用于治疗动脉粥样硬化的b细胞耗竭剂的制作方法

专利名称：用于治疗动脉粥样硬化的b细胞耗竭剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及动脉粥样硬化的预防或治疗，尤其涉及用于预防或治疗动脉粥样硬化的B细胞耗竭剂(cbpleting agent)。
背景技术：
动脉粥样硬化是西方社会最常见的死亡原因，并预期在二十年内将成为世界上心血管疾病的主要原因。动脉粥样硬化导致可以影响冠状动脉(引起缺血性心脏病)、脑循环(引起脑血管疾病)、主动脉(产生有血栓形成和破裂倾向的动脉瘤)和周围血管(通常是腿)(引起周围性血管疾病和间歇性跛行)的动脉粥样硬化性血管疾病(AVD)的发生。缺血性心脏病 (IHD)包括心绞痛(由心肌供血不足引起的胸痛)和心肌梗死(心肌的死亡)，而脑血管疾病包括中风和短暂性脑缺血发作。三分之一的男性和四分之一的女性会死于IHD，且在 1990年IHD死亡率是每100，000人中58人。动脉粥样硬化斑块从位于大动脉内皮下的脂肪痕(fatty streaks)开始。巨噬细胞的募集及其随后LDL源的胆固醇的摄取是引起脂肪痕形成的主要细胞事件。许多证据表明脂质和LDL的载脂蛋白B (apo B)成分的氧化性或非氧化性修饰驱动最初的脂肪痕形成。通常在天然LDL的体外氧化后进行研究的氧化LDL(oxLDL)的特定性质取决于修饰的程度。这可以从其中LDL颗粒仍可以被LDL受体识别的“最小”修饰(mmLDL)至其中apoB 成分是碎裂和赖氨酸残基由氧化脂质的反应性分解产物共价修饰的过度氧化(extensive oxidation)。这种颗粒不被LDL受体结合，而是被巨噬细胞和平滑肌细胞上表达的所谓的清道夫受体结合。许多促炎性和致动脉粥样硬化性质归因于mmLDL和oxLDL及其组分。例如，溶血磷脂酰胆碱或氧化磷脂提高单核细胞的粘附、单核细胞和T细胞的趋化性，并可以诱导促炎性基因表达。虽然单核细胞募集到动脉壁及其随后分化成巨噬细胞初始可以起到去除细胞毒素的和促炎性的oxLDL颗粒或凋亡细胞的作用，但巨噬细胞的逐渐积聚及其摄入oxLDL最终导致动脉粥样硬化损害的发生。从相对简单的脂肪痕到更复杂的斑块的转变的特征在于平滑肌细胞从动脉壁的中间层迁移到内弹性膜和迁移到内膜空间或内皮下空间，或特征在于平滑肌细胞祖细胞的募集。内膜平滑肌细胞可以增殖并摄取修饰的脂蛋白，由此引起泡沫细胞形成，并合成导致纤维帽(fibrous cap)发生的细胞外基质蛋白。因此，发展的动脉粥样硬化斑块简略地分成两部分构成表层的纤维帽和构成深层的脂质核心。该细胞外基质(ECM)由极大地不同的大分子(包括胶原蛋白、弹性蛋白、糖蛋白和蛋白聚糖)组成。大量ECM沉积在纤维帽中， 使得斑块的强度得到保持，而在脂质核心中，除脂质沉积外，ECM降解增强，导致组织脆性增加。这种斑块脆性引起斑块易损性，随之成为斑块破裂的原因。该阶段的斑块发生受单核细胞/巨噬细胞与T细胞之间的相互作用影响，该相互作用导致大范围的细胞和体液反应以及获得慢性炎性状态的许多特征。似乎在发展中损害的细胞成分之间发生明显的串扰(cross talk)。损害的T细胞似乎被激活并同时表达Thl和Th2细胞因子。类似地，基于其表达MHCII类分子的和众多的炎性产物例如TNF、IL-6和 MCP 1，巨噬细胞、内皮细胞和平滑肌细胞表现为被激活。因此，本领域对用于治疗动脉粥样硬化症的新的可靠方法存在着公认的和持续的需要。用于治疗动脉粥样硬化症的现有方法是基于Thl和Th2途径似乎发挥关键作用的迹象。因此促进调节性免疫的免疫调节治疗可代表治疗和/或预防动脉粥样硬化症的有吸引力的工具。这可以由促进调节性T细胞(Treg)产生(例如Trl细胞、⑶4+⑶25+细胞或 Th3细胞)来实现。在这一点上，已经显示自然产生的⑶4(+)⑶25(+)调节性T细胞(其主动地保持对自身抗原和非自身抗原的免疫耐受性)在几种小鼠模型中是动脉粥样硬化的有力抑制剂。另一方面，最近的研究表明，B细胞缺陷增加小鼠模型中的动脉粥样硬化 (Major al.2002)。另一个最近的研究表明，对抗动脉粥样硬化的保护作用由B细胞赋予(Caligiuri等人，2002)。因此，现有技术暗示，耗竭B细胞不是治疗动脉粥样硬化的可行方法，与以下专利申请中公开的但非证明的相反US2004/202658、US2005/186206、 US2008/26064UW02007/053661 和 US2004/167619。

发明内容
本发明涉及用于治疗或预防动脉粥样硬化的B细胞耗竭剂。本发明也涉及用于治疗或预防动脉粥样硬化的药物组合物。发明详述本发明人已经证明，施用B细胞耗竭剂(S卩，抗-⑶20抗体)使得小鼠模型中的动脉粥样硬化斑块尺寸明显减小。B细胞依赖性反应与(自身)_免疫病症的发病机理有关且B细胞耗竭明显减少几种免疫介导的疾病的负担。然而，B细胞的活化到目前与抗动脉粥样硬化的保护作用相关(Caligiuri 等人，2002 ；Major 等人，2002 ；Binder 等人，2004 ；Miller 等人，2008)，暗示 B细胞耗竭疗法将提高心血管风险。本发明人在此出人意料地证明，利用CD20单克隆抗体耗竭成熟B细胞在动脉粥样硬化症的各种小鼠模型中诱导动脉粥样硬化的明显降低。这种治疗相对于IgG型抗-oxLDL 抗体保持了天然的和潜在保护性的抗氧化的低密度脂蛋白(oxLDL)IgM自身抗体的产生， 并显著减少致病性的T细胞活化。B细胞耗竭的动脉粥样硬化保护(atheroprotective)机制包括导致T细胞来源的Y -干扰素分泌减少和白介素-17产生增加的免疫反应转换，白介素-17的中和消除CD20抗体-介导的动脉粥样硬化保护作用。这些结果挑战了当前B细胞活化在动脉粥样化形成中起总体保护作用的模式，确定了基于B细胞调节的新的抗致动脉粥样策略，并提出目前用B细胞耗竭剂例如(CD20抗体)治疗其他免疫介导疾病的患者也可能受益于通过限制动脉粥样硬化损害的发生或炎症而获得的心血管风险降低。发明人还表明B细胞耗竭有益于心肌梗死。定义术语“B细胞”具有本领域的一般含义。B细胞是在体液免疫反应(与由T细胞支配的细胞介导的免疫反应相反)中起巨大作用的淋巴细胞。“B细胞耗竭剂”是耗竭或破坏患者体内的B细胞和/或干扰一种或多种B细胞功能的分子，例如通过降低或阻止由B细胞引起的体液反应。B细胞耗竭剂优选与B细胞表面标志物结合。B细胞耗竭剂优选能够耗竭其所治疗的患者体内的B细胞(即，减少循环的B细胞水平)。这种耗竭可以通过各种机制(例如抗体-依赖性的细胞介导的细胞毒性 (ADCC)和/或补体依赖性的细胞毒性(CDC)、B细胞增殖的抑制和/或B细胞死亡的诱导 (例如经由细胞凋亡))来完成。B细胞耗竭剂包括但不限于抗体、合成或天然序列的肽和小分子拮抗剂，其优选与B细胞表面标志物结合，任选地与细胞毒性剂偶联或融合。优选的 B细胞耗竭剂包括抗体，更优选B细胞耗竭抗体。在优选的实施方式中，B细胞耗竭剂不能耗竭浆细胞。在另一个优选的实施方式中，B细胞耗竭剂不能耗竭BlO细胞(或Breg细胞)。在另一个优选的实施方式中，B细胞耗竭剂不能耗竭Bl细胞。因此，在特别优选的实施方式中，B细胞耗竭剂不能耗竭浆细胞和BlO细胞。因此，在特别优选的实施方式中，B细胞耗竭剂不能耗竭浆细胞、BlO细胞和 Bl细胞。“补体依赖性的细胞毒性”或“⑶C”意指在补体存在下靶细胞的溶解。经典补体通道的激活从补体系统的第一组分结合至与其同种异体抗原结合的抗体开始。为评估补体活化，可进行例如在feizzano-Santoro等人(1997)中记载的CDC试验。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”意指其中结合到存在于特定细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞)上的Fc受体 (FcR)上的分泌抗体使得这些细胞毒性效应细胞能够与携带抗原的靶细胞特异性结合并随后杀死该靶细胞的细胞毒性形式。为评估所关注分子的ADCC活性，可以进行例如美国专利第5，500，362或5，821，337号所描述的体外ADCC试验。这里的“B细胞表面标志物”或“B细胞靶”或“B细胞抗原”是在B细胞表面表达的抗原，其可作为与其结合的B细胞耗竭剂的靶标。示例性的B细胞表面标志物包括但不限于 CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、 CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85 和 CD86 白细胞表面标志物。特别关注的B细胞表面标志物与哺乳动物的其他非B细胞组织相比优先在B细胞上表达，且可以在前体B细胞和成熟B细胞上表达。在一个实施方式中，该标志物是类似于⑶20 或CD19的一种标志物，其在从干细胞阶段直到最终分化成浆细胞前的时间点的整个谱系分化过程的B细胞上发现。“⑶20”抗原是从外周血液或淋巴器官的大于90%的B细胞表面上发现的35kDa 非糖基化的磷蛋白。CD20在早期前-B细胞发育期间表达，并保留到浆细胞分化。CD20存在于正常B细胞上以及恶性B细胞上。文献中⑶20的其他名称包括“B-淋巴细胞限制抗原”和“Bp;35，，。CD20 抗原例如记载在 Clark 等人 PNAS(USA)82 :1766(1985)中。根据本发明，“抗体”或“免疫球蛋白”具有相同的含义，并在本发明中同等地使用。 本文使用的术语“抗体”意指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含免疫特异性地结合抗原的抗原结合位点的分子。如此，术语抗体不仅包括整个抗体分子，而且包括抗体片段以及抗体和抗体片段的变体(包括衍生物)。在天然抗体中，两条重链通过二硫键彼此连接，且各重链通过二硫键与轻链连接。有两种类型的轻链，λ (1)和K (k)。有五类主要的重链(或同种型)(其决定抗体分子的功能活性)IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。 各链包含明显不同的序列域。轻链包含两个域，可变域(VL)和恒定域(CL)。重链包含四个域，一个可变域(VH)和三个恒定域(CHI、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH) 的可变区决定与抗原的结合识别和特异性。轻链和重链的恒定区(CL和CH)的域赋予重要的生物学性质，例如抗体链结合、分泌、经胎盘活动性(trans-placental mobility)、补体结合以及结合至Fc受体(FcR)。Fv片段是免疫球蛋白的Fab片段的N-末端部分并由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性在于抗体结合位点(antibody combining site)和抗原决定簇之间的结构互补性。抗体结合位点由主要来自超可变或互补性决定区 (CDR)的残基构成。偶尔，来自非超可变或框架区(FR)的残基影响整体域结构并因此影响结合位点。互补性决定区或CDR意指共同限定原始免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲合力和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个CDR，分别称为 L-CDRl、L-CDR2、L-CDR3 和 H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。因此，抗原结合位点包含六个 CDR，包含来自各个重链和轻链V区的CDR组。框架区(FR)意指插置在CDR之间的氨基酸序列。术语“嵌合抗体”意指包含本发明抗体的VH域和VL域以及人抗体的CH域和CL域的抗体。根据本发明，术语“人源化抗体”意指具有来自人抗体的可变区框架和恒定区但是保留本发明抗体的CDR的抗体。术语“Fab”表示具有约50，000的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其中通过在用蛋白酶(木瓜蛋白酶)处理IgG获得的片段中H链N-末端侧的大约一半和整个L链通
过二硫键结合在一起。术语“F(ab' )2”意指在用蛋白酶(胃蛋白酶)处理IgG获得的片段中具有约 100, 000的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其比经由铰链区的二硫键结合的Fab略大。术语“Fab' ”意指具有约50，000的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其通过切割F(ab' )2的铰链区的二硫键获得。单链Fv(“SCFv”)多肽是共价连接的VH: :VL杂二聚体，其通常由包括由通过编码肽的接头连接的VH和VL编码基因的基因融合表达。“dsFv”是由二硫键稳定的VH: VL杂二聚体。二价和多价抗体片段可以通过单价scFv的结合而自发形成或可以通过由肽接头偶联单价scFv而产生(例如二价sc (Fv) 2)。术语“双特异性抗体”意指带有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含与相同的多肽链(VH-VL)中的轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH)。通过使用太短以致不能在相同链的两个域之间配对的接头，所述域被迫与另一个链的互补域配对并产生两个抗原结合位点。“B细胞耗竭抗体”定义为与B细胞表面上的B细胞表面标志物结合并且当其与所述细胞表面标志物结合时介导B细胞的破坏或耗竭的那些抗体。该术语包括抗体片段。这种抗体包括但不限于，抗-⑶20、抗-⑶19、抗-⑶22、抗-⑶21、抗-⑶23、抗-⑶观、抗-⑶37、 抗-⑶40、抗-⑶52抗体。抗-⑶20抗体的例子是RITUXAN (利妥昔单抗)。B细胞耗竭抗体也包括经由其他机制破坏B细胞的抗体。例如，它们包括通过结合至B细胞表面并投送致死剂量的辐射而促进B细胞的破坏的放射标记的抗体。它们包括131 I-Lym-I (抗-HLA-D)、 131 I-托西莫单抗(BEXXAR )、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan) (Y-90, In-IllZEVALIN )和90Y-依帕珠单抗。在本发明的情况中，本文使用的术语“治疗”或“疗法”意指逆转、减轻或抑制该术语所应用的病症或状态的进展或者这种疾病或病症的一种或多种症状。“治疗有效量”意指给予受试者治疗益处所需的活性剂的最小量。例如，对于患者的“治疗有效量”是诱导、改善或另外地引起病理症状、疾病发展或与病症相关或抵抗疾病恶化的生理状态的改善的量。以其广义理解，术语“预防”或“防止”是指在还没有被诊断为患有疾病或病症的受试者中防止该疾病或病症的发生。术语“患者”是指患有动脉粥样硬化或易患动脉粥样硬化的任何受试者(优选为人)。“药用的”或“药学上可接受的”意指当适当地施用于哺乳动物(特别是人)时不产生有害、过敏性或其他不良反应的分子实体和组合物。药学可接受的载体或赋形剂意指任何类型的非毒性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂辅料。治疗方法本发明涉及用于在需要的患者中预防或治疗动脉粥样硬化的方法，包括耗竭所述患者的B细胞群的步骤。更具体地，本发明涉及用于在需要的患者中预防或治疗动脉粥样硬化的方法，包括向所述患者施用B细胞耗竭剂的步骤。根据本发明的方法可以提供给已经诊断为患有以下冠状动脉病症之一的患者-无症状冠状动脉冠心病，伴有无症状心肌缺血或没有缺血；-不伴有心肌坏死的慢性缺血性病症，例如稳定型或劳力型心绞痛；-不伴有心肌坏死的急性缺血性病症，例如不稳定型心绞痛；-伴有心肌坏死的缺血性疾病，例如ST段升高型心肌梗死或非ST段升高型心肌梗死。事实上，所述病状是动脉粥样硬化并发症，并因此被认为是动脉粥样硬化的指征。本发明的另一方面涉及用于在需要的患者中预防或治疗血管或冠状动脉病症的方法，包括耗竭所述患者的B细胞群的步骤。更具体地，本发明涉及用于预防或治疗血管或冠状动脉病症的方法，包括向需要的患者施用B细胞耗竭剂的步骤。在具体的实施方式中，所述冠状动脉病症或血管病症选自动脉粥样硬化性血管病症，例如动脉瘤或中风、无症状冠状动脉冠心病、不伴有心肌坏死的慢性缺血性病症，例如稳定型或劳力型心绞痛；不伴有心肌坏死的急性缺血性病症，例如不稳定型心绞痛；和缺血性病症例如心肌梗死。在具体的实施方式中，本发明涉及用于在需要的患者中预防或治疗心肌梗死的方法，包括耗竭所述患者的B细胞群的步骤。更具体地，本发明涉及用于预防或治疗心肌梗死的方法，包括向需要的患者施用B 细胞耗竭剂的步骤。在另一个具体的实施方式中，本发明涉及用于在需要的患者中预防或治疗动脉瘤的方法，包括耗竭所述患者的B细胞群的步骤。更具体地，本发明涉及用于预防或治疗动脉瘤的方法，包括向需要的患者施用B细胞耗竭剂的步骤。在具体实施方式
中，B细胞耗竭剂可以是B细胞耗竭抗体。针对B细胞表面标志物的抗体可以根据已知方法通过将适当的抗原或抗原决定基施用于选自例如特别是猪、母牛、马、兔子、山羊、绵羊和小鼠的宿主动物产生。可以使用本领域已知的各种助剂以加强抗体的产生。虽然用于实施本发明的抗体可以是多克隆的， 但优选是单克隆抗体。可使用用于通过培养中的连续细胞系产生抗体分子的任何技术制备并分离单克隆抗体。用于产生和分离的技术包括但不限于杂交瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术和EBV-杂交瘤技术。或者，描述用于产生单链抗体的技术(例如参见美国专利第4，946，778号)可适用于产生抗B细胞表面标志物的单链抗体。根据本发明的有用抗体也包括抗体片段，包括但不限于F(ab' )2片段，其可通过胃蛋白酶消化完整抗体分子而产生；和Fab片段，其可通过还原F(ab' )2片段的二硫键而产生。或者，可以构建Fab和/或scFv表达文库以允许快速识别具有所需的对B细胞表面标志物的特异性的片段。也可以根据已知技术制备人源化抗体和由其得到的抗体片段。“人源化抗体”是包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的非人(例如，啮齿类动物)嵌合抗体的形式。对于其大部而言，人化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)(例如小鼠、大鼠、兔子或非人类灵长类动物)的具有所需的特异性、亲合力和能力的高变区残基所替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。而且，人源化抗体可包含受体抗体或供体抗体中不存在的残基。 进行这些修饰以进一步改进抗体性能。通常，人源化抗体将包括至少一个和通常两个可变域的基本上全部，其中全部或基本上全部的高变环(hypervariable loop)对应于非人免疫球蛋白的那些部分，且全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列的那些部分。人源化抗体任选地还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常是人免疫球蛋白恒定区。用于制备人源化抗体的方法例如由Winter (美国专利第5，225，539号)和Boss (Celltech，美国专利第4，816，397号)描述。然后在如上所述产生针对B细胞表面标志物的抗体后，本领域技术人员可以容易地选择耗竭B细胞的那些抗体，例如通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、B细胞增殖的抑制或B细胞死亡的诱导(例如经由细胞凋亡)而耗竭 B细胞的那些抗体。在具体的实施方式中，B细胞耗竭抗体可以是与细胞毒性剂或生长抑制剂偶联的针对B细胞表面标志物的抗体。因此本发明预期使用包含与细胞毒性剂或生长抑制剂偶联的抗B细胞表面标志物抗体的免疫偶联物。本文使用的“生长抑制剂”意指在体外或体内抑制细胞(特别是B细胞)生长的化合物或组合物。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期进程的试剂，例如诱导Gl停滞和M 期停滞的试剂。经典的M期阻断剂包括长春花类(长春新碱和长春花碱)、紫杉烷类和拓扑异构酶II抑制剂如亚德利亚霉素、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博莱霉素。抑制Gl的那些试剂也扩展到S-期停滞，例如，DNA烷化剂如它莫西芬、强的松、达卡巴嗪、氮芥、顺钼、 氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶。
本文使用的术语“细胞毒性剂”意指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Rel86、Rel88、Sml53、 Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化疗剂，例如氨甲喋呤、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(长春新碱、长春花碱、依托泊苷)、亚德利亚霉素、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、 柔红霉素或其他嵌入剂、酶及其片段如核溶解酶(nucleolytic enzyme)、抗生素和毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体，例如白树毒素、蓖麻毒素、皂草素和各种以下公开的抗肿瘤或抗癌剂。其他的细胞毒性剂描述如下。 杀肿瘤剂(tumoricidal agent)引起肿瘤细胞的破坏。可使用多种双官能蛋白偶联剂使本发明抗体与细胞毒性剂或生长抑制剂偶联， 所述双官能蛋白偶联剂包括但不限于O-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、 (N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、亚氨基硫烷(iminothiolane) (IT)、酰亚胺酯(imidoester)的双官能衍生物(例如二甲基己二酰亚胺盐酸盐(dimethyl adipimidate HC1))、活性酯类(例如双琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛类(例如戊二醛)、双叠氮化合物(例如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮盐衍生物(例如双-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸盐(例如甲苯2，6- 二异氰酸酯(tolyene 2,6-diisocyanate))和双-活性氟化合物(例如1，5_ 二氟_2，4_ 二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素可以如Vitetta等人(1987)所描述的制备。碳标记的1_异硫氰酸苄基甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸结合至抗体的典型螯合剂(W0 94/11026)。或者，含有抗体和细胞毒性剂或生长抑制剂的融合蛋白可通过重组技术或肽合成制备。DNA的长度可包含或者彼此相邻或者由编码连接肽的区域分开的编码偶联物的两个部分的各自区域，所述连接肽不破坏偶联物的所需性质。在一个具体实施方式
中，优选的B细胞表面标志物是⑶20。因此，在本发明的优选实施方式中，B细胞耗竭剂是抗-CD20抗体。本发明预期的耗竭抗体的例子包括结合⑶20抗原的抗体“C2B8”，其是“利妥昔单抗”(“RITUXAN ”)(美国专利第5，736，137号，以引用方式明确地结合于此)； 钇-[90]-标记的2138鼠抗体，命名为“Y2B8”(美国专利第5，736，137号，以引用方式明确地结合于此)；鼠IgG2a “131”，任选地以1311标记以产生“1311-B1”抗体(BEXXARTM ) (美国专利第5，595，721号，以引用方式明确地结合于此)；鼠单克隆抗体“1F5” (Press等 ABlood 69(2) :584-591(1987))；“嵌合 2H7”抗体(美国专利第 5，677，180 号，以引用方式明确地结合于此)；以及可从hternational Leukocyte Typing Workshop获得的单克隆抗体 L27、G28-2、93-1133、B-Cl 或 NU-B2 (Valentine 等人，In =Leukocyte Typing III (Μ cMichael, Ed. ，p. 440, Oxford University Press(1987))。此处的术语“利妥昔单抗”或“RITUXAN ”意指针对⑶20抗原且在美国专利第 5，736，137号中称为“C2B8”的遗传工程化的嵌合鼠/人单克隆抗体，该专利以引用方式明确地结合于此。该抗体是含有鼠轻链和重链可变区序列和人恒定区序列的IgG，κ免疫球蛋白。利妥昔单抗对于CD20抗原具有大约8. OnM的结合亲合力。它是商业可得的，例如可购自 Genentech (South San Francisco，CA)。本发明的B细胞耗竭剂可以以如下定义的药物组合物的形式施用。
优选地，所述B细胞耗竭剂以治疗有效量施用。“治疗有效量”意指以适用于任何医学治疗的合理的利益/风险比治疗或预防动脉粥样硬化的B细胞耗竭剂的足够量。可以理解，本发明的化合物和组合物的总的定期(perodically)使用将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重性、所使用的具体化合物的活性、所使用的具体组合物、患者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；给药时间、给药途径、和所使用的具体化合物的排泄速度；治疗持续时间；与使用的特定多肽联合使用或同时使用的药物；以及医学领域中众所周知的类似因素。例如，本领域技术人员公知，以低于达到预期治疗效果所需要的剂量水平的化合物起始剂量水平开始，并逐渐增加剂量直至达到预期效果。然而，产物的每日剂量可以在每个成人每天0. 01到IOOOmg的宽范围内变化。优选地，组合物包含0. 01、 0. 05,0. 1,0. 5,1. 0,2. 5,5. 0,10. 0,15. 0,25. 0,50. 0、100、250 和 500mg 的活性成分以用于对需要治疗的患者进行剂量的症状调整。药物通常含有约0. Olmg到约500mg的活性成分， 优选Img到约IOOmg的活性成分。药物的有效量通常以每天0. 0002mg/kg体重到约20mg/ kg体重的剂量水平提供，特别是每天约0. OOlmg/kg体重到7mg/kg。药物组合物本发明的B细胞耗竭剂可以与药学可接受的赋形剂和任选的缓释基质(例如生物可降解的聚合物)组合以形成治疗组合物。在本发明的药物组合物中，单独的或与另一种活性成分组合的活性成分可以作为与常规药物载体的混合物以单位给药形式施用于动物和人类。适合的单位给药形式包括口服途径形式(例如片剂、胶囊、粉剂、颗粒和口服悬浮液或溶液)、舌下和口腔施用形式、气雾剂、植入物、皮下施用形式、透皮施用形式、局部施用形式、腹膜内施用形式、肌内施用形式、静脉内施用形式、皮下施用形式、经皮施用形式、鞘内施用形式和鼻内施用形式及直肠施用形式。优选地，该药物组合物含有用于能够注射的制剂的药学上可接受的载体。它们可以特别地是等渗的、无菌的盐溶液(磷酸二氢钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等，或这些盐的混合物)，或是干的(特别是冻干的)组合物，其在视情况添加无菌水或生理盐水后使得构成可注射溶液。适于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散液；含有芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂；和用于现场制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的和必须是达到易于注射(syringability)的程度的流体。它在制备和存储条件下必须稳定，且必须保持对抗微生物(例如细菌和真菌)的污染活动。含有作为游离碱或药学可接受盐的本发明化合物的溶液可以在水中适当地与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)混合而制备。分散液也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和在油中制备。在存储和使用的通常条件下，这些制剂包含防腐剂以阻止微生物的生长。本发明的B细胞耗竭剂可以配制成中性或盐形式的组合物。药学可接受的盐包括酸加成盐(以蛋白质的游离氨基形成)，且其与无机酸(例如盐酸或磷酸)或如醋酸、草酸、 酒石酸、扁桃酸等的有机酸形成。与游离羧基形成的盐也可以源自于无机碱(例如钠、钾、 铵、钙或铁氢氧化物和如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。
载体也可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物和植物油。可以维持适当的流动性，例如通过利用涂层 (例如卵磷脂)，在分散体的情形通过保持所需的颗粒大小以及通过使用表面活性剂。预防微生物的活动可以通过各种抗菌和抗真菌剂(例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延迟吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。无菌注射液通过将在适当溶剂中的所需量的活性多肽与如所需的上面列举的多种其他组分混合，随后过滤除菌来制备。通常，分散体通过将各种灭菌的活性成分加入包含基本分散介质和所需的上述其他组分的无菌载体中来制备。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冻干技术，其由预先无菌-过滤的溶液产生活性成分加上任何附加的所需成分的粉末。在配制后，溶液将以与剂型相容的方式并以使得治疗有效的量施用。该制剂方便地以多种剂型施用，例如上述的注射液类型，但也可以使用药物释放胶囊等。对于水性溶液的肠胃外给药，例如，，溶液应该适宜地缓冲(如有必要)，且液体稀释液首先用足够的盐水或葡萄糖赋予等渗性。这些特定的水性溶液特别适于静脉内、肌内、 皮下和腹膜内施用。关于这一点，可以使用的无菌水性介质对于本领域技术人员来说在参照本发明公开的内容的情况下是已知的。例如，一个剂量可以溶解在Iml的等渗NaCl溶液中，并添加到IOOOml的皮下输注流体中或在建议的输注位点注射。根据待治疗受试者的状况，将有必要进行剂量的一些变化。无论如何，负责给药的人将决定个体受试者的适合剂量。本发明的B细胞耗竭剂可配制在治疗混合物中，从而每剂量大致含有约0. 0001到 1. 0毫克，或约0. 001到0. 1毫克，或约0. 1到1. 0或甚至约10毫克。也可施用多个剂量。除配制成肠胃外施用(例如静脉内或肌内注射)的本发明化合物之外，其他药学可接受的形式包括例如片剂或其他用于口服施用的固体、脂质体制剂、定时释放胶囊和目前使用的任何其他形式。参照以下附图和实施例进一步说明本发明。


图1 抗-鼠⑶20处理3个月后血液中的B细胞耗竭，所述处理为每3周一次腹膜内QOOyg)注射。图2 抗-⑶20处理3个月后脾中的B细胞耗竭，所述处理为每3周一次腹膜内 (200 μ g)注射。图2A和2B表示在2个不同实验中的B细胞耗竭。图3 抗-⑶20处理3个月后骨髓中的B细胞耗竭(B220高)，所述处理为每3周一次腹膜内QOO μ g)注射。图4 :B细胞耗竭诱导脾⑶4 T细胞的⑶69表达减少，表明⑶4 T细胞失活。图5 =B细胞耗竭诱导脾⑶4 T细胞的⑶44高表达的减少，表明⑶4 T细胞失活。图6 :B细胞耗竭诱导脾⑶4 T细胞的体内BrdU掺入减少，表明体内⑶4T细胞增殖的减少。图7 在纯化的CDllc+树突细胞的存在下在体外用抗-CD3抗体刺激的纯化脾⑶4+T细胞的细胞因子产生。图8 使用流式细胞计评估嗜中性粒细胞计数(Ly6G+CDllb+)和单核细胞计数 (⑶llb+/Ly6G-/Ly6C高、低或neg)(第一组实验)。发明人发现抗-⑶20处理3个月后嗜中性粒细胞和单核细胞计数增加。图9 使用流式细胞计评估嗜中性粒细胞计数(Ly6G+CDllb+)和单核细胞计数 (⑶llb+/Ly6G-/Ly6C高、低或neg)(第二组实验)。发明人发现抗-⑶20处理3个月后嗜中性粒细胞和单核细胞计数增加。图10 处理3个月后组间的体重和血浆胆固醇水平相似。图11 在6或12周的处理后用抗-⑶20抗体(MB20-11)处理的小鼠组中主动脉窦损伤大小明显减小。图12 ⑶20mAb ( α -⑶20)处理耗竭B细胞并减少动脉粥样硬化的发生。图A到 D显示在使用正常饮料饮食(chow diet)(⑶)或西方饮食(western diet) (WD)饲养的 Apoe+或Ldlr+小鼠4个不同实验中经过α-⑶20治疗后动脉粥样硬化发生的减少。显示了对于各实验设置，油红0染色的主动脉窦的代表性显微照片，以及内膜病灶大小的量化。 棒指示中值。图13 ⑶20mAb ( α -⑶20)处理减少胸主动脉中动脉粥样硬化的发生。用西方饮食 (WD)饲养12周并用α-⑶20或对照抗体处理的Apoe+小鼠的胸主动脉中油红0染色程度的定量分析。数据(平均值士 s. e. m.)表示每组9只(对照)到10只小鼠(α -⑶20)。图14 心肌梗死后的B细胞耗竭。显示量化的心脏功能。
具体实施例方式实施例1 :Β细胞耗竭和动脉粥样硬化结果和讨论动脉粥样硬化的发生与B细胞活化的迹象相关，尤其表现为天然IgM型和适应性 IgG型抗氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)(自身)抗体的产生增加(Caligiuri等人，2002 ；Shaw 等人，2000)。然而，与其他免疫介导的疾病(即类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮)相反，B 细胞在动脉粥样硬化中被赋予保护作用(Caligiuri等人，2002 ；Major等人，2002 ；Binder 等人，2004 ；Miller等人，2008)。虽然IgG型抗-οχ-LDL抗体显示与血管风险的可变相关性，IgM型抗-ox-LDL抗体的循环水平更经常地与人血管风险降低关联(Karvonen等人，
2003；Tsimikas等人，2007)。在小鼠中，IL-5-和IL-33-介导的动脉粥样硬化保护效应间接地与特定的Bl细胞激活和天然IgM型抗-oxLDL抗体的产生增加相关(Binder CJ等人，
2004；Miller AM等人，2005)。另一方面，脾切除术或μ MT-缺陷(B细胞缺陷)骨髓转移到致死辐射的动脉粥样硬化易感小鼠中导致IgG或总抗-oxLDL抗体产生的极大减少，且与损害发展的加速有关。这些研究导致目前的认识模式总体B细胞活化是动脉粥样硬化保护性的。然而，出乎意料的是，成熟B细胞耗竭是否如先前研究所预期的那样加速免疫活性(immimo-competent)小鼠中的动脉粥样硬化损害的发展仍然尚待考察。考虑到在患有严重的类风湿性关节炎或者系统性红斑狼疮的患者(其特别地处于心血管疾病的高风险中)中临床使用B细胞耗竭的CD20-靶向的免疫疗法可能产生的心血管并发症的潜在重要风险，这是非常重要的问题。为了直接评估B细胞在动脉粥样硬化中的作用，发明人检查了在有或者没有B细胞耗竭的情况的小鼠中的损害发展。他们首先使用高脂肪西方饮食饲养的Apoe+小鼠 (先前证明与明显B细胞活化和抗-OX-LDL抗体的高产生相关，并且预先用于评估B细胞在动脉粥样硬化中的保护作用的模型)。为耗竭B细胞，用预先验证的小鼠单克隆CD20抗体(Uchida 等人，Int Immunol，2004 ;Uchida 等人，J Exp Med, 2004)每 3 周处理小鼠 6 或 12周的时间。对照小鼠接受对照单克隆抗体(mAb)。如所预期的，用CD20 mAb处理导致血液(图1)、脾(图2)、腹膜和骨髓中成熟B细胞数目的持续的和重度的减少。在所有研究位点的B220 sIgM+细胞严重耗竭(92%到100%)。脾B220 IgM+细胞也显示明显减少 ( 80%)，但是如先前所观察到的，未成熟骨髓Β220 (IgM+)细胞(图3)对⑶20mAb_介导的耗竭较不敏感。用⑶20mAb处理6周不影响血浆胆固醇水平(对照组和⑶20mAb-处理组中分别是6. 4士0. 9对6. 3士0. 8g/L，P = O. 88)。但是意外地导致动脉粥样硬化损害发展的明显减少而非加速(图12A)。发明人随后分析了在高脂饮食情况下处理12周的 Apoe+小鼠的实验，且仍然发现在2个不同血管位点(图12B和图13)动脉粥样硬化的明显减少，尽管血浆胆固醇水平类似(对照IgG组和抗-⑶20-处理组中分别为18. 7+1. 1对 17. 9士 1. 0g/L，P = 0. 68)。为了排除⑶20mAb处理的动脉粥样硬化保护作用是由于使用响应于非常高的脂质超负荷而产生过度炎症的小鼠模型的可能性，考察了以正常饮料饮食饲养的Apoe+小鼠中B细胞耗竭的效应。用⑶20抗体处理这些小鼠12周也导致损害发展的明显减少(图12C)，尽管血浆胆固醇水平类似(对照IgG组和⑶20mAb-处理组分别是 5. 5士0. 6对5. 7士0. 8g/L，P = O. 96)。Apoe+小鼠中升高的血浆胆固醇水平大部分是极低密度脂蛋白(VLDL)亚型，而LDL升高是人中的主要动脉粥样硬化风险因子。因此，发明人考察了 LDL受体缺陷(LDLr+)小鼠模型中B细胞耗竭的效应。再一次，用⑶20mAb处理 LDLrv-小鼠导致显著的B细胞耗竭且导致动脉粥样硬化的明显减少(图12D)。总的说来，这些研究在三种动脉粥样硬化的小鼠模型中提供了 B细胞的意外的致动脉粥样硬化作用的确实证据。接着发明人研究了引起B细胞耗竭后动脉粥样硬化保护的潜在机制。他们发现用 ⑶20耗竭抗体处理导致在6周和12周治疗中IgG型抗-oxLDL抗体的重度减少，这和血液、 脾和骨髓中的B220高细胞的大量耗竭一致。可以认为，抗-oxLDL IgG减少可能限制了免疫复合物形成对动脉粥样硬化的潜在有害影响。然而，在其他的研究中且特别是在脾切除术后，观察到与动脉粥样硬化加速而非减少相关的抗-oxLDL IgG水平的大量减少。因此， 在没有直接针对IgG型抗-oxLDL抗体对动脉粥样硬化的作用的研究的情况下，CD20mAb处理后抗-oxLDL IgG水平的变化并不能认为引起损害减少。抗铜氧化的或丙二醛修饰的LDL 的IgM型抗体的水平也在CD20-靶向治疗的6或12周后降低。IgM型抗体具有动脉粥样硬化保护性能，且CD20mAb治疗后IgM型抗体的减少不能说明动脉粥样硬化保护的原因，而是相反，可能阻碍动脉粥样硬化的减少。然而，有意思的是可注意到与IgG型抗体相比，IgM型抗-oxLDL和T15id+IgM抗体的减少要低得多，这可能保持了动脉粥样硬化保护途径。IgM 型抗体支配Apoe+小鼠中对oxLDL的体液响应，且甚至在幼小时(在该研究中CD20mAb处理开始之前)增加，这可以至少部分地解释⑶20免疫治疗(不急剧影响预存在抗体效价的治疗)后显著IgM水平的保持。IgM保持也可能与使用⑶20mAb显著耗竭腹膜Bl细胞所需的延迟有关。接着发明人考察了动脉粥样硬化损害组成以获得对动脉粥样硬化保护机制的更深入的了解。有趣的是，CD20mAb处理与病灶内T淋巴细胞积聚的显著和特异性减少有关， 表明B细胞在驱动T细胞-依赖性病灶炎症中的作用。如所预期的，在损害形成的这一阶段，斑块内或外膜层内几乎没有检测到B细胞，不论是否是处理组，表明通过⑶20mAb疗法调节病灶T细胞积聚很可能是由于全身B细胞耗竭后T细胞功能的系统性调节的结果而发生。为了证实这种假设，发明人考察了 T细胞活化和增殖。有趣的是，发明人果然发现，用高脂饮食饲养6周和12周用⑶20抗体处理的小鼠与对照组相比源自脾的⑶4+T细胞上⑶69 和⑶44s表达明显减少，表明T细胞活化减少。B细胞耗竭也导致效应⑶4+⑶25-T细胞的体内BrdU染色的明显减少，表明增殖减少。CD20mAb-处理小鼠中T细胞活化减少也与在 ⑶Ilc+树突细胞上⑶40表达的明显减少一致。因此，使用⑶20抗体的B细胞耗竭的主要后果是体内T细胞活化的明显减少，这可能潜在地说明其动脉粥样硬化保护效应的原因。T细胞来源的细胞因子明显改变损害发展。因此，发明人考察了 B细胞耗竭对纯化 T细胞的细胞因子产生的影响。发明人发现，与对照相比，从CD20mAb处理小鼠中回收的纯化T细胞的致动脉粥样化IFN-γ明显减少。值得注意的是，这与⑶20mAb处理动物中针对 T细胞源的IL-17A产生明显增加的免疫反应的偏离有关。发明人的实验室中进行的最近研究确认了在动脉粥样硬化中对IL-17A产生的意外的调节和保护作用。IL-17A也显示调节 Thl极化。为了考察CD20mAb-诱导的T细胞细胞因子分布的变化(Thl减少和IL17增加) 是否可以引起CD20mAb-依赖性动脉粥样硬化保护作用，在对照或者抗-IL17A中和抗体的存在下将CD20mAb施用于Apoe+小鼠(高脂饮食饲养6周)。IL17中和导致动脉粥样硬化的主动脉中IFN-Y产生增加，且完全消除了 CD20mAb治疗的动脉粥样硬化保护效应，尽管循环胆固醇水平类似和抗-oxLDL抗体水平没有明显变化。总的看来，这些结果确认了迄今为止未意料到的B细胞通过调节T细胞活化和细胞因子产生驱动动脉粥样硬化发生的作用。当前的结果看起来与先前显示小鼠中μ MT缺陷和脾切除术加速动脉粥样硬化的研究相反。然而，这些研究没有直接说明成熟B细胞耗竭对免疫活性小鼠中的动脉粥样硬化的作用。几种其他的伴随免疫细胞机能障碍可能造成 μ MT缺陷动物中的损害发展增强。而且，报道的脾切除小鼠用纯化B细胞重建后动脉粥样硬化加速的限制可能被B细胞重建小鼠中血浆胆固醇水平的明显减少混淆，且不能选择性归因于B细胞，因为T细胞重建也导致动脉粥样硬化保护作用。最后，应该注意到，虽然在目前研究中B细胞耗竭明显限制损害发展，但B细胞的特异亚型在驱动或控制动脉粥样硬化中的作用值得进一步调查。更具体地，重要的是说明调节性的与非调节性的B细胞在这些过程中的各自的作用。总之，发明人提供了成熟B细胞耗竭减少小鼠中动脉粥样硬化发展的强有力证据。这些结果对B细胞总体功能是动脉粥样硬化保护性的模式形成挑战，并且显示B细胞在动脉粥样硬化中的主要作用是驱动朝向提高致动脉粥样硬化性Thl免疫反应和限制动脉粥样硬化保护性IL-17产生的T细胞活化。虽然受限的血管B细胞浸润可以在动脉粥样硬化早期检测到，但B细胞积聚在小鼠和人中先进的动脉粥样硬化冠状动脉病灶和动脉粥样硬化性腹主动脉瘤内及其周围随时间显著增加，且甚至在与其他免疫介导的疾病有关的血管炎症中更突出。通过耗竭或者免疫调节抑制过度B细胞活化可显著地限制血管炎症和动脉粥样硬化损害发展。方法动物。所有小鼠为基于C57B1/6背景。Apoe+小鼠是10周大的雄性，以正常饮料饮食饲养12周或以西方饮食(20%脂肪、0. 15%胆固醇、0%胆酸盐)饲养6或12周。 Ldlr-7-小鼠是10周大的雄性，以西方饮食饲养6周。在10周大时，用预先验证的小鼠单克隆 CD20 抗体(Uchida 等人，Int Immunol，2004 ;Uchida 等人，J Exp Med, 2004)或对照 IgG 腹膜内(i. P.)处理小鼠6或12周(每三周200 μ g)。在一些实验中，小鼠接受纯化的中和抗-IL-17A特异性抗体QOO μ g/小鼠，每周两次)(Uyttenhove等人，2006和2007 ；Wang等人，2009)或对照IgG的i. p.注射6周。根据法国兽医指南和由欧洲共同体为实验动物使用制定的规定(L358-86/609EEC)进行实验，并经发明人的机构hserm(国家医药研究院) 批准。动脉粥样硬化损害的程度和组成。如先前描述的进行损害大小和组成的量化 (Taleb 等人，2007)。细胞回收和纯化、培养、增殖和细胞因子分析。如先前详细描述的(Taleb等人， 2007)纯化和处理⑶Ilc+和⑶4+细胞用于细胞增殖试验和细胞因子产生。使用特异性 ELISA (BD Biosciences 和 R&D Systems)测量上清液中的 IL-17 和 IFN-γ 的产生。流式细胞法。APC-偶联的抗-CD3 ε (145-2C11)、FITC-或PE_Cy7-偶联的抗-CD4 (RM4-5)、APC-偶联的抗-CD25 (PC61. 5)、PE-偶联的抗-CD69 (HI. 2F3)、APC-偶联的抗-IgM (11/41)、FITC-偶联的抗-CD86 (GLl)、PE-偶联的抗-CD80 (16-10A1)、 APC-偶联的抗-CD40 (1C10)、PE-Cy7-偶联的抗-CDllc (N418)、PE-Cy7-偶联的抗-CDllb (M1/70)和 PE-偶联的抗-CD45R(B220) (RA3-6B2)来自 eBioscience。FITC-偶联的抗-⑶5 (53-7. 3)、生物素-偶联的抗-⑶44继之以APC-偶联的抗生物素蛋白链菌素、 APC-Cy7-偶联的抗-CD45R(B220) (RA3-6B2)、APC-偶联的抗-IFN y (XMG1. 2)和 PE-偶联的抗-IL17A(TC11-18H10)来自BD Biosciences。对于血液染色，使用BD FACS细胞溶解液(BD Biosciences)溶解红细胞。对于胞内细胞因子染色，根据厂商的说明用白细胞活化混合物(BD Biosciences)体外刺激淋巴细胞4小时。在渗透之前用细胞内染色试剂盒 (eBioscience)进行表面染色。前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)用于选通(gate)活细胞，从而排除总脾细胞、淋巴结、骨髓和腹膜群中的红血细胞、碎片和细胞集合体。使用BD CantoII 或 BD LSRII 流式细胞仪(Becton Dickinson)分析细胞。溴脱氧尿苷(BrdU)标记和细胞分析。如先前描述的(Fisson等人，2007)进行 BrdU标记。在处死前一周在异氟烷麻醉下将每天1. 2mg的BrdU(Sigma-Aldrich)递送 7天的小型渗透泵(ALZET 1007D ；Charles River Laboratories)移植到小鼠皮下。用 PE-Cy7-偶联的抗-CD4(RM4-5)和APC-偶联的抗_CD25(PC61. 5)染色淋巴结细胞和脾细胞。按照厂商的说明用FITC BrdU Flow试剂盒(BD Pharmingen)进行BrdU检测。使用BD CantoII 或 BD LSRII 流式细胞仪(Becton Dickinson)分析细胞。定量实时聚合酶链式反应。在ABI prizm 7700上进行定量实时PCR，一式三次。 GAPDH的CT用于归一化基因表达。对于以下蛋白质进行定量实时PCR:IL10、TGF-β和 IFN- γ ο循环抗体的测定。对于血浆中给定抗原的特异性抗体效价如先前描述的(Friguet等人，1985 ；Binder等人，2003 ；Chou等人，2009)的通过化学发光ELISA测定。统计分析。数值用平均数生s. e.m来表示。使用非参数Marm-Whitney或 Kruskal-Wallis检验考查数值间差异，且P < 0. 05被认为是显著的。实施例2 =B细胞耗竭与心肌梗死模型中的缩短分数增加有关。通过结扎冠状动脉左前降支在8周大的雄性C57BL6J小鼠中引发心肌梗死。心肌缺血性损伤后一小时，通过给小鼠腹膜内注射小鼠单克隆CD20抗体(160yg)处理小鼠或者不处理。发明人证明，B细胞渗入梗死区域。在MI后的第1、3、7和14天通过流式细胞法分析血液B细胞水平。⑶20抗体处理后，IgM+B220+-B细胞的百分比明显降低。在MI后第14天处死小鼠，并由超声波心动描记术测量心脏功能(图14)。这种处理与缩短分数的增加有关，表明所述处理可能对治疗心肌梗死有益。实施例3 腹主动脉瘤中B细胞耗竭的影响。首先，发明人使用验证的动脉动脉瘤形成小鼠模型。当用血管紧张素(Ang) II输注观天时，以正常饮料饮食或高脂饮食饲养的Apoe-/-小鼠形成腹主动脉动脉瘤 (Daugherty A等人，2000)。该模型在动脉瘤血管内或周围再现了炎性细胞(包括B细胞) 的积聚。为了获得更精确的结果，发明人也可以使用专利申请WO 2009056419中描述的新的具有高动脉瘤破裂发生率的主动脉动脉瘤模型。该模型使用Apoe+/+或Apoe-/-小鼠， 且结合AngII输注和TGF-β活性的中和，与人类疾病高度相关的两种因子。在该模型中， TGF-β活性的系统中和导致这些小鼠对AngII-诱导的主动脉动脉瘤易感性的意外的和明显的增加(92. 5%)，并导致因主动脉夹层形成(aortic dissection)和破裂的高死亡率水平(65% )。使用抗-CD20mAb的B细胞耗竭在动脉瘤诱导时开始，以评估其对动脉瘤发生的影响。动脉瘤诱导后一小时进行第一次200 μ g i.p.的输注，二周后进行第二次输注。四周后处死小鼠。评估腹主动脉瘤和免疫反应，进行回波描记术分析。参考文献本申请中，各种参考文献描述了本发明所属领域的现有技术状况。因此这些参考文献的公开以引用方式合并于本公开中。Binder, CJ.等人· Pneumococcal vaccination decreases atherosclerotic lesion formation :moIecuIar mimicry between Streptococcus pneumoniae and oxidized LDLNat Med 9,736-43 (2003).Binder, CJ.等人· links adaptive and natural immunity specific for epitopes of oxidized LDL and protects from atherosclerosis. J Clin Invest 114， 427-37(2004).Caligiuri，G.，Nicoletti，A.，Poirier, B. &Hansson，G. K. Protective immunity against atherosclerosis carried by B cells of hypercholesterolemic mice. J Clin Invest 109,745-53(2002).Chou, M. Y.等人.Oxidation-specific epitopes are dominant targets of innate natural antibodies in mice and humans. J Clin Invest 119，1335-49(2009) ·Daugherty A，Manning MW, Cassis LA. Angiotensin II promotesatherosclerotic lesions and aneurysms in apo lipoprotein E—deficient mice. J Clin Invest. 2000 ；105 :1605-1612. Fisson，S·等人.Continuous activation of autoreactive CD4+CD25+regulatory T cells in the steady state. J Exp Med 198, 737-46(2003).Friguet, B.，Chaffotte，A. F.，D javadi-Ohaniance，L. &Goldberg， Μ. E. Measurements of the true affinity constant in solution of antigen—antibody complexes by enzyme — linked immunosorbent assay. J Immunol Methods 77， 305-19(1985).Karvonen，J.，Paivansalo，M.，Kesaniemi, Y. A. &Horkko, S. Immunoglobulin M type of autoantibodies to oxidized low-density lipoprotein has an inverse relation to carotid artery atherosclerosis. Circulation 108，2107-12(2003) ·Major，A. S.，Fazio, S. &Linton, M. F. B-Iymphocyte deficiency increases atherosclerosis in LDL receptor-null mice.Arterioscler Thromb Vase Biol 22， 1892-8 (2002). Miller, A. M. 入.IL—33 reduces the development of atherosclerosis. J Exp Med 205,339-46(2008).Roman，M. J.等人· Preval ence and relation to risk factors of carotid atherosclerosis and left ventricular hypertrophy in systemic lupus erythematosus and antiphospho lipid antibody syndrome. Am J Cardiol 87,663-6,Al 1 (2001).Shaw, P. X.等人.Natural antibodies with the T15 idiotype may act in atherosclerosis, apoptotic clearance，and protective immunity [see comments]. JClin Invest 105，1731-40 (2000).Taleb，S.等人.Defective Leptin/Leptin Receptor Signaling Improves Regulatory T Cell Immune Response and Protects Mice From Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vase Biol (2007). Tsimikas, S. et al. Relationship of IgG and IgM autoantibodies to oxidized low density lipoprotein with coronary artery disease and cardiovascular events. J Lipid Res 48，425-33 (2007) ·Uchida，J·等人.Mouse CD20 expression and function. Int Immunol 16， 119-29 (2004). Uchida, J.等人.The innate mononuclear phagocyte network depletes B lymphocytes through Fc receptor-dependent mechanisms during anti_CD20 antibody immunotherapy. J Exp Med 199，1659-69 (2004) ·Uyttenhove, C. &Van Snick, J. Development of an anti_IL_17A auto-vaccine that prevents experimental auto-immune encephalomyelitis.Eur J Immunol 36， 2868-74(2006). Uyttenhove, C，Sommereyns, C，Theate，L，Michiels，T. &Van Snick, J. Anti-IL-17A auto vaccination prevents clinical and histological manifestations of experimental autoimmune encephalomyelitis. Ann N Y Acad Sci 1110， 330-6(2007).Wang，Y.等人· A critical unsuspected role for TGF-beta activity in theprotection against aortic aneurysm formation and complications in adult mice. Under Revision(2009).
权利要求
1.B细胞耗竭剂，用于治疗或预防动脉粥样硬化。
2.根据权利要求1的B细胞耗竭剂，其中所述B细胞耗竭剂是B细胞耗竭抗体。
3.根据权利要求1的B细胞耗竭剂，其中所述B细胞耗竭抗体是抗-CD20抗体。
4.根据权利要求1-3任一项的B细胞耗竭剂，用于治疗或预防血管或冠状动脉病症。
5.根据权利要求4所述的B细胞耗竭剂，其中所述冠状动脉病症或血管病症选自下组 动脉粥样硬化性血管病症，例如动脉瘤或中风、无症状冠状动脉冠心病、不伴有心肌坏死的慢性缺血性病症，例如稳定型或劳力型心绞痛；不伴有心肌坏死的急性缺血性病症，例如不稳定型心绞痛；和缺血性病症例如心肌梗死。
6.根据权利要求5所述的B细胞耗竭剂，其中所述冠状动脉病症是动脉瘤。
7.根据权利要求5所述的B细胞耗竭剂，其中所述冠状动脉病症是心肌梗死。
全文摘要
本发明涉及动脉粥样硬化的预防或治疗，特别涉及用于预防或治疗动脉粥样硬化的B细胞耗竭剂。
文档编号A61K39/395GK102271710SQ201080004239
公开日2011年12月7日 申请日期2010年1月5日 优先权日2009年1月6日
发明者托马斯·泰德尔, 阿兰·泰德吉, 阿菲德·艾特·乌尔费拉, 齐亚德·马莱 申请人:国家健康与医学研究院