专利名称：表面功能化钛材及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物医学材料领域，涉及一种表面功能化的钛材，还涉及该钛材的制 备方法。
背景技术：
钛材不仅有良好的抗疲劳、抗腐蚀及生物相容性，而且有较小的磁性及透射性，是 制备血管支架的优良材料。近年来，血管支架广泛地应用于心血管疾病的治疗，用于支撑狭 窄甚至阻塞的冠状动脉血管，保证血液的流通。但钛基材血管支架在临床应用过程中也暴 露出一些问题，如支架植入后易导致血栓、支架再狭窄及炎症反应等。有研究表明，在血管支架表面预先进行内皮细胞化，可以改善支架与血管间的炎 症反应，改变血管畅通率，且细胞可以在支架表面形成完整内膜层，对于抑制其植入后再狭 窄有一定作用。目前，已有利用表面涂层、覆膜，固定生物活性分子，内皮种植与内皮祖细胞 捕获等方法来实现支架表面内皮化的研究报道，如层层自组装壳聚糖和肝素提高冠状支架 的内皮化和抗凝性质；肝素-胶原多层膜上原位交联抗CD34抗体促进血管内皮细胞粘附、 生长，且保持天然血管内皮细胞的特异功能；钛氧薄膜表面固定层粘连蛋白和/或纤连蛋 白提高其表面内皮化能力等。这些方法在一定程度上提高了血管支架的血液相容性、支架 表面内皮细胞的生长及内皮祖细胞捕获等能力，但效果仍不理想。此外，有研究表明，表面 具有纳米纹理及纳米管阵列的钛材可以提高成骨细胞的吸附、碱性磷酸酶的合成、钙沉积 及胶原的分泌。但迄今为止，国内外尚未见纳米结构和生物活性分子协同提高钛材表面内 皮化功能的研究报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种表面功能化钛材，利用纳米结构和生 物活性分子协同提高钛材表面的内皮化功能。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案
表面功能化钛材，钛材表面具有管径为3(T60nm的TW2纳米管阵列，所述TW2纳米管 阵列表面还固定有血管内皮细胞生长因子(VEGF)。本发明的目的之二在于提供所述表面功能化钛材的一种制备方法，操作简便易 行，周期短，成本低。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案 表面功能化钛材的制备方法，包括以下步骤
a、将钛材按照常规方法进行预处理；
b、采用阳极氧化法在步骤a预处理后的钛材表面制备管径为3(T60nm的TW2纳米管 阵列；
C、对步骤b制得的TW2纳米管阵列表面进行硅烷化处理，再通过化学反应在TW2纳米 管阵列表面引入羧基，再利用碳二亚胺和琥珀酰亚胺使羧基活化；d、通过接触反应将VEGF固定在步骤c制得的具有活化羧基的TW2纳米管阵列表面， 即制得表面功能化钛材。进一步，所述步骤a是将钛材依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗1(Γ30分 钟，干燥备用。进一步，所述步骤b是以步骤a预处理后的钛材为阳极，钼电极为阴极，置氟化铵 电解液中，在1(T20V的恒电压下电解，将氧化后的钛材用去离子水洗涤，干燥，制得表面具 有管径为3(T60nm的TW2纳米管阵列的钛材。进一步，所述步骤b是将氟化铵用体积分数为50%的乙醇溶液溶解制成浓度为 0. 27mol/L的溶液，作为电解液；再以步骤a预处理后的钛材为阳极，钼电极为阴极，置上述 氟化铵电解液中，在1(T20V的恒电压下电解3小时，将氧化后的钛材用去离子水洗涤，干 燥，制得表面具有管径为3(T60nm的TW2纳米管阵列的钛材。进一步，所述步骤c包括以下步骤
Cl、将步骤b制得的表面具有TW2纳米管阵列的钛材置3-氨基丙基-三乙氧基硅烷 (APTES)溶液中反应，制得TW2纳米管阵列表面硅烷化的钛材；
c2、将步骤cl制得的T^2纳米管阵列表面硅烷化的钛材置丁二酸酐溶液中反应，制得 TiO2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛材；
c3、将步骤c2制得的TiO2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛材置1-乙基-3-(3-二 甲基氨丙基)_碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的酸性或中性混合溶液中反应， 使酐功能基团水解暴露出羧基并使羧基活化，制得T^2纳米管阵列表面具有活化羧基的钛 材。进一步，所述步骤c包括以下步骤
cl JfAPTES用无水己烷溶解制成浓度为0. 01mol/L的溶液，将步骤b制得的表面具有 TiO2纳米管阵列的钛材浸入上述APTES溶液中，室温下反应3小时，再用无水己烷洗涤，干 燥，制得T^2纳米管阵列表面硅烷化的钛材；
c2、将丁二酸酐用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解制成浓度为0. lmol/L的溶液，将步骤 cl制得的TW2纳米管阵列表面硅烷化的钛材浸入上述丁二酸酐溶液中，室温下反应24小 时，再用DMF洗涤，干燥，制得T^2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛材；
c3、将EDC和NHS用浓度为0. 05mol/L、pH为5. 5的MES缓冲液溶解制成含有25mmol/ L EDC和5mmol/L NHS的溶液，将步骤c2制得的TiO2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛 材浸入上述EDC和NHS的酸性混合溶液中，室温下反应1小时，再用去离子水洗涤，干燥，制 得T^2纳米管阵列表面具有活化羧基的钛材。进一步，所述步骤d是将VEGF用PBS溶解制成浓度为25ng/ml的溶液，再将步骤 c制得的TW2纳米管阵列表面具有活化羧基的钛材浸入上述VEGF溶液中，4° C反应过夜， 再用PBS洗涤，干燥，即制得表面功能化钛材。本发明的有益效果在于本发明提供了一种表面功能化钛材，利用VEGF和管径为 3(T60nm的TiO2纳米管阵列结构协同提高钛材表面内皮细胞的活力及功能指标如前列环素 (PGI2)等的表达，能实现钛基材血管支架表面的快速内皮化，以减少支架植入后造成的血 栓、再狭窄及炎症反应等难题；而且，该表面功能化钛材的制备方法简便易行，周期短，成本 低；因此，本发明的表面功能化钛材具有良好的应用前景。
图1为表面具有管径为30nm的TiO2纳米管阵列的钛材的场发射扫描电镜 (FE-SEM)图。图2为表面具有管径为60nm的TW2纳米管阵列的钛材的FE-SEM图。图3为表面具有管径为IOOnm的TiO2纳米管阵列的钛材的FE-SEM图。图4为钛材表面经各步骤处理后其化学组成的X射线光电子能谱(XPS)表征图， 其中A为表面具有TW2纳米管阵列的钛材，B为TW2纳米管阵列表面硅烷化的钛材，C为 TiO2纳米管阵列表面具有活化羧基的钛材，D为表面具有TW2纳米管阵列和VEGF修饰的钛 材。图5为本发明的表面功能化钛材对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分泌PGI2的影响。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优 选实施例进行详细的描述。实施例1、表面功能化钛材(TiA纳米管管径为30nm)的制备 包括以下步骤
a、将钛材依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗10分钟，37°C烘干，备用；
b、将氟化铵用体积分数为50%的乙醇溶液溶解制成浓度为0.27mol/L的溶液，作为电 解液；再以步骤a预处理后的钛材为阳极，钼电极为阴极，置上述氟化铵电解液中，在IOV 的直流电作用下电解3小时，将氧化后的钛材用去离子水浸泡2小时，再用去离子水洗涤5 次，氮气吹干，制得表面具有管径为30nm的TW2纳米管阵列的钛材(钛材表面的FE-SEM图 如图1所示，XPS谱图如图4A所示)；
c JfAPTES用无水己烷溶解制成浓度为0. 01mol/L的溶液，将步骤b制得的表面具有 TiO2纳米管阵列的钛材浸入上述APTES溶液中，室温下反应3小时，再用无水己烷洗涤3次， 真空干燥4小时，制得TW2纳米管阵列表面硅烷化的钛材(钛材表面的XPS谱图如图4B所 示)；
将丁二酸酐用DMF溶解制成浓度为0. lmol/L的溶液，将制得的T^2纳米管阵列表面硅 烷化的钛材浸入上述丁二酸酐溶液中，室温下反应M小时，再用DMF洗涤6次，真空干燥4 小时，制得T^2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛材；
将EDC和NHS用浓度为0. 05mol/L、pH为5. 5的MES缓冲液溶解制成含有25mmol/L EDC和5mmol/L NHS的溶液，将制得的TiO2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛材浸入上 述EDC和NHS的酸性混合溶液中，室温下反应1小时，再用去离子水浸泡1小时，之后用去 离子水洗涤3次，干燥，制得TW2纳米管阵列表面具有活化羧基的钛材(钛材表面的XPS谱 图如图4C所示)；
d、将VEGF用PBS溶解制成浓度为25ng/mL的溶液，将步骤c制得的TW2纳米管阵列 表面具有活化羧基的钛材浸入上述VEGF溶液中，40C反应过夜，再用PBS洗涤5次，干燥，制 得表面具有TW2纳米管阵列和VEGF修饰的钛材，即本发明所述表面功能化钛材(TW2纳米 管管径为30nm)(钛材表面的XPS谱图如图4D所示)。
实施例2、表面功能化钛材(11 纳米管管径为60nm)的制备 包括以下步骤
a、将钛材依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗10分钟，37°C烘干，备用；
b、将氟化铵用体积分数为50%的乙醇溶液溶解制成浓度为0.27mol/L的溶液，作为电 解液；再以步骤a预处理后的钛材为阳极，钼电极为阴极，置上述氟化铵电解液中，在20V 的直流电作用下电解3小时，将氧化后的钛材用去离子水浸泡2小时，再用去离子水洗涤5 次，氮气吹干，制得表面具有管径为60nm的TW2纳米管阵列的钛材(钛材表面的FE-SEM图 如图2所示)；
c JfAPTES用无水己烷溶解制成浓度为0. 01mol/L的溶液，将步骤b制得的表面具有 TiO2纳米管阵列的钛材浸入上述APTES溶液中，室温下反应3小时，再用无水己烷洗涤3次， 真空干燥4小时，制得T^2纳米管阵列表面硅烷化的钛材；
将丁二酸酐用DMF溶解制成浓度为0. lmol/L的溶液，将制得的T^2纳米管阵列表面硅 烷化的钛材浸入上述丁二酸酐溶液中，室温下反应M小时，再用DMF洗涤6次，真空干燥4 小时，制得T^2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛材；
将EDC和NHS用浓度为0. 05mol/L、pH为5. 5的MES缓冲液溶解制成含有25mmol/L EDC和5mmol/L NHS的溶液，将制得的TiO2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛材浸入上 述EDC和NHS的酸性混合溶液中，室温下反应1小时，再用去离子水浸泡1小时，之后用去 离子水洗涤3次，干燥，制得T^2纳米管阵列表面具有活化羧基的钛材；
d、将VEGF用PBS溶解制成浓度为25ng/mL的溶液，将步骤c制得的TW2纳米管阵列 表面具有活化羧基的钛材浸入上述VEGF溶液中，40C反应过夜，再用PBS洗涤5次，干燥，制 得表面具有TW2纳米管阵列和VEGF修饰的钛材，即本发明所述表面功能化钛材(TW2纳米 管管径为60nm)。实施例3、表面功能化钛材(11 纳米管管径为IOOnm)的制备 包括以下步骤
a、将钛材依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗10分钟，37°C烘干，备用；
b、将氟化铵用体积分数为50%的乙醇溶液溶解制成浓度为0.27mol/L的溶液，作为电 解液；再以步骤a预处理后的钛材为阳极，钼电极为阴极，置上述氟化铵电解液中，在25V 的直流电作用下电解3小时，将氧化后的钛材用去离子水浸泡2小时，再用去离子水洗涤5 次，氮气吹干，制得表面具有管径为IOOnm的TW2纳米管阵列的钛材(钛材表面的FE-SEM图 如图3所示)；
c JfAPTES用无水己烷溶解制成浓度为0. 01mol/L的溶液，将步骤b制得的表面具有 TiO2纳米管阵列的钛材浸入上述APTES溶液中，室温下反应3小时，再用无水己烷洗涤3次， 真空干燥4小时，制得T^2纳米管阵列表面硅烷化的钛材；
将丁二酸酐用DMF溶解制成浓度为0. lmol/L的溶液，将制得的T^2纳米管阵列表面硅 烷化的钛材浸入上述丁二酸酐溶液中，室温下反应M小时，再用DMF洗涤6次，真空干燥4 小时，制得T^2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛材；
将EDC和NHS用浓度为0. 05mol/L、pH为5. 5的MES缓冲液溶解制成含有25mmol/L EDC和5mmol/L NHS的溶液，将制得的TiO2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛材浸入上 述EDC和NHS的酸性混合溶液中，室温下反应1小时，再用去离子水浸泡1小时，之后用去离子水洗涤3次，干燥，制得T^2纳米管阵列表面具有活化羧基的钛材；
d、将VEGF用PBS溶解制成浓度为25ng/mL的溶液，将步骤c制得的TW2纳米管阵列 表面具有活化羧基的钛材浸入上述VEGF溶液中，40C反应过夜，再用PBS洗涤5次，干燥，制 得表面具有TW2纳米管阵列和VEGF修饰的钛材，即本发明所述表面功能化钛材(TW2纳米 管管径为lOOnm)。实施例4、表面功能化钛材对HUVEC分泌PGI2的影响
无菌条件下获得离体4小时内的健康新生儿脐带，用Hank’ s液冲洗脐带外表面至无 血丝残留，向脐带静脉管腔中注入NaCl溶液冲洗至洗出液无色，再向静脉管腔中注入质量 分数为0. 1%的II型胶原酶消化液，两端结扎，37°C消化10分钟，收集消化液，1000r/min离 心5分钟，弃上清，向沉淀中加入培养液，吹打10分钟至细胞悬浮均勻，获得原代HUVEC。 将原代HUVEC进行传代培养，取第3代HUVEC，以细胞密度为1 X 104/cm2分别接种到实施例 Γ3制得的表面功能化钛材的表面，同时设置表面未处理的钛材、表面VEGF修饰的钛材、以 及表面具有不同管径的TW2纳米管阵列的钛材为对照，用RPMI 1640完全培养液在温度为 370C XO2气体体积分数为5%的条件下孵育M小时，再将完全培养液更换成RPMI 1640不完 全培养液(无酚红、无血清)，继续培养M小时，收集不完全培养液，离心取上清，采用人PGI2 酶联免疫吸附测定试剂盒测定HUVEC分泌的PGI2含量。结果如图5所示，表面VEGF修饰的钛材相比表面未处理的钛材，表面功能化钛 材相比表面具有TW2纳米管阵列的钛材，其表面种植的HUVEC分泌的PGI2含量显著提高 (P<0. 01)，说明在钛材表面单独引入VEGF可以提高钛材表面内皮细胞的活力及功能指标 的表达；表面具有管径为3(T60nm的TW2纳米管阵列的钛材相比表面未处理的钛材，其 表面种植的HUVEC分泌的PGI2含量显著提高(P<0. 05)，说明在钛材表面单独引入管径为 3(T60nm的TW2纳米管阵列也可以提高钛材表面内皮细胞的活力及功能指标的表达；TW2 纳米管管径为3(T60nm的表面功能化钛材与表面具有相应管径TW2纳米管阵列的钛材之 间的PGI2含量差值，明显高于表面VEGF修饰的钛材与表面未处理的钛材之间的PGI2含量 差值(P<0. 05)，说明在钛材表面同时引入管径为3(T60nm的TW2纳米管阵列和VEGF可以 协同提高钛材表面内皮细胞的活力及功能指标的表达。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。
权利要求
1.表面功能化钛材，其特征在于钛材表面具有管径为3(T60nm的1102纳米管阵列，所 述TW2纳米管阵列表面还固定有血管内皮细胞生长因子即VEGF。
2.权利要求1所述表面功能化钛材的制备方法，其特征在于包括以下步骤a、将钛材按照常规方法进行预处理；b、采用阳极氧化法在步骤a预处理后的钛材表面制备管径为3(T60nm的TW2纳米管 阵列；C、对步骤b制得的TW2纳米管阵列表面进行硅烷化处理，再通过化学反应在TW2纳米 管阵列表面引入羧基，再利用碳二亚胺和琥珀酰亚胺使羧基活化；d、通过接触反应将VEGF固定在步骤c制得的具有活化羧基的TW2纳米管阵列表面， 即制得表面功能化钛材。
3.根据权利要求2所述的表面功能化钛材的制备方法，其特征在于所述步骤a是将 钛材依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗1(Γ30分钟，干燥备用。
4.根据权利要求2所述的表面功能化钛材的制备方法，其特征在于所述步骤b是以 步骤a预处理后的钛材为阳极，钼电极为阴极，置氟化铵电解液中，在1(T20V的恒电压下电 解，将氧化后的钛材用去离子水洗涤，干燥，制得表面具有管径为3(T60nm的TW2纳米管阵 列的钛材。
5.根据权利要求4所述的表面功能化钛材的制备方法，其特征在于所述步骤b是将 氟化铵用体积分数为50%的乙醇溶液溶解制成浓度为0. 27mol/L的溶液，作为电解液；再 以步骤a预处理后的钛材为阳极，钼电极为阴极，置上述氟化铵电解液中，在1(T20V的恒电 压下电解3小时，将氧化后的钛材用去离子水洗涤，干燥，制得表面具有管径为3(T60nm的 TiO2纳米管阵列的钛材。
6.根据权利要求2所述的表面功能化钛材的制备方法，其特征在于所述步骤c包括 以下步骤Cl、将步骤b制得的表面具有TW2纳米管阵列的钛材置3-氨基丙基-三乙氧基硅烷 即APTES溶液中反应，制得TW2纳米管阵列表面硅烷化的钛材；c2、将步骤cl制得的T^2纳米管阵列表面硅烷化的钛材置丁二酸酐溶液中反应，制得 TiO2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛材；c3、将步骤c2制得的TiO2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛材置1-乙基-3-(3-二 甲基氨丙基)_碳二亚胺即EDC和N-羟基琥珀酰亚胺即NHS的酸性或中性混合溶液中反应， 使酐功能基团水解暴露出羧基并使羧基活化，制得T^2纳米管阵列表面具有活化羧基的钛 材。
7.根据权利要求6所述的表面功能化钛材的制备方法，其特征在于所述步骤c包括 以下步骤Cl、将APTES用无水己烷溶解制成浓度为0. 01mol/L的溶液，将步骤b制得的表面具有 TiO2纳米管阵列的钛材浸入上述APTES溶液中，室温下反应3小时，再用无水己烷洗涤，干 燥，制得T^2纳米管阵列表面硅烷化的钛材；c2、将丁二酸酐用N，N-二甲基甲酰胺即DMF溶解制成浓度为0. lmol/L的溶液，将步骤 cl制得的TW2纳米管阵列表面硅烷化的钛材浸入上述丁二酸酐溶液中，室温下反应24小 时，再用DMF洗涤，干燥，制得T^2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛材；c3、将EDC和NHS用浓度为0. 05mol/L、pH为5. 5的MES缓冲液溶解制成含有25mmol/ L EDC和5mmol/L NHS的溶液，将步骤c2制得的TiO2纳米管阵列表面具有酐功能基团的钛 材浸入上述EDC和NHS的酸性混合溶液中，室温下反应1小时，再用去离子水洗涤，干燥，制 得T^2纳米管阵列表面具有活化羧基的钛材。
8.根据权利要求2所述的表面功能化钛材的制备方法，其特征在于所述步骤d是将 VEGF用PBS溶解制成浓度为25ng/ml的溶液，再将步骤c制得的TW2纳米管阵列表面具有 活化羧基的钛材浸入上述VEGF溶液中，40C反应过夜，再用PBS洗涤，干燥，即制得表面功能 化钛材。
全文摘要
本发明属于生物医学材料领域，涉及一种表面功能化钛材，钛材表面具有管径为30~60nm的TiO2纳米管阵列，TiO2纳米管阵列表面还固定有血管内皮细胞生长因子(VEGF)；其制备方法是先采用阳极氧化法在钛材表面制备管径为30~60nm的TiO2纳米管阵列，再对TiO2纳米管阵列表面进行硅烷化处理，通过化学反应在其表面引入羧基，利用碳二亚胺和琥珀酰亚胺使羧基活化，再通过接触反应将VEGF固定在具有活化羧基的TiO2纳米管阵列表面，即得；本发明利用VEGF和管径为30~60nm的TiO2纳米管阵列结构协同提高钛材表面内皮细胞的活力及功能指标如前列环素的表达，能实现钛基材血管支架表面的快速内皮化。
文档编号A61L27/40GK102058901SQ20101061857
公开日2011年5月18日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者杨再香, 蔡开勇 申请人:重庆大学