专利名称：一种Hsp65-hIL-2融合表达的重组表达载体及重组菌株的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及TB新型疫苗的开发，特别涉及一种Hsp65-hIL_2 融合表达的重组表达载体及重组菌株。
背景技术：
据WHO报告，全世界已有约20亿人感染结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis, MTB)，其中受耐药菌株感染者可能达到5000万，每年新发患者约1000万，每年死亡人数高达300万，在所有传染病中结核病(tuberculosis，TB)死亡率仅次于艾滋病。WHO将TB与艾滋病、疟疾一起列为人类最主要的传染性杀手。我国属于全球22个TB高负担国家之一，每年因TB死亡人数约25万，在我国27种法定报告传染病中排第一位，为各种其他传染病和寄生虫病死亡人数总和的2倍。因此，我国卫生部将TB 列为全国重点控制的重大疾病之一。卡介苗(BacillusCalmette-Guerin vaccine, BCG)是目前 TB 预防的惟一有效疫苗，但因BCG主要针对MTB的早期感染，不能预防和控制潜伏感染状态MTB的复发，并且存在着保护期短，保护性免疫应答较弱，不能防止隐性感染复发等问题，因此亟需研制开发可用于感染者并防止复发的新型TB疫苗。在TB的治疗方面，由于TB化疗疗程长达6个月以上，导致患者不能坚持服药和依从性差，并往往引起耐药，特别是出现广泛结核耐药和超级耐药结核菌，这是寻找免疫治疗方法的重要原因。随着对MTB本质认识的逐步深入，已证实TB患者Thl型细胞免疫反应较低，因此可提高机体免疫功能、尤其是Thl型反应的治疗性疫苗具有较好的应用前景。目前正在开发的TB新型疫苗主要有亚单位疫苗、基因疫苗、减毒活疫苗和重组分枝杆菌疫苗等。其中重组分枝杆菌活疫苗是TB疫苗研究的重要方向之一，其是以分枝杆菌如BCG和耻垢分枝杆菌等作为表达载体，利用大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体将外源性基因导入分枝杆菌中进行表达，构建成重组分枝杆菌。利用分枝杆菌作为表达载体具有以下优点所表达的靶抗原不需纯化，可直接用于免疫保护试验，免去了蛋白质后处理的复杂工序；运用分子生物学手段，通过对不同靶抗原的剪切和拼接，可使新型疫苗理想化；单次接种即可持续诱导对靶抗原的免疫应答；分枝杆菌本身作为一种强免疫佐剂，可提高宿主的免疫力等。将外源性基因导入分枝杆菌构建成重组分枝杆菌活疫苗是新型TB疫苗研究的重要方向之一，国内外研究多选用BCG作为分枝杆菌活疫苗载体，但重组BCG疫苗尚存在下述缺点生长缓慢，营养要求高，培养一代需10多个小时；细胞壁厚，富含脂质，妨碍了外源DNA在内的分子运输；转化效率低；外源基因的表达需特殊载体等。耻垢分枝杆菌 (Mycobacteriumsmegmatis, MS)是一种生长快，转化效率高的非致病菌分枝杆菌和强细胞免疫佐剂，具有与BCG相似的免疫学特性，例如Siu DY, et al. (Recombinants smegmatis vaccine targeted delivering IL-12/GLS into macrophages caninduce specific cellular immunity against M. tuberculosis in BALB/c mice. Vaccine, 2007 ；25(4)638-648.)等构建了表达IL12和GLS融合基因的rMS，该重组活疫苗能够刺激T淋巴细胞增殖，启动Thl细胞免疫应答，促使分泌各种细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-12等)，提高机体对病原体的吞噬功能及杀灭作用等。Harth等(High extracellular levels of mycobacterium tuberculosisglutamine synthetase and superoxide dismutase in actively growing cultures aredue to high expression and extracellular stability rather than to a protein-specificexport mechanism. Immunol Cell Biol.2003, 87(7) :209-215.)将MTB四种分泌型蛋白的转入MS中进行表达，多种指标检测表明重组蛋白与天然蛋白的生化免疫特性几乎完全相同。Rachael(A new Gateway vector and expression protocol for fast and efficient recombinant protein expression inMycobacterium smegmatis. Protein Expression and Purification，2008 ；57 (1) 81-87.)等构建了快速高效的MS表达载体，克隆基因本身的启动子作用下能稳定地表达重组分泌型蛋白，且其产量为BCG的5 10倍。胡佳杰(重组M.S-SB6GST疫苗有关毒性实验研究.华南预防医学，2002 ;28 44-45)等检测了重组BCG_hsp70和重组MS_sj26GST 对小鼠的毒性，结果表明这两种重组分枝杆菌所诱导淋巴细胞增殖指数较对照组高，小鼠体重、各脏器重量、各血象指标、血清肌酐和ALT含量与对照组无差异。说明此疫苗能提高小鼠的免疫功能，且对小鼠无系统毒性作用。因此，MS是分枝杆菌活疫苗优良载体。在重组分枝杆菌疫苗的研究中，如何获得理想免疫效果的疫苗株是研究者最关注的问题，其主要的措施就是选择合适的靶抗原。选择合适的靶抗原可显著提高疫苗的保护效率。MTB热休克蛋白65(Hsp65)是热休克蛋白60家族成员之一，由groEL2基因编码， 具有高度保守性。Oftung 等(OftungF, Mustafa AS, Shinnick TM, et al. Epitopes of the Mycobacterium tuberculosis65-kilodalton protein antigen as recognized by human T cells. J. Immunol,1988,141 :2749-2754)禾口 Kaufmann 等(Kaufmann SH, Vath U, Thole JE, et al. Enumeration of T cells reactive with Mycobacterium tuberculosis organisms andspecific for the recombinant mycobacterial 64~kD protein. Eur J Immunol, 1987，17 :351-357)研究表明，Hsp65可被人和小鼠体内的T细胞广泛识别，如在 MTB感染的小鼠体内，20%的反应性T细胞能够识别Hsp65。Bonato等(VLD, Lima VMF， Tascon RE, et al. Identification and Characterization ofProtective T Cells in hsp65 DNA-Vaccinated and Mycobacteriumtuberculosis-Infected Mice. Infect. Immun, 1998，66 169-175)发现，在MTB感染过程中，Hsp65是机体对抗其入侵的重要的免疫保护性抗原之一。其刺激机体可产生Thl型的细胞免疫反应，如⑶44(hi)⑶4+和⑶44(hi)⑶8+T 细胞的产生，IL-2和IFN-Y等的释放，这些免疫反应在机体控制MTB感染中起着重要作用。IL-2是一种广泛使用的Thl型的细胞因子佐剂，可提高机体的细胞免疫应答，并可诱导CTL、NK等多种杀伤细胞的分化和效应功能，促进IFN-γ的产生。何炬斌等(白细胞介素-2在结核病治疗中的应用.上海免疫学杂志，1994，14 =245-246)研究发现，在TB患者中IL-2的产生较正常人减少，重型患者尤其明显。Sutherland (JS，Adetifa IM, Hillet PC, et al. Pattern anddiversity of cytokine production differentiates between Mycobacteriumtuberculosis infection and disease. Eur J Immunol, 2009,39 :723-729) 等研究了 TB患者和MTB隐性感染人群中细胞因子表达谱的变化，发现在TB患者中，分泌IL-2的T细胞数及IL-2的水平均低于MTB隐性感染者中的，并表明针对MTB感染的IL-2应答的减少在TB复发和恶化中起着重要作用。Johnson(Clinical and immune responses of tuberculosis patients treated withlow-dose IL_2and multidrug therapy. Cytokines Mol Ther, 1995,1 :185-196)等利用动物实验表明，外源性IL_2可提高机体IL_2水平，并使 IL-2R的表达增高，明显降低受感染动物的死亡率，具有较强的抗菌能力及免疫恢复能力。 目前临床已开始将IL-2用于难治性TB患者的辅助治疗，并且疗效较好。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种Hsp65-hIL_2融合表达的重组表达载体及重组菌株，集中了靶抗原和细胞因子佐剂的优势应用于抗MTB的感染、防御和治疗。本发明是通过以下技术方案来实现 一种Hsp65-hIL-2融合表达的重组表达载体，是在大肠杆菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体中插入Hsp65-hIL-2融合基因，所述的Hsp65-hIL-2融合基因是将Hsp65基因通过酶切位点和linker与hIL_2基因连接。所述的Hsp65-hIL_2融合基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。所述的Hsp65-hIL_2融合表达的重组表达载体是pDE-hSp65-hIL_2表达载体，将 Hsp65-hIL-2融合基因通过EcoRV和HindIII酶切位点克隆入pDE22表达载体。一种Hsp65-hIL_2融合表达的重组菌株，是以耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)为宿主细胞，转化宿主细胞的外源性表达载体是包含Hsp65-hIL_2融合基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体。所述的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体为pDE-hsp65-hIL-2表达载体，通过电穿孔法转化感受态的耻垢分枝杆菌。所述的电穿孔法转染是在0. 4cm的电穿孔杯内进行，电压为2. 5KV，电容为25 μ F， 电阻为1000 Ω。所述的Hsp65-hIL-2融合表达的重组菌株为耻垢分枝杆菌Hsp65-hIL-2_MS，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2010098。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明将靶抗原Hsp65和细胞因子佐剂IL-2连接后构成融合基因，将其整合到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体PDE22中；该载体转化宿主细胞后，能够被表达并分泌产生融合蛋白Hsp65-h IL-2。进一步，将pDE-hsp65-hIL-2转化感受态的耻垢分枝杆菌，制备重组的耻垢分枝杆菌HSP65-hIL-2-MS重组菌株。表达HSP65_hIL_2融合基因的重组分枝杆菌株集中了靶抗原、细胞因子佐剂和活载体的优势，免疫接种后可刺激机体产生包括体液免疫水平和细胞免疫水平的免疫应答，提高机体的免疫保护力。HSP65-hIL-2_MS重组菌株扩大培养后，取IO7皮下免疫小鼠，检测体液免疫应答水平包括抗体滴度和抗体亚类测定；检测细胞免疫应答水平，包括外周血CD4+/CD8+比例、 脾淋巴细胞杀伤效应、ELISA检测IFN-Y水平。检测结果表明，筛选获得的表达结核分枝杆菌Hsp65和hIL-2融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌株免疫小鼠，在免疫1周后可诱导比耻垢分枝杆菌更高的体液和细胞免疫应答水平。
MTB是一种胞内菌，控制MTB的感染主要依靠机体的Thl型的免疫反应，⑶4+和 CD8+T介导的细胞免疫反应及IFN-Y在抗MTB感染中发挥着重要作用。本发明提供的 Hsp65-hIL-2-MS菌株在免疫机体之后，一方面可稳定的分泌表达融合蛋白Hsp65-hIL_2 ； 另一方面不仅可以诱导机体产生Thl型的免疫反应，而且可刺激产生更多的⑶4+和⑶8+T 淋巴细胞数量，提高CTL杀伤活性及诱发机体产生特异性的IFN- γ，Hsp65-hIL-2-MS菌株在免疫机体1周后所刺激产生的免疫强度优于传统BCG。因此Hsp65-hIL-2-MS菌株在TB 新型疫苗及治疗制剂方面具有潜在的应用前景。保藏说明本发明所述的耻垢分枝杆菌Hsp65-hIL-2_MS (Mycobacterium smegmatisHsp65-hIL-2-MS)进行了下述保藏保藏单位中国典型培养物保藏中心；保藏地址武汉市武昌珞珈山；保藏时间2010年4月22日；保藏号为CCTCC M 2010098。
图1为pDE-hsp65-hIL-2表达载体的双酶切鉴定的结果图；图2为重组HSP65-hIL-2_MS的PCR扩增进行基因型鉴定的结果图；图3为Hsp65-hIL_2融合基因表达的Western-blot分析结果图；图4为重组Hsp65-hIL-2-MS表达Hsp65-hIL-2融合蛋白的免疫荧光结果观察图；图5为重组Hsp65-hIL-2-MS免疫小鼠后ELISA检测抗体水平的结果图；图6为重组Hsp65-hIL-2-MS免疫小鼠后检测抗体亚类比例的结果图；图7为重组Hsp65-hIL-2-MS免疫小鼠后检测CD4+/CD8+免疫细胞及其总和的结果图；图8为重组Hsp65-hIL-2-MS免疫小鼠后检测淋巴细胞的细胞杀伤效应的结果图；图9为重组Hsp65-hIL-2-MS免疫小鼠后脾淋巴细胞IFN- γ产生水平的结果图。
具体实施例方式本发明提供表达Hsp65-hIL_2融合表达的表达载体pDE-hSp65-hIL_2，并将其转染耻垢分枝杆菌制备重组MS，经过潮霉素抗性筛选得到耻垢分枝杆菌Hsp65-hIL-2-MS ； 并对目的基因的表达和Hsp65-hIL-2-MS的免疫效果进行验证，结果表明该重组 Hsp65-hIL-2-MS在结核病预防和治疗方面的制剂或药物中的应用具有良好的应用前景。下面结合附图对本发明作进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。l、Hsp65-hIL-2融合表达的pDE-hSp65-hIL_2大肠杆菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体的构建1. 1HSP65蛋白基因的克隆根据GenBank公布的MTB H37Rv的HSP65的编码基因groEL2全长cDNA序列设计引物，以克隆其全长基因，设计的引物对具体为正向弓丨物 Pl RcRatatcat ggccaagaca attgcgtac 29 ；反向弓丨物 P2 :RcatcRatRa aatccatgcc acccatgtc 29;
其中，正向引物引入EcoRV酶切位点，反向引物引入Cla I酶切位点；以提取的或包含MTB基因组DNA为模板，以引物对Pl进行PCR扩增，PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶回收长度为1645bp的目的基因片段，并将其克隆入测序用的pGEM-T载体，序列测定由 Invitrogen公司完成，测序结果显示克隆的HSP65基因序列正确。1.2 5'端带有疏水性linker的hIL-2基因的克隆参照GenBank公开的人源性IL_2 (hIL_2)基因序列设计扩增其全长的引物，并在 hIL-2基因上游引物中引入了 48bp的疏水linker性，设计的引物对具体为正向 弓I 物 P3 :RcatcRatRR tRRctcaRRt ggctccggtg RaRRCRRaaR CRRcRRtRRaRRatcaccta cttcaagttc tacaaag77 ；反向弓I物 P4caagtcagtg ttgagatg 28;其中，正向引物引入Cla I酶切位点，波浪线标注的序列为引入的48bp疏水性 linker，反向引物引入HindIII酶切位点；以提取的或包含hIL_2基因的载体为模板，以引物对P2进行PCR扩增，PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶回收长度为45!3bp的目的基因片段， 并将其克隆入测序用的PGEM-T载体，序列测定由hvitrogen公司完成，测序结果显示克隆的hIL-2基因序列正确。1. 3大肠杆菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体pDE-hsp65-hIL-2的构建将上述克隆的HSP65基因片段通过EcoRV、Cla I酶切位点克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体PDE22，得到中间表达载体；然后再将克隆的带有疏水性linker的 hIL-2基因片段通过Cla I、HindIII酶切位点克隆入中间表达载体，通过Cla I酶切位点和疏水性linker将HSP65基因片段与hIL-2基因片段连接，得到包含Hsp65-hIL_2融合基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体，命名为pDE-hsp65-hIL-2。将构建的重组载体pDE-hsp65-hIL-2转染大肠杆菌，扩增并提取质粒，然后对提取的质粒进行EcoRV和HindIII双酶切鉴定，双酶切后的电泳检测结果如图1所示，其中泳道M为maker，泳道1、2为酶切后的重组质粒，均可以看到2087bp的目标片段，说明在重组的pDE-hsp65-hIL-2载体中，形成了 Hsp65-hIL_2融合基因。对重组载体pDE-hsp65-hIL_2 测序之后，Hsp65-hIL-2融合基因的序列如SEQ. ID. NO. 1所示。2、Hsp65-hIL_2融合表达的重组耻垢分枝杆菌的构建及表达2. 1耻垢分枝杆菌(MQ感受态的制备从改良罗氏培养基保存的菌种中挑取一接种环的MS，接种于5ml 7H9培养基， 30 °C，IOOrpm振荡过夜培养，按1 100的比例转接于200ml 7H9培养基，继续培养至 0D600nm = 0. 8 1，冰浴1.釙之后4°C、5000rpm离心lOmin，收集菌体。然后将沉淀悬浮于预冷的10%甘油溶液中，4°C、5000rpm离心lOmin，共洗涤三次，每次重悬10%甘油溶液体积减半。最后将菌体沉淀按照100 1比例重悬于10%甘油溶液中，得到感受态的 MS，-70°C保存至使用。2. 2重组质粒电转化MS感受态细胞取0. 4ml MS感受态细胞冰浴融化，与5 μ g用乙醇沉淀的pDE-hsp65-hIL_2重组表达载体混勻，冰上放置lOmin，转入0. 2cm预冷的电穿孔杯，用电穿孔法转化感受态MS，参数设置为电压2. 5kV，电容25 μ F，电阻1000 Ω。转化完成后，冰浴2min，转入5ml 7H9培养基，30°C培养浊后涂布于含OADC (葡萄糖-牛血清白蛋白因子ν-过氧化氢酶-油酸甘油酯)和潮霉素150 μ g/ml的7H10平板中，在设空白质粒作为对照下，利用潮霉素抗性筛选表达载体阳性转染的重组MS，30°C培养 5 7d后形成可见菌落。2. 3转染pDE-hsp65-hIL-2成功的重组Hsp65-hIL-2_MS的进一步筛选与鉴定2. 3. 1基因型鉴定挑取转化后培养5 7d后形成的单菌落，离心收集细菌，提取DNA后，PCR扩增法鉴定重组MS的基因组是否包含Hsp65-hIL-2融合基因，扩增鉴定所采用的引物对为HSP65 基因克隆的上游引物Pl和hIL-2基因克隆的下游引物P4，PCR反应体系为10Xbuffer 5 μ l,dNTPs 5μ 1(2. 5 mmol/L)，DNA 模板为 1 μ 1，Ρ1、Ρ4 引物各 1μ 1 (25 μ mol/L)及 Pfu 酶 1μ 1，加水至50μ 1。PCR反应程序为95°C预变性5min，95°C变性15s，65°C复性30s，72°C 延伸50s，30个循环，末次循环后72°C延伸IOmin。PCR扩增产物的电泳结果如图2所示，其中，泳道M为Marker，泳道1为MS空白对照，泳道2为挑取的重组MS的PCR扩增鉴定结果，可以清晰的看到长度为2087bp的目的片段，这表明HSP65-hIL-2融合基因整合到了潮霉素抗性筛选的重组MS中。2. 3.1表型型鉴定l)Western blotting 鉴定挑取基因型鉴定阳性的Hsp65-hIL-2-MS(rM. S)菌株接种于含潮霉素(150 μ g/ ml)的7H9培养基，培养至0D600大于l，6000rpm离心IOmin收取菌体和培养上清。将培养上清分别用蔗糖和PEG 6000浓缩后，进行SDS-PAGE 取预先处理的PVDF膜与PAGE胶相贴，在恒压100V条件下转移电泳lh，50g/L脱脂奶封闭后，加入抗HSP65-hIL-2融合基因免疫小鼠血清(Wang LM, Bai YL, Shi CH, et al. Immunogenicity and protective efficacy of aDNA vaccine encoding the fusion protein of mycobacterium heat shock protein65 (HSP65)with human interleukin_2against Mycobacterium tuberculosis inBALB/C mice. APMIS, 2008,116 :1071-1081)，4 °C 过夜；PBST 洗涤后，加入 HRP-羊抗鼠 IgG，37°C放置Ih ；PBS洗涤后，加入底物液显色。Western blotting鉴定结果如图3所示，其中泳道M为Maker，泳道1、2为重组 Hsp65-hIL-2-MS培养上清的检测结果，在约78kDa处可见明显的特异性目的条带，这表明可表达Hsp65-hIL-2的重组耻垢分枝杆菌株构建成功，而且Hsp65-hIL-2融合基因表达的融合蛋白是可分泌表达的。2)免疫荧光鉴定取少量的MS和Hsp65-hIL-2-MS培养菌涂抹于多聚赖氨酸处理过的载玻片上，自然风干后，过酒精灯火焰上方固定三次。加Hsp65-hIL-2融合基因免疫小鼠的血清作用，4°C过夜，以PBS洗涤后，加FITC-羊抗鼠IgG，37°C作用lh，PBS洗涤后， 免疫荧光显微镜下观察。荧光观察结果如图3所示，可以看出Hsp65-hIL-2-MS重组菌株呈现出较强的特异性绿色荧光，进一步表明Hsp65-hIL-2-MS(rM. S)重组菌株可特异性表达 Hsp65-hIL-2融合蛋白。将上述基因型和表型鉴定均为阳性的克隆为Hsp65-hIL_2融合基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体pDE-hsp65-hIL-2已转化到耻垢分枝杆菌株中，而且 Hsp65-hIL-2融合蛋白以分泌的形式被表达。将pDE-hsp65-hIL-2重组成功的重组耻垢分枝杆菌株命名为耻垢分枝杆菌HSP65-hIL-2-MS(rM. S)，并送中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC M2010098。3、Hsp65-hIL-2_MS菌株在小鼠体内诱导产生的免疫应答实验动物分组及免疫取BALB/c小鼠36只，随机分成三组(每组12只)，即 Hsp65-hIL-2-MS(rM. S)免疫组、BCG免疫组和生理盐水注射对照组。Hsp65-hIL-2_MS (rM. S)和BCG组采用背部皮下免疫，剂量均为0. 2mg/0. Iml/只，生理盐水对照组同样注射。3. lHsp65-hIL-2_MS(rM. S)免疫小鼠抗体水平ELISA法检测各组免疫小鼠血清中特异性抗体。Hsp65-hIL-2-MS(rM. S)免疫组用纯化的Hsp65-hIL-2融合蛋白(10 μ g/ml)作为抗原，BCG免疫组和生理盐水对照组用MTB 培养滤液蛋白CFP(10y g/ml)作为抗原，100 μ 1/孔包被酶联板，4°C过夜；洗涤后加牛血清白蛋白(BSA)，37°C封闭Ih;洗涤后加不同稀释度的待检血清100μ 1/孔，37°C孵育 Ih;洗涤后加入1 5，000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，37°C孵育Ih;洗涤后加入OPD底物溶液100 μ 1/孔显色后，再加入50 μ 1/孔终止液，测波长490nm吸光度(A)。以生理盐水组小鼠血清作阴性对照，Am/Aratta^ 2. 1为阳性。检测IgGh/IgGl亚型时，所有血清以 1 100稀释，二抗为1 5，000稀释的HRP-羊抗鼠IgG^i或HRP-羊抗鼠IgGl。ELISA检测抗体水平的结果如图5所示，横坐标分别为三种免疫方式，纵坐标为免疫小鼠血清中的特异性抗体滴度，Hsp65-hIL-2-MS(rM. S)免疫的小鼠在免疫1周后体内的抗Hsp65-hIL-2抗体平均滴度就达1 4000，明显高于同期BCG免疫小鼠的抗体滴度 1 290 (P < 0. 01)和生理盐水对照组的1 20(P < 0. 01)。免疫4周后，Hsp65-hIL-2-MS (rM. S)免疫小鼠体内的抗体水平急剧下降至 1 400，但仍高于BCG免疫小鼠的抗体滴度1 200(P<0.05)和生理盐水对照组的 1 20 (P < 0. 05)。ELISA法对各组免疫小鼠血清中特异性抗体亚类进行分析，结果如图6所示，在免疫1周后，Hsp65-hIL-2-MS(rM. S)免疫小鼠的抗体亚型以IgGh为主(如图6A所示)，而免疫4周后，其IgGh/IgGl的比例明显下降，抗体亚型主要为IgGl (如图6B所示)。BCG 免疫组和生理盐水对照组小鼠在免疫1周和4周后，IgGh和IgGl的的抗体亚型比例基本不变。3. 2Hsp65-hIL-2-MS (rM. S)免疫小鼠的细胞免疫测定(1)脾淋巴细胞中⑶4+T细胞和⑶8+T细胞所占百分比的检测小鼠免疫1周和4周后，分离小鼠的脾淋巴细胞。取100 μ 1分离的各组小鼠脾淋巴细胞的10% FCS-RPMI 1640悬液(细胞密度为5 X IO5 1 X IO6个细胞)，加大鼠抗小鼠的⑶4 :FITC/⑶8 =RPE荧光双标抗体与脾淋巴细胞单细胞悬液充分混勻，室温(25°C左右) 避光染色15 30min ；然后用PBS洗涤3次，每次2. 5ml, 1，OOOrpmX 5min ；弃去上清，加入终浓度2%的多聚甲醛固定液500 μ 1重悬细胞后进行流式细胞仪分析。分析各免疫组的⑶4+和⑶8+细胞数量，结果如图7所示免疫1周后(如图7Α所示)，Hsp65-hIL-2-MS(rM. S)免疫小鼠产生的CD4+T细胞和CD8+T细胞总和明显多于BCG 组的和生理盐水组的(P < 0. 05)。免疫4周后(如图7B所示)，Hsp65-hIL-2-MS(rM. S) 组的⑶4+T细胞和⑶8+T细胞的总和仍高于BCG组和生理盐水组(P < 0. 05)，但明显低于 HSP65-hIL-2-MS (rM. S)免疫1周后刺激产生的CD4+T细胞和CD8+T细胞的百分比及其总和 (P < 0. 05)。
(2)脾淋巴细胞杀伤效应在免疫1周和4周后，分别分离各组免疫小鼠脾淋巴细胞，用含10% FCS的 RPMI1640完全培养液将分离的淋巴细胞浓度分别调整至2X 107ml、lX 107ml、5X 106/ml 及2. 5X 106/ml，100 μ 1/孔加入96孔板中。靶细胞P815-Hsp65-hIL_2 (王丽梅，徐志凯， 柏银兰等.结核分枝杆菌HSP65-Hil-2融合基因稳定转染细胞系的建立.科学技术与工程，2009，9 (11) =2899-2902)浓度调至 4X 105/ml，加入 50 μ 1/孔，37°C 5% CO2 培养 5h 后， 1000rpm、5min离心，每孔取50 μ 1上清，加入LDH分析液50 μ 1/孔，作用30min后终止反应。490nm可见光检测OD值。检测结果如图8所示，Hsp65-hIL-2-MS(rM. S)免疫小鼠在免疫1周和4周后的CTL 活性为(84. 2士4. 2%和62. 3士3. 1 均明显高于同期BCG免疫组小鼠的(38. 9士 1.9%和 47. 5士2. 3% ) (P < 0. 01)。3. 3脾淋巴细胞中诱生的IFN- γ水平的检测在各免疫组进行免疫1周和4周后，分别分离免疫小鼠脾淋巴细胞，用含10% FCS的RPMI 1640完全培养液将分离的淋巴细胞浓度分别调整至2. 5 X 106/ml，用相应抗原刺激。Hsp65-hIL-2-MS(rM. S)免疫组每孔加入50 μ 1/孔纯化的HSP65_hIL_2融合蛋白 (25mg/L溶于PBS)，而BCG和生理盐水对照组加50 μ 1 MTB培养滤液蛋白CFP (25mg/L溶于 PBS)，ELISA检测各组小鼠脾淋巴细胞分泌IFN- γ的水平。结果如图9所示，Hsp65-hIL-2-MS(rM. S)免疫1周后小鼠产生的IFN-γ水平最高为(115. 00 士4. llpg/ml)，且高于 BCG 免疫组的(99. 37 士8. 87 pg/ml) (P < 0. 05)。免疫 4 周后，Hsp65-hIL-2-MS(rM. S)免疫组 IFN-γ 水平为(82. 84士 3. 36pg/ml)，低于 BCG 免疫组的(117. 60士7. 91pg/ml) (P < 0. 05)。说明 Hsp65-hIL-2_MS 能够诱发较高水平的 IFN- γ。 而IFN-Y是激活巨噬细胞抗MTB活性的中心活性因子，在MTB保护免疫过程中有举足轻重的作用，由IFN-Y激活感染的巨噬细胞途径而发挥杀菌作用，从而使得机体具有强的保护力，可抵抗MTB的感染。MTB是一种胞内菌，控制MTB的感染主要依靠机体的Thl型的免疫反应，⑶4+和 CD8+T介导的细胞免疫反应及IFN-Y在抗MTB感染中发挥着重要作用。本发明提供的 Hsp65-hIL-2-MS菌株在免疫机体之后，一方面可稳定的分泌表达融合蛋白Hsp65-hIL_2 ； 另一方面不仅可以诱导机体产生Thl型的免疫反应，而且可刺激产生更多的⑶4+和⑶8+T 淋巴细胞数量，提高CTL杀伤活性及诱发机体产生特异性的IFN- γ，Hsp65-hIL-2-MS菌株在免疫机体1周后所刺激产生的免疫强度优于传统BCG。因此Hsp65-hIL-2-MS菌株在TB 新型疫苗及治疗制剂方面具有潜在的应用前景。
权利要求
1.一种HSp65-hIL-2融合表达的重组表达载体，其特征在于，是在大肠杆菌_分枝杆菌穿梭分泌表达载体中插入Hsp65-hIL-2融合基因，所述的Hsp65-hIL-2融合基因是将Hsp65 基因通过酶切位点和linker与hIL_2基因连接。
2.如权利要求1所述的Hsp65-hIL-2融合表达的重组表达载体，其特征在于，所述的 Hsp65-hIL-2融合基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
3.如权利要求1所述的Hsp65-hIL-2融合表达的重组表达载体，其特征在于，所述的 Hsp65-hIL-2融合表达的重组表达载体是pDE-hsp65-hIL-2表达载体，将Hsp65-hIL_2融合基因通过EcoRV和HindIII酶切位点克隆入pDE22表达载体。
4.一种Hsp65-hIL-2融合表达的重组菌株，其特征在于，是以耻垢分枝杆菌 (Mycobacterium smegmatis)为宿主细胞，转化宿主细胞的外源性表达载体是包含 Hsp65-hIL-2融合基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体。
5.如权利要求4所述的Hsp65-hIL-2融合表达的重组菌株，其特征在于，所述的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体为pDE-Hsp65-hIL-2表达载体，通过电穿孔法转化感受态的耻垢分枝杆菌。
6.如权利要求5所述的Hsp65-hIL-2融合表达的重组菌株，其特征在于，所述的电穿孔法转染是在0. 4cm的电穿孔杯内进行，电压为2. 5KV，电容为25 μ F，电阻为1000 Ω。
7.如权利要求4所述的Hsp65-hIL-2融合表达的重组菌株，其特征在于，所述的 Hsp65-hIL-2融合表达的重组菌株为耻垢分枝杆菌Hsp65-hIL-2-MS，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010098。
全文摘要
本发明公开了一种Hsp65-hIL-2融合表达的重组表达载体，是在大肠杆菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体中插入Hsp65-hIL-2融合基因，所述的Hsp65-hIL-2融合基因是将Hsp65基因通过酶切位点和linker与hIL-2基因连接。一种Hsp65-hIL-2融合表达的重组菌株，是以耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)为宿主细胞，转化宿主细胞的外源性表达载体是包含Hsp65-hIL-2融合基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体。重组的耻垢分枝杆菌HSP65-hIL-2-MS重组菌株集中了靶抗原、细胞因子佐剂和活载体的优势，免疫接种后可刺激机体产生包括体液免疫水平和细胞免疫水平的免疫应答，提高机体的免疫保护力。
文档编号A61P31/06GK102174555SQ20101061186
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者师长宏, 康健, 张海, 张薇, 徐志凯, 柏银兰, 王丽梅, 王平 申请人:中国人民解放军第四军医大学