4′-甲氧基-7-羟基异黄酮在制备抗肿瘤药物中的应用及其制备方法

专利名称：4′-甲氧基-7-羟基异黄酮在制备抗肿瘤药物中的应用及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种抗肿瘤化合物的制备方法及包含该抗肿瘤化合物的药物在制备抗肿瘤药物方面的应用，特别涉及一种来源于熊胆的4'-甲氧基-7-羟基异黄酮作为核受体小分子调节剂的制备方法及在抗肿瘤药物中的应用，属于医药技术领域。
背景技术：
肿瘤(Tumor)是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。一般认为，肿瘤細胞是单克隆性的，即ー个肿瘤中的所有瘤細胞均是ー个突变的細胞的后代。一般将肿瘤分为良性和恶性两大类。所有的恶性肿瘤总称为癌症(cancer)。瘤細胞具有异常的形态、代谢和功能，并在不同程度上失去了分化成熟的能力。肿瘤生长旺盛，并具有相対的自主性，即使致瘤因素已不存在，仍能持续性生长，提示肿瘤細胞的遗传异常可以传给子代細胞。每个肿瘤細胞都含有引起其异常生长的基因组的改变。肿瘤性增生不仅与机体不协调，而且有害。核受体(NR，Nuclear Receptor)是ー类介导类固醇激素、维生素以及脂肪酸衍生物等生物学作用的細胞内蛋白质，是真核細胞转录因子成员中最大的ー个基因家族，是预防、治疗癌症、肿瘤的理想靶点药物，核受体以一种配体依赖的调控模式參与正常細胞或癌細胞的许多不同的生物学过程，參与細胞増殖、分化、凋亡、免疫、代谢等人体几乎所有的生理过程，人类许多疾病的发生均可能与其异常调控有关。因此，该基因家族被认为是发现和开发预防与治疗癌症、肿瘤药物的ー个理想的靶点。核受体被认为是继细胞跨膜受体、激酶之后最重要的分子靶点。据2002统计， 美国百强处方药中有16种药物是针对核受体，其中包括Wyeth Ayerst, Glaxo Wellcome, SmithKline Beecham，Lilly和Roche等著名制药公司。针对核受体靶点家族已成功开发了许多药物，并在临床上广泛用于治疗癌症、糖尿病、心血管疾病以及脑痴呆等各种疾病，例如用于治疗前列腺癌的针对雄性激素受体(AR)的Casodex ；用于治疗心脏衰竭的针对皮质激素受体(MR)的Aldactone ；用于治疗糖尿病的针对过氧化物酶体增生受体(PPAR)开发的药物Avandia ；用于治疗痤疮的针对维甲酸受体(RAR)的Accutane以及厦门大学张晓坤教授开发用于治疗皮肤癌的针对视黄醇受体(RXR)的专利药Targretin等等。Nur77是ー种类固醇_甲状腺激素_类维生素A类转录因子，由于其配体并未被鉴定确认，因此被称作孤儿核受体。孤儿受体Nur77又称为TR3或NGFI-B，是核受体超家族的中药成员，是ー种立刻早起基因，其表达可以被血清、生长因子、十四烷酰佛波醋酸酷-13(TPA)以及钙信号迅速诱导。Nur77是ー种細胞存活因子，可以介导多种存活信号通路，包括蛋白激酶A、蛋白激酶C、MAPK和NF-κ B通路；Nur77也是ー种促凋亡因子，它可以对多种凋亡因子，如钙离子载体、佛波酯、镉等做出应答。目前研究表明Nur77虽然通常情况下存在于細胞核中，但在某种情况下，也能转
3移到线粒体中，并引起线粒体膜的滲透性变化，最终导致細胞凋亡。最近发现，一直被认为是通过诱导凋亡前期基因来诱导凋亡的转录因子P53也可以从細胞核转移到线粒体，并同 ー种热休克蛋白Hsp70相互作用。Nur77作为p53对线粒体的特异性靶标，可以防止抗凋亡蛋白Bcl-2阻止线粒体膜的滲透性变化，从而促进凋亡的发生，导致細胞死亡。同样，在某种情况下，Nur77又可以通过对线粒体的局部作用来完成类似于其它因子的凋亡前期功能，在受到凋亡诱导剂刺激后，Nur77从細胞核移位至細胞质，并与线粒体膜发生结合，导致細胞色素c释放，从而启动凋亡过程。同吋，Nur77还能够与另ー細胞核内受体视黄醇X受体(RXRs)结合成异源ニ聚体并移位到細胞质，作用于线粒体上的Bcl-2，使后者从抗凋亡分子转化为促凋亡分子，从而促进凋亡的产生。最新研究表明来源于Nur77的ー个9个氨基酸序列的小肽片段NuBCP-9及其对映体，可以直接作用于Bcl-2，通过改变Bcl-2的构象， 将Bcl-2由抗凋亡蛋白转变为促凋亡蛋白。这ー研究结果表明作用于Nur77的小分子化合物很有可能通过这ー机制发挥独特的抗癌作用。对核受体TR3诱导表达用于疾病预防和治疗的研究目前主要有申请号为 200810027772.9的中国发明专利申请公开具有诱导核受体TR3表达的强心苷类化合物，该强心苷类化合物具有以下通式其中=R1为CH3、CHO或CH2OH ；も为H或OH ；民为H或OH ；R4为糖类所组成的直链糖链或支链糖链。该强心苷类化合物，能够诱导核受体TR3表达，从而可以作为诱导剂应用于制备预防和治疗癌症、肝炎、动脉粥样硬化等药物；申请号为200810200713. 7的专利申请公开了一种用于制备治疗癌症的药物--紫草素衍生物，该药物以孤儿受体Nur77作为作用靶点，该紫草素衍生物通过作用于孤儿受体Nur77，诱导肿瘤細胞凋亡，达到治疗癌症的目的。

发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于熊胆的具有核受体调节作用的化合物异黄酮， 其制备方法及其在抗肿瘤药物中的应用。为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种核受体Nur77的诱导剂4'-甲氧基-7-羟基异黄酮的制备方法，包括依次进行的步骤1)对熊胆粉进行提取处理，制得熊胆醇提物，其中提取溶剂为甲醇或乙醇ツ)对熊胆醇提物依次进行大孔树脂柱分离、硅胶柱层折，反相硅胶柱层折，即得。
其中，步骤1)中所述提取溶剂甲醇或乙醇的体积与熊胆粉的重量之比为 8-16 1，即当熊胆粉的重量(干重)为Ikg吋，甲醇或乙醇的体积为8-16L;当熊胆粉的重量(干重)为Ig吋，甲醇或乙醇的体积为8-16ml。特别是，步骤1)中所述熊胆醇提物按照如下步骤制得将熊胆粉加入到甲醇或乙醇中，搅拌，接着进行超声提取，然后过滤，收集滤液，滤液干燥，即得。特別是，超声提取的时间为30-60min。特別是，采用超声提取熊胆粉2-3次，每次提取溶剂甲醇或乙醇的体积与熊胆粉的重量之比为4-8 1，即当熊胆粉的重量(干重)为Ikg吋，甲醇或乙醇的体积为4-8L ； 当熊胆粉的重量(干重)为Ig吋，甲醇或乙醇的体积为4-8ml。其中，步骤2)中所述大孔树脂柱分离包括如下步骤A)向熊胆醇提物中加入蒸馏水，溶解，制成熊胆水溶液；B)将熊胆水溶液上大孔树脂柱，进行梯度洗脱，分离，其中流动相依次为蒸馏水、 质量百分比浓度为40-70%的乙醇溶液，分别收集洗脱液；C)将流动相为质量百分比浓度为70%的乙醇溶液的洗脱液蒸干，得到熊胆树脂柱分离物。特别是，步骤A)中熊胆醇提物与蒸馏水的重量体积比为1 7-10，优选为 1 8-9。其中，步骤B)中采用D101、D-201、AB-8或HP-20型非极性大孔吸附树脂中的ー种进行所述的大孔树脂柱梯度洗脱，优选为HP-20型大孔树脂。特别是，步骤B)中所述大孔树脂与所述熊胆醇提物的重量之比为10-40 1，优选为14-15 1 ；所述大孔树脂柱分离过程中的流动相依次为蒸馏水，质量百分比浓度为 20%、40%、70%的乙醇溶液。尤其是，还包括在以流动相为质量百分比浓度为70%的乙醇溶液进行洗脱后，在以质量百分比浓度为95%的乙醇溶液继续洗脱。特别是，所述大孔树脂柱的柱直径与柱高之比为1 1-10，优选为1 2-3。特别是，步骤B)中所述各流动相的体积与熊胆醇提物的重量之比分别为 60-90 1，即当熊胆醇提物重量(干重)为Ikg吋，流动相的体积为60-90L，当熊胆醇提物重量(干重)为Ig吋，流动相的体积为60-90ml，优选为65-70 1。其中，步骤幻中所述硅胶柱层析包括如下步骤A)将经过大孔树脂柱分离后得到的熊胆树脂柱分离物，拌入硅胶，干燥得到硅胶层析样品；B)将硅胶层析样品置于硅胶柱顶部，以体积之比为99 1-1 1的氯仿-甲醇溶液为洗脱剂，进行硅胶柱梯度洗脱，收集洗脱液；C)收集体积比为1 1的氯仿-甲醇混合溶液为洗脱剂的洗脱液，蒸干，即得熊胆硅胶柱层析物。特别是，步骤A)中所述熊胆树脂柱分离物与硅胶的重量比为1 1-5;所述拌样硅胶为60-100目硅胶。特别是，步骤B)中所述硅胶柱中吸附剂硅胶与熊胆树脂柱分离物的重量之比为 5-30 1，优选为15-20 1，进ー步优选为20 1 ；所述硅胶柱中的吸附剂硅胶的粒度为200-300目；硅胶柱的柱直径与柱高之比为1 2-10，优选为1 7。其中，步骤B)中所述的洗脱剂为体积之比依次为99 1、95 5、9 1、3 1、 1 1的氯仿-甲醇混合液。特別是，每个洗脱梯度的洗脱剂体积与熊胆树脂柱分离物的重量之比为 130-150 1，即当熊胆树脂柱分离物重量(干重)为Ikg吋，流动相的体积为130-150L，当熊胆树脂柱分离物重量(干重)为Ig吋，流动相的体积为130-150ml。其中，步骤幻中所述反相硅胶柱层析过程中的填料为十八烷基硅烷键合硅胶 (ODS)；特別是，填料十八烷基硅烷键合硅胶与硅胶柱层析物的重量之比为8-35 1，优选为10-20 1，进ー步优选为15 1。其中，所述反相硅胶柱层析过程中流动相为甲醇水溶液，其中，甲醇与水的体积之比为2 8-9 1，优选为3 7-8 2，进ー步优选为6.5 3.5。本发明另一方面提供一种按照上述方法制备而成的核受体Nur77的诱导剂 4'-甲氧基-7-羟基异黄酮。本发明又一方面提供ー种4'-甲氧基-7-羟基异黄酮在制备诱导核受体Nur77 表达的诱导剂中的应用。其中，4'-甲氧基-7-羟基异黄酮作为诱导剂在制备预防和治疗与核受体Nur77 相关的人类疾病的药物中的应用。特別是，4'-甲氧基-7-羟基异黄酮作为诱导剂在制备预防和治疗癌症、肿瘤药物中的应用。特别是，所述的癌症、肿瘤选自白血病、急性粒細胞性白血病、结肠癌、乳腺癌或宫颈癌。其中，本发明药物由4'-甲氧基-7-羟基异黄酮和药学上可接受的辅料组成；通过ロ服、舍下、经皮、肌肉、皮下、皮肤黏膜、静脉途径给药。特別是，药物按照常规方法制成的散剤、片剂、胶囊剂、丸剤、栓剂、滴丸剂、肠溶齐U、注射剂、糖浆剂、乳剤、混悬剂、锭剂、膏剂、喷雾剂等剂型，用于制备Nur77的诱导剂及制备预防和治疗与核受体Nur77相关疾病，如抗癌症药物、抗肿瘤药物。ロ服给药可制成片剂、散剤、颗粒剂、胶囊剂等常用剂型，至少需要一种赋形剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖、羟甲基纤维素等，除了这些赋形剂以外，还可以使用硬脂酸镁、月桂醇硫酸钠、滑石粉等作为润滑剤；糊精、结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶等作为粘合剤；马铃薯淀粉、羟己基纤维素作为崩解剂。此外还可以制成糖浆剂、乳剂、混悬剂等，对于这些剂型，可以加入矫味剂、矫臭剂等。外用剂型包括栓剂、软膏剂、外用散剤、喷雾剂、灌肠剂、乳剂等，对于软膏剂，选用水、脂肪、脂肪油、羊毛脂、凡士林、甘油、蜂蜡、石蜡、液体石蜡、树脂等組成的疏水性基质或亲水性基质等在内的添加剤。制成注射剂时，一般是用注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水溶液、直射用植物油、 丙ニ醇、聚乙ニ醇等，必要时还可以加入适宜的等张剂、助溶剂、抗氧化剂、防腐剂等。本发明的优点表现如下1、本发明的4'-甲氧基-7-羟基异黄酮能够显著上调Nur77mRNA的表达，其对Nur77mRNA转录水平的影响与佛波酯(TPA)的相似，可作为作为核受体Nur77表达的诱导剂。2、本发明的4'-甲氧基-7-羟基异黄酮在低浓度(ΙΟμπιοΙ/L)下即可强烈诱导 Nur77蛋白的表达，使Nur77蛋白的表达显著提高，说明4'-甲氧基-7-羟基异黄酮可以有效诱导Nur77蛋白的表达，具有成为核受体调节作用的新型抗肿瘤药物的潜力。3、本发明的4'-甲氧基-7-羟基异黄酮对Nur77蛋白表达量随药物浓度的増大而増大，并且4‘-甲氧基-7-羟基异黄酮在有效浓度范围内对Nur77蛋白的表达表现出很好的量效关系。4、本发明的4'-甲氧基-7-羟基异黄酮抗癌的效果显著，对HCT-8结肠癌細胞、 MCF-7乳腺癌細胞和Hela宫颈癌細胞具有很好的选择性細胞毒性作用，对HCT-8结肠癌细胞的半抑制浓度(IC5tl)为12. 5 μ M ；对MCF-7乳腺癌細胞的半抑制浓度(IC5tl)为8. 3 μ M ； 对Hela宫颈癌細胞的半抑制浓度(IC5tl)为1. 59 μ Μ。5、本发明的4'-甲氧基-7-羟基异黄酮对肿瘤的抑制效果显著，促使肿瘤細胞的凋亡，肿瘤抑制率达到51 %以上。因此，由于核受体Nur77的表达与多种人类疾病相关，因此，本发明的4'-甲氧基-7-羟基异黄酮可以作为诱导剂应用于制备治疗和预防与核受体Nur77相关的人类疾病的药物。


图1是4 ‘-甲氧基-7-羟基异黄酮对核受体Nur77的mRNA表达的凝胶电泳图；图2是4'-甲氧基-7-羟基异黄酮对核受体Nur77蛋白质表达的凝胶电泳图；图3是不同浓度的4'-甲氧基-7-羟基异黄酮对核受体Nur77蛋白质表达的凝胶电泳图。附图标记说明1.空白对照；2.阳性对照(TPA)；3.4'-甲氧基-7-羟基异黄酮溶液(浓度4.4'-甲氧基-7-羟基异黄酮溶液(浓度5.4'-甲氧基-7-羟基异黄酮溶液(浓度
具体实施例方式本发明的主要药效学试验方法及结果如下试验例1 -甲氧基-7-羟基异黄酮对核受体Nur77的调节作用1. 1材料与仪器实验細胞人HCT-8结肠癌細胞实验仪器細胞培养箱美国Thermo公司离心管比利时Orange Scientific公司一次性培养皿及6孔培养板比利时Orange kientific公司1μ mol/L)； :10ymol/L)； 100μ mol/L)ο
湿式转移槽 Millipore超纯水仪 PCR仪
凝胶成像系统主要试剂
単体化合物4'-甲氧基-7-羟基异黄酮(实施例1制备得到)； HCT-8人结肠癌細胞； 佛波酯(TPA)(美国!Iomega公司)
DMEM培养基、trizol裂解剂、随机六聚体引物(Random hexamer primer) ,5X反拽缓冲液(Reaction buffer)、逆转录 _ (RevertAid M-Mulv Reverse Transcriptase)、 RNA 酶抑制剂(Ribolock Ribonuclease inhibitor)、dNTP 混合物，蛋白标记(Marker), 6 X Loading buffer (均购 _ Invitrogen 公 ロコ)；胰酶消化液，青霉素，链霉素，溴化乙啶(EB)，琼脂糖，苯甲基磺酰氟(PMSF)， 0. 05%胰蛋白酶；β -actin 3'端及5'端引物、Nur773'端及5'端引物(厦门闽博生物技术有限公司)胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司提供，使用前于56°C灭火30min)；DEPC水(用于RNA提取时各种塑料用品的浸泡及RNA溶解)；PCR 试剂盒(Fermentas 公司)；Quick Start Bradford Dye Reagent, IX 试剂盒(BIO-RAD 公司)ECL化学发光检测试剂盒(购自Thermo公司)rTaq 酶(TaKaRa 公司)；缓冲液及其他溶液1)缓冲液a. PBS :137mmol/L NaCl,2. 7mmol/L KCl, lOmmol/L Na2HPO4, 2mmol/L KH2PO4 用盐酸调节pH至7. 4。b. 50XTAE :2mol/L Tris ；1. Omol/L NaAc ；0. 5mol/L EDTA(pH 8. 0)。c. 6XDNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液0. 25%溴酚兰；30%甘油水溶液。幻RIPA细胞裂解液50mmol/L Tris_cl(pH7. 4) ； 150mmol/L NaCl ；lmmol/L EDTA ；1% Triton ；
1 % NaDoC ；0. 1 % SDS ； lmmol/L PMSF ；5 μ g/ml Aprotenin ；5 μ g/ml Leupeptasin03)蛋白质电泳相关试剂a.分离胶用 Tris 缓冲液1. 5mol/L，ρΗ8· 8 ；b.积层胶用 Tris 缓冲液:lmol/L, pH 6. 8 ；c. 2XSDS 凝胶加样缓冲液100mmol/L Tris-HCl (pH 6. 8)，200mmol/L ニ硫苏糖醇(DTT)，4% SDS，0.2%溴酚蓝，20%甘油，10% β-巯基乙醇；d.电泳缓冲液=Tris-Hcl 3. 03g ；甘氨酸18. 77g ；SDS Ig溶于IOOOmL蒸馏水中；e.电转液Tris 3. 03g，甘氨酸14. 4g，溶于900mL蒸馏水中，再加入IOOmL甲醇；f. IXTBST :10mmol/L Tris-HCl (pH 7. 5), 150mmol/L NaCl,0. 1% Tween-20 ；g.封闭液5% (ff/V)脱脂奶粉溶于1 X TBST中。1.2实验方法及结果1. 2. 14'-甲氧基-7-羟基异黄酮对Nur77dmRNA表达的影响采用RT-PCR进行分析。RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技木。 首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测細胞中基因表达水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。(一)配制4'-甲氧基-7-羟基异黄酮及阳性对照佛波酯(TPA)溶液将上述制备的4'-甲氧基-7-羟基异黄酮溶解于ニ甲基亚砜(DMS0)，制成浓度为lmmol/L UOmmol/L及IOOmmol/L的4'-甲氧基-7-羟基异黄酮溶液；将阳性对照佛波酯(TPA)溶于DMS0，制得浓度为100 μ g/mL的佛波酯溶液。(ニ)HCT-8人结肠癌細胞培养将液氮冻存HCT-8人结肠癌細胞于37°C迅速解冻复苏，孵育于含10%胎牛血清， 100U/ml青霉素，100U/ml链霉素的DMEM培养基中，在37°C、5% CO2培养箱中培养。传代时吸去培养液，PBS洗2次，加适量胰酶消化液，在培养箱中静置2-5min，显微镜下观察細胞变圆后，用添加胎牛血清的DMEM培养基终止胰酶的消化，将消化液用移液枪加入1. 5mL离心管中，SOOrpm离心％iin，吸去上清液后，加入DMEM培养液，用移液枪吹成单细胞悬液，即 HCT-8人结肠癌单细胞悬液。(三)4'-甲氧基-7-羟基异黄酮诱导HCT-8细胞Nur77mRNA的表达1、細胞培养将HCT-8人结肠癌单细胞悬液分传至6孔板，至細胞生长到大约占孔板底面积的 80%吋，吸去培养液，换上2ml新鮮的DMEM培养基(胎牛血清的含量为10% )，分別加入 2 μ L浓度为lmmol/L和lOmmol/L的4'-甲氧基-7-羟基异黄酮溶液，37°C，5% CO2培养箱中培养他；同时，以加入2 μ Lニ甲基亚砜(DMSO)溶液作为空白对照，以加入2μ L 100 μ g/ mL的TPA溶液作为阳性对照。2、总RNA的提取1)将培养的各HCT-8細胞培养液吸去上清液后，加入600 μ 1 Trizol裂解剂，反复吹打至細胞脱落，得到細胞裂解物，将细胞裂解物转移到1.5mL EP管中。2)室温(25°C)下放置5min后，加入150 μ 1氯仿，盖紧EP管，用カ摇晃15s，再于室温下放置:3min后在4°C，12000g离心15min，吸取上层水相至另ー EP管中。3)向上述上层水相中加入0. 5mL异丙醇，于室温下放置IOmin后，于4°C，12000g 离心lOmin，倒掉离心上清液，RNA沉于离心管底。4)向底部沉淀RNA的EP离心管中加入ImL 75%的乙醇，用移液枪轻轻吹打RNA 沉淀，使RNA沉淀悬浮于乙醇中，然后在4°C，SOOOg离心5min，倒掉上清液，将沉淀于室温下晾干lOmin，得到RNA样品。5)向RNA样品中加入30μ L DEPC水，在55°C下恒温水浴lOmin，使沉淀溶解，测定 RNA溶液的OD值，计算RNA溶液的浓度，即得到4'-甲氧基-7-羟基异黄酮、空白对照及阳性对照诱导HCT-8細胞后細胞的RNA溶液。3、RNA 反转录1)向各个PCR管内加入2μ 1上述浓度为750ng/y 1的RNA溶液，再向各个PCR管中加入1μ 1随机六聚体引物(Random hexamer primer)及DEPC水，使各个PCR管中溶液总体积为12μ 1，将各PCR管低速离心几秒，使混合液混勻；2)将上述各PCR管放入70°C水浴中，5min后取出，立即放于冰上，低速离心混勻；3)于冰上，向各个PCR管中依次加入5X反应缓冲液4μ 1，RNA酶抑制剂 (Ribolock Ribonuclease inhibitor, 20u/μ 1) 1 μ 1 及 dNTP 混合物(IOmM) 2 μ 1，低速离心几秒后，室温放置5min ；4)向上述各个PCR管中加入逆转录酶(RevertAid M-Mulv Reverse Transcriptase) 1 μ 1，使各PCR反应的反应总体积均为20 μ 1 ；5)将上述各反应体系于室温(25°C )下放置lOmin，再于42°C水浴60min ；6)将上述反应各体系于70°C下水浴IOmin终止反应，然后立即放在冰上冷却，即得到4'-甲氧基-7-羟基异黄酮ひ讓は/し川讓は/！入空白对照及阳性对照诱导!!^^ 細胞后細胞的DNA溶液；各DNA溶液均于_20°C进行保存。4、引物设计1)从基因库中查找人类基因Nur77的序列，其在基因库中人类基因Nur77的登录号为 NM_00213。2)通过PCR引物设计软件Primer Premier 5. O寻找基因Nur77的保守序列。3)运用PCR引物设计软件Primer Primer 5. O设计如下四个引物5 ‘ Nur77 (目的片段)TCATGGACGGCTACACAG-----------18bp3 ‘ Nur77 (目的片段)GTAGGCATGGAATAGCTC-----------18bp5' β-actin(内參)CTAAAACTAC-------------------IObp3' β-actin(内參)TATATTAATA-------------------IObp5、PCR 反应1)将所有下述參与PCR反应的溶液解冻后，混勻；2)将PCR反应溶液按照下述体积依次加入PCR管中，所有操作均在冰上进行DEPC 水10. 3μ1IOXbuffer2. 5 μ 1
10
dNTP混合物2.,0μ 1
3' Nur770.,5μ 1
5' Nur770.,5μ 1
β -actin30.5 μ 1
β -actin50.5 μ 1
rTaq 酶0.,2μ 1最后，再向各？0 管中分别加入上述浓度分别为1レ11101/し1(^11101/1的4'-甲氧基-7-羟基异黄酮、空白对照及阳性对照诱导HCT-8細胞后細胞的DNA溶液3 μ 1，使各 PCR管中总体积20 μ 1。3)将上述PCR管低速离心几秒后放入PCR仪中，设定PCR仪程序如下95°C，5min变性94 °C，30s退火55°C，30s延伸72°C，30s72°C, IOmin循环次数30即得到各PCR产物。6、凝胶电泳检测将上述各PCR产物用琼脂糖胶进行电泳分析，结果如图1。由图1可见， 在ΙΟμπιοΙ/L浓度下，4'-甲氧基-7-羟基异黄酮可显著上调Nur77mRNA的表达，其对 Nur77mRNA转录水平的影响与阳性对照TPA (lOOng/mL)的相似，提示4'-甲氧基-7-羟基异黄酮为核受体Nur77的诱导剂。1. 2. 24'-甲氧基-7-羟基异黄酮对Nur77蛋白质表达的影响采用蛋白质印迹(Western Blotting)方法进行蛋白质分析。Western Blotting，又称蛋白质印迹，与Southern印迹杂交或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体， “显色”用标记的ニ杭。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素膜 NC膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。(一)HCT-8人结肠癌細胞培养将HCT-8人结肠癌細胞孵育于含10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素的DMEM培养基中，在37°C、5% CO2培养箱中培养。传代时吸去培养液，PBS洗2次，加适量胰酶消化液，在培养箱中静置2-5min，显微镜下观察細胞变圆，用添加胎牛血清的DMEM培养基终止胰酶的消化，将消化液用移液枪加入1. 5mL离心管中，SOOrpm离心％iin，吸去上清液后，加入含10%胎牛血清DMEM培养液，用移液枪吹成单细胞悬液。(ニ)4'-甲氧基-7-羟基异黄酮诱导HCT-8細胞Nur77蛋白的表达1、細胞培养
将上述培养的HCT-8单细胞悬液分传至6孔板，至細胞生长到大约占孔板底面积的80%吋，吸去培养液，换上2ml新鮮的含有0. 5%胎牛血清的DMEM培养基，分別加入2 μ L 浓度为lOmmol/L的4'-甲氧基-7-羟基异黄酮，37 °C，5% C02培养箱中培养他；同吋，以加入2 μ LDMSO作为空白对照。2、细胞收集将上述培养的細胞用4°C的缓冲液PBS洗三次，加入ImL含lmmol/L苯甲基磺酰氟 (PMSF)的PBS，将细胞收集到1. 5mL离心管中，于4°C，2000rpm离心lOmin，倒掉上清液。3、細胞裂解向每个离心管中加入40 μ L RIPA細胞裂解液裂解30min，其间，在振荡器上每隔 5min振荡10s，然后在4°C，12000rpm离心lOmin，收集上清液，即蛋白样品。4、蛋白浓度的測定按照BIO-RAD 公司的 Quick Start Bradford Dye Reagent，1 X 试剂盒的说明测定上述各蛋白样品的浓度。5、蛋白凝胶电泳按照各蛋白样品的浓度換算后，分別取50μ g蛋白样品，加入等体积的2XSDS上样缓冲液(含10% β-巯基乙醇)，100°C煮lOmin，离心后于TriS-甘氨酸缓冲液中进行电泳(80V，过分离胶后100V)，其中，每板电泳加入5μ L蛋白标记(Marker)。6、电转移用与蛋白电流凝胶同样大小的PVDF膜(提前用无水甲醇浸泡lmin)和滤纸预先浸于电转液中，PVDF膜贴于胶后，赶尽气泡，两面覆盖滤紙，赶尽气泡，按膜朝正极的顺序装于电转槽中，加入电转液和冰袋，于4°C冰箱中进行电转移(100V，60min)。7、抗原抗体反应1)封闭将电转移后的PVDF膜于含5%的脱脂牛奶的TBST缓冲液中室温封闭 lh；2) 一抗反应将封闭后的PVDF膜封于杂交袋中，按0. lmL/cm2加入ー抗 anti-Nur77 (Santa Cruz 公司，浓度 1 1000)于 4°C 摇床上过夜；3) c. ニ抗反应将PVDF膜于TBST缓冲液中摇洗3次，每次5min，之后在相应的ニ 抗(山羊抗兔ニ抗，浓度1 10000，Santa Cruz公司)中室温孵育lh。8、ECL化学发光检測倒掉ニ杭，用TBST缓冲液洗膜，室温摇洗三次，毎次5min，蛋白面朝上，置于保鲜膜中，将ECL化学发光检测试剂盒的A液和B液以1 1(V/V)混和，于暗室中，按 0. 05-0. lmL/cm2的量滴加于膜表面，孵育lmin，用滤纸吸去多余液体，封好膜后，立即于暗室中曝光，显影，结果如图2、3。由图2可知，4'-甲氧基-7-羟基异黄酮在lOymol/L浓度下即可强烈诱导Nur77 蛋白的表达。在ΙΟμπιοΙ/L浓度下，即可使Nur77蛋白的表达显著提高，说明4'-甲氧基-7-羟基异黄酮可以有效诱导Nur77蛋白的表达，具有成为核受体调节作用的新型抗肿瘤药物的潜力。由图3可知4'-甲氧基-7-羟基异黄酮在ΙΟμπιοΙ/L和ΙΟΟμπιοΙ/L的浓度条件下可明显诱导Nur77蛋白的表达，且Nur77蛋白表达量随药物浓度的増大而增大；而4'-甲氧基-7-羟基异黄酮在1 μ mol/L的浓度条件下诱导Nur77蛋白的表达并不明显， 这些结果显示4'-甲氧基-7-羟基异黄酮在有效浓度范围内对Nur77蛋白的表达表现出很好的量效关系。试验例-甲氧基-7-羟基异黄酮的体外抑瘤实验采用MTT法测试4'-甲氧基-7-羟基异黄酮对肿瘤細胞的抑制作用。选融合度在80 %，对数期生长的細胞，用胰酶消化，转移，离心，去上清液，用新配制的含10% FBS(灭活的胎牛胎血清)的DMEM培养液混悬。各种细胞仪1. OX IO4万/孔接种于96孔培养板，均同时依次加入5个不同稀释度的待筛样品药液，每个稀释度重复3 个孔，同时平行做相同浓度的溶剂对照和不加药的阴性对照，37°C培养72小吋，MTT染色， DMSO脱色，測定OD57tl,计算肿瘤生长抑制率顶(％ )，其中顶=(空白OD平均值-给药组OD平均值)/空白OD平均值X 100%试验结果如表1所示，4'-甲氧基-7-羟基异黄酮对人体的10种肿瘤細胞非小肺癌細胞H-460，A549与Calu_6 ；前列腺癌細胞LNCaP ；乳腺癌細胞MCF-7 ；结肠癌細胞 SW-480、HCT-8、HCT-116 ；宫颈癌細胞Hela ；肝癌細胞H印G2的増殖具有不同程度的抑制作用。表14'-甲氧基-7-羟基异黄酮的体外抑瘤实验数据
权利要求
1.一种核受体Nur77的调节剂4'-甲氧基-7-羟基异黄酮的制备方法，包括依次进行步骤1)对熊胆粉进行提取处理，制得熊胆醇提物，其中提取溶剂为甲醇或乙醇；2)对熊胆醇提物依次进行大孔树脂柱分离、硅胶柱层析、反相硅胶柱层折，即得。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤2)中采用D101、D-201、AB-8或HP-20 型非极性大孔吸附树脂中的一种进行所述的大孔树脂柱分离。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是步骤幻的所述硅胶柱层析过程中硅胶与熊胆醇提物经过大孔树脂柱分离后制得的熊胆树脂柱分离物的重量之比5-30 1。
4.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是步骤2)的所述反相硅胶柱层析过程中填料十八烷基硅烷键合硅胶与经硅胶柱层析制得的熊胆硅胶柱层析物的重量之比 8-35 1。
5.ー种4'-甲氧基-7-羟基异黄酮在制备诱导核受体Nur77表达的诱导剂中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征是在制备预防和治疗与核受体Nur77相关的人类疾病的药物中的应用。
7.如权利要求5所述的应用，其特征是在制备预防和治疗癌症、肿瘤药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征是所述的癌症、肿瘤选自白血病、急性粒細胞性白血病、结肠癌、乳腺癌或宫颈癌。
9.如权利要求7所述的应用，其特征是药物由4'-甲氧基-7-羟基异黄酮和药学上可接受的辅料组成。
10.如权利要求7所述的应用，其特征是药物是通过ロ服、舍下、经皮、肌肉、皮下、皮肤黏膜、静脉途径给药。
全文摘要
本发明涉及诱导核受体Nur77表达的异黄酮类化合物4′-甲氧基-7-羟基异黄酮的制备方法及其应用。本发明所述的4′-甲氧基-7-羟基异黄酮化合物，能够诱导核受体Nur77表达，从而可以作为诱导剂应用于制备预防和治疗癌症、肿瘤等药物。
文档编号A61K31/352GK102584767SQ20111000310
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月7日 优先权日2011年1月7日
发明者何加友, 吴华, 吴德培, 张晓坤, 曾锦章, 罗强, 陈丽玲, 陈志鸿, 陈海峰 申请人:福建归真堂药业股份有限公司