专利名称：Tob1基因在制备抑制乳腺癌转移的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因药物领域，具体涉及7 97基因(抗增殖蛋白家族成员Tobl, transducer of ErbB2，1)在制备抑制乳腺癌转移药物中的应用。
背景技术：
侵袭、转移是恶性肿瘤的重要表现之一，也是恶性肿瘤患者死亡的主要原因。乳腺 癌是目前最常见的女性恶性肿瘤性疾病，约1/3乳腺癌病人在确诊时已有转移灶的发生， 而远处转移也是治疗最终失败并致患者死亡的主要原因之一。相关研究表明，乳腺癌转移 是涉及多基因、多步骤的复杂过程，与互相关联的诸多因素有关如细胞外基质和基底膜的 降解与破坏、细胞骨架重构引起细胞运动与迁移，以及肿瘤血管和淋巴管生成等，这些均受 到乳腺癌转移相关基因的调控。抗增殖蛋白家族成员TOBl是新近报道的乳腺癌抑制基因，研究发现TOBl蛋白能 通过多种机制显著抑制乳腺癌细胞MCF-7的生长，其基因功能的缺失还与乳腺癌的进展有关。另外，发明人所在课题组研究了抗增殖蛋白Tb似对人类宫颈癌细胞系 HeLa放射敏感性的影响为探讨抗增殖蛋白家族成员Tobl (transducer of ErbB2， 1)对宫颈癌细胞系He La放射敏感性的影响，构建可表达Tb力7基因全长的重组质粒 pcDNA3. Q-Tobl (pc3-W)，采用脂质体介导转染入HeLa细胞，经G418筛选出阳性耐抗 克隆。通过集落形成实验研究Tb力7对HeLa细胞放射敏感性的影响，借助流式细胞术和 WesternBlot法检测相关分子机制。结果显示，较之HeLa母细胞和转染〃空〃质粒pcDNA3. 0 的HeLa/pC3细胞，转染pc3/7^7后HeLa细胞放射敏感性明显增加-,Tobl蛋白高表达增加 了 HeLa细胞中由辐射诱导的细胞凋亡，提高了由辐射引起的Bax蛋白的表达，降低了 Bcl2 蛋白表达。上述结果提示Tobl提高了 HeLa细胞对电离辐射的敏感性，其机制可能与其上 调Bax蛋白的表达、下调Bcl2蛋白的表达，从而增加由辐射诱导的细胞凋亡有关(参见焦 旸，徐加英，车俊，樊赛军.辐射研究与辐射工艺学报.2010年04期)。然而TOBl基因在制备抑制乳腺癌转移药物的应用国内外至今未见报道。
发明内容
本发明目的是提供一种TOBl基因的新应用，即TOBl基因在制备抑制乳腺癌转移 药物中的应用。为达到上述目的，本发明采用的技术方案是-.TOBl基因在制备抑制乳腺癌转移药 物中的应用，具体的，脂质体介导的真核表达质粒PC3-7H97在制备抑制乳腺癌转移药物中 的应用。本发明同时要求保护一种抑制乳腺癌转移药物，所述抑制乳腺癌转移药物的活性 成分包括携带TOBl基因的真核表达质粒，优选的技术方案中，所述携带7 97基因的真核表 达质粒为真核表达质粒PC3-7H97。
上述技术方案中，真核表达质粒PC3-7H97的制备方法为现有技术，可以参见文 献焦旸，徐加英，车俊，樊赛军.辐射研究与辐射工艺学报.2010年04期。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点
本发明所述TH^基因通过抑制多种乳腺癌转移相关蛋白的表达，抑制乳腺癌细胞的 远处转移。因此，本发明可以针对在乳腺癌发病早期即能发生远处转移、从而导致不良预后 的情况，直接给予阻断乳腺癌转移的TOBl基因治疗药物，使患有高侵袭性乳腺癌的患者得 到及时治疗，有效提高患者的生存率。
附图1为实施例中成功筛选的TOBl过表达的乳腺癌细胞系MDA-MB-231的RT-PCR 结果附图2为实施例中TOBl过表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231体外侵袭实验结果图； 附图3为实施例中TOBl过表达抑制MDA-MB-231细胞体外迁移能力测试实验结果图； 附图4为实施例中TOBl过表达引起MDA-MB-231中肿瘤转移相关基因表达水平的改变 的结果图。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述 实施例一
1材料和方法
1. 1 材料高侵袭性人乳腺癌细胞株MDA-MB-231购于美国细胞收藏中心(ATCC)， 重组真核表达质粒pcDNA3. O-Tb力7 (pc3-7b力7)自行构建和保藏。RPMI1640细胞培 养基、0. 25%胰酶、胎牛血清、谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素-链霉素双抗、脂质体 Lipofectamin、G418 和 Trizol 等均购自美国 Invitrogen 公司；Supper Array Oligo 基因 芯片与Truelabeling-AMP标记试剂盒购于美国SABiosciences公司；Matrigel由美国BD 公司购得；实验所需其余有机、无机试剂均购自上海生工。1.2细胞培养与质粒稳定转染
细胞采用含5%胎牛血清的RPMI1640细胞培养基，置于37°C、5%C02恒温恒湿条件下常 规培养，每2d换液1次，3d-4d传代1次。Tobl重组真核表达质粒pc3-7H97和“空”质粒 pc3-neo经脂质体介导转染入MDA-MB-231细胞，继续在含500 μ g/ml G418的完全培养液中 培养至有耐抗克隆的生成。另设置一组空白组，为未加任何处理的MDA-MB-231细胞。1. 2. 2采用RT-PCR法验证转染了真核表达质粒pc3-7H97的MDA-MB-231细胞株 能否成功获得过表达TOBl 总RNA采用Trizol法进行提取，经紫外分光光度法测定浓度与 纯度后，经MMV-cDNA合成试剂盒合成第一链DNA，采用Green Master Mix PCR反应试剂进 行特异性基因扩增。实验所需引物由上海生工合成SEQ ID Ν0:1，7 97(正向引物):5’-GTG GAT CCA TGC AGC TTG AAA TCC AAG TA-3，，SEQ ID NO :2，(反向引物)5' - TTT TTT TAG TTA GCC ATA ACA GGC TGG AA-3，；SEQ ID NO ·. ,,GAPDH (正向引物):5，-CAA CTA CAT GGT CTA CAT GTT CC-3，，SEQ ID NO :4，(反向引物):5，-CAA CCT GGT CCT CAG TGT AG-3，。PCR 反应条件参照文献焦旸，徐加英，车俊，樊赛军.辐射研究与辐射工艺学报.2010年04
结果如图1所示与作为对照组的母细胞和“空”质粒转染的MDA-MB-231相比， pc3-TOBl稳定转染后乳腺癌细胞MDA-MB-231中TOBl mRNA表达水平增加4至5倍左右； 而各组细胞中作为内参基因的似/ //表达水平无明显差别。因此，可知采用脂质体转染和 G418筛选成功获得可表达高水平TOBl蛋白的乳腺癌细胞MDA-MB-231。1.2.3采用Transwel 1人工基底膜体外侵袭实验检测TOBl高水平表达对高侵袭 性乳腺癌细胞系MDA-MB-231体外侵袭能力的影响使用前小室底膜常规经Matrigel胶稀 释液包被、水化。细胞经无血清RPMI1640重悬，调整密度为IX 106/ml，上室中加入IOOy 1 细胞悬液，下室中加入500 μ 1完全培养基，继续培养24h。取出小室，经PBS洗涤后进行二 甲苯固定和台盼蓝染色。于显微镜下观察穿膜细胞数，并计算穿过率，每膜取16个视野，每 组设3个复膜，求平均值。结果如图2所示，未转染和转染“空”质粒的对照组MDA-MB-231细胞穿透基底膜 的比率约为60%左右；而稳定高表达TOBl的乳腺癌细胞穿透人工基底膜的细胞数占接种细 胞数的比率降低至约10%，与对照组相比，穿透率显著降低0°<0.05)。1. 2. 4采用划痕实验检测TOBl对MDA-MB-231体外迁移能力的影响，
对数期细胞以IXlOfVml密度接种于6孔细胞培养板，待生长至完全融合后，用200 μ 1 加样枪头划痕。用PBS完全洗去漂浮细胞，每孔重新加入2ml RPMI1640完全生长培养基， 继续培养48h。采用Macintosh HD system在显微镜下观察并拍照记录各组细胞划痕的愈 合情况，以此检测其体外迁移能力。结果如图3所示过表达TOBl的细胞，其体外迁移能力较之对照组细胞有明显下 降趋势；划痕后48h，对照组(未转染质粒或转染“空”质粒pcDNA3. 0的细胞)划痕基本全部 愈合，而过表达TOBl的细胞仍存在明显划痕，基本未愈。1.2.5采用通路特异性的基因芯片法进行检测，分析7 97抑制乳腺癌细胞 MDA-MB-231体外侵袭、转移所涉及的机制SABioscienses Supper Array实验具体操作详 见试剂盒操作说明。简述如下总RNA采用Trizol法进行提取，经紫外分光光度法测定浓 度与纯度后，经TrueLabeling-AMP 2.0试剂盒合成并标记cRNA。各组标记好的cRNA与肿 瘤转移特异性Oligo芯片杂交、洗膜和显影后，通过X线胶片曝光，经BandScan软件进行图 像分析。结果发现，高表达TOBl的MDA-MB-231细胞中，多种肿瘤转移相关基因发生了明 显的表达改变肿瘤转移抑制基因的表达明显增加，而促进肿瘤转移的相关基因 HSP90、FXYD5、RHOC、S100A4 等的表达则明显降低 O°<0. 05)(图 4 )。1. 2. 6统计学分析本实施例中所有数据分析采用SPSS10. 0统计软件的t检验和 One-way ANOVA检验，P值<0. 05为差异有统计学意义。
权利要求
1.TOBl基因在制备抑制乳腺癌转移药物中的应用。
2.脂质体介导的真核表达质粒PC3-7H97在制备抑制乳腺癌转移药物中的应用。
3.一种抑制乳腺癌转移药物，所述抑制乳腺癌转移药物的活性成分包括携带TOBl基 因的真核表达质粒。
4.根据权利要求3所述乳腺癌转移药物，其特征在于，所述携带TOBl基因的真核表达 质粒为真核表达质粒W-TOBl0
全文摘要
本发明属于基因药物领域，具体涉及TOB1基因在制备抑制乳腺癌转移药物中的应用。本发明公开了一种抑制乳腺癌转移药物，所述抑制乳腺癌转移药物的活性成分包括携带TOB1基因的真核表达质粒。本发明所述TOB1基因通过抑制多种乳腺癌转移相关蛋白的表达，抑制乳腺癌细胞的远处转移。因此，本发明可以针对在乳腺癌发病早期即能发生远处转移、从而导致不良预后的情况，直接给予阻断乳腺癌转移的TOB1基因治疗药物，使患有高侵袭性乳腺癌的患者得到及时治疗，有效提高患者的生存率。
文档编号A61P35/04GK102139117SQ201110003119
公开日2011年8月3日 申请日期2011年1月7日 优先权日2011年1月7日
发明者樊赛军, 焦旸 申请人:苏州大学