诱导移植耐受的方法

专利名称：诱导移植耐受的方法
诱导移植耐受的方法本文所公开的内容是在美国国立卫生研究院的批准号为U19AI46132的政府资助下完成的。因此，美国政府也对该发明享有一定的权利。该申请中所引用的各种出版物用数字在括号内注明。这些参考文献的出处可在说明书末尾权利要求书之前找到。这些出版物公开的内容通过引用整体并入本申请，以便能够更全面地说明本发明所涉及的现有技术水平。
背景技术：
对抗传染原的正常功能基于免疫系统如何实现自我/非我的区分，而这一直是免疫学的核心问题(1)。免疫系统将什么看作是“自身的”和将什么看作是“外来的”决定免疫系统如何区分自我和非我。在这方面，Burnet和Medawar初期的工作提出自我相对于非我的定义对于免疫系统是随意的，原因是在胎儿期提呈的外来抗原在随后被看作是自我的 (2,3)0另外，已知就T细胞在胸腺阴性选择(其中表达对多数自身抗原都具有高亲和力的 TCR的胸腺细胞被除去)前的胸腺阳性选择(4-7)过程中依赖与MHC分子结合的自身肽被阳性选择而存活来讲，所有T细胞都是自我指向的(self-referential) (8_10)。通常认为胸腺阴性选择消除了外周的病原性自体免疫的“紧急危险”，是自身耐受的主要机制。然而，在正常情况下，在释放具有低亲和力的“无害的”自身反应性T细胞时， 胸腺阴性选择还允许大部分具有“较高”或“中等”亲和力的自身反应性T细胞释放至外周中(11-13)。外周中“中等亲和力”的自身反应性T细胞的存在代表了各个体中所遗传的病原性自身免疫的“潜在危险”，原因是这些T细胞在遇到以足够水平提呈的自身肽时常常被活化，并且有些可能分化成潜在的病原性效应细胞以启动自身免疫性疾病(13-16)。自我/ 非我的区分必须在胸腺阴性选择后在外周中延续，且外周调节机制的主要功能之一是在不损害对外来病原的正常应答的情况下选择性地下调对自身抗原的免疫应答，以保持自身耐受(17)。免疫系统如何在外周中区分自我和非我？由于胸腺阴性选择过程中启动的自我/ 非我的区分是基于胸腺细胞活化的亲和力(8-10)并且大部分自身反应性T细胞逃脱了胸腺阴性选择(11-1 ，因此对所产生的外周T细胞库如何被调节以完成为维持自身耐受而由胸腺阴性选择启动的自我和非我的区分的理解至关重要。为此，本发明人提出并测试了通过Qa-1/HLA-E限制性⑶8+T细胞(18，19)选择性地下调对自身和外来抗原均具有中等亲和力的T细胞而能够在外周中实现自我非我的区分的“外周T细胞调节的亲和力模型”。 由于潜在病原性自身反应性T细胞包含在中等亲和力的T细胞库中，选择性地下调中等亲和力的T细胞能够直接控制自身免疫性疾病。另一方面，选择性地下调中等亲和力的T细胞的一元化机制在很大程度上不抑制由高亲和力T细胞介导的对外来传染原或同种抗原的免疫性，原因仅是高亲和力T细胞不受这种下调作用影响。因此，通过一元化的简单机制， 免疫系统能够在外周中实现自我非我的区分以特异性地维持自身耐受，而无需付出消减抗感染和抗肿瘤免疫的代价。感知T细胞活化的亲和力可以被翻译成外周T细胞调节的概念是“亲和力模型”的核心。定义感知T细胞活化的亲和力如何被翻译成外周T细胞调节的细胞机制以及调节性 T细胞识别的能够使其区分外周中的自我和非我的分子结构是调节性T细胞生物学的主要问题。为此，最近鉴定出了被Qa-I限制性⑶8+T细胞特异性地识别的替代性靶结构Oia-I/ Hsp60sp) (1)。作为T细胞活化的生物学结果，所述共同的替代性靶结构(Qa-1/HspeOsp复合物)优选仅在中等亲和力(而非高亲和力和低亲和力)的T细胞上以较高水平表达(1)。 因此，在生物学体系的水平上，通过对在中等亲和力T细胞上表达的共同靶结构的特异性识别，免疫系统能够通过感知T细胞活化的亲和力而实现在外周中区分自我非我的目的。移植医学的最大难题是免疫系统对外来器官的反应性，即排斥。通常，移植器官的受体必须无限地接受免疫抑制药物以对抗易于造成失败并使患者处于感染的高风险之中的排斥反应。本文公开的发明提供了无需长期使用免疫抑制药物而诱导对移植器官的持久耐受的新治疗策略，该治疗策略引入了亲和力模型。

发明内容
一种防止供体受试者向受体受试者中移植的组织排斥的方法，其包括a)在所述组织移植前向所述受体受试者施用以下物质从而抑制所述受体受试者中同种反应性T细胞的活化(i)来自所述供体受试者的大量外周血单核细胞(PBMC)，其中所述PBMC已经受到辐射从而使其不能在体内增殖，和(ii)特异性地结合CD40配体的单克隆抗体，从而抑制所述受体受试者中同种反应性T细胞的活化；和b)在所述组织移植后向所述受体受试者施用通过HLA-E限制性CD8+T细胞增强供体组织活化的HLA-E+T细胞的下调的试剂，从而由此增强所述供体组织活化的HLA-E+T细胞的下调，由此防止向所述受体受试者中移植的所述组织的排斥。


图1 :Qa-l (或HLA-E)限制性⑶8+T细胞介导通路的细胞事件，其由初次免疫反应 (其中T细胞上的TCR与常规APC提呈的MHC/抗原肽复合体相互作用)过程中原初T细胞的活化启动。初始的T细胞活化的结果之一是特异性“靶抗原”(在这种情况下包括在靶T 细胞表面的“Qa-Ι/自身肽复合体”)的差异表达。重要的是，由调节性T细胞上的TCR识别的“靶抗原”表达是由T细胞活化的亲和力相互作用决定的，而与靶T细胞由哪个抗原触发无关。因此，由于T细胞不是专职APC，诸如树突细胞的专职APC可能被募集并发挥作用以在调节性T细胞的诱导期过程中提供共刺激信号。在某种活化的T细胞上表达的“靶抗原”触发调节性T细胞以分化为效应细胞，该效应细胞反过来在二次免疫应答的过程中下调表达同一靶抗原的任何活化的T细胞。
具体实施例方式一种防止供体受试者向受体受试者中移植的组织排斥的方法，其包括a)在所述组织移植前向所述受体受试者施用以下物质从而抑制所述受体受试者中同种反应性T细胞的活化(i)来自所述供体受试者的大量外周血单核细胞(PBMC)，其中所述PBMC已经受到辐射从而使其不能在体内增殖，和(ii)特异性地结合CD40配体的单克隆抗体，从而抑制所述受体受试者中同种反应性T细胞的活化；和b)在所述组织移植后向所述受体受试者施用通过HLA-E限制性CD8+T细胞增强供体组织活化的HLA-E+T细胞的下调的试剂，从而由此增强所述供体组织活化的HLA-E+T细胞的下调，由此防止向所述受体受试者中移植的所述组织的排斥。一种防止供体受试者向受体受试者中移植的组织排斥的方法，其包括a)在所述组织移植前向所述受体受试者施用以下物质从而抑制所述受体受试者中同种反应性T细胞的活化(i)来自所述供体受试者的大量外周血单核细胞(PBMC)，其中所述PBMC已经受到辐射从而使其不能在体内增殖，和(ii)特异性地结合CD40配体的单克隆抗体，从而抑制所述受体受试者中同种反应性T细胞的活化；和b)在所述组织移植后向所述受体受试者施用通过HLA-E限制性CD8+T细胞增强供体组织活化的HLA-E+T细胞的下调的试剂，从而由此增强所述供体组织活化的HLA-E+T细胞的下调，由此防止向所述受体受试者中移植的所述组织的排斥。在一个实施方式中，所述方法进一步包括在步骤a)的过程中、在步骤b)的过程中或在步骤a)和步骤b)两者的过程中向所述受体受试者施用免疫抑制药物。在一个实施方式中，所述试剂是HLA-E/IgG融合蛋白或HLA-E/Hsp60sp四聚体。在一个实施方式中，所述HLA-E+T细胞是CD4+/HLA-E+T细胞或CD8+/HLA-E+T细胞。在一个实施方式中，所述试剂是源自树突细胞的荷载有B型自身肽的携带HLA-E 的外来体。在一个实施方式中，所述B型自身肽具有SEQ ID NO=I中所示的序列。在一个实施方式中，所述试剂是源自树突细胞的荷载有Hsp60sp肽的携带HLA-E 的外来体。在一个实施方式中，所述试剂是荷载有Hsp60sp肽的自体树突状T细胞。在一个实施方式中，所述Hsp60sp肽包含具有SEQ ID NO 2中所示序列的连续氨基酸。在一个实施方式中，在作为所述试剂向所述受体受试者施用所述自体树突状T细胞前，所述自体树突状T细胞已经从所述受体受试者中移出、离体培养并与Hsp60sp肽接触，从而使所述细胞荷载Hsp60sp肽。在一个实施方式中，所述试剂经过静脉内、肌内或经口施用。在一个实施方式中，在步骤a)中，向所述受体受试者施用所述针对CD40配体的单克隆抗体高达10周。在一个实施方式中，在步骤a)中，将来自所述供体受试者的所述大量细胞分成两个单独的部分施用给所述受体受试者，首先施用第一部分然后是第二部分，其中在施用所述第一部分后约7天向所述受体受试者施用所述第二部分。在一个实施方式中，在步骤a)中，(1)在施用所述大量细胞的所述第一部分日的前1天，和( 在施用所述大量细胞的所述第一部分的当天，和C3)在施用所述大量细胞的所述第一部分日的后1天，和(4)在施用所述大量细胞的所述第一部分日的后3天，和(5) 在施用所述大量细胞的所述第一部分日的后7天，和(6)在施用所述大量细胞的所述第一部分日的后14、21、28、35、42、49和56天，向所述受试者施用所述针对⑶40配体的单克隆抗体。在一个实施方式中，在施用所述大量细胞后或在施用所述大量细胞的所述第一部分后每日施用所述免疫抑制药物高达10周。在一个实施方式中，每天施用所述免疫抑制剂药，施用56天。在一个实施方式中，在施用所述大量细胞或所述大量细胞的所述第一部分后2-3 周将所述组织移植到所述受体受试者中。在一个实施方式中，所述方法进一步包括在施用所述针对CD40配体的单克隆抗体期间向所述受体受试者施用抗血栓栓塞剂。在一个实施方式中，所移植的组织是肺组织、心脏组织、肾脏组织、肝脏组织、视网膜组织、角膜组织、皮肤组织、胰腺组织、肠组织、生殖器组织、卵巢组织、骨组织、腱组织或血管组织。在一个实施方式中，所移植的组织是作为完整器官移植的。在一个实施方式中，已经利用2000-4000拉德(Rad)辐射PBMC足够的时间，从而使其不能在体内增殖。本文使用的“受体受试者”是要接受或已经接受来自另一个受试者的移植细胞、组织或器官的受试者。本文使用的“供体受试者”是在向受体受试者移植细胞、组织或器官前将待移植的细胞、组织或器官从其移出的受试者。在一个实施方式中，所述供体受试者是灵长类。在一个实施方式中，所述供体受试者是人。在一个实施方式中，所述受体受试者是灵长类。在一个实施方式中，所述受体受试者是人。在一个实施方式中，所述供体受试者和受体受试者均为人。因此，本发明包括异种移植的实施方式。本文使用的“免疫系统的排斥”描述了识别来自非我供体的移植细胞、组织或器官的受体受试者免疫系统的超急性、急性和/或慢性反应事件。本文使用的“免疫抑制药物”是用于抑制受体受试者免疫应答的药学上可接受的药物。非限制性实例包括环孢霉素A JK506和雷帕霉素。本文使用的“预防有效”量是可有效预防或延迟施用物质的受试者的给定病理状况的发生的所述物质的量。本文使用的“治疗有效”量是可有效治疗、改善或减轻施用物质的受试者所遭受的给定病理状况的症状或起因的所述物质的量。在一个实施方式中，所述治疗有效量或预防有效量为每剂量大约Img试剂/kg受试者至Ig试剂/kg受试者。在另一个实施方式中，所述治疗有效量或预防有效量为大约 IOmg试剂/kg受试者至500mg试剂/kg受试者。在再一个实施方式中，所述治疗有效量或预防有效量为大约50mg试剂/kg受试者至200mg试剂/kg受试者。在再一个实施方式中， 所述治疗有效量或预防有效量为大约IOOmg试剂/kg受试者。在还一个实施方式中，所述治疗有效量或预防有效量选自50mg试剂/kg受试者、IOOmg试剂/kg受试者、150mg试剂/ kg受试者、200mg试剂/kg受试者、250mg试剂/kg受试者、300mg试剂/kg受试者、400mg试剂/kg受试者和500mg试剂/kg受试者。在优选的实施方式中，所述治疗有效量或预防有效量为每剂量大约20mg试剂/kg受试者。本文使用的“B型肽”或“B型自身肽”为与HLA-E结合的HLA-E结合肽，其(i)当与HLA-E结合时不通过结合⑶94/NKG2A抑制NK细胞，(ii)当与HLA-E结合时通过调节性 ⑶8+T细胞而被识别，并且(iii)能够与诸如B7sp之类的A型HLA-E结合肽竞争。优选地， 所述B型肽是单体。本文使用的“HLA-E”具有本领域使用的常规含义，即人白细胞抗原系统E。 本文使用的“HLA-E限制性⑶8+T细胞”是一种调节性⑶8+T细胞，其识别由免疫系统抗原提呈细胞(APC)上或HLA-E+树突细胞上的HLA-E分子提呈的肽。本文所涵盖的用于HLA-E限制性⑶8+T细胞的APC是中等亲和力的T细胞，其也是这些⑶8+T细胞的特异性靶。Hsp60sp的“结构上相关的肽”表示与SEQ ID NO :2中所示的序列具有70%至99% 序列相似性的肽。本文使用的“供体组织活化的HLA-E+T细胞”是由已经移植至受体中的供体组织活化的受体的HLA-E+T细胞。类似地，当所述方法涉及移植细胞或器官时，“细胞活化的 HLA-E+T细胞”或“器官活化的HLA-E+T细胞”分别是由已经移植至受体中的供体组织或器官活化的受体的HLA-E+T细胞。本文使用的“同种反应性T细胞”是当供体与受体是同一物种时与供体受试者的细胞反应的移植受体受试者的T细胞。在一个实施方式中，所述同种反应性T细胞与来自人供体的非受体人细胞反应，而不与受体人细胞反应。在一个实施方式中，所述HLA-E+T细胞是CD4+/HLA-E+T细胞、CD8+/HLA-E+T细胞， 并且B型HLA-E结合肽是Hsp60sp肽。在再一个实施方式中，Hsp60sp肽包含具有SEQ ID NO 2中所示序列的连续氨基酸。在再一个实施方式中，所述肽具有fea-Met/Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Leu (SEQ ID NO 1)的序列。在再一个实施方式中，所述肽是与HLA-E结合的单体。在再一个实施方式中，所述肽不与CD94/NKG2A受体结合。在再一个实施方式中， 所述肽在与HLA-E结合时被调节性CD8+T细胞识别。在再一个实施方式中，用于与HLA-E 结合的所述肽能够与B7sp竞争。“试剂”应表示任何化学物质，包括但不限于糖酸聚合物(glycomer)、蛋白、抗体、 血凝素、核酸、小分子及其任意组合以及诸如外来体或脂质体之类的生物学实体。“小分子” 是可以被无机原子或包含无机原子的基团取代的有机分子，该分子的分子量小于lOOODa。 试剂的具体非限制性实例包括源自树突细胞的荷载有Hsp60sp肽的携带HLA-E的外来体； 荷载有Hsp60sp肽的自体树突状T细胞；荷载有Hsp60sp肽的膜结合组分或脂质体；HLA-E/ IgG融合蛋白；或HLA-E/Hsp60sp四聚体。在实施方式中，所述Hsp60sp是人的Hsp60sp肽。在实施方式中，所述试剂是源自树突细胞的荷载有B型HLA-E结合性肽的携带 HLA-E的外来体，或者所述试剂是源自树突细胞的荷载有Hsp60sp肽的携带HLA-E的外来体，或者所述试剂是HLA-E/IgG融合蛋白，所述试剂是HLA-E四聚体或HLA-E/Hsp60sp四聚体。融合蛋白描述于美国专利号5，116，964和5，336，603中，这两个文献通过引用并入本文。HLA-E 四聚体描述在，例如Braud et al. ,Nature. 1998Feb 19 ；391 (6669) :740-1,743 ； 和 Garcia et al. ,Eur. J. Immunol. 2002 Apr ；32 (4) :936-44 中，这两个文献均通过引用并入本文。HLA-E 蛋白序列描述在 NCBI 登录号 CAA05527、CAA40172、BAB63328 和 BAF31260中，这些文献通过引用并入本文。在实施方式中，所述试剂是HLA-E/IgG融合蛋白，所述试剂是HLA-E四聚体或HLA-E/Hsp60sp四聚体。四聚体描述在，例如&ilcedo et al. , Eur. J. Immunol. 2000 Apr ；30 (4) :1094-101中，该文献通过引用并入本文。适合本发明使用的试剂描述在2008年8月公开的W0/2008/103471中，该文献通过引用并入本文。Hsp60sp 具有 QMRPVSRAL(SEQ ID NO 2)的序列，或者对于人具有 QMRPVSRVL(SEQ. ID NO 3)的序列。“施用”试剂可以通过使用本领域技术人员已知的多种方法和递送系统中的任一种实现或执行。例如，可以通过静脉注射、经口、经鼻、经由脑脊髓液、经由植入物、透粘膜、 透皮、肌内和皮下等方式进行施用。以下采用多种常规使用的药学上可接受的载体的递送系统仅代表根据本发明方法可预见的用于施用组合物的多种实施方式。可注射的药物递送系统包括溶液、悬浮液、凝胶、微球和聚合物注射剂，并且可以包含诸如改变溶解性的试剂(例如乙醇、丙二醇和蔗糖)以及聚合物(例如聚己酸内酯和 PLGA)之类的赋形剂。可移植系统包括条材和片材，并且可包含诸如PLGA和聚己酸内酯之类的赋形剂。经口递送系统包括片剂和胶囊。这些递送系统包含赋形剂，例如粘合剂(如羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、其它纤维素材料和淀粉)、稀释剂(如乳糖和其它糖类、淀粉、磷酸二钙和纤维素材料)、崩解剂(如淀粉聚合物和纤维素材料)和润滑剂(如硬脂酸盐和滑石粉)。透粘膜递送系统包括贴片、片剂、栓剂、阴道栓剂、凝胶剂和乳膏，并且可包含诸如增溶剂和强化剂(如丙二醇、胆汁盐和氨基酸)之类的赋形剂和其它载体(如丙二醇、脂肪酸酯和衍生物以及亲水聚合物，如羟丙基甲基纤维素和透明质酸)。皮肤递送系统包括，例如水凝胶和非水凝胶、乳膏、复合乳剂、微乳剂、脂质体、软膏、含水溶液和非水溶液、洗剂、气溶胶、碳氢化合物基质和粉剂，并且可包含赋形剂，如增溶剂、渗透增强剂(如脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)和亲水聚合物(如聚卡波菲 (polycarbophil)和聚乙烯吡咯烷酮)。在一个实施方式中，所述药学上可接受的载体为脂质体或透皮增强剂。可重组的递送系统的溶液、悬浮液和粉末包含诸如助悬剂(如树胶、黄原胶、纤维素物质和蔗糖)、湿润剂(如山梨糖醇)、增溶剂(如乙醇、水、PEG和丙二醇)、表面活性剂 (如月桂基磺酸钠、司盘(Span)类、吐温类和十六烷基吡啶)、防腐剂和抗氧化剂(如对羟基苯甲酸酯类、维生素E和C及抗坏血酸)、抗结块剂、涂覆剂和螯合剂(如EDTA)之类的载体。本文使用的“药学上可接受的载体”是用于向动物或人递送本发明化合物的药学上可接受的溶剂、助悬剂或媒介。所述载体可以为液体、气溶胶、凝胶或固体，并且根据计划的施用方式而选择。“抗体”应该包括，但不限于包含两个重链和两个轻链并且识别抗原的免疫球蛋白分子。所述免疫球蛋白分子可源自公知的任何类型，包括但不限于IgA、分泌性IgA、IgG和 IgM。IgG亚类也是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于人IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。 “抗体”包括如天然存在的和非天然存在的抗体；单克隆和多克隆抗体；嵌合和人源化抗体； 人或非人抗体；完全人工合成的抗体；以及单链抗体。非人抗体可以通过重组方法而人源化，从而降低其在人中的免疫原性。本领域技术人员熟知用于使抗体人源化的方法。“抗体”还包括，但不限于上述任意免疫球蛋白分子的片段或部分并且包括单价和二价片段或部分。抗体片段包括，例如Fc片段和抗原结合片段(Fab)。“单克隆抗体”(也命名为mAb)是其一级序列基本相同且显示相同的抗原特异性的抗体分子。单克隆抗体可以通过杂交瘤、重组、转基因或本领域技术人员熟知的其他技术而产生。“人源化”抗体指其中⑶R区外的一些、多数或全部氨基酸被源自人免疫球蛋白分子的相应氨基酸取代的抗体。在所述抗体的人源化形式的一个实施方式中，CDR区外的一些、多数或全部氨基酸已经被来自人免疫球蛋白分子的氨基酸取代，而在一个或多个CDR 区内的一些、多数或全部氨基酸没有被改变。氨基酸的少量添加、缺失、插入、取代或修饰也是允许的，只要其不消除所述抗体与给定抗原的结合能力。合适的人免疫球蛋白分子包括 IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE和IgM分子。“人源化”抗体保留了与初始抗体相似的抗原特异性。在一个实施方式中，抗-⑶40配体是通过5c8杂交瘤产生的5c8单克隆抗体，ATCC 登录号为HB 10916，在1995年12月12日授予的美国专利号5，474，771 (通过引用整体并入本文)中有描述。本领域技术人员知晓如何制备用于本发明的所述人源化抗体。多种出版物(其中有一些通过引用并入本申请中)也描述了如何制备人源化抗体。例如，美国专利号 4，816，567中描述的方法包括制备具有一个抗体的可变区和另一个抗体的恒定区的嵌合抗体。美国专利号5，225，539描述了用于产生人源化抗体的另一种方法。该专利描述了使用重组DNA技术产生人源化抗体，其中一个免疫球蛋白的可变区的CDR被具有不同特异性的免疫球蛋白的CDR取代，从而使所述人源化抗体识别期望的靶标但不以明显的方式被人受试者免疫系统识别。具体地，使用位点定向诱变将CDR嫁接在框架上。用于使抗体人源化的其它方法描述在美国专利号5，585，089(73)和 5，693，761(74)以及WO 90/07861中，这两个文献描述了用于产生人源化免疫球蛋白的方法。这些人源化抗体具有一个或多个CDR以及来自供体免疫球蛋白的可能的额外氨基酸以及来自接受的人免疫球蛋白的框架区。这些专利描述了用于提高抗体与期望抗原的亲和力的方法。将框架内的一些氨基酸选择为与供体而非接受者中那些位置的氨基酸相同。具体地，这些专利描述了通过使小鼠单克隆抗体的CDR与人免疫球蛋白框架和恒定区组合来制备结合受体的人源化抗体。可以将人框架区选择为与小鼠序列的同源性最大化。可以使用计算机模型以鉴别框架区内的可能与CDR或特异性抗原相互作用的氨基酸，然后可以在这些位置使用小鼠氨基酸以产生人源化抗体。专利5，585，089和5，693，761以及WO 90/07861(75)还公开了可以用于设计人源
化抗体的四个标准。第一个提议是，对于受体，使用来自通常与待人源化的供体免疫球蛋白同源的特定人免疫球蛋白的框架，或者使用来自多个人抗体的共有框架。第二个提议是，如果人免疫球蛋白框架中的氨基酸是不常规的并且在该位置的供体氨基酸对于人序列是典型的，则可选择供体氨基酸而非接受体氨基酸。第三个提议是，在人源化免疫球蛋白链内与 3个CDR紧邻的位置可以选择供体氨基酸而非接受体氨基酸。第四个提议是，在预测氨基酸在抗体的三维模型中具有CDR的3A以内的侧链原子并且推测氨基酸能够与CDR相互作用的框架位置使用供体氨基酸残基。以上方法仅例示了本领域技术人员可以采用的制备人源化抗体的一些方法。使用Wu et al. (1999) J. Mol. Biol. 284 :151和美国专利号6，165,793、 6，365，408和6，413，774中描述的定向进化的方法可以提高人源化抗体的结合亲和性和/ 或特异性。Hsp60sp 具有 QMRPVSRAL(SEQ ID NO :2)的序列或者对于人具有 QMRPVSRVL(SEQ ID NO 3)的序列。本文所述的方法、组合物和过程的各种元素的所有组合也都在本发明的范围之内。通过参考以下实验细节可更好地理解本发明，但本领域技术人员可容易理解具体的实验细节仅例示本发明，在权利要求书中将对本发明进行更全面的描述。实验细节亲和力模型强调在缺乏高亲和力T细胞的缩减的T细胞库的背景中，任何抗原的特异性中等亲和力T细胞的选择性下调是免疫系统用以实现外周自身耐受的生物学基础。 基于调节系统的这种性质，急性移植排斥通常由对下调耐受的高亲和力同种反应性T细胞介导，而慢性移植排斥主要由受到下调的中等亲和力的同种反应性T细胞介导。本发明公开了通过采用已知降低对同种异体抗原应答的T细胞的亲和力的试剂来删除高亲和力的同种反应性T细胞或者将所述同种反应性T细胞由高亲和力转化成中等亲和力。所产生的同种反应性T细胞库将缺乏高亲和力同种反应性T细胞，但富含诱导调节性抑制细胞并且还易于受所述抑制影响的中等亲和力的同种反应性T细胞。目前使用的用于防止急性移植排斥的某些非特异性免疫抑制剂将通过优选辐射多数活化克隆而针对移植物改造T细胞库，其中所述克隆可能具有高亲和力并因此富含在中等亲和力T细胞中。对于同种应答性(all0-reSp0nding)T细胞库的组成，这将使所移植的移植物处于介于外来抗原和自身抗原之间的独特位置。根据所述亲和力模型，这产生了使免疫系统能够将移植物如同是自身抗原来处理(treat)的情况。例如，可通过使用诸如 “抗-CD40L mAb”之类的免疫调节剂使移植物在急性排斥中存活，其中所述免疫调节剂可通过引发缺乏高亲和力的同种反应性T细胞的中等亲和力应答特异性地修饰同种反应T细胞库。残余的同种反应性T细胞可以主要介导随后的由体内所接受的移植物持续活化的中等亲和力的慢性排斥。下调这些细胞的有效方法是重新活化HLA-E限制性CD8+T细胞介导的调节通路，该通路可能在急性排斥期被之前的抗排斥治疗所破坏。因此，已经证明，在非人灵长类中，在相对短期的同种移植物排斥治疗后， 抗-CD40L mAb 5C8诱导长期移植耐受。确实，一个月时间的单个疗程引起数年的同种移植物耐受。不用药情况下的长期耐受的诱导部分是由于通过最初接受抗-CD40L治疗对同种反应性T细胞库的修饰，该修饰允许通过HLA-E限制性调节性CD8+T细胞选择性地下调中等亲和力的同种反应性T细胞。然而，使用抗-CD40L mAb治疗与免疫相关的临床问题一直处于暂停状态，原因是已知该药物在少量患者但随时间将在显著比例的患者中具有诱导血栓栓塞现象的副作用。因此，亲和力模型提供了使用一次抗-CD40L以修饰同种反应性T细胞库并随后重新活化HLA-E限制性CD8+T细胞调节通路以建立长期的移植耐受的理论基础。使用一次抗-⑶40L mAb可以显著降低血栓栓塞现象的几率并且还允许在医院施用抗-CD40L的过程中密切地监测患者。此外，短期治疗方案允许使用包括阿司匹林在内的抗血栓形成治疗和通常用于防止血栓栓塞的抗血小板药物波立维(Plavix)。例如，可能类似地采用在插入用于心肌功能不全的心脏支架过程中使用的抗血小板药物以在抗-CD40L mAb治疗中防止血栓栓塞并发症。诱导移植耐受的方法如下。所述治疗由两个阶段组成在供体特异性输注(DST) 过程中使用一次抗-⑶40L mAb和免疫抑制药物(数星期)以修饰抗-同种T细胞库，然后是HLA-E限制性⑶8+T细胞的重新活化。第1阶段.对同种反应库进行修饰以除去高亲和力的抗供体的特异性T细胞设计DST以引发初级抗同种免疫应答从而为同种反应性T细胞库的修饰提供时间窗口，以在移植物移植前除去高亲和力的同种反应性T细胞。通过在第1天和在第7天(作为加强剂)向受体静脉注射IOX IO6个经放射的供体细胞(来自人或猴的PBMC)实现DST。 抗⑶40L mAb将在第_1、0、3、7天和每周(共8周)以20mg/kg注射至受体05)。在8周内施用常规用于移植患者的免疫抑制药物(包括环孢霉素AJK506或雷帕霉素)。将在开始治疗后2-3周进行移植物移植(次级抗同种应答)。在施用抗-⑶40L过程中，将给予受体抗血小板药物波立维和阿司匹林，并且将要求受体住院并密切监测血栓栓塞并发症的任何迹象。第2阶段.诱导HLA-E限制性⑶8+T细胞通路以防止慢性排斥第2阶段应在完成第1阶段之后进行。可以向患者施用以下试剂1. HLA-E四聚体可以使用HLA-E-Hsp60sp四聚体作为特异性抗原以在体内诱导 HLA-E限制性⑶8+T细胞。2.外来体荷载有所选HLA-E结合性肽的携带HLA-E的外来体可以用于在体内活化该通路06)。已知可以使用源自树突细胞的外来体作为基于肽的疫苗，其中所述外来体携带有能够荷载有所选合成肽的功能性MHC I型和II型分子06)。3.由HLA-E/Hsp60sp组成的分子工程化复合物也可以用作特异性活化HLA-E限制性CD8+T细胞的抗原。因此，作为人工抗原提呈细胞的部分，已知MHC多聚体可能是用于刺激并分析在免疫应答中的抗原特异性T细胞的有用工具(27-32)。4.利用荷载有Hsp60sp的自体树突状T细胞对受体接种疫苗。为了使细胞荷载Hsp60sp，将例如受体树突细胞，来自例如PBMC的细胞在体外培养6天，然后在37°C荷载50uM Hsp60sp持续2个小时，然后通过静脉施用于受体。该技术通过诱导对供体组织的耐受降低或消除了对持续的免疫抑制治疗的需求。实施例在向受体受试者中移植器官前，向所述受试者施用(i)来自供体受试者的大量细胞，其中所述供体细胞已经被辐射；和( )特异性结合CD40配体的单克隆抗体，以抑制受体受试者中同种反应性T细胞的活化。对所述受试者进行移植手术。在移植后，向所述受体受试者施用通过HLA-E限制性CD8+T细胞增强供体组织活化的HLA-E+T细胞的下调的试剂，由此增强供体组织活化的HLA-E+T细胞的下调，从而由此防止受体受试者的免疫系统对向受体受试者中移植的组织排斥。在再一个实施例中，给所述受体受试者进一步施用免疫抑制药物。参考文献
1. Chen，W.，L Zhang，B. Liang，Y. Saenger, J. Li，L Chess，and H. Jiang. 2007. Perceiving the avidity of T cell activation can be translated into peripheral T cell regulation. Proc Natl Acad Sci U S A 104 :20472-20477.2.Burnet, Μ. , and F.Fenner. 1949.Production of Antibodies. McMillan, Melbourne.3. Billingham, R. E.，L. Brent, and P. B. Medawar. 1953. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature 172 :603-606.4. Bevan, M. J. 1977. In a radiation chimaera，host H-2 antigens determine immune responsiveness of donor cytotoxic cells. Nature 269 :417-418.5.Waldmann, H. 1978.The influence of the major histocompatibility complex on the function of T—helper cells in antibody formation. Immunol Rev 42 202-223.6.Zinkernagel，R. M. 1978.Thymus and lymphohemopoietic cells their role in T cell maturation in selection of T cells1 H-2-restriction-specificity and in H-2 linked Ir gene control. Immunol Rev 42 :224-270.7. von Boehmer，H.，and P. Kisielow. 1990. Self-nonself discrimination by T cells. Science 248:1369-1373.8. Kappler, J. W.，N. Roehm，and P. Marrack. 1987. T cell tolerance by clonal elimination in the thymus. Cell 49 :273-280.9. Hengartner, H.，B. Odermatt, R. Schneider，M. Schreyer, G. Walle, H. R. MacDonald，and R. M. Zinkernagel. 1988. Deletion of self-reactive T cells before entry into the thymus medulla. Nature 5(336) :388-390.10. Pircher, H.，U. H. Rohrer, D. Moskophidis，R. M. Zinkernagel，and H. Hengartner. 1991. Lower receptor avidity required for thymic clonal deletion than for effector T-cell function. Nature 351 :482-485.11. Bouneaud, C，P. Kourilsky, and P. Bousso. 2000. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide :a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity 13 :829-840.12. Sandberg, J. K.，L Franksson，J. Sundback, J. Michaelsson, M. Petersson, A. Achour, R. P. Wallin, N. E. Sherman，T. Bergman，H. Jornval 1, D. F. Hunt，R. Kiessling，and K. Karre. 2000. T cell tolerance based on avidity thresholds rather than complete deletion allows maintenance of maximal repertoire diversity. J Immunol 165 25-33.13. Jiang，H.，S. Curran, Ε. Ruiz-Vazquez, B. Liang，R. Winchester, and L. Chess. 2003. Regulatory CD8+T cells fine-tune the myelin basic protein-reactive T cell receptor V beta repertoire during experimental auto immune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A 100 :8378-8383.Epub 2003 Jun 8324.14. Anderton, S. M.，C. G. Radu, P. A. Lowrey, E. S. Ward, and D. C. Wraith. 2001. Negative selection during the peripheral immune response to antigen. J Exp Med193 :1-11.15. Han，B. , P. Serra，J. Yamanouchi，A. Amrani，J. F. Elliott, P. Dickie, Τ.P.Dilorenzo, and P. Santamaria.2005.Developmental control of CD8 T cell-avidity maturation in autoimmune diabetes. J Clin Invest 115 :1879-1887.16. Zehn, D.，and M. J. Bevan. 2006. T cells with low avidity for a tissue-restricted antigen routinely evade central and peripheral tolerance and cause autoimmunity. Immunity 25 :261-270.17. Jiang，H.，and L. Chess. 2006. Regulation of immune responses by T cells. N Engl J Med 354 :1166-1176.18. Jiang，H.，and L. Chess. 2000. The Specific Regulation of Immune Responses by CD8+ T Cells Restricted by the MHC Class IB Molecule，QA-1. Annu. Rev. Immunol. 18 :185-216.19. Jiang, H.，Y. Wu, B. Liang, Z. Zheng, G. Tang, J. Kanellopoulos, M. Soloski, R. Winchester, I.Goldstein，and L. Chess. 2005. An affinity/avidity model of peripheral T cell regulation. J. Clin. Invest. 115 :302-312.20. Durie，F. H.，Τ. Μ. Foy, S. R. Masters，J. D. Laman, and R. J. Noelle. 1994. The role of CD40 in the regulation of humoral and cell-mediated immunity. [Review]. Immunology Today 15 :406-411.21. Blazar, B. R. , P. A. Taylor, A. Panoskaltsis-Mortari, J. Buhlman, J. Xu, R.A.Flavell，R. Korngold，R. Noelle，and D.A.Vallera. 1997.Blockade of CD40 1igand_CD40 interaction impairs CD4+ T cell-mediated alloreactivity by inhibiting mature donor T cell expansion and function after bone marrow transplantation. J Immunol 158 :29-39.22. Kirk, A. D. ， D. Μ. Harlan, N. N. Armstrong, T. A. Davis, Y. Dong, G. S. Gray, X. Hong, D. Thomas，J. Fechner，Jr.，and S. J. Knechtle· 1997. CTLA4_Ig and anti_CD40 ligand prevent renal allograft rejection in primates. Proc Natl Acad Sci USA 94 :8789-8794.23. Chess, L. 2000. Blockade of the CD40L/CD40 Pathway. In Therapeutic Immunology, 2nd ed. K. F. Austen，S. J. Burakoff，F. S. Rosen，and T. B. Strom，eds. Blackwell Science，Inc.，Cambridge，MA.24. Honey, K. , S. P. Cobbold, and H. Waldmann. 1999. CD40 ligand blockade induces CD4+ T cell tolerance and linked suppression. J Immunol 163 :4805-4810.25. Preston，E. H.，H. Xu，K. K. Dhanireddy，J. P. Pearl，F. V. Leopardi， M. F. Starost, D. A. Hale, and A. D. Kirk. 2005. IDEC-131 (anti-CD154)， sirolimus and donor-specific transfusion facilitate operational tolerance in non-human primates. Am J Transplant 5 :1032-1041.26. Chaput, N.，N. Ε. Schartz, F. Andre，J. Taieb，S. Novault, P. Bonnaventure, N. Aubert, J. Bernard，F. Lemonnier, M. Merad，G. Adema，M. Adams，M. Ferrantini, A.F. Carpentier, B.Escudier, T.Tursz, E. Angevin, and L Zitvogel. 2004. Exosomes aspotent cell-free peptide—based vaccine. II. Exosomes in CpG adjuvants efficiently prime naive TcI lymphocytes leading to tumor rejection. J Immunol 172 2137-2146.27. Dal Porto, J.，Τ. Ε. Johansen, B. Catipovic, D. J. Parfiit, D. Tuveson, U. Gether, S. Kozlowski, D. Τ. Fearon, and J. P. Schneck. 1993. A soluble divalent class I major histocompatibility complex molecule inhibits alloreactive T cells at nanomolar concentrations. Proc Natl Acad Sci U S A 90 :6671-6675.28. Oelke， M. ， and J. P. Schneck. 2004. HLA-Ig-based artificial antigen-presenting cells :setting the terms of engagement. Clin Immunol 110 243-251.29. Casares，S.，C. A. Bona，and T. D. Brumeanu. 1997. Engineering and characterization of a murine MHC class II-immunoglobulin chimera expressing an immunodominant CD4 T viral epitope.Protein Eng 10 :1295-1301.30. Malherbe, L. ， C. Filippi， V. Julia, G. Foucras, M. Moro, H. Appel， K. Wucherpfennig, J. C.Guery, and N. Glaichenhaus. 2000. Selective activation and expansion of high-affinity CD4+ T cells in resistant mice upon infection with Leishmania major. Immunity 13 :771-782.31. Casares, S.，C. A. Bona，and T. D. Brumeanu. 2001. Enzymatically mediated engineering of multivalent MHC class ΙΙ-peptide chimeras. Protein Eng 14 195-200.32. Al tman, J. D.，P. A. Moss, P. J. Goulder, D. H. Barouch, M. G. McHeyzer-Williams, J. I. Bell， A. J. McMichael, and M.M.Davis. 1996. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science 274 :94-96.
权利要求
1.一种防止从供体受试者向受体受试者中移植的组织排斥的方法，所述方法包括a)在所述组织移植前向所述受体受试者施用以下物质从而抑制所述受体受试者中同种反应性T细胞的活化(i)来自所述供体受试者的大量外周血单核细胞(PBMC)，其中所述 PBMC已经受到辐射从而使其不能在体内增殖，和(ii)特异性地结合CD40配体的单克隆抗体，从而抑制所述受体受试者中同种反应性T细胞的活化；和b)在所述组织移植后向所述受体受试者施用通过HLA-E限制性CD8+T细胞增强供体组织活化的HLA-E+T细胞的下调的试剂，从而由此增强所述供体组织活化的HLA-E+T细胞的下调，由此防止向所述受体受试者中移植的所述组织的排斥。
2.如权利要求1所述的方法，其进一步包括在步骤a)的过程中、在步骤b)的过程中或在步骤a)和步骤b)两者的过程中向所述受体受试者施用免疫抑制药物。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述试剂是HLA-E/IgG融合蛋白或HLA-E/ Hsp60sp四聚体。
4.如权利要求1、2或3所述的方法，其中，所述HLA-E+T细胞是⑶4+/HLA-E+T细胞或 CD8+/HLA-E+T 细胞。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述试剂是源自树突细胞的荷载有B型自身肽的携带HLA-E的外来体。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述B型自身肽具有SEQID NO :1中所示的序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述试剂是源自树突细胞的荷载有 Hsp60sp肽的携带HLA-E的外来体。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述试剂是荷载有Hsp60sp肽的自体树突状T细胞。
9.如权利要求3、7或8所述的方法，其中，所述Hsp60sp肽包含具有SEQID NO :2或 SEQ ID NO 3中所示序列的连续氨基酸。
10.如权利要求8所述的方法，其中，在作为所述试剂向所述受体受试者施用所述自体树突状T细胞前，所述自体树突状T细胞已经从所述受体受试者中移出、离体培养并与 Hsp60sp肽接触从而使所述细胞荷载HspeOsp肽。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述试剂经过静脉内、肌内或经口施用。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，在步骤a)中，向所述受体受试者施用所述针对CD40配体的单克隆抗体高达10周时间。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，在步骤a)中，来自所述供体受试者的所述大量细胞分两个单独的部分施用给所述受体受试者，首先施用第一部分然后是第二部分，其中在施用所述第一部分后约7天向所述受体受试者施用所述第二部分。
14.如权利要求13所述的方法，其中，在步骤a)中，(1)在施用所述大量细胞的所述第一部分日的前1天，和( 在施用所述大量细胞的所述第一部分的当天，和C3)在施用所述大量细胞的所述第一部分日的后1天，和(4)在施用所述大量细胞的所述第一部分日的后 3天，和( 在施用所述大量细胞的所述第一部分日的后7天，和(6)在施用所述大量细胞的所述第一部分日的后14、21、28、35、42、49和56天，向所述受试者施用所述针对⑶40配体的单克隆抗体。
15.如权利要求2、13或14所述的方法，其中，在施用所述大量细胞后或在施用所述大量细胞的所述第一部分后每日施用所述免疫抑制药物高达10周。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述免疫抑制药物每天施用，施用56天。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，在施用所述大量细胞或所述大量细胞的所述第一部分后2至3周将所述组织移植到所述受体受试者中。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，进一步包括在施用所述针对CD40配体的单克隆抗体期间向所述受体受试者施用抗血栓栓塞剂。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，所移植的组织是肺组织、心脏组织、 肾脏组织、肝脏组织、视网膜组织、角膜组织、皮肤组织、胰腺组织、肠组织、生殖器组织、卵巢组织、骨组织、腱组织或血管组织。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中，所移植的组织是作为完整器官移植的。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，已经利用2000-4000拉德辐射PBMC 足够的时间，从而使其不能在体内增殖。
全文摘要
本发明提供了无需长期施用非特异性免疫抑制药物即可防止受体受试者免疫系统对向该受体受试者移植的来自供体受试者的组织排斥的方法。
文档编号A61K39/395GK102388063SQ201080016230
公开日2012年3月21日 申请日期2010年2月9日 优先权日2009年2月10日
发明者伦纳德·切斯, 宏·姜 申请人:纽约市哥伦比亚大学受托人