专利名称：放射性标记胰岛素的制作方法
放射性标记胰岛素本申请为分案申请，原申请的申请日为2005年9月13日，申请号为 200580037994. 3 (PCT/GB2005/003527)，发明名称为“放射性标记胰岛素”。本发明涉及体内显像剂、特别是放射性标记胰岛素及其制备方法。放射性标记胰 岛素的用途是应用单光子发射断层显像(SPECT)或正电子发射断层显像(PET)进行诊断成 像以及用于研究体内胰岛素受体与其配体的相互作用。胰岛素是胰岛0细胞所产生的一种多肽激素。胰岛素调节糖代谢和脂质代谢， 影响蛋白质合成。最新的文献资料(New Scientist，2004年8月14日，第34页)还指出 细胞能量水平可能影响细胞生长和增殖，因此胰岛素受体的选择性成像剂可具有癌症成像 和诊断的功效。胰岛素是一种活性二聚体，由51个氨基酸残基组成。天然胰岛素(来源于 人、牛或猪)、重组胰岛素和半合成人胰岛素通常用于治疗糖尿病。放射性标记胰岛素(例 如掺入放射性碘标记)，为本领域所知并用于研究例如胰岛素代谢和体内受体结合实验。诊 断和研究成像的放射性标记生物活性肽的应用在核医学领域中的重要性日渐显现。18F，其 半衰期约110分钟，是用于许多成像研究和诊断方法的精选正电子发射核素。需要将18F快 速有效地掺入生物活性肽中，这样，18F-标记产物才会保留其生物活性。一份18F-标记胰岛 素的报告(Shai等，Biochemistry (1989)，28，4801-6)中，使用4-(氟甲基)苯甲酰合成子 标记人胰岛素的&位。然而，放射性合成既复杂又耗时。因此，需要其它放射性标记(包 括18F-标记)胰岛素的方法和新的放射性标记(包括18F-标记)胰岛素显像剂。因此，根据本发明的一个方面，提供用于放射性标记的方法，该方法包括使下式 ⑴化合物与下式(II)化合物反应，得到下式(III)的缀合物 其中R1是与R2位点特异性反应的官能团。R1可为氨衍生物，例如伯胺、仲胺、羟胺、胼、 酰胼、氨基氧基(aminoxy)、苯胼、氨基脲或氨基硫脲，优选为胼、酰胼或氨基氧基；R2为醛部分、酮部分、被护醛例如缩醛、被护酮例如缩酮或者用氧化剂能快速有效 地氧化为醛或酮的官能团，例如二醇或N-端丝氨酸残基；R*为适于SPECT或PET检测的放射性标记部分；
I胰岛素I^(连接基)——X — N =1-(连接基)-R *
Y(HI)其中X 为-C0-NH-、-NH-、-0-、-NHC0NH-或-NHCSNH-，优选为-C0-NH-、-NH-或-0-； Y为H、烷基或芳基取代基；R*的定义同式(II)化合物。可以在合适的溶剂中，例如在pH范围为2-11、适宜为3-11、更适宜为3-6的含水
4缓冲液中，于5-80°C非极端温度、优选环境温度下进行反应。式⑴和式(II)化合物中的连接基各自独立地为烃基，适宜为烃基，任 选包括1-30个杂原子，适宜为1-10个杂原子，例如氧或氮。合适的连接基包括烷基链、烯 基链、炔基链、芳环、多芳环和杂芳环，和聚合物，包括乙二醇、氨基酸或糖亚基。术语“烃基”是指由碳和氢组成的有机取代基，这样的基团可以包括饱和、不饱和 或芳环部分。式⑴化合物和本发明有关方面的R1优选选自-NHNH2、-C(0)NHNHjn _0NH2，优选 为-onh2。式(II)化合物和本发明有关方面的R2各自优选选自-CH0、> C = (K-OK-O-Ch 烷基-0-)例如-CH(-0CH2CH20-)和-CH(0(V4烷基)2例如-CH(0CH3)2，在一个优选方面，R2 为-CH0。R2醛适于由含有1，2_二醇或1，2氨基醇基团的前体官能化载体原位氧化而产生。 例如在合成过程中，采用氨基酸FmOC-Dpr(BOC-Ser)-0H，可以将上述1，2_ 二醇或1，2氨基 醇基团直接插入到肽序列中，参见Wahl等，Tetrahedron Letts. 37,6861(1996)。合适的氧 化剂可以用于产生式(II)化合物中的R2部分，它包括高碘酸盐、高碘酸、仲高碘酸、偏过碘 酸钠和偏过碘酸钾。R*为适于SPECT或PET检测的放射性标记部分，优选R*为18F、放射性碘(1231、1241、 1251或131I) >75Br或含"C基团例如["ClC^烷基胺，最优选R*为18F。
式(III)化合物和本发明有关方面的Y优选为H、(V6烷基(例如甲基)或苯基。 在本发明的一个方面，式(II)化合物为下式(Ila)化合物
其中m为0-10的整数，n为0-20的整数，Y为氢、烷基(例如甲基)或苯基c 优选式(Ila)化合物中，m为0，n为0，Y为氢，因此式(Ila)化合物为4_[18F]氟苯甲醛。 其中X 为-C0-NH-、-NH-或 _0_，优选为 _0_。式⑴和式(la)化合物中优选的连接基包括-C (0) - (^20 烷基)-NHC (0) CH2_ 和-C (0) - 烷基)-。因此，在一个优选的方面，本发明提供用于放射性氟化的方法，该方法包括使下式 (la)化合物与下式(Ila)化合物反应，得到下式(Ilia)的化合物 其中 X 为-C0-NH-、-NH-或 _0_，优选为 _0_
其中m为0-10 (优选为0)的整数，n为0_20 (优选为0)的整数，Y为氢、(㈣烷基 (例如甲基)或苯基(优选Y为氢)； 其中X的定义同式(la)化合物，m和n的定义同式(Ila)化合物。在另一个优选的方面，本发明提供用于放射性氟化的方法，该方法包括使下式 (lb)化合物与下式(lib)化合物反应，得到下式(Illb)的化合物 对式(I)、式(la)、式(lb)、式(II)、式(Ila)和式(lib)化合物中的连接基进行 选择，使得放射性氟化反应的效率最大化，并提供良好的体内药代动力学特性，例如所得 式(III)、式(Ilia)或式(Illb)缀合物具有良好的排泄特性。采用不同亲脂性和/或电 荷的连接基可显著改变肽的体内药代动力学特性以适应成像需要。例如，当式(III)、式 (Ilia)、式(Illb)缀合物需要通过肾排泄从体内清除时，就采用亲水连接基，而当需要通 过肝胆排泄清除时，则采用疏水连接基。已发现包括聚乙二醇部分的连接基会延缓血液清 除，这在某些情况下是需要的。式(I)、式(la)、式(lb)、式(III)、式(Ilia)和式(Illb)化合物中，胰岛素可为 人胰岛素、牛胰岛素、猪胰岛素，尽管适宜为人胰岛素；且可为天然、重组或合成的胰岛素。 胰岛素或可为天然胰岛素的类似物，例如记载于以下文献中的胰岛素US 5，656，722、DE 3，837，825、W095/07931、EP 383472 或 J Brange 等，Nature 333 (1988)，679。可以用标准肽合成方法制备式(I)、式(la)和式(lb)化合物，例如固相肽合成， 例如参见 Atherton，E.和 Sh印pard，R. C. "Solid PhaseSynthesis，，，IRL Press Oxford, 1989。可以通过肽的游离伯氨基反应实现在式(I)、式(la)或式(lb)化合物中掺入R1基 团，该修饰不会影响胰岛素的结合特性。官能团R1优选通过形成稳定的酰胺键在肽合成 时或在肽合成后引入，酰胺键是由肽胺官能团与活化羧酸反应而生成的。正如对本领域技 术人员显而易见的是，在向式(I)、式(la)或式(lb)化合物中引入R1时，需要保护胰岛 素的某些官能团。合适的保护和脱保护方法可参见例如John ffiley&Sons Inc.出版的 "ProtectingGroups in Organic Synthesis，，，Theodora W. Greene 和 Peter G.M. Wuts。一种特别有用的被保护的胰岛素中间体为A” B29-二 Boc-胰岛素，可以通过Shai等， Biochemistry (1989)，28，4801-6所述方法制备，该中间体可以通过加入连接基和R1基团 加以修饰。通过用酸(例如三氟乙酸)水解，可以在放射性氟化反应之前脱去Boc (叔丁氧 羰基)保护基。另一方面，本发明提供上述定义的式(I)、式(la)或式(lb)化合物及其被保护的 衍生物。优选的式(I)、式(la)和式(lb)化合物是胰岛素为人胰岛素的化合物。式(I)、 式(la)和式(lb)化合物用作PET显像剂和诊断剂合成的前体，根据上述方法，例如可以现 成的放射性氟化试剂盒的形式提供。可以按照国际专利申请W0 2004/080492所述方法，制备R*为18F的式(II)、式 (Ha)和式(lib)化合物。可以在酸例如过乙酸存在下，使相应的三烷基锡前体与放射性碘 盐、适宜为碱金属碘盐(例如碘化钠)反应，从而由三烷基锡前体制备R*为放射性碘的式 (II)化合物。例如，可以通过相应伯胺的"C-烷基化，制备R*为含"C基团(例如"C-烷 基胺基团)的式(II)化合物。该"C-标记技术的全面性综述可参见Antoni等“Aspects on the Synthesis of nC_Lablled Compounds，，，Handbook of Radiopharmaceuticals, M. J. Welch 和 C. S. Redvanly 主编(2003，John Wiley 和 Sons)。又一方面，本发明提供上述式(III)、式(Ilia)或式(Illb)放射性标记缀合物。 优选的式(III)、式(Ilia)或式(Illb)化合物是胰岛素为人胰岛素的化合物。本发明还提供放射性药物组合物，其包含有效量(例如有效用于体内PET成像的 量)的上述式(III)、式(Ilia)或式(Illb)化合物以及一种或多种药学上可接受的辅剂、 赋形剂或稀释剂。本发明优选的实施方案涉及上述通式(III)、通式(Ilia)或通式(Illb)化合物， 其用于医药用途，特别是在SPECT或PET体内成像中的用途，适于体内成像或诊断胰岛素相 关疾病，例如心肌胰岛素抵抗、心脏肥大、高血压、癌症和II型糖尿病。式(III)、式(Ilia)或式(Illb)放射性标记缀合物可给予患者以用于SPECT或 PET成像，其用量足于产生所需信号，每70kg体重0.01-100mCi、优选0. l_50mCi的典型放 射性核素剂量一般便足够。因此，可完全按照本领域技术的方法，用生理上可接受的载体或赋形剂配制用于 给药的式(III)、式(Ilia)或式(Illb)放射性标记缀合物。例如可将化合物与任选加入的 药学上可接受的赋形剂一起悬浮或溶于水性介质中，然后将所得溶液或悬浮液灭菌。从另一个方面看，本发明提供式(III)、式(Ilia)或式(Illb)放射性标记缀合物 在制备放射性药物中的用途，该放射性药物用于体内成像方法、适宜为SPECT或PET方法， 优选用于胰岛素相关疾病的成像；包括给予人或动物体所述放射性药物，在人或动物体的 至少某一部位形成影像。从又一个方面看，本发明提供在人或动物体形成影像的方法，该方法包括给予人 或动物体(例如血管系统)放射性药物，应用SPECT或PET时，在所述放射性药物所分布的 人或动物体的至少某一部位形成影像，其中所述放射性药物包含式(III)、式(Ilia)或式 (Illb)放射性标记缀合物。从再一个方面看，本发明提供用对抗胰岛素相关疾病的药物治疗人或动物体的效 果的监测方法，该方法包括给予人或动物体式(III)、式(Ilia)或式(Illb)放射性标记缀合物，检测所述缀合物的摄取，任选但优选重复进行所述的给药和检测，例如在用所述药物 治疗前、治疗中和治疗后。在本发明另外又一个实施方案中，提供试剂盒，用于制备包含式(II)、式(Ila)或 式(lib)辅基和式(I)、式(la)或式(lb)化合物的放射性氟化示踪物。
实施例下面通过实施例举例说明本发明，其中所用缩写词如下HPLC:高效液相色谱法TFA:三氟乙酸UV 紫外线DMF:N，N_ 二甲基甲酰胺B0C 叔丁氧羰基DMS0:二 甲亚砜用氨基氧基缀合法制备MF-Bf修饰胰岛素实验材料根据Shai 等[Biochemistry 28(1989)4801]的方法，用人重组胰岛素(Sigma)制 备 A,, B29- 二 -B0C-胰岛素(A1 B29-di-BOC-insulin)。B0C-氨基氧基乙酸得自 Fluka。六 氟磷酸(4-氮杂-1，2，3-苯并三唑-3-基氧基)-三(吡咯烷基)辚(PyA0P)、4-氟苯甲醛、 Kryptofix :和N-甲基吗啉(NMM)、无水乙腈和无水二甲亚砜均得自Sigma-Aldrich。B^BOC-氨基氧基_乙酰基_k” 二 _B0C_胰岛素(中间体1，流程1)的制备制备型HPLC柱子PhenomenexLuna prep. C18 ；A 水(0. 1% TFA)，B :MeCN(0. 1% TFA)，流速:5ml/分钟，梯度30-60% B 30分钟，UV检测器:214nm分析型HPLC柱子PhenomenexLuna C18 ；A 水(0. 1% TFA)，B :MeCN(0. 1% TFA)，流速:1ml/分钟，梯度25-80% B 20分钟，UV检测器:214nm和254nmMl将B29- 二 -B0C-胰岛素(10mg, 1. 7u mol)的 DMF 溶液加 A 到 B0C-氨基氧 基乙酸(1. 3mg,6. 6umol)、PyAOP (3. 4mg, 6. 6 u mol)禾口 NMM(L 3mg, 1. 5u 1,13 u mol)的 DMF(1.5ml)溶液中。4小时后，减压蒸发DMF，粗产物用制备型HPLC纯化(产量5. 3mg， 51% )。B,-(4- g -亚苄基氨,基氧,基)-乙Bffi _ fl夷岛素(仆,合物1，流消1)的泡丨备向B0C-保护的胰岛素衍生物中间体1 (5mg)中加入TFA/5%水溶液(0. 2ml)。室 温下静置1分钟后，液相经氮气流蒸发。残余物溶于乙酸铵缓冲液(PH4. 0,0. 5mM)，与1当 量的4-氟苯甲醛反应。产物用制备型HPLC纯化，用LC-MS表征。B.-C^pFl氟-亚苄基氨基氧基)_乙酰基-胰岛素(化合物2，流程3)的制备r^Fl氟苯甲醛按照S.M.Haka 等[J. Labelled Cpd. and Radiopharm. 27 (1989) 823]的方法制备[18F]氟苯甲醛。简单地说，用180(p, n)18F与19MeV的质子束和浓缩[180]H20(30% )作为 靶材料，在回旋加速器进行核反应得到18F-氟。向辐射靶的水(370MBq，10mCi，lml)中加入 Kryptofix (10mg)、碳酸钾(lmg)和乙腈(0.8ml)的混合物。混合物在氮气流中加热至 100°C。除去溶剂后，加入乙腈(0.5ml)，然后蒸发。这一步骤重复两次。将装有无水[18F]KF-氪酸盐(kryptate)的小瓶冷却至室温，加入苯甲醛三氟甲基 磺酸4-三甲基铵盐(lmg)的无水DMS0溶液(0. 2ml)。混合物于90°C加热15分钟，再冷却 至室温。缀合步骤加入脱保护氨基氧基-胰岛素(见上，1-2当量)的乙酸铵缓冲液(pH4.0，5mM， 0. lml)溶液，然后70°C下加热10分钟。反应混合物用HPLC流动相(0. 2ml, 20% B)猝灭， 用制备型HPLC纯化。(B0C- t[某氧,某-乙酰胺)-P靡(化合物3，、流禾g 2)的制各根据 S. Deroo 等[Tetr. Lett. 44 (2003) 8379]所述方法，从 B0C-3-(氨基氧基)乙 酸得到B0C-3-(氨基氧基)乙酸N-琥珀酰亚胺酯。在室温下，使N-琥珀酰亚胺酯与7-氨 基庚酸(1. 1当量)和二异丙基乙胺(3当量)在二氯甲烷中反应16小时。偶合产物，即化 合物3，用硅胶快速色谱法纯化。B,-(B0C-氨基氧基-乙酰胺)-己酰基-k” B^- 二 _B0C_胰岛素(化合物4,流稈 2)的制备按照上述用于&-B0C-氨基氧基-Ai，B29-二-B0C-胰岛素(中间体1)的方法，进 行氨基氧基连接基的偶合。Bf (4-g-亚苄基氨某氧某-乙M安)夷岛素(仆,合4勿5,流jg 2)白勺 制备按照上述用于化合物1的方法，脱去胰岛素前体的B0C保护基，然后与4-氟苯甲 醛偶合。B.-C^pFl氟-亚苄基氨基氧基-乙酰胺)_己酰基-胰岛素(化合物6，流程3) 的制备按照上述制备化合物2的方法，由化合物4和[18F]-4-氟苯甲醛进行化合物6的 放射性合成。流程权利要求
一种用于放射性标记的方法，该方法包括使下式(I)化合物与下式(II)化合物反应，得到下式(III)的缀合物R*-(连接基)-R2(II)其中R1是与R2位点特异性反应的官能团；R1可为氨衍生物，例如伯胺、仲胺、羟胺、肼、酰肼、氨基氧基、苯肼、氨基脲或氨基硫脲，优选为肼、酰肼或氨基氧基；R2为醛部分、酮部分、被护醛例如缩醛、被护酮例如缩酮或者用氧化剂能快速有效地氧化为醛或酮的官能团，例如二醇或N-端丝氨酸残基；R*为适于SPECT或PET检测的放射性标记部分；其中X为-CO-NH-、-NH-、-O-、-NHCONH-或-NHCSNH-，优选为-CO-NH-、-NH-或-O-；Y为H、烷基或芳基取代基；R*的定义同式(II)化合物。FSA00000088639000011.tif,FSA00000088639000012.tif
2.权利要求1的方法，其中R*为18F、放射性碘(123I,124I,125I或131I)、75Br或含"C基团 例如["C] Cm烷基胺。
3.权利要求1或2的方法，其中R*为18F。
4.一种用于放射性氟化的方法，该方法包括使下式(la)化合物与下式(Ila)化合物反 应，得到下式(Ilia)的化合物 其中X为-CO-NH-、-NH-或-0-，优选为-0-； 其中m为0-10的整数，n为0-20的整数，Y为氢、烷基或苯基；
5 权利要求4的方法，该方法包括使下式(IB)化合物与下式(IIB)化合物反应，得到下式(IIIB)的化合物 其中X的定义同式(la)化合物，m和n的定义同式(Ila)化合物。 5.权利要求4的方法，该方法包括使下式(lb)化合物与下式(lib)化合物反应，得到 下式(Illb)的化合物
6. 一种下式(III)的化合物 其中 X 为-C0-NH-、-NH-、-0-、-NHC0NH-或-NHCSNH-，优选为-C0-NH-、-NH-或-0- ；Y 为H、烷基或芳基取代基；R*为适于SPECT或PET检测的放射性标记部分。
7.权利要求6的化合物，其中R*为18F、放射性碘(123I,124I,125I或131I)、75Br或含"C基 团例如["QCh烷基胺，优选为18F。
8.权利要求6或7的化合物，所述化合物为下式(Ilia)化合物 其中X为-CO-NH-、-NH-或-0- ；m为0-10的整数；n为0-20的整数。
9.权利要求6-8中任一项的化合物，所述化合物为下式(Illb)化合物
10.一种下式(I)的化合物 其中R1为氨衍生物，例如伯胺、仲胺、羟胺、胼、酰胼、氨基氧基、苯胼、氨基脲或氨基硫 脲，优选为胼、酰胼或氨基氧基。
11.权利要求10的化合物，所述化合物为下式(la)化合物 (间其中 X 为-CO-NH-、-NH-或-0-。
12.权利要求10或11的化合物，所述化合物为下式(lb)化合物
13.一种放射性药物组合物，其包含有效量的权利要求6-9中任一项限定的式(III)、 式(Ilia)或式(Illb)化合物，以及一种或多种药学上可接受的辅剂、赋形剂或稀释剂。
14.用于医药用途的权利要求6-9中任一项限定的通式(III)、通式(Ilia)或通式 (Illb)化合物。
15.权利要求6-9中任一项限定的式(III)、式(Ilia)或式(Illb)放射性标记缀合 物在制备放射性药物中的用途，所述放射性药物用于体内成像方法、适宜为SPECT或PET方 法，用于胰岛素相关疾病的成像。
16.一种形成人或动物体影像的方法，该方法包括给予人或动物体例如血管系统放射 性药物，使用SPECT或PET时，在所述放射性药物所分布的人或动物体的至少某一部位形 成影像，其中所述放射性药物包含权利要求6-9中任一项限定的式(III)、式(Ilia)或式 (Illb)放射性标记缀合物。
17.一种用对抗胰岛素相关疾病的药物治疗人或动物体的效果的监测方法，该方法包 括给予人或动物体权利要求6-9中任一项限定的式(III)、式(Ilia)或式(Illb)放射性标 记缀合物，检测所述缀合物的摄取，任选重复进行所述的给药和检测。
全文摘要
本发明涉及体内显像剂，特别是下式(III)放射性标记胰岛素衍生物及其制备方法以及在体内成像方法中的用途其中X为-CO-NH-、-NH-、-O-、-NHCONH-或-NHCSNH-，优选为-CO-NH-、-NH-或-O-；Y为H、烷基或芳基取代基；R*为适于SPECT或PET检测的放射性标记部分。
文档编号A61K51/08GK101856502SQ20101016264
公开日2010年10月13日 申请日期2005年9月13日 优先权日2004年9月14日
发明者A·卡思伯森, F·布拉迪, H·卡尔森, M·E·格拉泽尔, S·K·卢思拉 申请人:哈默史密斯网上成像有限公司;安盛药业有限公司