专利名称：一种锁阳免疫佐剂及含有该佐剂的流感疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种锁阳免疫佐剂，还涉及含有锁阳免疫佐剂的流感疫苗，属于生物 技术领域，
背景技术：
锁阳为锁阳科植物锁阳(Cynomorium songaricum Rupr.)的干燥肉质茎，首载于 《本草衍义补遗》，又名琐阳(《丹溪心法》)，取名源于该草药的药用功效“锁住阳气，长盛不 衰”，故又被称为“不老药”，常作为中医蒙医中重要的补益药，在我国仅1属1种。近十余年 人们对其化学成分和药理学作用方面进行了很多研究，发现锁阳具有增强人体性功能、润 肠通便、清除自由基、抗氧化及抗衰老、耐缺氧、抗应激、抗疲劳、增强动物免疫功能、抗血小 板聚集、抗癌及抑制艾滋病病毒的增殖等多种药理作用。这些药理作用与锁阳所含的多种 有效成分，如儿茶素、缩合鞣质、多糖、熊果酸、乙酰熊果酸，熊果酸丙二酸半酯、齐墩果酸丙 二酸半酯、铁、锌等密切相关。佐剂是一类能增强抗原的免疫原性、提高疫苗效果的物质。在流感疫苗中使用佐 剂不仅可以增强免疫原性，还可以降低抗原用量。特别在应对大流行流感时，使用佐剂降低 抗原用量进而扩大接种人群数量的特性显得尤为重要。目前上市流感疫苗使用的佐剂主要 是铝佐剂和MF59。但事实上铝佐剂对蛋白亚单位疫苗诱导抗体产生的能力较弱，不能有效 地诱导免疫应答，在一些情况下还可产生与超敏反应有关的IgE ；MF59作为佐剂使用在增 免疫原性的同时，也增强了反应原性，如接种部位红、肿、热、痛等症状增加。此外，由于安全 性、副作用等问题，一些其他物质如壳聚糖、ISCOMs等作为流感疫苗佐剂也还只限于研究阶 段。因此，随着各种新发流感在世界的爆发和对人感染性的增强，加快新型流感疫苗的研 究，寻求更高安全性和免疫原性的佐剂仍然是流感疫苗发展的一个需要。佐剂发挥作用是由于能增强抗原的免疫原性、提高疫苗效果，因此佐剂一般可在 多种疫苗中进行使用，如目前的铝佐剂。因此佐剂的研究不仅对流感，而且对其它感染性疾 病的防治也有很高的价值。锁阳提取物作为免疫佐剂的应用，以流行性感冒(简称流感)病毒疫苗为例得到 了应用性的实验结果。流行性感冒(简称流感)是指由流感病毒引起，具有高度传染性的急性呼吸道传 染病。流感发病快，传染性强，发病率高，主要通过空气飞沫传播。流感的流行没有明显的 季节性，只是冬末春初发病率稍高一点，而且几乎每年都会发生，或者局部爆发，或者大规 模流行，甚至造成世界规模的大流行，严重危害了人类的健康和生命，给社会造成了沉重的 负担。到目前为止，接种流感疫苗被认为是预防流感发生与传播的最佳方法。由于流感病 毒变异很快，通常每年的流行类型都有所不同，生产企业一般都在世界卫生组织(WHO)指 导下选择流感病毒毒株进行疫苗生产，每年接种最新的流感疫苗才能达到预防的效果。一 旦流感病毒变异造成大规模流行或者是世界性流行，疫苗需求量会大量增加，但由于目前 流感疫苗生产工艺的限制，短时间内不可能提供足量疫苗，所以，应用免疫佐剂，减少疫苗
3用量并提高其效果就显得非常重要。经系统查阅文献和专利，目前未发现关于锁阳提取物具有免疫佐剂作用的报道。
发明内容
为解决目前免疫佐剂单一，副作用难以避免，疫苗生产供应量有限，难以应付感染 性疾病暴发时疫苗需求量大，疫苗起效时间慢等问题，本发明提供一种能提高疫苗免疫效 果，同时带来巨大的经济效益和社会效益的锁阳免疫佐剂。本发明的另一个目的在于提供一种含有锁阳免疫佐剂的流感疫苗。本发明提供的锁阳免疫佐剂是由下列质量比的组分组成的锁阳提取物0.001 100%载体0 99. 999%。所述载体由下列质量比的组分组成乳化剂20 70%助乳化剂20 70%油相1 50%水相1 30%。所述乳化剂为常规的TweenSO或聚氧乙烯蓖麻油中的一种，或者为质量混合比为 3 2 2 3的常规TweenSO与SpanSO的混合物，或者为质量混合比为1 1的常规聚 氧乙烯蓖麻油与SpanSO的混合物。所述助乳化剂为常规的1，2_丙二醇或聚乙二醇400中的一种。所述油相为常规的肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯或注射用大豆油中的一种。所述水相为注射用水或者含有药物或疫苗成分的注射用水溶液。本发明提供的锁阳免疫佐剂，优选下列质量比锁阳提取物0.1 100%载体0 99.9%。本发明提供的一种含有锁阳免疫佐剂的流感疫苗的组成是锁阳免疫佐剂与流感 疫苗血凝素的质量比为50 150000，其中，所述锁阳免疫佐剂由下列质量比的组分组成锁阳提取物0.001 100%载体0 99. 999%。所述锁阳提取物是用乙醇或水作为溶剂，经现有技术的常规方法提取得到的，具 体是乙醇提取将干燥的锁阳粉碎成粉，置于容器内，用乙醇冷浸、温浸提取或加热回 流提取，过滤取滤液，回收乙醇并浓缩得浸膏；其中，所述乙醇冷浸、温浸提取是每次提取 时，乙醇的浓度为60 95%，乙醇加入量是锁阳药材质量的2 10倍，冷浸时间1 10 天，温浸时间1 2小时，温度40 60°C，提取次数为1 3次；所述加热回流提取是回 流时间为每次20分钟 4小时，温度为20 60°C，提取次数为1 3次；水提取将干燥的锁阳粉碎成粉，置于容器内，用蒸馏水冷浸、温浸提取或加热回 流提取，过滤取滤液，浓缩得浸膏；其中，所述蒸馏水冷浸、温浸提取是每次提取时，蒸馏 水的加入量是锁阳药材质量的2 10倍，冷浸时间1 10天，温浸时间1 2小时，温度
440 60°C，提取次数为1 3次；所述加热回流提取是回流时间为每次20分钟 4小时， 温度为20 60°C，提取次数为1 3次。另外，所述锁阳提取物还可采用现有技术的除水提取、乙醇提取以外的其它常规 溶剂提取而得到的提取物，如采用甲醇、丙酮、乙酸乙酯为溶剂进行的提取。本发明提供的锁阳免疫佐剂与传统氢氧化铝佐剂相比，具有以下优点1)锁阳提取物制备方法简单、经济、环保。2)锁阳是一种天然中草药，常作为保健品使用。在流感疫苗中作为佐剂使用，安全 性高、副作用小。例如用含锁阳提取物的流感疫苗肌肉注射小鼠，4小时内观察小鼠活动性 无明显减弱，未见全身不良反应。而用含氢氧化铝佐剂流感疫苗注射，可观察到小鼠活动性 明显减弱，注射局部肿胀明显。3)用锁阳提取物为佐剂的流感疫苗，制备方法简便，疫苗质量容易控制；而以氢 氧化铝为佐剂制备流感疫苗，制备和存储过程中，影响因素较多，对于疫苗的质量较难控 制。4)用锁阳提取物作为流感疫苗佐剂，可更好的提高疫苗免疫原性，大大降低疫苗 抗原用量。例如通过以锁阳提取物为佐剂的流感疫苗和以氢氧化铝为佐剂的流感疫苗免疫 小鼠发现，以锁阳提取物为佐剂使用的疫苗抗原用量即使是以氢氧化铝为佐剂的疫苗抗原 用量的一半或者更少，同样可以达到理想的免疫保护效果。
图1为不同接种组在56天内的血凝抑制抗体效价变化；图2为不同接种组在接种后一周内的体重增长情况；图3为不同接种组在42天内的血凝抑制抗体效价；图4为不同接种组在2周、4周、8周的血凝抑制抗体效价。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步说明，但并不以此来限定本发明。本发明实施例中未特别指明的组分均为市购产品，所用设备或仪器均是常规的。实施例1锁阳乙醇提取物的制备取干燥锁阳20g，粉碎成粉，置于容器内，用5倍(IOOg) 质量浓度为95%的乙醇，按常规进行加热回流提取，其中，回流时间为每次30分钟，温度 为60°C，提取次数为1次，过滤后，对滤液进行减压回收乙醇后，余下滤液经浓缩干燥，得浸膏。实施例2锁阳水提取物的制备取干燥锁阳20g，粉碎成粉，置于容器内，用10倍(200g)蒸 馏水按常规进行加热回流提取，其中，回流时间为每次4小时，温度为20°C，提取次数为3 次，过滤，合并滤液后，经浓缩干燥，得浸膏。实施例3纳米乳剂载体的制备1)按下列质量比备料2g注射用水，2g注射用大豆油，4g聚乙二醇400，0.8gTween80,1. 2g Span80 ；2)向混合搅拌瓶内加入0. 8g Tween80，1.2g Span80，4g聚乙二醇400，在转速为 200转/分钟，室温条件下，持续搅拌1 10分钟，混勻后加入2g注射用大豆油，混合均勻 得混合物；3)在上述2)的混合物中滴入2g注射用水，同时在转速为200转/分钟，室温下， 搅拌混合物至液体为透明，得到纳米乳剂载体；4)对3)制得的纳米乳剂载体进行如下检测1.经马尔文粒径检测仪检测，粒径范 围为18. 906 24. 854nm,合格；2.经3000rpm, 15min离心分离，纳米乳剂体系不分层，合 格；3.经4°C放置50天，纳米乳剂体系无变化，合格。实施例41)称取实施例2的锁阳提取物10mg，溶于2ml市购的H3N2流感病毒裂解疫苗(血 凝素含量43. 67/ml)，得含锁阳提取物的流感疫苗；2)取2g注射用大豆油，4g聚乙二醇400，0. 8g Tween80,1. 2g Span80，放于搅拌瓶 中，转速维持在200转/分钟，室温搅拌1 10分钟，至充分混勻，得混合溶液；3)在上述2)的混合溶液中缓慢滴入1)制备的含锁阳提取物的流感疫苗2ml，同 时维持转速在200转/分钟，搅拌至溶液为黄棕色透明，得到以锁阳提取物、纳米乳剂载体 为佐剂的流感病毒疫苗，其中锁阳提取物的质量比为0.125%，载体质量比为99. 875% ； 锁阳免疫佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为91710。4)对3)制得的含有锁阳免疫佐剂的流感病毒疫苗进行如下检测1.经马尔文粒 径检测仪检测，粒径范围为26. 913 32. 850nm，合格；2.经3000rpm，15min离心分离，纳米 乳剂体系不分层，合格；3.经4°C放置50天，纳米乳剂体系无变化，合格。用实施例4制备的含有锁阳免疫佐剂的流感病毒疫苗，注射标准体重昆明种雄性 小鼠，每只小鼠200ul。此200ul注射疫苗中流感疫苗血凝素含量为1. 2ug，锁阳0. 2mg。第 1天接种一针，第21天补种一针。于首次免疫后第一周开始，每隔7天采尾血，分离血清测 定血凝抑制效价，同时设立注射等量的生理盐水空白对照组、等血凝素含量的Al (OH)3佐剂 流感疫苗的佐剂对照组、等血凝素含量的单独流感疫苗对照组。得到的血凝抑制抗体效价 检测结果见附图1。实施例51)称取实施例1的锁阳提取物3. 5mg,溶于475ul市购的H3N2流感病毒裂解疫苗 (血凝素含量为43. 67ug/ml)，得含锁阳提取物的流感疫苗；2)称取肉豆蔻酸异丙酯lg，l，2-丙二醇lg，TweenSOlg于搅拌瓶中，转速维持在 100转/分钟，室温搅拌1 10分钟，至充分混勻，得混合溶液；3)在上述2)的混合溶液中缓慢滴入1)制备的含锁阳提取物的流感疫苗475ul， 同时维持转速在100转/分钟，搅拌至溶液为淡红棕色透明，得到以锁阳提取物、纳米乳 剂载体为佐剂的流感病毒疫苗。其中锁阳提取物的质量比为0. 117%，载体质量比为 99. 883% ；锁阳免疫佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为145097。实施例61)制备下列不同的佐剂或溶液a)取实施例2的锁阳提取物0. 2mg溶于160 μ 1生理盐水，备用；
b)取浓度为15. 98mg/ml的氢氧化铝12. 5 μ 1，其中含AL (OH) 30. 2mg，加入生理盐 水至体积为160 μ 1，备用；c) 160 μ 1生理盐水，备用；d) 200 μ 1生理盐水，备用；2)制备下列不同的疫苗取血凝素含量为43. 67 μ g/ml的市购H3N2流感病毒裂解疫苗40 μ 1，分别和上述 a、b、c不同溶液混合，分别得到含有锁阳免疫佐剂的流感疫苗样品Α、含有AL(OH)3佐剂的 流感疫苗样品B、单独的流感疫苗样品C。d组不加疫苗，为生理盐水空白对照样品D。所配 置的上述A、B、C、D四个样品均制备三份，体积均为200μ 1，备用；其中含有锁阳免疫佐剂的 流感疫苗样品A中锁阳提取物的质量比为100%，载体质量比为0%;锁阳免疫佐剂与流感 疫苗血凝素的质量比为144。3)免疫接种及检测用上述2)所配的Α、B、C、D四个不同的样品分别免疫标准体重雌性昆明小鼠，每 组3只，每只肌肉注射200ul，第1天接种一针，第21天补种一针。于第一天接种前和接种 后第8天对各组小鼠进行体重测量，对7天内各组平均增长的体重进行计算，结果见附图2 ； 并于首次免疫后14天、21天、28天、35天、42天取尾血，分离血清测定血凝抑制效价，结果 见附图3。实施例71)制备下列不同的疫苗A、取实施例1的锁阳提取物0. 3mg溶于178. 5μ 1生理盐水，然后加入市购的Η3Ν2 流感裂解疫苗20μ 1至终体积为200μ 1，Η3Ν2流感裂解疫苗的血凝素含量为0. 87ug，得含 有锁阳免疫佐剂的流感病毒疫苗，备用；其中锁阳提取物的质量比为100%，载体质量比 为0% ；锁阳免疫佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为345。B、取实施例2的锁阳提取物0. Img溶于160 μ 1生理盐水中，然后加入市购的Η3Ν2 流感裂解疫苗40μ 1至终体积200μ 1，Η3Ν2流感裂解疫苗的血凝素含量为1. 75μ g，得含 有锁阳免疫佐剂的流感病毒疫苗，备用；其中锁阳提取物的质量比为100%，载体质量比 为0% ；锁阳免疫佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为57。C、取H3N2流感裂解疫苗40 μ 1，其中含血凝素1. 75 μ g，与160 μ 1生理盐水混合 至终体积为200 μ 1，作为单独疫苗对照组，备用；D、取浓度为15. 98mg/ml的氢氧化铝佐剂37. 5 μ 1，其中含0. 6mgAL (OH) 3，与含血 凝素1. 75 μ g的流感疫苗40 μ 1混合，然后加入生理盐水至终体积200 μ 1，作为AL (OH) 3佐 剂疫苗对照组，备用Ε、生理盐水200 μ 1，为空白对照组，备用；2)免疫接种及抗体检测将上述配好的Α、B、C、D、E五个样品分别免疫标准体重昆明雌性小鼠，肌肉注射， 每只200 μ 1，每组5只，第1天接种一针，第21天补种一针，分别于首次免疫后2周、4周、6 周进行尾部采血，分离血清，检测血凝抑制抗体效价，结果见附图4。结论本发明提供的锁阳免疫佐剂具有显著的免疫佐剂效果，毒副作用小，可用于 人、兽多种疫苗，以防治各种感染性疾病。
权利要求
一种锁阳免疫佐剂，其特征在于由下列质量比的组分组成锁阳提取物0.001～100％载体 0～99.999％。
2.根据权利要求1所述的锁阳免疫佐剂，其特征在于所述载体由下列质量比的组分组成乳化剂 20 70% 助乳化剂 20 70% 油相1 50%水相1 30%。
3.根据权利要求2所述的锁阳免疫佐剂，其特征在于所述乳化剂为TweenSO或聚氧乙 烯蓖麻油中的一种，或者为质量混合比为3 2 2 3的TweenSO与SpanSO的混合物，或 者为质量混合比为1 1的聚氧乙烯蓖麻油与SpanSO的混合物；所述助乳化剂为1，2_丙 二醇或聚乙二醇400中的一种；所述油相为肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯或注射用大豆油中 的一种；所述水相为注射用水或者含有药物或者疫苗成分的注射用水溶液。
4.一种锁阳免疫佐剂，其特征在于由下列优选的质量比的组分组成 锁阳提取物0. 1 100%载体0 99. 9%。
5.一种含有锁阳免疫佐剂的流感疫苗，其特征在于锁阳免疫佐剂与流感疫苗血凝素的 质量比为50 150000，其中，所述锁阳免疫佐剂由下列质量比的组分组成锁阳提取物 0.001 100% 载体0 99. 999%。
6.根据权利要求1所述的锁阳免疫佐剂，其特征在于所述锁阳提取物是用乙醇或水作 为溶剂，经现有技术的常规方法提取得到的，具体是乙醇提取将干燥的锁阳粉碎成粉，置于容器内，用乙醇冷浸、温浸提取或加热回流提 取，过滤取滤液，回收乙醇并浓缩得浸膏；其中，所述乙醇冷浸、温浸提取是每次提取时， 乙醇的浓度为60 95%，乙醇加入量是锁阳药材质量的2 10倍，冷浸时间1 10天，温 浸时间1 2小时，温度40 60°C，提取次数为1 3次；所述加热回流提取是回流时间 为每次20分钟 4小时，温度为20 60°C，提取次数为1 3次；水提取将干燥的锁阳粉碎成粉，置于容器内，用蒸馏水冷浸、温浸提取或加热回流提 取，过滤取滤液，浓缩得浸膏；其中，所述蒸馏水冷浸、温浸提取是每次提取时，蒸馏水的 加入量是锁阳药材质量的2 10倍，冷浸时间1 10天，温浸时间1 2小时，温度40 60°C，提取次数为1 3次；所述加热回流提取是回流时间为每次20分钟 4小时，温度 为20 60°C，提取次数为1 3次。
全文摘要
本发明涉及一种锁阳免疫佐剂及含有该佐剂的流感疫苗，其中锁阳免疫佐剂由下列质量比的组分组成锁阳提取物0.001～100％，载体0～99.999％。所述含有锁阳免疫佐剂的流感疫苗的组成是锁阳免疫佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为50～150000。本发明提供的锁阳佐剂具有显著的免疫佐剂效果，用于各种人、兽疫苗中，能起到有效的疾病防治作用。锁阳提取物作为流感疫苗的免疫佐剂，与传统氢氧化铝佐剂比较，其使用安全性高、副作用小，能更好地提高流感疫苗免疫原性，在制备流感疫苗过程中，其方法简便，经济环保，质量容易控制，大大降低了流感疫苗抗原用量，能够满足流行性流感暴发时的免疫需求。
文档编号A61K39/39GK101897966SQ201010230599
公开日2010年12月1日 申请日期2010年7月20日 优先权日2010年7月20日
发明者吕青, 李映波, 毕湖冰, 程永现, 陈芹芹 申请人:中国医学科学院医学生物学研究所;中国科学院昆明植物研究所