有至少一个反应性硫醇基的多肽进行修饰 (例如PEG化或糖基化)的方法，所述方法包括使所述多肽与包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的官能化试剂反应，所述乙烯基取代基能够与多肽中至少一个硫醇基反应，其中所述官能化试剂与聚(亚烷基二醇)分子(例如聚乙二醇(PEG)分子)或聚糖基团共价连接，以便所述官能化试剂的乙烯基取代基与所述多肽的硫醇基反应，从而使所述聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团与所述多肽共价连接。除了使所述官能化试剂与所述多肽反应以将它们连接在一起的步骤之外，本发明的方法还可包括一个或更多个步骤。例如，所述方法可包括使包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的官能化试剂前体与所述聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团反应以产生所述官能化试剂的起始步骤。作为替代或者补充，所述方法可包括以下起始步骤确定多肽中反应性硫醇基的位置、选择用于与本发明官能化试剂反应的一个或更多个硫醇基、以及任选地保护剩余硫醇基中的一些。然后可使所述多肽与本文所述的官能化试剂反应。通过上文应当理解，所述乙烯基与所述多肽硫醇基的反应通常产生-CH2-CH2-S-基团，其使所述官能化试剂与所述多肽共价连接。在该反应中产生的硫醚键在生物条件下通常非常稳定。该稳定性可与现有技术中使用马来酰亚胺作为交联剂形成对比，使用马来酰亚胺作为交联剂具有潜在缺点，当用其对多肽进行衍生化时，多肽在储存过程中发生反应，例如开环。在其中所述多肽不包含合适的硫醇基或者所述多肽链的所期望位置中不包含合适的硫醇基的本发明实施方案中，本发明可包括对母体多肽进行修饰的起始步骤，例如通过化学反应或定点突变产生在所述多肽的一个或更多个期望位置上具有硫醇基的变体多肽。优选地，这是通过用半胱氨酸残基替代所述多肽中一个或更多个氨基酸来实现的。在涉及多肽糖基化的本发明实施方案中，可对所述母体多肽的天然糖基化位点进行修饰，例如对天冬酰胺、苏氨酸或丝氨酸残基进行修饰，以引入之后可与包含一个或更多个聚糖基团的官能化试剂反应的硫醇基。这是可以进行的，例如当母体多肽的该位点未糖基化时(例如作为其所产生之方式的结果)，或者当糖基化已被除去时。作为替代或者补充，本发明方法可包括对与反应性硫醇基空间上接近的氨基酸残基进行修饰以提高硫醇基对官能化试剂的反应活性。例如，可对空间上接近的氨基酸残基进行修饰来改变所述反应性硫醇基周围的局部PH、氢键相互作用、水化(waters of hydration)、或空间可接近性。优选地，所述反应性硫醇基(不论其是天然存在于多肽中还被引入的)是半胱氨
酸氨基酸残基的一部分。在进行上文所述的方法后，然后可在一个或更多个其它步骤中对所述PEG化或糖基化多肽进行纯化或分离。在又一个方面中，本发明提供了下式所示的用于用聚(亚烷基二醇)或聚糖基团对多肽进行官能化的化合物
权利要求
1.一种用于修饰具有至少一个反应性硫醇基的多肽的方法，所述方法包括使所述多肽与包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的官能化试剂相接触，所述乙烯基取代基能够与所述多肽的至少一个硫醇基反应，其中所述官能化试剂与聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团共价连接，使得所述官能化试剂的乙烯基取代基与所述多肽的硫醇基反应，从而使所述聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团与所述多肽共价连接。
2.一种方法，其包括使具有至少一个反应性硫醇基的多肽与包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的官能化试剂相接触，所述乙烯基取代基能够与所述多肽的至少一个硫醇基反应，其中所述官能化试剂与聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团共价连接，使得所述官能化试剂的乙烯基取代基与所述多肽的所述硫醇基反应，从而使得所述聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团与所述多肽共价连接。
3.权利要求1或权利要求2的方法，还包括使包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的官能化试剂前体与所述聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团反应来产生所述官能化试剂的初始步骤。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述聚(亚烷基二醇)分子是聚乙二醇(PEG) 分子。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述含氮芳香杂环是吡啶环、嘧啶环或叠氮环。
6.前述权利要求中任一项的方法，还包括确定所述多肽中反应性硫醇基的位置，以及任选地将其中的一些进行保护。
7.前述权利要求中任一项的方法，还包括通过化学反应或通过定点突变以产生在所述多肽的一个或更多个期望位置上具有硫醇基的变体多肽来对母体多肽进行修饰的起始步骤。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述硫醇基存在于半胱氨酸残基中。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的官能化试剂以下述通式表示
10.权利要求9的方法，其中X和Y都是CH或者X和Y之一是CH而另一个是N。
11.权利要求9或权利要求10的方法，其中R1或&之一包含聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团。
12.权利要求9或权利要求10的方法，其中R1和&都包含聚(亚烷基二醇)分子和/或聚糖基团。
13.权利要求9或权利要求10的方法，其中R1和&之一包含聚(亚烷基二醇)分子并且R1和&中另一个包含聚糖基团。
14.权利要求9至13中任一项的方法，其中用于使所述聚(亚烷基二醇)分子和/或所述聚糖基团与所述含氮芳香杂环相连的所述札和/或&基团独立地选自-(CH2)n-Z-(CH2) 。-R 或-C (O)-Z-(CH2)。-R。
15.权利要求9至13中任一项的方法，其中在所述队和&基团中，ο是0并且所述基团可表示为-(CH2) n-Z-R 或-C (0) -Z-R。
16.前述权利要求中任一项的方法，其中所述官能化试剂以下述通式之一表示其中至少R1以及任选地&与聚(亚烷基二醇)分子和/或聚糖基团共价连接；并且进一步地其中R1以及任选地&独立地选自-(CH2)n-Z-(CH2)。-C(0)-R，其中 Z 是 0、S 或 NH，n 是 0 至 10，o 是 0 至 10，并且其中 R 是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者-(CH2)n-Z-(CH2)。-R，其中Z是0、S或ΝΗ，η是0至10，ο是0至10，并且其中R是氢、 聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者-C(0)-Z-(CH2)。-R，Z是0、S或ΝΗ，ο是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者-(CH2)n-Z-C(0)-(CH2)。-R，其中 Z 是 0、S 或 ΝΗ，η 是 0 至 10，ο 是 0 至 10，并且其中 R 是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者-Y-(CH2)n-Z-C (O)-(CH2)。-R，其中 Y 是芳基基团、0、S 或 NH，Z 是 0 或 ΝΗ，η 是 0 至 10， ο是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者-Y-R，其中Y是0或S，R是氢、聚糖、聚(亚烷基二醇)分子、芳基或C1,烷基；前提是当&不与聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团相连时，其可另外选自氢或吸电子基团，例如卤素(F、Cl 或 Br)、-NO2, -CO2H, -CO2R4, COR4, -CHO, _CN、-CF3> -SO2NR4Ii5、烷基或苯基，其中R4和&独立地选自氢或C1,烷基。
17.前述权利要求中任一项的方法，其中所述聚糖是用于使所述多肽糖基化的碳水化合物基团。
18.权利要求17的方法，其中所述糖基是天然或合成的单糖、寡糖或多糖。
19.权利要求17或权利要求18的方法，其中所述聚糖是N-连接或0-连接的糖基。
20.权利要求1至19中任一项的方法，其中所述聚(亚烷基二醇)分子基团的分子量为 IkDa 至 50kDa。
21.前述权利要求中任一项的方法，其中所述聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团与所述多肽缀合以改变所述多肽的药理学特性。
22.权利要求21的方法，其中所述药理学特性是所述多肽的稳定性、生物半衰期、水溶性和/或免疫学性质。
23.前述权利要求中任一项的方法，其中所述多肽是促红细胞生成素、干扰素、白细胞介素、趋化因子、淋巴因子、细胞因子、胰岛素、单克隆抗体或其片段、重组抗体或其片段、凝血因子、集落刺激因子、生长激素、纤溶酶原激活因子、病毒衍生肽、生殖激素、治疗性酶或用于缀合物疫苗的载体蛋白。
24.权利要求23的方法，其中所述缀合物疫苗是在载体蛋白与一个或更多个作为抗原性多糖的聚糖基团之间形成的。
25.下式所示的用于使用聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团对多肽进行官能化的化合物
26.权利要求25的化合物，其中X和Y都是CH或者X和Y之一是CH而另一个是N。
27.权利要求M或权利要求25的化合物，其中所述聚(亚烷基二醇)分子是聚乙二
28.权利要求25至27中任一项的化合物，其中R1或&之一包含聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团。
29.权利要求25至27中任一项的化合物，其中R1和&包含聚(亚烷基二醇)分子和/或聚糖基团。
30.权利要求25至27中任一项的化合物，其中R1和&之一包含聚(亚烷基二醇)分子并且R1和&中另一个包含聚糖基团。
31.权利要求25至30中任一项的化合物，其中用于使所述聚(亚烷基二醇)分子和 /或所述聚糖基团与所述含氮芳香杂环相连的所述R1和/或&基团独立地选自-(CH2) n-Z- (CH2)。-R 或者-C (0) -Z- (CH2)。-R。
32.权利要求25至30中任一项的方法，其中在R1和&基团中，ο是0并且所述基团可表示为-(CH2) n-Z-R 或-C (0) -Z-R。
33.下述通式之一所示的用于用聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团对多肽进行官能化的化合物
34.通过使权利要求25至33中任一项的化合物与多肽的一个或更多个硫醇基反应而形成的缀合物。
35.通过使权利要求25至33中任一项的化合物与多肽的一个或更多个硫醇基反应而形成的缀合物，其用于医学处理方法。
36.权利要求35的用于处理方法的缀合物，其中所述处理是治疗或诊断。
37.权利要求35的用于处理方法的缀合物，其中所述缀合物是疫苗。
38.权利要求37的用于处理方法的缀合物，其中所述疫苗是在载体蛋白和一个或更多个作为抗原性多糖的聚糖基团之间形成的。
全文摘要
本发明公开了用聚(亚烷基二醇)分子和聚糖基团对多肽进行官能化的试剂和方法，其基于包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的官能化试剂，所述乙烯基取代基能与天然存在于所述多肽中的或者引入所述多肽中的一个或更多个硫醇基反应(例如利用一个或更多个半胱氨酸残基的硫醇基)。所述官能化试剂与聚(亚烷基二醇)分子(例如聚乙二醇(PEG)分子)或聚糖基团共价连接，使得所述乙烯基与所述多肽中硫醇基之间的反应将所述多肽与所述聚(亚烷基二醇)分子和/或所述聚糖基团共价连接。
文档编号A61K47/48GK102317305SQ200980154905
公开日2012年1月11日 申请日期2009年12月21日 优先权日2008年12月19日
发明者安德鲁·格雷厄姆·沃茨, 特伦斯·坎特纳, 阿曼达·芭芭拉·麦肯齐 申请人:巴斯大学