专利名称：一种温敏凝胶引导组织再生屏障膜及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种温敏凝胶引导组织再生屏障膜及其制备方法，属于生物医学领 域。
背景技术：
引导组织再生技术的原理是使用屏障膜隔离周围软组织的长入，隔离周围组织的 长入，为牙周组织和骨组织的再生提供空间。屏障膜的性能在一定程度上决定了引导组织 再生技术的成败。目前，可吸收性生物膜由于具有生物相容性好，无须二次手术取出等优 点，在牙周组织再生和骨缺损的修复中已得到广泛应用。但目前国内外的膜产品存在生产 工艺复杂、价格高、不具有骨诱导作用等缺陷。壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的衍生物，具有良好的生物相容性、可降解活性以及促 进组织再生活性。以壳聚糖为基材的温敏凝胶系统可以在低温或常温下保持液体状态，当 温度升高后发生相转变。由于其相转变条件温和、具有良好的生物相容性等优点，近年来受 到广泛关注，已被应用于组织工程、药物载体等领域。当凝胶形成后，由于疏水作用、氢键及 共价键等静电作用，使之具有多孔的网状支架形态，并具有一定的机械强度和空间保持能 力。因此，利用壳聚糖制备可吸收性生物膜具有广阔的应用前景。目前，现有技术中，并没有关于利用壳聚糖温敏凝胶制备引导组织再生膜的相关 报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种温敏凝胶引导组织再生屏障膜，其生物相 容性好，可应用于引导组织再生或引导骨再生领域，本发明还提供了其制备方法。本发明是通过以下技术方案实现的—种温敏凝胶引导的组织再生屏障膜的制备方法，步骤如下(1)将壳聚糖溶解在浓度能保证壳聚糖充分溶解且溶解后所得溶液pH大于5. 0的 乙酸溶液中，制得壳聚糖浓度为0. 02g/ml的壳聚糖酸溶液，灭菌，于冰浴中放置至少15分 钟(防止凝结)，备用；(2)将β -甘油磷酸钠溶于去离子水，制得浓度为0. 35 0. 85g/ml的β -甘油磷 酸钠溶液，过滤除菌，于冰浴中放置至少15分钟(防止凝结)，备用；(3)在不断搅拌、冰浴条件下，将壳聚糖酸溶液与β -甘油磷酸钠溶液混合，其中， 壳聚糖与β-甘油磷酸钠的质量比为2 (3. 5 8. 5)，混合后继续搅拌8 12分钟，得到 澄清、均质的壳聚糖/ β “甘油磷酸钠溶液，静置1. 5 2. 5小时，脱泡；(4)将壳聚糖/β _甘油磷酸钠溶液注入平底容器中，37°C干燥成膜，即得。所述步骤(1)中，灭菌为121°C高压蒸汽灭菌10分钟。所述步骤(2)中，过滤除菌是用0. 22 μ m滤器过滤除菌。上述制备方法制备的引导组织再生膜，具有多孔结构和良好的生物相容性，其有效成分组成包括壳聚糖和β “甘油磷酸钠，其中，壳聚糖的重量百分比为19. 0 36. 4%, β -甘油磷酸钠的重量百分比为63. 6 81. 0% ；屏障膜具有多孔的表面和内部结构(可 根据β-甘油磷酸钠的重量百分比调节孔径大小)；具有一定的抗拉强度；具有生物降解性 能；具有良好的生物相容性。使用时，将屏障膜植入体内，起到隔离周围软组织的长入、隔离周围组织的长入的 功能，为牙周组织和骨组织的再生提供空间。另外，也可以将步骤(3)制备得到的壳聚糖/β-甘油磷酸钠溶液直接注入体内， 在人体体温下，自然成膜。本发明是利用壳聚糖溶液中加入弱碱性的β -甘油磷酸钠具有温度相转变的特 性，在37°C完成脱水后，形成透明略带黄色的生物膜，具有多孔的结构，并表现出了一定的 硬度和韧性。本发明的引导组织再生膜其合成方法简单，成膜条件温和，具有良好的细胞生物 相容性，符合生物体内应用的要求，作为一种新型生物膜具有良好的应用前景。
图1为红外光谱分析曲线图，其中，曲线a 壳聚糖；曲线b β _甘油磷酸钠；曲线 c:壳聚糖+5% β-甘油磷酸钠(Α膜)；曲线d:壳聚糖+10% β-甘油磷酸钠(B膜)。图2为L929细胞形态示意图，其中，a 处于对数生长期；b 经过胰酶消化后接种； (倒置相差显微镜X10)。图3为实施例1所制备得到的组织再生膜的形态图，其中，a 正面图；b 侧面图。图4为实施例1所制备得到的组织再生膜在电镜下的形貌图，其中，a 壳聚糖 +5% β-甘油磷酸钠所制备的屏障膜表面形貌；b:壳聚糖+10% β-甘油磷酸钠所制备的 屏障膜表面形貌。
具体实施例方式下面结合实验和实施例对本发明作进一步的说明。实验1.材料与方法1. 1实验材料1. 1. 1实验用细胞株小鼠成纤维细胞株(L929 cells)由山东省口腔生物医学重点实验室提供。1. 1.2主要试剂壳聚糖(脱乙酰度95%，海得贝生物技术有限公司，济南)，五水β-甘油磷酸钠 (Sigma, USA)，MTT (Sigma公司，美国)，DMEM(赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司)， 胰酶(Amres公司，美国)，胎牛血清(上海复蒙生物制品公司)，其余试剂均为分析纯。1.1. 3仪器与设备万能电子测力仪(新三思有限公司，深圳)，红外光谱仪(VRTEX 70，Bruker Opti 壳聚糖，德国)，电子分析天平(赛多利斯股份公司，德国)，CO2培养箱(Heraeus公司，德 国)，酶联免疫检测仪(MK-3，上海雷勃分析仪器公司)，超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，高速离心机(TDL-16G，上海安亭科学仪器厂)，微量移液器(Eppendof公司，德 国)，恒温水浴箱(DK-8B，上海精宏实验设备有限公司)、磁力搅拌器(90-2型，上海沪西分 析仪器厂)、电子PH计(Orion Research公司，美国)、测厚仪(六菱仪器设备有限公司，上 海)。1. 2实验方法1. 2. 1壳聚糖/ β _甘油磷酸钠溶液的制备及温敏特性将适量的壳聚糖粉末溶入0. IM乙酸溶液，磁力搅拌2小时，最终形成浓度为 0. 02g/ml的壳聚糖溶液，121°C高压蒸汽灭菌10分钟。0. 5g，1. Og五水β -甘油磷酸钠分 别溶解于Iml去离子水，0. 22 μ m滤器过滤除菌。配制前分别将壳聚糖与β-甘油磷酸钠溶 液置于0°C冰浴15分钟防止凝结，分别取壳聚糖溶液各IOmL在冰浴中磁力搅拌(200rpm) 逐滴加入两种不同浓度的β _甘油磷酸钠溶液，混合后继续搅拌10分钟，最终获得澄清、均 质的A (含β -甘油磷酸钠0. 5g)、B (含β -甘油磷酸钠1. Og)两组溶液。壳聚糖/ β -甘油磷酸钠混合溶液室温静置约2h脱泡，采用倒置法观察其温敏凝 胶特性。取2mL注入直径为12mm的玻璃管中，放入37°C恒温水浴箱。每隔一分钟取出玻璃 管并倒置观察溶液的流动性，倒置30秒溶液不流动的时间点计为凝胶时间。1. 2. 2壳聚糖/ β _甘油磷酸钠膜的制备分别取Α、Β两组溶液0. 5ml注入24孔板(每组5复孔)，放入37°C电动恒温箱中 凝胶并自然干燥，紫外线消毒30min，备用。另外，将IOml两组溶液注入培养皿(直径4cm) 中，水平置入37°C电动恒温箱中干燥成膜，进行物理特性分析和拉伸强度测量。1.2. 3膜的表征材料样品研磨成粉后KBr压片，在^ΟΟ-δΟΟοπΓ1波长范围进行傅里叶红外光谱分 析。同时采集纯壳聚糖与甘油磷酸钠粉末的红外光谱图，进行对照分析。 培养皿中的复合膜经ΡΗ7. 4的PBS液浸泡24h，切割成10 X 30mm长方形，并测量厚 度，重复5次，取均值。在室温条件下采用万能拉伸机测量拉伸强度，每组重复测量5次，取 均值。1. 2. 4细胞生物相容性实验实验分为三组实验组(A，B组)和空白对照组(C组)。实验前预处理在24孔板 成膜后，经紫外线照射30min，样品用75%酒精浸泡2h，消毒的去离子水反复冲洗并吸干。 每孔中加入500 μ LDMEM培养液，浸泡2h，吸干。选择对数生长期L929细胞，待长满培养瓶后，用2. 5g/L胰蛋白酶消化单层细胞， 用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成IX 105/mL单个细胞悬液。按每孔300 μ L将L929 细胞悬液接种于24孔板内(约3Χ IO4/孔)，在37°C、5% C02、饱和湿度的细胞培养箱中孵 育24小时后吸去原培养液，按500 μ L/孔加入新培养液，隔日换液。分别培养3、4、5d，各 观察时间点取出1块培养板，弃去培养液，每孔加入MTT溶液(5g/L)100yL，37°C继续孵育 4h后终止培养，小心吸去上清液，每孔加入750 μ L 二甲基亚砜(DMSO)振荡15min，使结晶 充分溶解，吸取上清150 μ L移入96孔板中，在490nm波长下酶标仪测定其吸光度(A)值。1. 3统计学处理采用SPSS11. 0统计软件，A值和细胞相对增殖率均采用均数士标 准差(i±s)表示，各时间点各组数据进行单因素方差分析，组间两两比较采用
5Student-Newman-Keuls (SNK)检验，设定 α = 0.05。2.结果2. 1壳聚糖/ β -甘油磷酸钠溶液的温敏特性与成膜性A、B两种溶液在37°C下均可形成凝胶，β -甘油磷酸钠含量越高，凝胶时间越短。 在37°C电热温箱中约24-48小时干燥成膜，β-甘油磷酸钠浓度越高其成膜速度越快。当 凝胶脱水达到一定时间后，壳聚糖/ β -甘油磷酸钠复合膜表现出良好的可塑性和韧性，干 燥后表现出一定的强度和脆性，再用ΡΗ7. 4的PBS浸泡后，膜恢复一定的柔韧性，抗拉强度 随β -甘油磷酸钠含量增高而降低(表1)。表1.壳聚糖/ β -甘油磷酸钠复合膜的特性 2. 2壳聚糖/ β -甘油磷酸钠温敏凝胶膜的红外光谱分析壳聚糖的红外光谱分析如图Ia所示，位于3435CHT1的宽峰是N-H与0_Η基团联合 振动吸收峰重叠所致。C-H对称与非对称吸收峰位于ΖδΤΘΙΘΖ^πΓ1，C = 0伸缩振动峰位 于1656CHT1 (氨基I)，N-H变形振动吸收峰位于1598CHT1 (氨基II)，C-O伸缩振动吸收峰分 别位于1155、1091和1032CHT1。β -甘油磷酸钠的红外光谱特征如下在3254CHT1处的宽 峰是O-H振动吸收峰，无机相PO43-的伸缩振动吸收峰值位于gOO-^OOcnT1，弯曲振动吸收峰 位于 500-700CHT1 (图.Ib)。通过比较壳聚糖/ β _甘油磷酸钠复合膜样品的红外光谱(图lc、d)，壳聚糖原位 于3435CHT1的吸收峰发生了红移，说明壳聚糖的N-H基与β -甘油磷酸钠的O-H基结合形 成共价键。壳聚糖氨基Ι、ΙΙ的特征峰也发生了红移，暗示氨基与磷酸根之间形成化学键结 合。磷酸根特征峰仍然存在，说明仍存在较多未结合的单体甘油磷酸钠，这与壳聚糖/ β-甘油磷酸钠体系中部分β-甘油磷酸钠只起到中和作用有关。同时，C-H对称吸收峰值 减弱，也表明C-H与O-H基之间发生了静电作用。2. 3壳聚糖/ β -甘油磷酸钠温敏凝胶膜的细胞生物相容性本实验采用的是处于对数生长期的L929细胞(图2a)，经过胰酶消化后接种到孔 板内(图2b)。培养3、4、5d后各组材料的A值见表2。由表可见，实验组及对照组A值均随培养 天数的增加而升高，培养3、4、5d时对照组与实验组间差异有统计学意义(P < 0. 05)，但实 验组即A、B组间差异无统计学意义(P > 0. 05)。培养3、4、5d后各组材料的细胞相对增殖 率及材料毒性分级见表3。L929细胞第3、4、5d的相对增殖率均在300%以上，表明材料对 细胞没有毒性，且能明显促进细胞的体外增殖。表2培养3、4、5d后各组材料的吸光度值(S ±s，η = 5)
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增殖率 分级 增殖率 分级增殖率(%) 分 目前，可吸收性生物膜由于具有生物相容性好，无须二次手术取出等优点，在牙 周组织再生和牙槽骨缺损的修复中已得到广泛应用。其原理是隔离周围软组织的长入， 为牙周组织和骨组织的再生提供空间。膜的性能在一定程度上决定了 GTR和引导骨再生 (guided boneregeneration，GBR)技术的成败。目前国内外的膜产品存在生产工艺复杂、 价格高、不具有骨诱导作用等。本研究初探了壳聚糖/ β “甘油磷酸钠温敏凝胶膜的制备方 法，通过与L929细胞的共培养初步评价其细胞生物相容性。壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的衍生物，具有良好的生物相容性、可降解活性以及促 进组织再生活性。然而，壳聚糖一般仅能溶于稀酸性溶液，当PH达到6. 2时会发生沉淀。当 弱碱性的β-甘油磷酸钠加入壳聚糖溶液后，二者间由于存在疏水作用、氢键及共价键等 静电作用，可以在低温或常温下保持液体状态，当温度升高后发生相转变。壳聚糖/β _甘 油磷酸钠复合溶液相转变条件温和、形成的凝胶具有良好的生物相容性、多孔的网状支架 形态、一定的机械强度和空间保持能力等优点。通常制备的壳聚糖产品往往需要碱性溶液的预处理等工序。本研究中，壳聚糖溶 于0. IM乙酸溶液后，加入弱碱性的β-甘油磷酸钠混合形成PH中性的透明溶液。由于壳 聚糖的氨基与甘油磷酸钠的磷酸根结合而甘油暴露，使壳聚糖没有发生沉淀。但温度 升高后，疏水作用加强而导致壳聚糖及其复合物析出形成凝胶。在37°C恒温箱完成脱水过 程，形成透明略带黄色的生物膜，并表现出了一定的硬度和韧性。通过观察溶液的温敏特性，β -甘油磷酸钠含量越高，其形成凝胶和成膜的速度越 快，膜的厚度也随之增加。由此推断所形成的壳聚糖甘油磷酸钠复合膜随着甘油
7磷酸钠的增加，所形成的网状结构孔径亦增加。而膜的多孔结构有利于组织细胞的吸附及 营养物质的交换。红外光谱分析壳聚糖/ β -甘油磷酸钠之间形成了以静电作用为基础的化学键结 合，使之在形成多孔结构的基础上具备一定的机械强度。力学测定壳聚糖/ β “甘油磷酸钠 温敏凝胶膜在湿润状态下的抗拉强度达到IMpa左右，符合体内应用的要求。L929细胞作为一种标准的细胞系，常用于体外评价生物材料的生物相容性。MTT 比色实验比较各时间点的A值，结果表明壳聚糖/ β -甘油磷酸钠温敏凝胶膜具有明显的促 进细胞增殖的作用。实验组与空白对照组A值之间差异有显著性统计学意义(P <0.01)。 其原因可能有以下两点1.由于膜具有多孔结构，其表面积大于单纯的24孔板面积，接种 后有利于细胞的粘附和增殖。2.膜材料中的壳聚糖和β-甘油磷酸钠都具有良好的生物相 容性，形成的壳聚糖/ β -甘油磷酸钠复合物具有促进成纤维细胞增殖的作用。4.结论本实验结果初步证实，壳聚糖/ β _甘油磷酸钠温敏凝胶具有良好的成膜特性，其 合成方法简单，成膜条件温和。壳聚糖/ β “甘油磷酸钠复合膜具有良好的细胞生物相容 性，符合生物体内应用的要求，作为一种新型生物膜具有良好的应用前景。实施例1制备引导组织再生屏障膜制备方法如下(1)将壳聚糖溶解在0. lmol/L的乙酸溶液中，制得壳聚糖浓度为0. 02g/ml的壳聚 糖酸溶液，121°C高压蒸汽灭菌10分钟，于冰浴中放置15分钟以防止凝结，备用；(2)将β -甘油磷酸钠溶于去离子水，制得浓度为0. 56g/ml的β -甘油磷酸钠溶 液，用0. 22 μ m滤器过滤除菌，于冰浴中放置15分钟以防止凝结，备用；(3)在不断搅拌、冰浴条件下，将IOml壳聚糖酸溶液与Iml β -甘油磷酸钠溶液混 合，混合后继续搅拌10分钟，得到澄清、均质的壳聚糖/ β -甘油磷酸钠溶液，静置2小时， 脱泡；(4)将壳聚糖/ β -甘油磷酸钠溶液注入平底容器中，37°C干燥成膜，即得。上述制备方法制备的组织再生膜，如图3所示，其具有多孔结构，如图4所示，扫描 电镜下可见，膜表面粗糙、多孔；其有效成分组成包括壳聚糖和甘油磷酸钠，其中，壳聚 糖的重量百分比为26.3%，β-甘油磷酸钠的重量百分比为73.7%。实施例2壳聚糖温敏凝胶引导组织再生屏障膜的表征表征方法如下(1)红外光谱分析材料样品研磨成粉后KBr压片，在^ΟΟ-δΟΟοπΓ1波长范围进行傅里叶红外光谱分 析。同时采集纯壳聚糖与甘油磷酸钠粉末的红外光谱图，进行对照分析。通过比较壳聚糖/ β _甘油磷酸钠复合膜样品的红外光谱(图lc、d)，壳聚糖原位 于3435CHT1的吸收峰发生了红移，说明壳聚糖的N-H基与β -甘油磷酸钠的O-H基结合形 成共价键。壳聚糖氨基Ι、ΙΙ的特征峰也发生了红移，暗示氨基与磷酸根之间形成化学键结 合。磷酸根特征峰仍然存在，说明仍存在较多未结合的单体甘油磷酸钠，这与壳聚糖/ β-甘油磷酸钠体系中部分β-甘油磷酸钠只起到中和作用有关。同时，C-H对称吸收峰值 减弱，也表明C-H与O-H基之间发生了静电作用。
(2) X射线衍射分析壳聚糖粉末及实验样品研磨成粉，采用日本Rigaku公司D/MAX-2500PC型X射线 衍射仪进行分析。结果，壳聚糖粉末在β-甘油磷酸钠的作用下，原位于2 θ =20.3°、11.46°以及 36.22°的衍射峰消失或减弱，衍射曲线变得平缓，表明壳聚糖结合了 甘油磷酸钠分子 的磷酸根而结晶度降低。(3)扫描电镜分析将温敏凝胶制备的屏障膜室温干燥，表面喷金，采用日本Hitachi公司，SU-70型 扫描电镜进行观察。发现壳聚糖温敏凝胶所成膜具有粗糙多孔的表面结构和内部结构，随着β _甘油 磷酸钠含量的增加，其孔径越大，有利于细胞的附着、增殖和营养成分的交换。实施例3壳聚糖温敏凝胶引导组织再生屏障膜的体外细胞生物相容性实验方法如下(1)主要试剂MTT(Sigma公司，美国)，DMEM(赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司)，胰 酶(Amres公司，美国)，胎牛血清(上海复蒙生物制品公司)，其余试剂均为分析纯。(2)细胞培养和接种选择对数生长期L929细胞，待长满培养瓶后，用2. 5g/L胰蛋白酶消化单层细胞， 用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成IX 105/mL单个细胞悬液。按每孔300 μ L将L929 细胞悬液接种于24孔板内(约3Χ IO4/孔)，在37°C、5% C02、饱和湿度的细胞培养箱中孵 育24小时后吸去原培养液，按500 μ L/孔加入新培养液，隔日换液。(3) MTT比色实验分别培养3、4、5d，各观察时间点取出1块培养板，弃去培养液，每孔加入MTT溶液 (5g/L) 100 μ L，37°C继续孵育4h后终止培养，小心吸去上清液，每孔加入750 μ L 二甲基亚 砜(DMSO)振荡15min，使结晶充分溶解，吸取上清150 μ L移入96孔板中，在490nm波长下 酶标仪测定其吸光度(A)值。培养3、4、5d后各组材料的A值见表2。由表可见，实验组及对照组A值均随培养 天数的增加而升高，培养3、4、5d时对照组与实验组间差异有统计学意义(P < 0. 05)，但实 验组即A、B组间差异无统计学意义(P > 0. 05)。培养3、4、5d后各组材料的细胞相对增殖 率及材料毒性分级见表3。L929细胞第3、4、5d的相对增殖率均在300%以上，表明材料对 细胞没有毒性，且能明显促进细胞的体外增殖。实施例4制备引导组织再生屏障膜制备方法如下(1)将壳聚糖溶解在0. lmol/L的乙酸溶液中，制得壳聚糖浓度为0. 02g/ml的壳聚 糖酸溶液，121°C高压蒸汽灭菌10分钟，于冰浴中放置15分钟以防止凝结，备用；(2)将β-甘油磷酸钠溶于去离子水，制得浓度为0.35g/ml的β -甘油磷酸钠溶 液，用0. 22 μ m滤器过滤除菌，于冰浴中放置15分钟以防止凝结，备用；(3)在不断搅拌、冰浴条件下，将IOml壳聚糖酸溶液与Iml β -甘油磷酸钠溶液 混合，混合后继续搅拌12分钟，得到澄清、均质的壳聚糖/ β -甘油磷酸钠溶液，静置1. 5小时，脱泡；(4)将壳聚糖/β-甘油磷酸钠溶液注入平底容器中，37°C干燥成膜，即得，其中， 壳聚糖的重量百分比为36.4%，β-甘油磷酸钠的重量百分比为63.6%。实施例5制备引导组织再生屏障膜制备方法如下(1)将壳聚糖溶解在0. lmol/L的乙酸溶液中，制得壳聚糖浓度为0. 02g/ml的壳聚 糖酸溶液，121°C高压蒸汽灭菌10分钟，于冰浴中放置15分钟以防止凝结，备用；(2)将β -甘油磷酸钠溶于去离子水，制得浓度为0. 85g/ml的β -甘油磷酸钠溶 液，用0. 22 μ m滤器过滤除菌，于冰浴中放置15分钟以防止凝结，备用；(3)在不断搅拌、冰浴条件下，将IOml壳聚糖酸溶液与Iml β -甘油磷酸钠溶液混 合，混合后继续搅拌8分钟，得到澄清、均质的壳聚糖/ β -甘油磷酸钠溶液，静置2. 5小时， 脱泡；(4)将壳聚糖/β-甘油磷酸钠溶液注入平底容器中，37°C干燥成膜，即得，其中， 壳聚糖的重量百分比为19.0%，β-甘油磷酸钠的重量百分比为81.0%。
权利要求
一种温敏凝胶引导组织再生屏障膜的制备方法，其特征在于，步骤如下(1)将壳聚糖溶解在浓度能保证壳聚糖充分溶解且溶解后所得溶液pH大于5.0的乙酸溶液中，制得壳聚糖浓度为0.02g/ml的壳聚糖酸溶液，灭菌，于冰浴中放置至少15分钟，备用；(2)将β 甘油磷酸钠溶于去离子水，制得浓度为0.35～0.85g/ml的β 甘油磷酸钠溶液，过滤除菌，于冰浴中放置至少15分钟，备用；(3)在不断搅拌、冰浴条件下，将壳聚糖酸溶液与β 甘油磷酸钠溶液混合，其中，壳聚糖与β 甘油磷酸钠的质量比为2∶(3.5～8.5)，混合后继续搅拌8～12分钟，得到澄清、均质的壳聚糖/β 甘油磷酸钠溶液，静置1.5～2.5小时，脱泡；(4)将壳聚糖/β 甘油磷酸钠溶液注入平底容器中，37℃干燥成膜，即得。
2.根据权利要求1所述的温敏凝胶引导组织再生屏障膜的制备方法，其特征在于所 述步骤(1)中，灭菌为121°C高压蒸汽灭菌10分钟。
3.根据权利要求1所述的温敏凝胶引导组织再生屏障膜的制备方法，其特征在于所 述步骤(2)中，过滤除菌是用0. 22 μ m滤器过滤除菌。
4.权利要求1或2或3所述的制备方法制备得到的引导组织再生屏障膜，其特征在 于其有效成分组成包括壳聚糖和甘油磷酸钠，其中，壳聚糖的重量百分比为19.0 36. 4%, β-甘油磷酸钠的重量百分比为63. 6 81. 0%。
全文摘要
本发明公开了一种温敏凝胶引导的组织再生屏障膜的制备方法，步骤如下(1)将壳聚糖溶解在乙酸溶液中，制得壳聚糖酸溶液，灭菌，于冰浴中放置至少15分钟，备用；(2)将β-甘油磷酸钠溶于去离子水，制得β-甘油磷酸钠溶液，过滤除菌，于冰浴中放置至少15分钟，备用；(3)在不断搅拌、冰浴条件下，将壳聚糖酸溶液与β-甘油磷酸钠溶液混合，得到澄清、均质的壳聚糖/β-甘油磷酸钠溶液，静置，脱泡；(4)将壳聚糖/β-甘油磷酸钠溶液注入平底容器中，37℃干燥成膜，即得。本发明的引导组织再生膜其合成方法简单，成膜条件温和，具有良好的细胞生物相容性，符合生物体内应用的要求，作为一种新型生物膜具有良好的应用前景。
文档编号A61L31/04GK101927036SQ20101025479
公开日2010年12月29日 申请日期2010年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者孙康宁, 崔军, 徐欣, 梁杰 申请人:山东大学