专利名称：可作为免疫调节剂的副干酪乳酸杆菌lt12的制作方法
技术领域：
本发明关于一种新颖副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)及其用于调节免疫反应及治疗与过敏相关疾病的用途。
背景技术：
过敏是指免疫系统对外来物，例如细菌、花粉或灰尘等，产生的一种过度免疫反应，该外来物被通称为“过敏原”。这些过敏原有时会被人体视为有害或具危险性而启动一部分的免疫系统，但事实上该过敏原不会造成感染或有毒性。当人体与过敏原接触而造成免疫反应时，组织胺和前列腺素可能接着会被释放出来造成过敏症状，包括呼吸道的发炎反应、异位性皮肤炎、过敏性结膜炎、荨麻疹、湿疹、特定胃肠疾病或哮喘等。据报导指出，发达国家的孩童较容易患有过敏，因为这些国家过分注重公共卫生， 也常接种疫苗或使用抗生素，因此降低了感染的机会，而感染通常会对抗过敏或气喘。在医学上，这种现象被称为是“卫生学假说”，主要论述孩童时期若是缺乏对感染原的接触，会趋向Th-2的免疫反应，例如生产过剩的IL-4(interleukin-4)、IL-5及IL-13。这些Th_2 型细胞激素会吸引嗜伊性红血球(eosinophils)、嗜碱性白血球(basophils)及肥大细胞 (mast cell)至发炎位置，这些细胞可以单独或是与免疫球蛋白E(IgE)共同作用而产生过敏反应。另外，IL-4与IL-13可促进B细胞进行抗体的类型转换(isotype switch)以增加血液中IgE的量。根据“卫生学假说(hygienehypothesis)”，诱发Th_l(T helper 1)细胞的免疫反应，例如促进IFN-γ的表现，也许可以有效的减缓过敏反应。许多研究指出，乳酸菌(Lactobacillus sp.)在生物体内具有调节免疫反应的能力，包括促进细胞激素的分泌、活化巨噬细胞与自然杀手细胞及抗体的产生等(Madsen et al. ,2001, Gastroenterology 121:580-591)。Collins 等人(U. S. Pat. No. 7，390，519)曾表示唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius) AH102，AH103，AH105，AH109 或 AH110 等品系可做为一种抗发炎的生物治疗剂来有效预防及/或治疗发炎反应。Hsu等人(U.S.Pat. No. 6994848)也揭露副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei) GM-080 可促进 IFN-γ 的分泌，且可用来治疗与过敏相关的疾病。然而，多种自然界中存在的乳酸菌至今还未被完全发现及进行完整地研究。本发明提供一个组合物，其包含一种新颖副干酪乳酸杆菌品系(Lactobacillus paracasei)及其免疫调节的应用，其与相关的先前文献已揭露的品系不同。
发明内容
本发明一方面为提供一种具有免疫调节功能的新颖副干酪乳酸杆菌 (Lactobacillus paracasei)LT 120本发明另一方面为提供一种组合物，包含上述副干酪乳酸杆菌LT12及载体。此组成物可为食品(例如优格、饼干、麦片、巧克力及点心棒)，饮料(例如茶、不含酒精的饮料、牛奶及果汁)，或是包含医学上可接受的载体的药物。
本发明的再另一方面提供一种调节免疫系统(如先天性免疫(innateimmunity) 或适应性免疫(adaptive immunity))或治疗过敏的方法及其组合物，其是为给予有需要的个体服用有效量的上述任一组合。该个体(例如人类患者)可为患有IgE介导的立即性过敏反应(immediate hypersensitivity)或是T细胞介导的迟发性过敏反应(delayed hypersensitivity)的病人。本发明又一方面亦包含利用前述副干酪乳酸杆菌LT12制备调节免疫系统或治疗过敏的药物的用途。应了解前述的发明内容和下列实施方式仅为例示和说明，并非为本发明的限制。
参照附图，将更能了解前述的发明内容以及实施方式。在图中图1为一照片显示利用人类细胞激素抗体数组分析法(Human cytokineantibody Array)分析各组的转渍(blot)周边血液单核细胞来源C空白组(图1A)、以LT12单独刺激周边血液单核细胞来源C (图1B)、以LT12与第二种副干酪乳酸杆菌刺激周边血液单核细胞来源C(图1C)、周边血液单核细胞来源E空白组(图1D)及以LT12与第二种副干酪乳酸杆菌刺激周边血液单核细胞来源E (图1E)。细胞激素抗体数组于膜上的位置图如表5 所示。菌株LT12保藏信息菌株LT12于2009年9月21日寄存于农业研究机构培养物保藏中心(NRRL) (1815N. University Street,Peoria, Illinois, 61601,U. S. A.)，寄存编号为 NRRL B-50327。
具体实施例方式本发明详细说明如下。在本发明中，参考文献的资料将详列于实施例中。为更佳了解本发明，本文中所使用的术语将另加以详细说明。本发明提供一种新颖副干酪乳酸杆菌品系，命名为LT12，此菌株可用来调节免疫反应及治疗过敏。该菌株LT12于2009年9月21日寄存于农业研究机构培养物保藏中心 (NRRL) (1815N. University Street, Peoria, Illinois, 61601, U. S. Α.)，寄存编号为 NRRL Β-50327。副干酪乳酸杆菌株LT12自人类粪便中分离，须在检体采样后的十二小时内进行分离的步骤。称重(约一公克)的检体放至均质机(Stomacher400，Seward, UK)搅拌30 秒使其均质化，再以预还原(pre-reduced)的脑心浸出物培养液(brain heart infusion broth)稀释，接着以适合的选择性培养基进行培养。适当的稀释物涂盘于乳酸菌醋酸盐培养基(RogosaAcetate agar, Difco, USA),或含有 12 μ g/ml 万古霉素(vancomycin, Sigma, USA)的乳酸菌醋酸盐培养基(Rogosa Acetate agar，Difco，USA)，以培养所有的乳酸菌属以及可抗万古霉素的乳酸菌，例如副干酪乳酸杆菌群(Lparacasei group)，包含副干酪乳酸杆菌(L.paracasei)、酪蛋白乳酸杆菌(L. casei)及雷曼氏乳酸杆菌(L. rhamnosus) 等。API 50CHL系统(bioM6rieuX，Inc. USA)用于鉴定抗万古霉素的副干酪乳酸杆菌中的品系。鉴定结果如表1所示。LT12的微生物学特征如下
(1)形态学特征(a)细胞形状及大小菌体在37°C下于MRS培养液中隔夜培养后，在显微镜下观察到的形状为杆状，边缘为圆形。(b)活动力有(c)鞭毛无(d)孢子形成无(e)革蓝氏染色阳性(2)培养特征(a)培养基=MRS 培养液(Difco, USA)，最终 pH 6. 2 6. 5。(b)培养条件37°C兼性厌氧(3)生理学特征(a)过氧化氢酶阳性(b)氧化酶阴性(C)API 50CHL测试测试结果如表1所示(4)遗传特征如实施例2所示，以随机放大多形态DNA鉴定(Random AmplificationPolymorphic DNA, RAPD) Tj ^M LT12> Lactobacillus paracasei (Cellbiotech Co. , Ltd. , Korea)(以下简禾尔 LP-CBT)、Lactobacillus paracaseiGMNL32 (以下简禾尔GMNL32)、Lactobacillus paracasei subsp. paracaseiBCRC 14023 (以 T" ■禾尔:BCRC 14023) R Lactobacillus paracasei subsp. paracasei BCRC 12188 (以下简称BCRC 12188)进行RAPD的分析。12个随机核酸引子如表2所列。电泳图结果显示LT12具有不同的条带模式(如表3所示)。综合以上鉴定结果，LT12为一种新颖副干酪乳酸杆菌株。根据本发明的一个具体实施例，可使用活细胞的形式的LT12或其功能变异株。 根据本发明的另一个具体实施例，可使用非活细胞的形式，如热致死菌体，其包含菌株LT12 产生的有利因子。本文在此所称的“功能变异株”一词是指其具有LT12相同特征的菌株， 可达相同功效。本发明提供一个LT12菌株及其功能变异株，其具有调节免疫活性及/或抗过敏反应的活性。本文在此所称的“调节免疫活性” 一词是指其具有自稳定态或低落的免疫系统提升免疫活性(免疫刺激活性)，或是抑制多余或过度的免疫反应以回复到适当的水平(抑制免疫活性)。以另一角度来说，此是用来调控免疫性细胞(例如T细胞、B细胞或巨噬细胞)以稳定总体免疫反应的平衡。举例来说，但不限于，刺激或抑制细胞激素的产生、活化淋巴细胞、平衡Thl/Th2活性及抑制过敏反应等。本发明亦提供一可用于治疗过敏的LT12菌株或其功能变异株。本文在此所称的“过敏” 一词是指生理上的保护性免疫所导致而伤害宿主的一种免疫反应。最常见的两种过敏是由IgE介导的立即性过敏反应，及T细胞介导的迟发性过敏反应。过敏的临床症状包含过敏性鼻炎、过敏性哮喘、食物过敏、过敏性皮肤炎、眼睛过敏及全身型过敏性反应 (anaphylaxis)等。本文在此所称的“治疗过敏”一词是指丨系列可以反转上述所提到免疫症状的免疫反应，例如，但不限于，阻断Th-2介导的免疫反应，减少Th-2型细胞激素(如IL-4，IL-5，IL-13)，增加Th-I型细胞激素(如INF- γ )，以及抑制IgE+记忆B细胞及嗜伊性红血球的活化或分化。根据本发明的一个具体实施例，藉由ELISA分析确认LT12能刺激由捐赠者血液分离出的周边血液单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)分泌 INF-γ (如表四)。INF-y是一种细胞激素，其对于先天性免疫及适应性免疫于对抗病毒及细菌的感染非常重要。它是Th-I型细胞激素的代表，可以抑制Th-2型细胞的分化，因此减少L-4， IL-5，IL-13的生成，该等细胞激素会刺激免疫球蛋白类转换成IgE，以及扩增原始及IgE+ 记忆B细胞的数量。因此，促进INF-γ的表现可能有效地治疗过敏。 根据本发明的另一个具体实施例，LT12也能刺激周边血液单核细胞分泌其它的细胞激素，包含由人类细胞激素抗体微数组(Human cytokine antibody array)所分析出的 IL-I α、IL-6、IL-IO、IFN-γ、MCP-2 以及 TNF-α (参见图 1Α-1Ε 及表 6)。因此，本发明提供一种调节免疫的方法及组合物，包括给予一个体服用有效量的副干酪乳酸杆菌LT12与医学上可接受的载体。本发明亦提供一个治疗过敏方法及组合物，包括给予一个体服用有效量的副干酪乳酸杆菌LT12与医学上可接受的载体。本文在此所称的“医药上可接受的载体”包括，但不限于生理食盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其相关的组合物。令人意外的是，本发明发现一组合物，包含LT12与第二种副干酪乳酸杆菌，亦具有免疫调节活性及/或抗过敏活性。在一个实施例中，第二种副干酪乳酸杆菌的品系为 LP-CBT，LT12与其的菌数比例为100 1。较佳的LT12与第二种菌株的菌数比为2 1。如实施例4的结果所示，组合物亦能刺激周边血液单核细胞分泌其它的细胞激素，包含由人类细胞激素抗体微数组(Human cytokine antibody array)所分析的 IL-1 α、IL-6、IL-10、 IFN- γ、MCP-2以及TNF- α。另外，MCP-3仅由经LT12组合物刺激的周边血液单核细胞产生。根据本发明，LT12提供了极佳的免疫调节及抗过敏的活性。根据本发明的一个实施例，LT12或其组合物可以用来作为一组合物的有效成分。该组合物可被制为食物、饮料或药物。除此的外，也可包含各种的添加物，添加物的种类举例来说，但不限于，例如人工色素(例如β_胡萝卜素、胭脂树红色素、姜黄、辣椒粉、药品及化妆品染料等)、调味料、 香料、甜味剂、乳化剂及/或增稠剂、防腐剂、维生素及抗氧化剂(例如维生素Α、C、D、Ε、 Β-1、Β_5、Β-6、锌、硒、钙、α-维生素 Ε、麸胱胺(glutathione)、二丁基羟基甲苯(butylated hydroxytoluene, BHT)、丁基羟基甲氧苯(butylated hydroxyanisole, BHA)及半胱胺酸 (cysteine))。本发明将由下列实施例做进一步的说明，但实际发明并不局限于此说明书所陈述的实施例。实施例1 分离副干酪乳酸杆菌株LT12副干酪乳酸杆菌LT12从人类粪便进行分离，须在检体采样后十二小时内进行分离的步骤。称重(约一公克)的检体放至均质机(Stomacher400，Seward, UK)搅拌30秒使其均质化，再以预还原(pre-reduced)的脑心浸出物培养液(brain heart infusion broth)稀释，接着以适合的选择性培养基进行培养。适当的稀释物涂盘于乳酸菌醋酸盐培养基(Rogosa Acetate agar，Difco，USA)，或含有 12 μ g/ml 万古霉素(vancomycin, Sigma,USA)的乳酸菌醋酸盐培养基(Rogosa Acetate agar,Difco,USA)以培养所有的乳酸菌属， 以及可抗万古霉素的乳酸菌，例如副干酪乳酸杆菌群(Lparacasei group)，包含副干酪乳酸杆菌(L.paracasei)、酪蛋白乳酸杆菌(L. casei)及雷曼氏乳酸杆菌(L. rhamnosus) 等。API 50CHL系统(bioM6rieuX，Inc. USA)系用于鉴定抗万古霉素的副干酪乳酸杆菌的品系。
实施例2 副干酪乳酸杆菌(Lactobacillusparacasei)的鉴定API 50CHL系统用于鉴定乳酸菌。藉由一系列酵素反应来建立乳酸菌菌株的特性。 LT12的API 50CHL系统鉴定结果列示如表1。表1LT12的API 50CHL系统鉴定结果
参考LT12
_好的鉴定_
试验条API50CHLV5.1
生化谱-----+----+++++-++++-+++++++++-++++----++++----+——
CTRL-GLY-ERY-DARA-LARA- RIB + DXYL-LXYL- ADO -MDX-
GAL+GLU+ FRU +MNE+SBE+ RHA — DUL+INO+ MAN +SCR+
MCM -MDG+ NAG +AMY+ARB+ ESC + SAL+CEL+ MAL +LAC+
MEL-SAC+ TRH + INU+MLZ+RAF- AMD-GLYG-XLT-GEN+
TUR+LYX+ TAG +CffUC-LPUC一 DARL -LARL-GW+ 2KG -SKO-
有意义的分类单位鉴定％T值不一致的试验
Lactobacillus paracasei ssp paracasei 195.20.69DUL13% INO 6% LYX 20%
下一个分类单位鉴定％ T值不一致的试验
Lactobacillus paracasei ssp paracasei 24.60.6LAC 0% LYX 16%随机放大的多形态DNA (RAPD分析)鉴定以下几种菌株分别进行40小时的培养后进行DNA萃取LT12、Lactobacillus paracasei (Cell biotech Co. , Ltd. , Korea)(简禾尔 LP-CBT)、Lactobacillus paracasei GMNL32(简称GMNL32)、Lactobacillus paracaseisubsp. paracasei BCRC 14023 (简称BCRC 14023)、Lactobacillus paracaseisubsp. paracasei BCRC 12188 (简称BCRC 12188)，抽取染色体后以12个随机多型性核酸引子(表2)进行RAPD分析。RAPD分析结果详见表3，可由电泳分析观察到LT12与其它四株菌株有不同的的条带模式。综合API 50CHL鉴定及RAPD分析，LT12有别于典型的副干酪乳酸杆菌菌株。因此，LT12为一种新颖副干酪乳酸杆菌株。表 2
-编码DNA序列(5’-3’)序列编号图宗—
OPD-Ol ACCGCGAAGG__1__IA
0PD-03 GTCGCCGTCA2IB
0PD-07 TTGGCACGGG3IC
权利要求
1.一种经分离的副干酪乳酸杆菌菌株(Lactobacillus paracasei strain)，其中该副干酪乳酸杆菌菌株具有寄存于农业研究机构培养物保藏中心，寄存编号为NRRL B-50327的菌株的特性。
2.如权利要求1所述的副干酪乳酸杆菌，其中该菌株为LT12，寄存于农业研究机构培养物保藏中心，寄存编号为NRRL B-50327。
3.一种组合物，包括如权利要求1所述的副干酪乳酸杆菌。
4.如权利要求3所述的组合物，其中该副干酪乳酸杆菌菌株为LT12，寄存于农业研究机构培养物保藏中心，寄存编号为NRRL B-50327。
5.如权利要求3所述的组合物，其具有抗过敏活性。
6.如权利要求3所述的组合物，其具有免疫调节活性及抗过敏活性。
7.如权利要求3所述的组合物，其中该副干酪乳酸杆菌为活体。
8.如权利要求3所述的组合物，其中该副干酪乳酸杆菌是非活化的。
9.如权利要求3所述的组合物，其可为食物、饮料、或是药物。
10.如权利要求3所述的组合物，其可进一步包含第二种副干酪乳酸杆菌菌株。
11.如权利要求10所述的组合物，其中该副干酪乳酸杆菌与第二种副干酪乳酸杆菌菌株的菌数比可介于2 1至100 1。
12.如权利要求11所述的组合物，其具有免疫调节活性及抗过敏活性。
13.如权利要求10所述的组合物，其可为食物、饮料、或是药物。
14.一种组合物用于制备调节免疫的药物的用途，其包括有效量的如权利要求1所述副干酪乳酸杆菌菌株与医药上可接受载体。
15.如权利要求14所述的用途，其中该副干酪乳酸杆菌菌株为LT12，寄存于农业研究机构培养物保藏中心，寄存编号为NRRL B-50327。
16.如权利要求14所述的用途，其中该组合物能调节先天性免疫(innateimmunity) 或适应性免疫(adaptive immunity)。
17.如权利要求14所述的用途，其中该组合物能促进细胞激素的产生。
18.如权利要求17所述的用途，其中该细胞激素选自于由IL-Ia、IL_6、IL-10、 INF- y、MCP-2和TNF- α所组成的群。
19.一种组合物用于制备治疗过敏的药物的用途，其包括有效量的如权利要求1所述副干酪乳酸杆菌菌株与医学上可接受载体。
20.如权利要求19所述的用途，其中该副干酪乳酸杆菌菌株为LT12，寄存于农业研究机构培养物保藏中心，寄存编号为NRRL Β-50327。
21.如权利要求19所述的用途，其是供患有免疫球蛋白E(IgE)介导的立即性过敏反应(immediate hypersensitivity)或是T细胞介导的迟发性过敏反应(delayed hypersensitivity)的病人月艮用。
全文摘要
本发明提供一种副干酪乳酸杆菌LT12组合物，其具有调节免疫的活性，以及其用于调节免疫反应及治疗过敏的用途。
文档编号A61K35/74GK102168043SQ20101060246
公开日2011年8月31日 申请日期2010年12月23日 优先权日2009年12月23日
发明者张天鸿, 李淑绫, 王宜婕 申请人:利统股份有限公司