专利名称：一种丝素/羟基磷灰石多孔支架的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物材料技术领域，特别是涉及丝素蛋白在人体骨组织替代品方面的
开发利用，具体是一种丝素/羟基磷灰石多孔支架的制备方法。
背景技术：
丝素(SF， fibroin)主要是由家蚕后部丝腺分泌的动物性蛋白，由十八种氨基酸 构成。整个结构分为结晶区和非结晶区。丝素具有良好的生物相容性、缓慢的生物降解性、 力学性质，实际制备中单一的丝素蛋白不具有免疫反应和炎症反应。可用于生物材料的开 发利用。 羟基磷灰石(HA，hydroxy即atite， [Cai。(P04) (0H)2])属于磷酸钙类，是生物体牙、 骨、皮肤小骨和幼年软体动物骨中无机物的主要组成成份。骨骼中的羟基磷灰石不但作为 骨骼的重要受力组成，同时它不断地经历溶解、生长，为生物体维持平衡的钙环境。人工合 成的HA与人体骨骼中的HA组成相同、结构相似，表现出良好的生物相容性、新骨诱导性和 骨传导性。但单一的羟基磷灰石脆性大、韧性差，溶蚀明显。不利于直接用作骨组织的修复 材料。 当前国内外制备丝素/羟基磷灰石支架的方法多采用冻融_冷冻干燥制备的方 法，制备时间周期较长，产品可塑性较差，支架的力学性能较差。
发明内容
针对现有技术存在的不足之处，本发明的目的是提供一种制备机械性能较强的丝 素/羟基磷灰石多孔支架的方法，可制备得到弹性模量接近于人体松质骨的支架材料，该 方法包括以下步骤 (1)丝素蛋白粉的制备用常规方法将蚕茧脱胶干燥得到丝素纤维，将丝素纤维 按浴比1 : 5溶解于质量比浓度为50%的CaCl2溶液，98t:，5min，收集溶液，透析浓縮，冷 冻干燥得到丝素冻干粉； (2)羟基磷灰石的制备将Ca(N03)2 4H20溶液按Ca/P比为1. 67，缓慢滴加到 (NH4) 2HP04溶液中，反应温度60°C ，滴加过程中磁力搅拌子100rpm/min搅拌，并用氨水保持 pH值为10 11 ;滴加完后将反应得到的悬浊液继续300rpm/min搅拌3h，加热悬浊液至沸 腾，除去氨气后，室温条件静置48h ;倾去上清液收集下部沉淀浆料，用蒸馏水反复冲洗至 PH = 7，然后再加入无水乙醇处理，将浆料冷冻干燥得到羟基磷灰石粉末；
(3)将丝素粉末添加于磷酸缓冲液，静置使丝素粉末完全溶于磷酸缓冲液，并用超 声波分离器振荡3min使丝素蛋白充分混匀；然后加入NaHC03粉末，用玻棒搅拌均匀；再均 匀加入羟基磷灰石，当羟基磷灰石完全浸没后，放入超声振荡仪处理5min，伴随玻棒快速搅 拌使羟基磷灰石和丝素粉末充分混匀；最后，依次添加体积比终浓度为1%的戊二醛为交 联剂，体积比终浓度为0.5%的甲醇为促13化剂，搅拌均匀后注入模具静置3h成型，反应温 度37。C，湿度100% ;
(4)将成型后的支架取出，经过超声波反复冲洗，除去杂质后置于_20°C，2 3h， 冷冻干燥8h，得到不同比例的丝素/羟基磷灰石多孔支架。
步骤(1)透析时间为3d，浓縮浓度为8%。 步骤(3)中，丝素与羟基磷灰石的质量比为9 : 1 1 : 9，丝素、羟基磷灰石共混 物与磷酸缓冲液的质量体积比为0. 25 1. 25g : lml， NaHC03粉末的量为丝素、羟基磷灰 石共混物质量的40% ;模具为直径lmm，高度2mm的圆柱管状体。
本发明具有以下优点 1、丝素与羟基磷灰石复合后，丝素作为粘合剂，可将羟基磷灰石颗粒束缚，羟基磷 灰石能提高丝素的力学性能，两者之间达到优势互补。通过调节丝素与羟基磷灰石的比例 可得到不同力学性能的支架材料，最大力学性能接近于人体松质骨的力学性能50MPa，溶剂 采用磷酸缓冲液可在一定条件縮短支架凝固时间。 2、本发明制备工艺简单，反应条件温和，温度为37t:，湿度为100%，接近于人体 生理环境。使用可通过注射方式根据损伤实际形状任意塑性。添加的制孔剂能在较低温度 下经过分解产生气体达到制孔目的，整个过程无有毒物质生成。由于所用试剂少，制备成本 低，支架孔隙率高，孔径大小能满足新骨细胞的生长繁殖，有利于新骨组织形成。
图1为不同比例丝素/羟基磷灰石多孔支架的弹性模量。
图2为不同比例丝素/羟基磷灰石多孔支架的压縮强度。
具体实施例方式以下将通过实例来具体描述本发明的技术方案
实施例1 :纤维状丝素的制备 将蚕茧茧壳剪成小块，放入质量比浓度为0.5%的化20)3溶液中，浴比为1 : 100， 煮沸2次，每次30min，脱去蚕丝表面丝胶，用双蒸水充分洗净，自然干燥得到纤维状丝素。
实施例2 :丝素蛋白粉末的制备 取干燥的丝素纤维溶于50 %的CaCl2溶液中，丝素CaCl2 : H20 = 5g : 25g : 25ml，温度98t:，5min，将所得溶液注入透析袋(截留分子量8000 12000)， 室温流水透析3d，得到丝素溶液，将透析得到的丝素溶液浓縮为8%，冷冻干燥物理粉碎后 得到丝素粉末。 实施例3 :羟基磷灰石粉末的制备 将浓度为0. 32mol/L体积为300ml的Ca (N03) 2 4H20溶液放入水浴锅保持温度为 60。C，并用氨水将溶液pH值调制10 ll，按Ca/P比为1. 67，再将300ml浓度为0. 19mo1/ L(NH4)2HP04溶液缓慢滴加到Ca(N03)2 *4H20溶液中，滴加速度控制为0. lml/s ;反应过程中 将磁力搅拌子的速度调至100rpm/min，利用氨水使ra保持在10 11 ;反应完成后将磁力 搅拌子的速度调至300rpm/min，维持3h ;将反应得到的悬浊液加热至沸腾，直至完全除去 未反应的氨水。 将羟基磷灰石悬浊液室温静置48h，倾去上清液利用蒸馏水反复洗涤浆料至PH = 7 ;加入无水乙醇分散羟基磷灰石微粒；室温放置24h挥发乙醇后将浆料冷冻干燥得到羟基磷灰石粉末。
实施例4 : (1)称取0. 9g丝素粉末添加于lml磷酸缓冲液，静置使丝素粉末完全溶于磷酸缓
冲液，并用超声波分离器振荡3min使丝素蛋白充分混匀； (2)称取0. 4gNaHC03粉末溶于上述溶液，采用玻棒搅拌均匀； (3)称取O. lg羟基磷灰石均匀倒入丝素溶液，当羟基磷灰石完全浸没后，将该混
合物放入超声振荡仪处理5min，伴随玻棒快速搅拌使羟基磷灰石和丝素粉末能充分混匀； (4)取出混合溶液向其中添加比例为终浓度为1%的戊二醛溶液(市售)，用玻棒
搅匀； (5)最后添加终浓度为0. 5 %的甲醇溶液(市售)，将该混合物放入超声振荡仪处 理5min，伴随玻棒快速搅拌； (6)将混合物倒入注射器，在物理作用下出去气泡，最后注入圆柱形模具，移入 37t:，湿度为100%环境中静置3h固化成型。 (7)将成型后的支架材料反复冲洗，放置于-2(TC冷冻2 3h后，放入-5(TC冷冻 干燥机中干燥8h，最终制得SF/HA为9 : 1的丝素/羟基磷灰石多孔支架。该支架弹性模 量为21. 71MPa，压縮强度为0. 54MPa，孔隙率为79%。
实施例5 : (1)称取0. 8g丝素粉末添加于lml磷酸缓冲液，静置使丝素粉末完全溶于磷酸缓
冲液，并用超声波分离器振荡3min使丝素蛋白充分混匀； (2)称取0. 4gNaHC03粉末溶于上述溶液，采用玻棒搅拌均匀； (3)称取0. 2g羟基磷灰石均匀倒入丝素溶液，当羟基磷灰石完全浸没后，将该混
合物放入超声振荡仪处理5min，伴随玻棒快速搅拌使羟基磷灰石和丝素粉末能充分混匀； (4)取出混合溶液向其中添加比例为终浓度为1%的戊二醛溶液(市售)，用玻棒
搅匀； (5)最后添加终浓度为0. 5 %的甲醇溶液(市售)，将该混合物放入超声振荡仪处 理5min，伴随玻棒快速搅拌； (6)将混合物倒入注射器，在物理作用下出去气泡，最后注入圆柱形模具，移入 37t:，湿度为100%环境中静置3h固化成型； (7)将成型后的支架材料反复冲洗，放置于-2(TC冷冻2 3h后，放入-5(rC冷冻 干燥机中干燥8h，最终制得SF/HA为8 : 2的丝素羟基磷灰石多孔支架。该支架弹性模量 为28. 31MPa，压縮强度为0. 64MPa，孔隙率为55%。
实施例6: (1)称取0. 7g丝素粉末添加于lml磷酸缓冲液，静置使丝素粉末完全溶于磷酸缓
冲液，并用超声波分离器振荡3min使丝素蛋白充分混匀； (2)称取0. 4gNaHC03粉末溶于上述溶液，采用玻棒搅拌均匀； (3)称取0. 3g羟基磷灰石均匀倒入丝素溶液，当羟基磷灰石完全浸没后，将该混
合物放入超声振荡仪处理5min，伴随玻棒快速搅拌使羟基磷灰石和丝素粉末能充分混匀； (4)取出混合溶液向其中添加比例为终浓度为1%的戊二醛溶液(市售)，用玻棒
搅匀；
5
(5)最后添加终浓度为0. 5 %的甲醇溶液(市售)，将该混合物放入超声振荡仪处 理5min，伴随玻棒快速搅拌； (6)将混合物倒入注射器，在物理作用下出去气泡，最后注入圆柱形模具，移入 37t:，湿度为100%环境中静置3h固化成型； (7)将成型后的支架材料反复冲洗，放置于-2(TC冷冻2 3h后，放入-5(TC冷冻 干燥机中干燥8h，最终制得SF/HA为7 : 3的丝素羟基磷灰石多孔支架。该支架弹性模量 为31. 63MPa，压縮强度为1. 17MPa，孔隙率为68%。
实施例7 : (1)称取0. 6g丝素粉末添加于lml磷酸缓冲液，静置使丝素粉末完全溶于磷酸缓
冲液，并用超声波分离器振荡3min使丝素蛋白充分混匀； (2)称取0. 4gNaHC03粉末溶于上述溶液，采用玻棒搅拌均匀； (3)称取0. 4g羟基磷灰石均匀倒入丝素溶液，当羟基磷灰石完全浸没后，将该混
合物放入超声振荡仪处理5min，伴随玻棒快速搅拌使羟基磷灰石和丝素粉末能充分混匀； (4)取出混合溶液向其中添加比例为终浓度为1%的戊二醛溶液(市售)，用玻棒
搅匀； (5)最后添加终浓度为0. 5 %的甲醇溶液(市售)，将该混合物放入超声振荡仪处 理5min，伴随玻棒快速搅拌； (6)将混合物倒入注射器，在物理作用下出去气泡，最后注入圆柱形模具，移入 37t:，湿度为100%环境中静置3h固化成型； (7)将成型后的支架材料去除反复冲洗，放置于-2(TC冷冻2 3h后，放入_50°C 冷冻干燥机中干燥8h，最终制得SF/HA为6 : 4的丝素羟基磷灰石多孔支架。该支架弹性 模量为48. 09MPa，压縮强度为1. 44MPa，孔隙率为70%。
实施例8 : (1)称取0. 5g丝素粉末添加于lml磷酸缓冲液，静置使丝素粉末完全溶于磷酸缓
冲液，并用超声波分离器振荡3min使丝素蛋白充分混匀； (2)称取0. 4gNaHC03粉末溶于上述溶液，采用玻棒搅拌均匀； (3)称取0. 5g羟基磷灰石均匀倒入丝素溶液，当羟基磷灰石完全浸没后，将该混
合物放入超声振荡仪处理5min，伴随玻棒快速搅拌使羟基磷灰石和丝素粉末能充分混匀； (4)取出混合溶液向其中添加比例为终浓度为1%的戊二醛溶液(市售)，用玻棒
搅匀； (5)最后添加终浓度为0. 5 %的甲醇溶液(市售)，将该混合物放入超声振荡仪处 理5min，伴随玻棒快速搅拌； (6)将混合物倒入注射器，在物理作用下出去气泡，最后注入圆柱形模具，移入 37t:，湿度为100%环境中静置3h固化成型； (7)将成型后的支架材料反复冲洗，放置于-2(TC冷冻2 3h后，放入-S(TC冷冻 干燥机中干燥8h，最终制得SF/HA为5 : 5的丝素羟基磷灰石多孔支架。该支架弹性模量 为34. 59MPa，压縮强度为0. 76MPa，孔隙率为91 % 。
实施例9 : (1)称取0. 6g丝素粉末添加于2ml磷酸缓冲液，静置使丝素粉末完全溶于磷酸缓冲液，并用超声波分离器振荡3min使丝素蛋白充分混匀； (2)称取0. 4gNaHC03粉末溶于上述溶液，采用玻棒搅拌均匀； (3)称取0. 4g羟基磷灰石均匀倒入丝素溶液，当羟基磷灰石完全浸没后，将该混
合物放入超声振荡仪处理5min，伴随玻棒快速搅拌使羟基磷灰石和丝素粉末能充分混匀； (4)取出混合溶液向其中添加比例为终浓度为1%的戊二醛溶液(市售)，用玻棒
搅匀； (5)最后添加终浓度为0. 5 %的甲醇溶液(市售)，将该混合物放入超声振荡仪处 理5min，伴随玻棒快速搅拌； (6)将混合物倒入注射器，在物理作用下出去气泡，最后注入圆柱形模具，移入 37t:，湿度为100%环境中静置3h固化成型； (7)将成型后的支架材料去除反复冲洗，放置于-2(TC冷冻2 3h后，放入_50°C 冷冻干燥机中干燥8h，最终制得SF/HA为6 : 4的丝素羟基磷灰石多孔支架。该支架弹性 模量为35. 76MPa，压縮强度为0. 269MPa，孔隙率为94%。
实施例10 : (1)称取0. 6g丝素粉末添加于0. 8ml磷酸缓冲液，静置使丝素粉末完全溶于磷酸
缓冲液，并用超声波分离器振荡3min使丝素蛋白充分混匀； (2)称取0. 4gNaHC03粉末溶于上述溶液，采用玻棒搅拌均匀； (3)称取0. 4g羟基磷灰石均匀倒入丝素溶液，当羟基磷灰石完全浸没后，将该混
合物放入超声振荡仪处理5min，伴随玻棒快速搅拌使羟基磷灰石和丝素粉末能充分混匀； (4)取出混合溶液向其中添加比例为终浓度为1%的戊二醛溶液(市售)，用玻棒
搅匀； (5)最后添加终浓度为0. 5 %的甲醇溶液(市售)，将该混合物放入超声振荡仪处 理5min，伴随玻棒快速搅拌； (6)将混合物倒入注射器，在物理作用下出去气泡，最后注入圆柱形模具，移入 37t:，湿度为100%环境中静置3h固化成型。 (7)将成型后的支架材料反复冲洗，放置于-2(TC冷冻2 3h后，放入-5(rC冷冻 干燥机中干燥8h，最终制得SF/HA为6 : 4的丝素羟基磷灰石多孔支架。该支架弹性模量 为74. 98MPa，压縮强度为1. 96MPa，孔隙率为20%。
对照例 羟基磷灰石与丝素比例为0 : IO，制备方法同前，该溶液无法固化，不能得到成型 支架。 以上仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许 多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或是联想到的所有变形， 均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
一种丝素/羟基磷灰石多孔支架的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)丝素蛋白粉的制备用常规方法将蚕茧脱胶干燥得到丝素纤维，将丝素纤维按浴比1∶5溶解于质量比浓度为50％的CaCl2溶液，98℃，5min，收集溶液，透析浓缩，冷冻干燥得到丝素冻干粉；(2)羟基磷灰石的制备将Ca(NO3)2·4H2O溶液按Ca/P比为1.67，缓慢滴加到(NH4)2HPO4溶液中，反应温度60℃，滴加过程中磁力搅拌子100rpm/min搅拌，并用氨水保持pH值为10～11；滴加完后将反应得到的悬浊液继续300rpm/min搅拌3h，加热悬浊液至沸腾，除去氨气后，室温条件静置48h；倾去上清液收集下部沉淀浆料，用蒸馏水反复冲洗至PH＝7，然后再加入无水乙醇处理，将浆料冷冻干燥得到羟基磷灰石粉末；(3)将丝素粉末添加于磷酸缓冲液，静置使丝素粉末完全溶于磷酸缓冲液，并用超声波分离器振荡3min使丝素蛋白充分混匀；然后加入NaHCO3粉末，用玻棒搅拌均匀；再均匀加入羟基磷灰石，当羟基磷灰石完全浸没后，放入超声振荡仪处理5min，伴随玻棒快速搅拌使羟基磷灰石和丝素粉末充分混匀；最后，依次添加体积比终浓度为1％的戊二醛为交联剂，体积比终浓度为0.5％的甲醇为促β化剂，搅拌均匀后注入模具静置3h成型，反应温度37℃，湿度100％；(4)将成型后的支架取出，经过超声波反复冲洗，除去杂质后置于-20℃，2～3h，冷冻干燥8h，得到不同比例的丝素/羟基磷灰石多孔支架。
2. 根据权利要求l所述的方法，其特征在于，步骤(1)透析时间为3d，浓縮浓度为8X。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，丝素与羟基磷灰石的 质量比为9 : 1 1 : 9，丝素、羟基磷灰石共混物与磷酸缓冲液的质量体积比为0.25 1. 25g : lml， NaHC03粉末的量为丝素、羟基磷灰石共混物质量的40% ;
4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，丝素与羟基磷灰石的质 量比为6 : 4。
全文摘要
一种丝素/羟基磷灰石多孔支架的制备方法，通过丝素蛋白粉的制备、羟基磷灰石的制备，再经一系列工艺步骤实现。该方法丝素与羟基磷灰石复合后，丝素作为粘合剂，可将羟基磷灰石颗粒束缚，羟基磷灰石能提高丝素的力学性能，两者之间达到优势互补。通过调节丝素与羟基磷灰石的比例可得到不同力学性能的支架材料，最大力学性能接近于人体松质骨的力学性能50MPa，溶剂采用磷酸缓冲液可在一定条件缩短支架凝固时间。制备工艺简单，成本低，反应条件温和，温度为37℃，湿度为100％，支架孔隙率高。
文档编号A61L27/22GK101773684SQ201010127319
公开日2010年7月14日 申请日期2010年3月19日 优先权日2010年3月19日
发明者张胡静, 徐水 申请人:西南大学