一种重组人碱性成纤维细胞生长因子基因及其非融合表达产物、生产方法和应用的制作方法

专利名称：一种重组人碱性成纤维细胞生长因子基因及其非融合表达产物、生产方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程应用领域。本发明涉及一种修改后的人碱性成纤维细胞生长因子的基因，含有该基因的表达载体和原核表达系统。本发明还涉及该修改后基因的非融合表达产物及其该产物在制备治疗神经系统损伤等疾病药物方面的应用。
背景技术：
碱性成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)是成纤维细胞因子家族中的一种。成纤维细胞生长因子(FGF)最初是作为对balb/c3T3细胞具有生长促进活性的因子，从牛脑垂体组织中分离的(D.Gospodarrowicz，Nature 249123，1974)。该因子对酸和温度敏感，具有高的(碱性)等电点，pI＝9.3-9.6。
bFGF可以选择性地激发包括中胚层细胞和神经外胚层细胞在内的许多细胞的生物学反应，这些细胞包括内皮细胞、平滑肌细胞、肾上腺皮质细胞、成肌细胞及成骨细胞。bFGF除可以刺激细胞生长外，还可刺激许多类型的细胞以非有丝分裂方式发生不同的反应，例如促进细胞向受伤部位迁移(趋化因子活性)、促进新的血管生成、调节神经退化和存活性(神经营养活性)、调节内分泌功能以及刺激或抑制特异性细胞蛋白质表达、细胞外基质产生及细胞存活等(Baird，A.and Bohler，P.，Handbook of Exp.Pharmacol.，95(1)369-418，1990)。这些性质为使用bFGF制备用来加速伤口愈合、神经组织修复、预防和治疗脑和心肌局部缺血(侧枝血管生成)的药物提供了基础。
人碱性成纤维细胞生长因子(human basic Fibroblast Growth Factor，hbFGF，下称hbFGF)由于其氨基酸序列与人体天然的hbFGF完全一致，因此应用于人体治疗不会产生免疫反应，可以广泛应用于包括神经系统损伤、烧烫伤、创伤、各类溃疡方面疾病的治疗。因此有极高的开发价值。
自1986年Abraham等首次克隆bFGF的cDNA以来，bFGF基因的克隆和表达研究取得了重大的进展，使人们不再依赖组织提取来进行基础研究。细菌、酵母、病毒等bFGF表达体系的构建极大地方便了bFGF的研究。但若要采用这些表达体系大规模生产hbFGF，则由于其表达量不足而限制了其使用。
在国内，暨南大学生物工程研究所构建了bFGF表达载体，并成功开发出牛bFGF产品(专利申请号96114279.0)。在hbFGF表达研究方面，采用融合蛋白方法表达的可取得较高的表达量。也有采用信号肽OmpA序列重组分泌型表达载体，在周质中获得的hbFGF蛋白可占总周质蛋白的15％。但融合hbFGF由于其含有的这一段融合蛋白而极大地限制了其应用。而照常规方法构建胞内型表达载体表达非融合rhbFGF，表达率均不高，未有超过15％的报道。
翻译起始区(translation initiation region，下简称TIR)是指mRNA上影响到翻译起始的一段mRNA序列。一般意义上认为mRNA起始密码子附近的70个碱基对翻译的顺利起始非常重要，包含了翻译起始的大部分重要信息。因此翻译起始区的二级结构被认为对翻译的顺利起始具有非常重要的意义。mRNA一般情况下会形成各种各样的二级结构，例如各种发夹结构。在能量较低的情况下，这些二级结构有时会通过形成假结(pseudoknot)结构，从而形成更复杂的各种三级结构。一般而言，过于稳定的mRNA二级结构会严重地影响核糖体RNA对TIR区内重要位点的识别，例如SD区等。翻译的起始阶段，当核糖体16S亚基开始识别SD序列并开始结合到mRNA时，必须先打开发夹之类的二级结构，如果这些二级结构很难打开，翻译将不能起始。故理论上认为当二级结构越不稳定时，翻译的起始效率也会越高。
有实验证明mRNA中G+C含量的减少时，一般情况下会减小TIR区二级结构的稳定性。碱基G和碱基C分别都含有三个成氢键基团。而碱基A和碱基U只含有二个成氢键基团。因此G+C含量增高时，形成的二级结构更稳定，故理论上认为序列具有更大的自由能降，从而降低mRNA的翻译起始效率。
另外，密码子系统的选择采用对于翻译的顺利也意义重大。大多数氨基酸由于密码子的简并性而具有不只一种密码子，它们对应tRNA的丰度在不同表达系统中会有很大差异，相应地造成在密码子偏好性上的巨大差异，因此不同的表达系统均有密码子偏好性的不同。因此外源基因在某一表达系统中表达时，采用该表达系统偏好的密码子比例高的其mRNA翻译速度快，而稀有密码子比例高的mRNA翻译速度慢。而当mRNA中具有较多的稀有密码子时，往往会造成外源基因表达效率很低或不表达的严重的后果。

发明内容
本发明的目的是提供一种能在原核表达体系中高效表达的hbFGF非融合基因；本发明的另一目的是提供一种含有这种hbFGF非融合基因的表达载体；本发明的另一目的是提供一种能高效表达hbFGF非融合蛋白的原核表达系统；本发明的另一个目的是提供一种依据该原核表达系统翻译表达产生的具有人碱性成纤维细胞生长因子活性的非融合型多肽；本发明的另一个目的是提供生产上述基因表达产物的方法；本发明的另一个目的是提供上述非融合重组人碱性成纤维细胞生长因子在制备治疗神经系统疾病的药物中的应用。
本发明的能在原核表达体系中高效表达的hbFGF非融合基因，是在不改变天然hbFGF氨基酸序列的情况下，将该基因的翻译起始区经过适当的修改，使具有较高的密码子偏好性，较低的G+C含量。这种hbFGF基因通过适当的载体可以在原核表达系统中有较高的翻译起始效率，从而提高表达率，而且可溶性蛋白的表达较高，大大节省了中下游发酵、纯化条件的优化时间及生产成本，也可以同时简化下游的蛋白产物纯化工艺和提高hbFGF的生物活性。该hbFGF基因具有如序列表所示的核甘酸序列。
本发明的含有这种hbFGF非融合基因的表达载体，该载体具有能在原核表达体系中翻译表达这种hbFGF基因的能力。其中，优选的一种载体是基于pET-3c克隆构建的。
本发明的能高效表达hbFGF非融合蛋白的原核表达系统，该系统包含上述含有hbFGF的载体，而且能够有效地防止本底表达。其中优选的原核表达系统是大肠杆菌表达系统，特别优选的是BL21(DE3)plySs。
根据上述提供的hbFGF基因、表达载体和原核表达系统，本发明提供一种依据该原核表达系统翻译表达产生的具有人碱性成纤维细胞生长因子活性的非融合型多肽，该非融合hbFGF多肽具有如序列表所示的氨基酸序列，具有17.2KD的分子量，且等电点为9.3-9.6。
根据上述提供的hbFGF基因、表达载体和原核表达系统，本发明生产该基因表达产物的方法包括(1)设计合适的PCR引物，通过PCR扩增，得到适当地修改过的编码具有非融合hbFGF的DNA序列；(2)将经过修改的DNA序列与适当的克隆表达载体相连接，得到重组表达载体；根据优选的实施方案，其中所说的重组表达载体为基于pET-3c构建的pET-JN系列；(3)用所说的重组表达载体转化适当的原核宿主细胞并筛选所得到的被转化的重组工程菌株；根据优选的实施方案，其中所说的原核宿主细胞为大肠杆菌细胞，其中最优选的是BL21(DE3)plySs(4)在适于表达所说的具有成纤维细胞生长因子活性之多肽的条件下发酵培养所说的被转化的工程菌，收集菌体，破碎离心，分别从离心的上清和沉淀产物中分离并纯化所说的多肽；(5)纯化的步骤依次为离子交换层析-亲合层析-凝胶层析，产物纯度达到98％以上。
本发明上述非融合hbFGF还可以在制备治疗神经系统疾病的药物中进行应用。该应用含有按本发明方法生产的非融合hbFGF作为必要的活性成分外，还可含有适当量的以及医药上可接受的载体或赋形剂。该药物组合物用于制备预防或治疗神经系统损伤等药物，特别是用于制备治疗神经组织损伤如外周神经损伤、神经性耳聋、急性缺血性脑中风、脑外伤等方面的药物。
以下详细描述本发明的技术方案首先，用本领域技术人员熟知的方法，设计适当的引物若干对，以我所保存的人碱性成纤维细胞生长因子基因作为模板(基因序列见中国专利96114279.0之附图2)，PCR扩增，将hbFGF基因的TIR即将ATG起始密码子开始的前0-30个密码子进行修改，如此获得的修改后的hbFGF基因再用限制性内切酶进行酶切，在T4连接酶的作用下将所得到的基因连接到适当的质粒载体，再借助CaCl2法或电穿孔法等常规方法将所得到的重组载体导入宿主细胞例如大肠杆菌中，再基于所用质粒载体所携带的抗生素抗性或其他抗性标志选择转化体。例如可使用pET-3c/3b/3c作为克隆载体，将修改了TIR的hbFGF基因克隆其中，转化大肠杆菌DH5α或JM109的情况下，可在含有氨苄青霉素(Ampicillin，下简称AMP)的LB培养基(1％胰蛋白胨、0.5％醇母提取物，1％NaCl，pH7.2，下略)平皿上培养该转化的细胞，得到相应的菌落。
对获得的菌落，需进一步鉴定其是否为重组子。可以采用双酶切的方法进行初步鉴定。如在使用大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，可以用常规方法从重组体大肠杆菌细胞中抽取质粒，用限制性酶消化所得到的质粒，溴乙锭(EB)染色，DNA琼脂糖电泳进行鉴定，如在紫外光下可见清晰的酶切片断，则可初步证实修改后的hbFGF基因已克隆入表达载体。为进一步证实，可以将初步鉴定确定的含有该克隆表达载体的宿主菌直接交由专业测序公司进行测序，将测序结果进行比较，以进一步证实基因序列是否与预期的一致，可推知氨基酸序列是否与预期完全相同。
然后将含有这种修改过TIR的hbFGF基因的重组表达载体进一步转化到适当的表达宿主细胞内。在适于表达具有hbFGF活性蛋白的通用条件下，培养所得到的转化体细胞。例如在分别使用pET-3c或pET-35b+和大肠杆菌BL21(DE3)或BL21(DE3)plySs作为质粒载体和宿主时，可在含有100μg/ml AMP的LB培养基中将转化体培养过夜。培养后收获细胞，用超声波破碎细胞，离心分离细胞的可溶性部分并从中分离和纯化所需的hbFGF。
这里应特别强调指出的是，在本发明中是由于利用突变了TIR区域的hbFGF基因从而大大提高了hbFGF的表达效率，特别是增加了从细胞可溶性部分中获得的表达产物的比例(因为从包含体中分离纯化表达产物时往往因使用破碎包含体的变性剂而导致产物的活性效率很低或失活)。
经发酵和层析纯化后获得的hbFGF可按照本领域已知的噻唑蓝(MTT)法(ArmelinHA.，Pituitary extracts and steroid hormones in the control of 3T3 cell growth，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 702702-2706，1973)，以提取的非融合hbFGF作为试验样品，以细胞最大半数增殖浓度(ED50)标定本发明的具有hbFGF之生物学活性。
可以使用多种常规层析技术纯化依照本发明提供方法培养的转化体细胞和/或培养基中具有hbFGF活性的多肽。例如可在破碎细胞后溶解所需的多肽，溶胞物离心后对所得上清层析分离。所使用的层析方法包括但不只限于离子交换层析，疏水相互作用层析，凝胶过滤层析和亲合层析。其中亲合层析包括但不只限于金属螯合例如铜或锌铬合的亲合柱层析和结合有对hbFGF有高度亲合力之硫酸肝素柱层析。
用于本发明的疏水柱层析介质是可共价连接正(异)丁基、辛烷基和苯基等的琼脂糖树脂，例如可以是购自Phamacia Co.Sweden的Butyl Sepharose phenyl sepharose 4L-4B等。可以使用本领域已知的方法通过1-氯-2，3-环氧丙烷或2，3-二溴丙醇作为间隔臂，将上述基团共价结合到Sepharose固相基质上。在以疏水相互作用层析分离hbFGF时，可以使用等度或梯度冼脱，但较好是使用选自磷酸盐缓冲液、Tris-Hcl缓冲液，硝酸盐缓冲液的缓冲盐溶液，以50-600cm/小时的流速进行洗脱。使用的浓度梯梯度一般为3.5M-0M，洗脱液的pH范围为6-9。
为进行金属螯合物亲合层析，可以使用偶联有Zn+、Cu2+、Fe3+、Mn2+等金属离子固相树脂，但较好是偶联Zn2+的Sepharose或Sephadex，羧甲基纤维素树脂柱(例如购自Pharmacia Co.，Swedem的Chelating Sepharose Fast Flow)。可在大约pH7-9条件下，以大约250-370cm/小时的流速进行洗脱。可使用含有NaCl缓冲液的洗脱液洗脱。
用于分离hbFGF的最重要的层析基质是携带共价交联的硫酸多糖，或琼脂糖、药聚糖或纤维素的基质，例如按前述方法制得的或购自Phramacia Co.，Sweden的产品名为Sepharose 6 FastFlow，或Hyperp的亲合层析树脂。可用含有NaCl的缓冲液梯度洗脱。
进行离子交换层析是根据不同蛋白质电荷性质不同而将其分离。层析介质是采用X-连接琼脂或X-连接右旋糖苷为树脂基。通常通过加大反荷离子的浓度来进行分离。最常使用为Nacl溶液进行步进式或梯度式洗脱，使用浓度梯度为0-1M，洗脱液的范围为pH6-9。
凝胶层析介质为X-链葡聚糖或双丙烯酰胺。例如选择Pharmacia公司的Sgphacryl S-100。可根据蛋白质分子大小不同达到分离的效果。可用一般的缓冲体系或含低浓度盐缓冲体系缓冲体系进行洗脱，而通常选用磷酸盐缓冲液。洗脱液的pH范围为6-9。
我们依次使用疏水相互作用层析-金属螯合物亲合层析-硫酸多糖亲合层析纯化或依次使用离子交换层析-亲合层析-凝胶层析等方法来制备的hbFGF，产物纯度达到98％以上。
在本表达系统中，所表达的hbFGF还有部分是在重组体的菌胞中是以可溶性包含体的形式积聚的。在这种情况下，可以回收并用变性剂(例如尿素)溶解后，除去变性剂以使hbFGF重新折叠并恢复其原有活性，然后再基本上按前述方法进行层析处理，以得到具有所需的非融合hbFGF多肽。
本发明还涉及含有非融合hbFGF的药物组合物，这些药物组合物可应用于治疗神经系统损伤如外周神经损伤、神经性耳聋、急性缺血性脑中风、脑外伤等方面的治疗。可以按照本发明所述方法制备的非融合hbFGF作为主要成分，与药学上可接受的赋形剂或稀释剂，以及其他辅助成分混合，制成适于临床治疗应用的药物组合物。可以按照医药工业领域已知的方法将本发明的药物组合物配制成可供静脉内、肌肉内、腹腔内、脑脊髓腔内注射的注射液。
特别是在使用本发明的非hbFGF作为基本活性成分的情况下，可以使用选自聚乙二醇、羧甲基纤维素、硫酸多糖、肝素、多聚赖氨酸等高分子化合物，以及可与hbFGF分子中的半胱氨酸形成二硫键的谷胱苷肽作为稳定剂，用以防止hbFGF分子在溶液中或病人血流中被迅速降解，或在储存期间发生分子多聚化而减少或丧失其生物学活性。
最后还应指出的是，根据使用目的的不同，本发明的药物组合物中除含有作为主要成分的非融合hbFGF外，还可含有其他相关的生物学活性蛋白质，例如表皮因子(EGF)、神经生长因子(NGF)及脑衍生的神经生长因子(BDNF)，这些活性因子可与hbFGF协同作用，提高本发明药物组合物的治疗效果。
以下通过具体实施例和


对本发明作进一步的详细说明。

附件显示非融合hbFGF基因序列及氨基酸序列图1显示重组表达载体pET-JN的构建。
图2显示重组表达载体pET-JN的酶切鉴定琼脂糖电泳图。标记如下MDNA分子量标记之λ/Hind III；M*DNA分子量标记之φ174/Hae III；C对照，未酶切的pET-JN表达质粒；Lanel-10pET-JN表达质粒的BemH I+Nde I酶切图3、图4显示在还原条件下SDS-PAGE对pET-JN系列诱导表达hbFGF的情况分析。除pET-JN系列的七株菌株外，还以克隆了未修改过TIR的hbFGF基因的pET-Yb菌株同时诱导表达作为对照，进行表达情况分析。
标记说明如下M蛋白质标准分子量标记；1*/2*/3*/4*/5*/6*/7*诱导表达后pET-JN1/2/3/4/5/6/7的上清；1/2/3/4/5/6/7诱导表达后pET-JN1/2/3/4/5/6/7的沉淀；C*对照菌株pET-Yb诱发表达后的上清；C对照菌株pET-Yb诱发表达后的沉淀。图5显示在还原条件下SDS-PAGE对pET-JN1的大规模表达hbFGF的结果分析。标记说明如下Lanel破碎后沉淀；Lane2破碎后上清Lane3蛋白质标准分子量标记图6显示对hbFGF的离子交换层析(步骤1，脉冲梯度洗脱方式)。平衡液0.1mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)；洗脱液0.3mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)和0.6mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)。
图7显示对hbFGF的亲合层析(步骤2，脉冲梯度洗脱方式)。平衡液0.6mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)；洗脱液1.2mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)和2.0mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)。
图8显示对hbFGF的凝胶层析(步骤3，等度洗脱方式)。洗脱液0.02mol/L PBS(pH＝7.0)。
图9显示使用纯化后的hbFGF-与人抗hbFGF单克隆抗体所作Western-blotting分析的结果。标识说明如下C对照，hbFGF标准品Lane1、2待检测的非融合hbFGF。
图10显示hbFGF生物活性检测曲线图。其中数字标识为1表示4-1，2表示4-2，......，7表示4-7，以此类推。
具体实施例方式
以下提供具体实施例并参照附图进一步深入描述本发明，这些实施例并不以任何方式限定本发明待批权利要求所要求的保护的范围。
实施例1TIR区域修改的hbFGF基因的制备设计上游引物如下F1GAA GCT GCT AGT ATT ACG ACA CTG CCG GCT CTG CCG GAA GAT GGTGGT AGC GGT GCTF2GAA GCT GCT GGT AGT ATT ACG ACG CTG CCG GCC CTG CCG GAA GATGGT GGT AGT GGT GCAF3GAA GCT GCT GGT AGT ATT ACT ACA CTG CCG GCC CTG CCG GAA GAT GGTGTT AGC GGT GCGF4GAA GCT GCT GGT AGT ATT ACT ACG CTG CCG GCT CTG CCG GAA GAT GGTGGT AGT GGT GCG
F5GAA

GCT GCT GGT AGC ATT ACA ACT CTG CCG GCA CTG CCG GAA GATGGT GGT AGT GGT GCCF6GAA

GCT GCT GGT AGT ATT ACA ACT CTG CCG GCA CTG CCG GAA GATGGT GGT AGT GGT GCAF7GAA

GCT GCT GGT AGC ATT ACG ACC CTG CCG GCG CTG CCG GAA GATGGT GAT AGT GGT GCT设计下游引物如下RGACA

TTA TCA GCT CTT AGC AGA CAT TGG方框内的碱基序列为酶切位点。
以F1和R，F2和R，......F7和R组合分别进行PCR扩增。
将合成的PCR引物作适当稀释。在洁净的Eppendof管中加入以下成分

充分混匀后，按以下反应程序进行PCR扩增95℃，4min→[95℃，30”→52℃，30”→72℃，45”]×30→72℃，10min，然后冷却至室温。PCR反应结束后，琼脂糖电泳检测扩增PCR产物，在紫外灯下切胶回收PCR产物，用QG-PCR产物纯化试剂盒(Qiagen公司出品)纯化，纯化后的PCR产物，用Bgl II和Nde I酶切后电泳，再次用QG试剂盒纯化。取少量酶切后的纯化产物电泳进行定量，-20℃保存备用。
实施例2pET-JN的构建及重组子的酶切将经酶切、纯化后的载体质粒DNA pET-3c/Nde I /BamH I和hbFGF/Nde I /Bgl II的DNA片段按照常规方法，在16℃的恒温水浴锅中连接30min，连接反应终了时，转化DH5α感受态细胞，取100μL转化液涂AMP抗性LB平板，37℃恒温箱中培养12-16h。构建过程见图1分别用无菌牙签挑取每个抗性平板上生长的菌落3-5个，分别接种到加有100μg/mLAMP的5mL液体LB培养基的试管中，37℃、200rpm/min振荡培养12-16h后，用碱法小量抽提质粒法，抽提质粒作BamH I+Nde I双酶切酶切，电泳鉴定，选出重组子。
从图中可以看出，重组质粒双酶切均产生一约440bp的小片段，说明7个hbFGF的基因均已经克隆到pET-3c载体质粒上，将筛选出的重组子命名为pET-JN.则由7对引物分别PCR扩增构建的重组子分别称为pET-JN1、pET-JN2，...，pET-JN7。见图2实施例3非融合hbFGF蛋白质的表达分析将含有经过酶切鉴定的重组质粒pET-JN系列的DH5α细胞在含100μg/ml AMP的5mL LB液体培养基中扩增，按碱法小量方法抽提质粒，转化BL21(DE3)pLysS细胞，涂布于含有100μg/mlAMP和氯霉素(Chloromycetin，下称CHL)双抗的LB培养平皿上培养，于37℃下培养过夜。挑取阳性菌落并接种于加入100μg/ml AMP和100μg/ml CHL的50ml LB试管中作表达试验，37℃培养至OD600为0.8，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导4小时。
为分析所得的菌株表达非融合hbFGF的更详细情况，将得到的有表达的菌株进一步扩大培养、诱导后，收集菌体，于8倍的破碎缓冲液中超声波破碎，离心，取上清和沉淀，分别进行还原型SDS-PAGE电泳，分析其产物表达情况。试验结果见图3。
对表达的7株菌株，进一步送测序公司测序(以T7启动子序列作为测序引物)，测序结果与预期构建的结果一致，推测出的氨基酸序列与天然的一致。
实施例4非融合hbFGF蛋白的大规模培养和纯化取pET-JN1工程菌株，进一步于10L的发酵罐中扩大培养，收集如此得到的培养液，于4℃以8000-15000rpm离心收获细胞。按10ml/g湿重的量向收获的细胞中加入菌体裂解缓冲液(每升含0.1M NaCl、10mM EDTA和20mM PB，pH7.0)，使用超声波破碎仪或高压匀浆仪裂解细胞。4℃下，8000-18500rpm离心30min，收集上清液，进行SDS-PAGE蛋白电泳，试验结果见图4、图5。
将所得上清液分别进行如下层析离子交换层析采用脉冲梯度洗脱方式；平衡液0.1mol/LNaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)；洗脱液0.3mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)0.6mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)。再进行亲合层析采用脉冲梯度洗脱方式，平衡液0.6mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)；洗脱液1.2mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)2.0mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)。最后进行凝胶层析采用等度洗脱方式，洗脱液0.02mol/L PBS(pH＝7.0)。以上配制的层析用溶液均于4℃保存。结果分别见图6、图7、图8。
实施例5非融合hbFGF的免疫印迹检测和体外生物活性检测。
为了证实如此纯化的非融合hbFGF蛋白的均质性，对洗脱物样品Western-blot印迹分析。按前述方法制备分离胶，在非还原条件下以10mA恒定电流电泳3小时，电泳后以大约8mA/cm2的稳定电流将电泳分离的样品电转移到硝酸纤维素膜上并用封闭缓冲液(10mM PBS(pH7.4)+0.5％Tween 20+1％BSA)处理30分钟，然后加入溶于漂洗缓冲液的鼠抗hbFGF单克隆抗体(由Promega生产)，37℃下反应2小时。用漂洗液(10mM PBS(pH7.4)+0.5％Tween20)洗3次后(10分钟/次)后，再加入溶于封闭缓冲液中，再用过氧化物酶偶联的抗鼠IgG(由Promega生产)37℃下保温2小时。保温后将滤膜用漂洗液洗3次(10分钟/次)。然后加入缓冲液(0.1M PBC(pH60)+1mg DAB+10ul H2O)，直到显现出清晰的条带后加入50mM EDTA终止反应。
免疫印迹试验结果见图9。
采用本领域技术人员已知的MIT法对hbFGF进行测活。取传代3T3细胞，用含10％小牛血清的DMEM培养基按5×104个细胞/mL的密度稀释3T3细胞，分别加入到两块96孔细胞培养板中，每孔100μL，培养24h，更换含1％小牛血清的DMEM培养基(维持培养基)继续饥饿培养24h。然后在两块板的第一行分别加入含有bFGF参比品的维持培养基，调节bFGF的浓度至终浓度400ng/mL，之后的各行，分别用维持培养基倍比稀释，同时取不含细胞的维持培养基和含有细胞但不含bFGF的维持培养基作空白对照，继续培养48h后，每孔加入浓度为1mg/mL的MTT50μL，与细胞结合4～5h后，吸出含MTT的培养基，每孔加入100μL酸性异丙醇，振荡10～20min，570nm与630nm双波长测定吸光值，并以不含细胞的空白维持培养基的吸光值为零，绘制相关曲线，确定bFGF生物学活性。计算公式如下， 根据公式计算比活1.09×106AU/mg；得出ED50＝0.92ng/ml。
活性检测结果见图9。
实施例6非融合hbFGF在制备预防、治疗局灶性脑缺血药物中的应用
1、材料和方法1.1实验动物与分组选用正常成年SD大鼠70只，体重300-400g，雌雄不拘，随机分7组脑缺血3小时后再灌流或同时给予hbFGF低、中、高剂量各一组、生理盐水组、假手术组和正常对照组，每组10只。
1.2大鼠脑缺血及再灌流模型制作 采用Nagasawa’s法加以改良。分离、暴露左侧颈总动脉，结扎之，并分离结扎左侧颈外动脉根部，分离左侧颈内动脉，分离结扎翼腭动脉，于左侧颈总动脉距末端约2mm处剪一小口，将一单股尼龙细丝插入颈总动脉，经分叉部进到颈内动脉，继续沿颈内动脉轻轻推送入颅腔，插入深度共约22～25.0mm，缺血达3小时时撒出细丝即行再灌流，hbFGF组和生理盐水组即在再灌流同时股静脉滴注hbFGF和生理盐水，hbFGF低、中、高剂+生理盐水组显著减少，说明高、中、低剂量的hbFGF均能阻止脑梗塞范围的扩大，且中剂量组较低剂量组的脑梗塞体积百分数明显减少，而高中剂量组之间、高低剂量组之间无明显差异。说明hbFGF在中剂量(50ug/kg体重)以下，存在剂量-效应相关关系，即随着hbFGF剂量由5ug-＞50ug/kg体重逐渐增加，脑梗塞体积百分数逐渐减少。而再加大剂量，如hbFGF250ug/kg体重，其效应与50ug/kg体重没有明显差异，即当hbFGF浓度增加到一定量时，再加大hbFGF剂量就不再出现效应增加。结果显示实验中选择的三个剂量，hbFGF50ug/kg体重功效最佳。
实施例7非融合hbFGF在制备治疗外周神经损伤药物中的应用1、材料入选对象340例患者，男190例，女150例，年龄4个月至76岁，病因以跌伤、击伤、坠伤、车祸为主；同时选择年龄、病情相近的300例为对照。
2、治疗方法(1)采用直流电导入法即导入部位为损伤神经的体表投影部位，hbFGF用量为4ug/ml至10ug/ml，共5ml，均匀撒布在100-200cm2的正极电极垫滤纸或纱布上，阴极置于对侧，电流6-15mA，每日一次，30天为一疗程，对照组则给予温热疗法和各种低、中、高频电疗等物理治疗。二组治疗前后均进行运动神经传导速度(缩写为MNCV)的检测。
(2)周围神经损伤导致的肌肉萎缩患者可在肌萎缩部位多点注射。
3、治疗效果如下表

4、结论hbFGF直流电导入或肌萎缩处多点注射法治疗周围神经损伤引起的活动功能障碍，感觉异常等有明显疗效。
实施例8非融合hbFGF在制备治疗神经药物中的应用1、材料入选对象280例神经性耳聋患者，其中男性152例，女性128例，年龄最小10个月，最大64岁，病程1年内为28例，1-10年为190例，11年以上为62例，病因多为药物中毒、脑膜炎、外伤和突聋等造成。听力损失多在70-95分贝。
2、治疗方法hbFGF配制成4ug/ml，听宫、听会等穴位注射，每日一次，4周为一个疗程。
3、疗效评定痊愈听力恢复到25分贝以内，头痛消失，耳鸣消失；显效听力提高30分贝；有效听力提高15分贝无效听力未提高，耳鸣头痛未消失。
4、治疗结果见下表

典型病例王某，男，7岁，三岁因高烧用链霉素导致耳聋，左耳听力损失在95分贝，由于极重聋，患儿不会说话，经用hbFGF穴位注射，二个疗程听力提高40分贝，正常谈话的声音已能听见，现说话基本正常。
一来自四川的一岁半男孩，因应用庆大霉素致聋，脑干诱发电位检查为右耳110dB，左耳全聋，经hbFGF听宫、听会等穴位注射，每日一次，每次4ug/1ml，，一个疗程后，听力提高为双耳70dB，配助听器可学习说话。
5、结论从实验结果可以分析得到，hbFGF具有修复内耳毛细胞和听神经的既成病变的功能。
hbFGF SEQUENCE LISTING<110> Jinan University<120> nonfusion hbFGF<160>
<170> Patentln version 3.2<210> 1<211> 468<212> DNA<213> Unknown<220>
<223> The translation initiation region of human basic fibroblastgrowth factor was mutated<220>
<221> CDS<222> (1)..(468)<220>
<221> misc_feature<222> (15，54)<223> Y＝T or C<220>
<221> misc_feature<222> (21，24，33，60)<223> n is a，c，g，or t<400> 1atg gct gct ggt agy att acn acn ctg ccg gcn ctg ccg gaa gat ggt48Met Ala Ala Gly Xaa Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly1 5 10 15ggt agy ggt gcn ttc ccg ccg ggc cac ttc aag gac ccc aag cgg ctg96Gly Xaa Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu20 25 30tac tgc aag aac ggg ggc ttc ttc ctg cgc atc cac ccc gac ggc cga 144Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg35 40 45gtg gac ggg gtc cgc gag aag agc gac cca cac atc aaa cta caa ctt 192Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu50 55 60caa gca gaa gag aga ggg gtt gtg tct atc aaa gga gtg tgt gca aac 240Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn65 70 75 80
cgt tac ctt gct atg aaa gaa gat gga aga tta cta gct tct aaa tgt 288Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys85 90 95gtt aca gac gag tgt ttc ttt ttt gaa cga ttg gag tct aat aac tac 336Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr100 105 110aat act tac cgg tca agg aaa tac acc agt tgg tat gtg gca ctg aaa 384Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys115 120 125cga act ggg cag tat aaa ctt gga tcc aaa aca gga cct ggg cag aaa 432Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys130 135 140gct aga ctt ttt ctt cca atg tct gct aag agc tga 468Ala Arg Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser145 150 155<210> 2<211> 155<212> PRT<213> Unknown<220>
<221> misc_feature<222> (5，18)<223> The’Xaa’at location 5 stands for Ser.
<220>
<223> The translation initiation region of human basic fibroblastgrowth factor was mutated<400> 2Met Ala Ala Gly Xaa Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly1 5 10 15Gly Xaa Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu20 25 30Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg35 40 45Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu50 55 60Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn
65 70 75 80Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys85 90 95Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr100 105 110Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys115 120 125Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys130 135 140Ala Arg Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser145 150 15权利要求
1.一种非融合重组人碱性成纤维细胞生长因子的基因，其特征是其5’端的前60个碱基序列为ATG GCT GCT GGT AGY ATT ACN ACN CTG CCG GCN CTG CCG GAA GATGGT GGT AGY GGT GCN，其中Y＝T或C，N＝A或T或C或G。
2.一种质粒载体，其特征是含有如权利要求1所述的基因。
3.如权利要求2所述的质粒载体，其特征是以pET-3c载体为基础构建的。
4.一种原核表达系统，其特征是含有如权2或3所述的载体。
5.如权利要求4所述的原核表达系统，其特征在于是由大肠杆菌表达系统。
6.如权利要求5所述的原核表达系统，其特征在于所述的大肠杆菌为BL21(DF3)plysS。
7.一种非融合重组人碱性成纤维细胞生长因子，其特征是由权利要求4或5或6所述的原核表达系统翻译表达产生的。
8.制备如权利要求7所述重组人碱性成纤维细胞生长因子的方法，其步骤为(1)设计合适的PCR引物，通过PCR扩增，得到修改过的编码具有非融合人碱性成纤维细胞生长因子的DNA序列；(2)将经过修改的DNA序列与适当的克隆表达载体相连接，得到重组表达载体；(3)用所说的重组表达载体转化适当的原核宿主细胞并筛选所得到的被转化的重组工程菌株；(4)在适于表达所说的具有成纤维细胞生长因子活性之多肽的条件下发酵培养所说的被转化的工程菌，收集菌体，破碎离心，分别从离心的上清和沉淀产物中分离并纯化所说的多肽；(5)纯化的步骤依次为离子交换层析-亲合层析-凝胶层析，产物纯度达到98％以上。
9.权利要求7所述的非融合重组人碱性成纤维细胞生长因子在制备治疗神经系统疾病的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于神经系统疾病为外周神经损伤、急性缺血性脑中风或神经性耳聋的。
全文摘要
本发明属于基因工程应用领域。本发明涉及一种非融合重组人碱性成纤维细胞生长因子的基因，该基因的翻译起始区经过修改后有较高的密码子偏好性和较低的G+C含量。本发明还提供含有该基因的载体和原核表达系统。该基因在本发明提供的原核表达系统中有较高的表达效率。本发明还涉及一种非融合重组人碱性成纤维细胞生长因子。本发明还涉及该非融合重组人碱性成纤维细胞生长因子在制备治疗神经系统损伤等疾病的药物中的应用。
文档编号A61K38/18GK1513991SQ0310888
公开日2004年7月21日 申请日期2003年4月3日 优先权日2003年4月3日
发明者陈小佳, 孙奋勇, 林剑, 洪岸, 谢秋玲, 张玲, 汪炬, 李志英 申请人:暨南大学