皮肤伤口愈合组合物及其使用方法
【专利摘要】本发明公开了伤口愈合组合物，其具有一类多肽化合物，所述多肽化合物具有每条链5至120个氨基酸单元的多肽链。所述组合物包含用于负载所述多肽化合物的药用介质，例如水性溶液、悬液、分散体、油膏、软膏、凝胶、霜剂、洗剂、喷剂或糊剂。另外，本发明公开了将伤口愈合组合物以约1μg/ml至约100μg/ml的浓度施用足以愈合所述伤口的时间的方法，所述伤口愈合组合物包含一类多肽化合物，所述多肽化合物具有每条链5至120个氨基酸单元的多肽链。
【专利说明】皮肤伤口愈合组合物及其使用方法
[0001]关于联邦资助研究的声明
[0002]本发明在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的合同号为GM67100和AR46538的政府支持下做出。美国政府在本发明中享有一定的权利。
[0003]发明背景
【技术领域】
[0004]本公开属于伤口愈合组合物及其应用的领域。具体来说，本公开涉及多肽组合物以及这些组合物向皮肤的表面施用，以通过促进所有皮肤细胞的迁移来加速伤口愈合。
【背景技术】
[0005]伤口愈合或伤口修复是皮肤在损伤后修复自身的错综复杂的过程。在正常皮肤中，表皮(最外层)和真 皮(内部或更深的层)以稳态平衡状态存在，形成针对外部环境的保护性屏障。正常的伤口愈合过程大体上可分为三个阶段，即炎性阶段、增殖阶段和成熟阶段。炎性阶段持续0-2天，并涉及细胞有序募集到伤口区域。其后是2-6天的增殖阶段，在此期间，伤口床中的成纤维细胞、角化细胞和其他细胞开始活跃增殖以封闭伤口。在组织修复的第一阶段中，发生急性炎性应答和细胞迁移。在前24-48小时，嗜中性粒细胞占主导地位；到第三天，巨噬细胞变得活跃。嗜中性粒细胞和巨噬细胞吞噬并消化病理性生物体和组织碎片。成熟阶段在增殖阶段之后，峰值出现在第21天，此时通过重建初始瘢痕组织而使伤口完全愈合。
[0006]严重伤口不遵从上述愈合过程的正常时间表。严重伤口所需的更长的时间可以引起不想要的花费和与愈合减缓相关的疼痛，以及工作能力和整体生活质量的降低。在每年确诊的两百万患有褥疮的人中，900，000人具有不愈合的下肢溃疡。据估计，年龄在65岁以上的患有糖尿病的患者中有18%的患者具有慢性、不愈合的足部溃疡。此外，由于小腿慢性伤口感染，每年进行50，000例下肢截肢手术。由于伤口异味、感染和疼痛，由不愈合的腿部溃疡的发病造成生活质量显著受损。此外，这些问题也在具有慢性皮肤伤口的患者中引起社会孤立和自我形象降低。在经济上，用于管理美国老年人中延迟的伤口愈合的费用据估计为每年90亿美元。
[0007]在慢性伤口愈合领域中已使用了大量的时间和金钱。Akella等在美国专利号7，081，240中公开了用于处理伤口的蛋白质混合物的应用，其中所述混合物分离自骨骼，或来自于重组蛋白例如骨形态发生蛋白、转化生长因子和成纤维细胞生长因子。然而，生长因子疗法的总体临床结果是令人失望的，并且很少的生长因子最终获得FDA批准。
[0008]Kiss讨论了非生长因子蛋白在伤口愈合中的应用，所述非生长因子蛋白由人类a 1-抗胰蛋白酶、人类胎盘碱性磷酸酶、人类转移和O1-酸糖蛋白构成。然而，该方法的缺点在于它需要在不同步骤中起作用的数种药剂的复杂的顺序施用，并且还可能需要根据每个治疗调整组合物。类似地，皮肤替代物的使用不具有成本效益。
[0009]上皮重新形成是人类皮肤伤口愈合中的关键事件，其中表皮角化细胞侧向迁移以封闭伤口。在慢性伤口中，角化细胞迁移被阻断，伤口保持开放，引起患者发病以及甚至死亡。
[0010]在人类皮肤伤口愈合期间，关键的限速步骤是伤口边缘处的固有表皮和真皮细胞开始迁移到伤口床中。人类角化细胞(ffiC)从切口边缘跨过伤口床侧向迁移，最终封闭伤口，该过程被称为上皮重新形成。真皮细胞包括真皮成纤维细胞(DF)和真皮微血管内皮细胞(HDMEC)，它们在HKC迁移后开始移动到伤口中，这些细胞在伤口中沉积基质蛋白，收缩并重塑新封闭的伤口，建造新的血管。HKC迁移主要由人类血清中的TGFa驱动，并且不受共存于人类血清中的高浓度TGFP家族细胞因子的影响。相反，即使在生长因子例如TOGF-BB和VEGF存在的条件下，TGFP的存在仍阻断真皮细胞的迁移。因此，尽管可以理解在伤口愈合期间HKC迁移为何在DF和HDMEC迁移之前启动，但在丰富的TGFP存在下DF和HDMEC如何移动到伤口床中，仍是未解之谜。
[0011]其它研究涉及使用热休克蛋白来促进伤口愈合。例如,Srivastava等在美国专利号6，475，490中公开了一种组合物，其包含未复合或与抗原性分子非共价复合的热休克蛋白，包括gp96、hsp90和hsp70。然而,在药物组合物中使用全长的这些大分子,导致每单位重量蛋白质的功效降低。
【发明内容】
[0012]为了克服上述问题，本公开鉴定了一种伤口愈合组合物，其包含一类具有相对小尺寸多肽链的多肽化合物。在本公开的一种实施方式中，所述多肽链具有每条链5至120个氨基酸单元。任选地， 所述组合物包含用于负载所述多肽化合物的药用介质，例如水性溶液、悬液、分散体、油膏、软膏、凝胶、霜剂、洗剂、喷剂或糊剂。
[0013]在本公开的另一种实施方式中，所述多肽链具有每条链20至60个氨基酸单元。任选地，多肽链包含hsp90 a肽的从236至350位氨基酸的氨基酸序列、EEKEDKEEEKEKEEKESEDKPEIEDVGSDEEEEKKD ⑶KKKKKKIKEKYIDQEE 或 SDEEEEKKD⑶KKKKKKIKEKYIDQE E。任选地，所述组合物可以包含5至120个氨基酸单元、20-60个氨基酸单元或上面显示的特定氨基酸单元的多肽链的混合物。
[0014]本公开还涉及愈合皮肤伤口的方法，所述方法包括将第一有效量的药物组合物与皮肤伤口接触，所述药物组合物由具有多肽链的多肽化合物构成。所述多肽链为每条链5至120个氨基酸单元，每条链20至60个氨基酸单元，或包含hsp90 a肽的从236至350位氨基酸的氨基酸序列、EEKEDKEEEKEKEEKESEDKPEIEDVGSDEEEEKKD⑶KKKKKKIKE KYIDQEE 或SDEEEEKKD⑶KKKKKKIKEKYIDQEE。
[0015]所述方法任选使用具有用于负载所述多肽化合物的药用介质的药物组合物，所述药用介质由水性溶液、悬液、分散体、油膏、软膏、凝胶、霜剂、洗剂、喷剂或糊剂构成。
[0016]在另一种实施方式中，所述多肽化合物以约10 U g/ml至约3mg/ml的浓度被配制在所述药用介质中。任选地，所述多肽化合物以约30 ii g/ml至约500 ii g/ml的浓度被配制在所述药用介质中。
[0017]在伤口愈合方法的一种实施方式中，约每6小时至约每72小时将所述组合物施用于伤口。任选地，约每24小时至约每48小时将所述组合物施用于伤口。
[0018]本公开的其他优点和其他特征被部分阐述在下面的描述中，并且对于本领域的普通技术人员来说，在研究了下述内容后，本公开的其他优点和其他特征将部分变得显而易见，或者可以从本公开的实践中认识到。可以按权利要求书中具体指出的来实现和获得本公开的优点。
[0019]正如将会认识到的，本公开能够具有其他不同的实施方式，并且本公开的一些细节可以在各种明显的方面进行修改，其全部都不背离本公开。因此，附图和说明书本质上应被认为是示例性的而不是限制性的。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1是示出了多肽化合物的各种功效及其与对照霜剂相比在小鼠中对伤口愈合的影响的条形图。
[0021]图2a_f是具有115个氨基酸的肽链的多肽与对照霜剂相比，小鼠的皮肤伤口愈合结果的照片。
[0022]图3a_3e是FDA批准的化合物(Regranex?，PDGF-BB)与对照霜剂相比，小鼠的皮肤伤口愈合结果的照片。
【具体实施方式】
[0023]不受理论的限制，据信在皮肤损伤后，旁分泌或自分泌释放的TGF a刺激HKC中预先存在的hsp90a蛋白的膜易位和分泌。分泌的hsp90a通过结合于细胞表面上的⑶91/LRP-1受体来启动HKC迁移，HKC迁移是上皮重新形成过程的关键事件。当细胞外hsp90 a扩散到伤口床中并在其中达到一定浓度时，它开始诱导DF和HDMEC从切口边缘迁移到伤口床中，即使是在“危险”条件下:没有ATP和ATPase活性，并存在通用细胞运动抑制剂例如TGFβ家族细胞因子。因此，细胞外hsp90a被用于皮肤伤口愈合。然而，当存在慢性伤口时，皮肤不能产生用于伤口愈合的hsp90 a。因此，必须向伤口施加促进皮肤伤口愈合的添加物。
[0024]正如可以在图1中看到的，与对照介质相比，全长(WT)hsp90a显示出显著的促运动活性。中间结构域加上带电荷序列(M-1)显示出与WT hsp90 a相似程度的活性。然而，缺少带电荷序列的中间结构域显示出显著降低的活性(M-2)，但是带电荷序列加上整个N’ -端结构域(N’)不显示出刺激活性。两个C’ -端结构域(C’ -1和C’ -2，为确保结果而制备的)都显示出中度的促运动活性。因此，hsp90a主要通过其中间和羧基端结构域来促进HKC迁移，这与它们在hsp90a中的表面位置相一致。因此，包含hsp90a的中间结构域的组合物将表现出与单独包含hsp90 a的组合物相似的伤口愈合性质。[0025]然而，正如也可以在图1中看到的，不是全部完整的hsp90a蛋白或hsp90a蛋白的整个中间结构域和带电荷部分对于促进伤口愈合来说都是必需的。由来自于236至350位氨基酸的115个氨基酸单元构成的F-3片段以及具有来自于236至289位氨基酸的54个氨基酸单元的F-5片段(序列EEKEDKEEEKEKEEKESEDKPEIEDVGSDEEEEKKD⑶KKKKKKIKEKYIDQEE)表现出与全长hsp90a相似的活性，其对细胞迁移的影响为100%。因此，hsp90a的非必需部分不需要被包含在用于伤口愈合的组合物中，从而允许组合物的每单位重量的活性伤口愈合剂的功效更高。此外，可以使用更廉价和常规的合成方法来获得链长更小的多肽链，而不用依赖于复杂的分离和提取方法来获得hsp90 a蛋白或hsp90a蛋白的中间结构域加上带电荷部分。
[0026]为了证实115个氨基酸单元和54个氨基酸单元的多肽化合物的功效，通过常规手段合成了它们。将含有IOOii g F-3片段的100 iill0%羧甲基纤维素霜剂和单独的霜剂每天表面施用到裸鼠背部上的Icm xlcm伤口，共施用5天，并且每两天对伤口进行分析。代表性实验的所选伤口照片被示出在图2A-2F中。可以看出，与霜剂对照相比，在第4天开始以及在第6天、第8天、第11天、第13天和第15天，F-3显著加速伤口的闭合。
[0027]实施例
[0028]在下面的实施例中，使用了下述条件或方法。
[0029]混合药用的100-110%羧甲基纤维素霜剂(无菌)，并表面覆盖裸鼠背部上的Icmxlcm伤口。在这种 处理之后，将伤口用数种抗生素和邦迪创可贴(bandi )覆盖，并通过用自粘缠外科绷带(coban)包扎小鼠来固定邦迪创可贴。然后每天加入F-3化合物混合物直至5天，并且每两天对伤口进行分析。
[0030]为了准备用于F-3表面处理的小鼠，通过在8至10周龄小鼠的背部中央用镊子夹起皮肤并用剪刀移除全厚度皮肤，来制造1.0-cm xl.0-cm的全厚度切除伤口。用不含(作为对照)或含有300ii g重组F-3化合物的100 ill 10%羧甲基纤维素对伤口进行表面覆盖。然后将伤口区域用邦迪创可贴(Band-Aid)和自粘缠外科绷带Coban覆盖，以防止干燥。仅仅向伤口施用一个剂量的F-3化合物。为了测量伤口面积，在创伤后第4、6、8、11、13和15天获取伤口的标准化数字照片，并使用图像分析仪(AlphaEase FC4.1.0版，Alpha InnotechCorporation)确定开放伤口的面积。通过将愈合中的伤口的面积与原始伤口的面积进行比较，确定伤口面积的百分率。使用Student T检验进行统计分析。使用由南加利福尼亚大学实验动物使用委员会(University of Southern California Institutional AnimalUse Committee)批准的方案进行所有动物研究。
[0031 ] 提供下面的实施例是出于示例的目的，而不是打算限制本发明的范围。
[0032]在8至10周龄的无胸腺裸鼠的背部中央制造1.0-cm2 (Icm xlcm)的正方形全厚度切除伤口，并且每天表面施用F-3的药物组合物，共施用5天(n=每组10只小鼠)。(A)示出了第4、6、8、11、13和15天的代表性伤口。在用含有F-3的霜剂表面处理的小鼠中，伤口尺寸显著减小(右图)，但是在使用单独霜剂的情况下没有显著减小(左图)。(B)在创伤后第4、6、8、11、13和15天，伤口尺寸测量结果的平均值土SD (n=每组10只小鼠)。
[0033]为了比较F-3化合物的功效，使用FDA批准的Regenerex?进行研究。使用上述方法，将40 y g剂量的H)GF-BB(Regenerex?)施用到小鼠上，共施用5天(n=每组10只小鼠)，并与F-3化合物进行比较。(A)图3A-3E中示出了第0、5、7、10和12天的代表性伤口。正如可以从图中看到的，在用含有F-3的霜剂表面处理的小鼠中，伤口尺寸显著减小(上图)，但是在使用Regenerex?的情况下没有显著减小(下图)。
[0034]可以通过使用常规材料、方法和设备来实践本公开。因此，在本文中没有详细列出这样的材料、设备和方法的细节。在上面的描述中列出了大量具体细节例如具体的材料、结构、化学品、方法等，以便提供对本公开的透彻理解。然而，应该认识到，可以无需采取具体列出的细节来实践本公开。在其他情况下，没有详细描述公知的处理结构，以免不必要地混淆本公开。
[0035]在本文中仅仅示出并描述了本公开的数个实施例。应该理解，本公开能够以各种其他组合并在各种其他环境中使用，并且能够在如本文中表述的发明构思的范围内进行改变或修 改。
【权利要求】
1.伤口愈合组合物，其包含: 具有多肽链的多肽化合物， 其中所述多肽链具有每条链5至120个氨基酸单元。
2.权利要求1的伤口愈合组合物，其还包含用于负载所述多肽化合物的药用介质，其中所述药用介质是至少一种选自以下的介质:水性溶液、悬液、分散体、油膏、软膏、凝胶、霜剂、洗剂、喷剂或糊剂。
3.权利要求3缺失。
4.权利要求1的伤口愈合组合物，其中所述多肽链具有每条链20至60个氨基酸单元。
5.权利要求1的伤口愈合组合物，其中所述多肽链包含氨基酸序列EEKEDKEEEKEKEEKESEDKPEIEDVGSDEEEEKKD⑶KKKKKKI KEKYIDQEE。
6.权利要求1的伤口愈合组合物，其中所述多肽链包含hsp90α肽从236至350位氨基酸的氨基酸序列。
7.权利要求1的伤口愈合组合物，其中所述多肽链包含氨基酸序列SDEEEEKKD⑶KKKKKKIKEKYIDQEE。
8.愈合皮肤伤口的方法，所述方法包括: 将第一有效量的药物组合物与所述皮肤伤口接触，所述药物组合物由具有多肽链的多肽化合物构成， 其中所述多肽链具有每条链5至120个氨基酸单元。
9.权利要求8的愈合皮肤伤口的方法，其中所述药物组合物还包含用于负载所述多肽化合物的药用介质，其中所述药用介质是至少一种选自以下的介质:水性溶液、悬液、分散体、油膏、软膏、凝胶、霜剂、洗剂、喷剂或糊剂。
10.权利要求9的愈合皮肤伤口的方法，其中所述多肽化合物以约10u g/ml至约3mg/ml的浓度被配制在所述药用介质中。
11.权利要求9的愈合皮肤伤口的方法，其中所述多肽化合物以约30μg/ml至约500 V- g/ml的浓度被配制在所述药用介质中。
12.权利要求8的愈合皮肤伤口的方法，其中所述多肽链具有每条链20至60个氨基酸单元。
13.权利要求12的愈合皮肤伤口的方法，其中所述药物组合物还包含用于负载所述多肽化合物的药用介质，其中所述药用介质是至少一种选自以下的介质:水性溶液、悬液、分散体、油膏、软膏、凝胶、霜剂、洗剂、喷剂或糊剂。
14.权利要求13的愈合皮肤伤口的方法，其中所述多肽化合物以约10μg/ml至约3mg/ml的浓度被配制在所述药用介质中。
15.权利要求13的愈合皮肤伤口的方法，其中所述多肽链包含氨基酸序列EEKEDKEEEKEKEEKESEDKPEIEDVGSDEEEEKKD⑶KKK KKKIKEKYIDQEE。
16.权利要求13的愈合皮肤伤口的方法，其中所述多肽链包含hsp90α肽从236至350位氨基酸的氨基酸序列。
17.权利要求13的愈合皮肤伤口的方法，其中所述多肽链包含氨基酸序列SDEEEEKKD⑶KKKKKKIKEKYIDQEE。
18.权利要求9的愈合皮肤伤口的方法，其中约每6小时至约每72小时将所述组合物施用于所述伤口。
19.权利要求13的愈合皮肤伤口的方法，其中约每24小时至约每48小时将所述组合物施用于所述伤口。
20.权利要求9的愈合皮肤伤口的方法，其中约每6小时至约每72小时将所述组合物施用于所述伤口。
21.权利要求13的愈合皮肤伤口的方法，其中约每24小时至约每48小时将所述组合物施用于所 述伤口。
【文档编号】A61K9/06GK103458914SQ201080070970
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2010年11月3日 优先权日:2010年11月3日
【发明者】郑杰方, 大卫·T·伍德利, 陈梅, 栗卫 申请人:南加利福尼亚大学