专利名称：一种三金制剂的质量控制方法
技术领域：
本发明涉及一种药物制剂的质量控制方法，特别是涉及一种中药制剂，三金片的质量控制方法。
背景技术：
三金制剂是由金樱根、金刚刺(菝葜)、金沙藤、羊开口、积雪草等五味中药经过提取加工制成的中药制剂，市场上已有销售，其药理作用为抗菌，抗炎，消肿，清热，利尿，镇痛，抗氧自由基，提高机体免疫力等。功能主治为清热解毒，利湿通淋，益肾。用于下焦湿热、热淋，小便短赤，淋浙涩痛；急、慢性肾盂肾炎、膀胱炎、尿路感染属肾虚湿热下注证者。 三金片的配方和质量控制方法已经列入2000年版中国药典。并于2003年修订增加了含量测定项，修订后的质量标准中对三金片的描述如下处方金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草制法以上五味，加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1. 15 1. 20(50 60°C )的清膏，干燥；加入辅料适量，混勻，制成颗粒，压制成1000片(小片)或600片(大片)，包衣，即得。性状本品为糖衣片或薄膜衣片，除去包衣后，显棕色至黑褐色；味酸、涩、微苦。鉴别(1)取本品15片(小片)或10片(大片)，除去包衣，研细，加乙醇15ml， 超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加0. 01mol/L的氢氧化钠溶液20ml，微热使溶解，用乙醚IOml振摇提取，弃去乙醚提取液，水层再用醋酸乙酯IOml振摇提取，醋酸乙酯提取液浓缩至lml，作为供试品溶液(水层备用)。另取金樱根对照药材2. 5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各10 μ 1， 分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇(17 3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显一个以上相同的斑点。(2)取鉴别(1)项下的水层，用水饱和的正丁醇15ml提取，分取正丁醇层，用正丁醇饱和的水5ml洗涤，弃去水层，正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液。另取积雪草苷对照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各10 μ 1，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(7 3 0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中， 在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。检查应符合片剂项下有关的各项规定(中国药典2000年版一部附录ID)含量测定取本品50片(小片)或30片(大片)，除去包衣，精密称取，研细，取约2. 5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100ml，密塞，精密称定，超声处理(功率160W，频率50kHz) 45分钟，放冷，精密称定，加甲醇补足减失的重量，摇勻，滤过，弃去初滤液，精密吸取续滤液50ml，蒸干，残渣加0. 05mol/L的氢氧化钠溶液30ml，使溶解，用水饱和的正丁醇提取3次，每次20ml，弃去水层，合并正丁醇层，用正丁醇饱和的水洗涤两次，每次IOml，弃去水层，正丁醇液减压蒸发至干，残渣加适量甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，作为供试品溶液。另取积雪草苷对照品适量，加甲醇制成每Iml含Img的溶液， 作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VI B)进行扫描，波长λ S =550nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。本品每片含积雪草以积雪草苷(C48H78O19)计，小片不得少于0. ISmg ；大片不得少于 0. 30mg。功能与主治清热解毒，利湿通淋，益肾。用于下焦湿热，热淋，小便短赤、淋浙涩痛；急、慢性肾盂肾炎，膀胱炎，尿路感染属肾虚湿热下注证者。用法与用量口服，大片一次3片，小片一次5片，一日3 4次。规格(1)小片相当于原药材2.lg(2)大片相当于原药材3. 5g贮藏密封。由于上述标准采用的质量控制含量测定方法是传统的薄层色谱法(TLCS法)，存在精密度、重现性、稳定性较差，显色不稳定、测定偏差大的不足。申请号为200510200471. 8的中国专利申请涉及一种治疗泌尿系统等疾病的三金药物制剂及制备方法和质量控制方法，它是将金樱根、菝葜、羊开口、金沙藤、积雪草制成药剂学上可以接受的剂型，得到的制剂崩解性好，生物利用度高，特别是它们的辅料用量都比较少，特别适合老年人及吞服药片或胶囊有困难的患者服用，本发明还提供了这种制剂的质量控制方法，能够保证制备的制剂质量并方便工业化生产的要求；与现有技术相比，提供的药物制剂用于对急、慢性肾盂肾炎，慢性尿路感染等疾病的治疗，有比较好的效果；本发明提供的制备工艺先进，简单易行；而且本发明提供的这些制剂不良反应小、可供病人长期使用。该申请中所涉及的质量控制方法包括(1)金樱根药材、积雪草苷、薯蓣皂苷元的薄层色谱鉴别测试方法；( 三金制剂中积雪草苷、羟基积雪草苷全部或部分成分的含量测试方法。该方法依旧采用了薄层色谱法(TLCS法)，依旧存在精密度、重现性、稳定性较差，显色不稳定、测定偏差大的不足。由于上述缺陷，申请人于2004年7月2日提出了申请号为200410050066. 8的中国专利申请，并授予了发明专利权。该专利公开了一种三金制剂的新的质量控制方法，该方法包括含量测定项，含量测定采用的是HPLC-ELSD法。本发明人在此基础上又进行了大量的研究，并经系统的分离研究发现，野蔷薇苷与蔷薇苷为金樱根的特征性活性成分，而金樱根又是三金制剂的必须组分，故增加野蔷薇苷与蔷薇苷为控制三金制剂质量的指标成分是十分必要的。而现有的质量标准及质量控制方法均不含野蔷薇苷和/或蔷薇苷含量的测定，可见，现有的质量标准及质量控制方法对三金制剂的质量检测不够全面，对质量控制依旧存在着一定的缺陷，势必存在一定的用药风险。鉴于此，本发明人提供一种新的质量控制方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种三金制剂的质量控制方法，在ZL200410050066. 8的基础上改进了含量测定方法，通过有效成分野蔷薇苷和/或蔷薇苷的HPLC-ELSD法含量测定，更加准确的把握有关药品的质量，降低用药风险，提高产品质量。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案一种三金制剂的质量控制方法，包括采用HPLC-ELSD法测定羟基积雪草苷和/或积雪草苷含量的步骤，其中，该方法还包括采用HPLC-ELSD法测定野蔷薇苷和/或蔷薇苷含量的步骤。本发明人经系统的分离研究发现，野蔷薇苷与蔷薇苷为金樱根的特征性活性成分，而金樱根又是三金制剂的必须组分，故增加野蔷薇苷与蔷薇苷为控制三金制剂质量的指标成分是十分必要的。本发明首次引入野蔷薇苷和/或蔷薇苷的质量含量，从而使三金制剂的质量控制指标更加全面。根据前述的质量控制方法，其中，所述的采用HPLC-ELSD法测定野蔷薇苷和/或蔷薇苷含量的步骤包括色谱条件与系统适应性试验、对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、 野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量测定。根据前述的质量控制方法，其中，所述色谱条件与系统适应性试验是用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为48 52的甲醇-水为流动相；用蒸发光散射检测器检测，理论板数按野蔷薇苷峰计算应不低于2000。根据前述的质量控制方法，其中，所述对照品溶液的制备采用以下方法分别取野蔷薇苷与蔷薇苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每Iml各含0. 5mg的混合溶液，即得。本发明所述野蔷薇苷与蔷薇苷对照品采用如下方法自制将金樱根的根茎，粉碎，用提取溶剂提取后，将提取液减压浓缩，进行溶剂萃取或上大孔树脂吸附，并依次用水、 30 %、40 90 %乙醇洗脱，收集40 90 %乙醇洗脱物，回收溶剂，再将萃取物或洗脱物经过柱层析分离，或将提取液浓缩至干后，直接经过柱层析分离；将含有野蔷薇苷和蔷薇苷的馏分再次经过硅胶柱层析分离，收集含有野蔷薇苷和蔷薇苷的馏分，得野蔷薇苷和蔷薇苷粗晶，再加入重结晶试剂反复重结晶即得。根据前述的质量控制方法，其中，所述供试品溶液的制备采用以下方法取三金片30片小片或20片大片，除去包衣，精密称定，研细，取约1. 5g，精密称定，精密加入甲醇 50ml，称定重量，在功率250W、频率40kHz条件下超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇勻，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次15ml，取正丁醇液，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇勻，即得。根据前述的质量控制方法，其中，所述野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量测定的步骤中，含量测定采用以下方法，分别精密吸取对照品溶液5 μ 1、10 μ 1与供试品溶液10 20 μ 1，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算野蔷薇苷、蔷薇苷的含量， 即得；本品每片含金樱根以野蔷薇苷(C36H58Oltl)计，小片不得少于0. IOmg;大片不得少于 0. 16mg ；含金樱根以蔷薇苷(C36H58Oltl)计，小片不得少于0. IOmg ；大片不得少于0. 16mg。根据前述的质量控制方法，其中所述采用HPLC-ELSD法测定羟基积雪草苷和/或积雪草苷含量包括如下步骤照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为 48 52的甲醇-水为流动相；用蒸发光散射检测器检测或使用紫外检测器检测，检测波长210nm，理论板数按羟基积雪草苷峰计算应不低于2000 ；对照品溶液的制备分别取羟基积雪草苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每 Iml分别含0. 2mg的溶液和每Iml含0. 6mg的溶液，即得；供试品溶液的制备取本品30小片或20大片，除去包衣，精密称定，研细，取约 1. 5g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量，在功率250W、频率40kHz的条件下超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇勻，滤过，精密量取续滤液25ml， 回收溶剂至干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次15ml，取正丁醇液，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇勻，即得；测定法分别精密吸取上述两种浓度的对照品溶液各10 μ 1与供试品溶液5 10μ 1，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得；本品每片含积雪草以羟基积雪草苷(C48H78O2tl)计，小片不得少于0. 22mg ；大片不得少于0. 35mg。本发明人意外地发现，采用HPLC-ELSD法测定野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量的过程其供试品溶液的制备与采用HPLC-ELSD法测定羟基积雪草苷和/或积雪草苷含量时其供试品溶液的制备方法完全一样，在采用HPLC-ELSD法测定羟基积雪草苷和/或积雪草苷含量的基础上不需要另外配制供试品溶液，从而简化了质量控制过程，节约了成本。本发明所述的质量控制方法还进一步包括对三金制剂进行鉴别的步骤。所述鉴别采用薄层色谱法。所述的薄层色谱法包括如下步骤(1)取三金片15小片或10大片，除去包衣，研细，加乙醇15ml，超声处理20分钟， 滤过，滤液蒸干，残渣加0. 01mol/L氢氧化钠溶液20ml，微热使溶解，用乙醚IOml振摇提取， 弃去乙醚液，水液再用乙酸乙酯IOml振摇提取，水溶液备用；乙酸乙酯液浓缩至约1ml，作为供试品溶液；另取金樱根对照药材2. 5g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(17 3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显两个或两个以上相同颜色的主斑点；(2)取(1)项下的水溶液，用水饱和的正丁醇15ml提取，分取正丁醇液，用正丁醇饱和的水5ml洗涤，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液； 另取积雪草苷对照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法 (中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各10 μ 1，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(7 3 0. 5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；(3)取三金片10小片或6大片，除去包衣，研细，加乙醇50ml，超声处理30分钟， 滤过，滤液加盐酸5ml，加热回流2小时，放冷，用40%氢氧化钠溶液调至中性，蒸至无醇味， 残渣加热水40ml使溶解，用二氯甲烷振摇提取2次(40ml，30ml)，合并二氯甲烷提取液，蒸干，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液；另取菝葜对照药材5g，同法制成对照药材溶液；再取薯蓣皂苷元对照品，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯G 1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显两个或两个以上相同颜色的荧光斑点；在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；(4)取三金片15小片或10大片，研细，加甲醇100ml，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至约10ml，加在100 200目、5g、内径Icm的中性氧化铝柱上，用甲醇50ml洗脱，收集流出液与洗脱液，蒸干，残渣加水20ml溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次15ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液；另取羊开口对照药材5g，加水 100ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇20ml，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各5 10 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-水(6 14 1)为展开剂，展开，取出，晾干， 置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。本发明所述方法不仅可检测三金片，还可以检测三金制剂的任何其他剂型，如糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲齐U、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾齐U、滴剂、贴剂。本发明的制剂，优选的是口服剂型，如胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、 散剂、丹剂、膏剂等。还可以检测以积雪草、蔷薇苷、野蔷薇苷为原料的制剂、积雪草药材及其提取物、蔷薇苷药材及其提取物、野蔷薇苷及其提取物。本发明的特点在于1、本发明在HPLC-ELSD法测定羟基积雪草苷含量的基础上增加了 HPLC-ELSD法测定野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量，使三金制剂的质量控制指标更加全面；2、本发明方法精密度、重现性、稳定性好。
图1为野蔷薇苷对照品线性回归方程，其回归方程为Y = 0. 6482Χ-7. 3328，r = 0. 9992 ；图2为蔷薇苷对照品线性回归方程，其回归方程为Y = 0. 8516Χ-8. 9913, r = 0. 9993 ；图3为野蔷薇苷与蔷薇苷混合对照液相色谱图(ELSD)，其中野蔷薇苷Rt = 42. 394min ；蔷薇苷 Rt = 32. 135min ；图4为样品液相色谱图(ELSD)，其中野蔷薇苷Rt = 42.256min ；蔷薇苷Rt = 32.086min ；图 5 为三金片 0910136 批(ELSD)；图6 为三金片 0910144 批(ELSD)；图 7 为三金片 0910160 批(ELSD)；图 8 为三金片 0910167 批(ELSD)；图 9 为三金片 0910175 批(ELSD)；
图 10 为三金片 0910181 批(ELSD)；图 11 为三金片 0910183 批(ELSD)；图 12 为三金片 0910191 批(ELSD)；图 13 为三金片 0910192 批(ELSD)；图 14 为三金片 0911005 批(ELSD)；图 15 为三金片 0911006 批(ELSD)；图 16 为三金片 0911021 批(ELSD)；图17为野蔷薇苷与蔷薇苷混合对照液相色谱图(UV)，其中野蔷薇苷Rt = 42. 394min ；蔷薇苷 Rt = 32. 135min ；图 18 为三金片 0910136 批(UV)；图19 为三金片 0910144 批(UV)；图 20 为三金片 0910160 批(UV)；图 21 为三金片 0910167 批(UV)；图 22 为三金片 0910175 批(UV)；图 23 为三金片 0910181 批(UV)；图 24 为三金片 0910183 批(UV)；图25 为三金片 0910191 批(UV)；图 26 为三金片 0910192 批(UV)；图 27 为三金片 0911005 批(UV)；图 28 为三金片 0911006 批(UV)；图四为三金片0911021批(UV)。
具体实施例方式以下为本发明的具体实施方式
，所述的实施例是为了进一步描述本发明，而不是限制本发明。实施例1野蔷薇苷与蔷薇苷含量测定为新增的含量测定标准。金樱根为三金片方中主要药味，本发明人经系统的分离研究发现，野蔷薇苷与蔷薇苷为金樱根的特征性活性成分，故增加野蔷薇苷与蔷薇苷为控制本品质量的指标成分是十分必要的。本标准在羟基积雪草苷含量测定的基础上增加了 HPLC-ELSD法测定野蔷薇苷与蔷薇苷的含量，使三金片的质量控制指标更加全面。1、仪器与试剂仪器=Waters 2695高效液相色谱仪，蒸发光散射检测器(Alltech-ELSD2000)， (紫外检测器为Waters 996)，Empower色谱工作站。试剂甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。对照品自制，因《中国药典》未收载野蔷薇苷与蔷薇苷化学对照品，故本发明人对野蔷薇苷与蔷薇苷进行了分离制备，并按《中药新药质量标准研究用对照品研究技术要求》 进行了结构确证和纯度检查，在选定的色谱条件下测定，按归一化法计算含量为98. 5%，结果表明所制备的野蔷薇苷和蔷薇苷化学对照品符合含量测定用对照品要求。
野蔷薇苷与蔷薇苷对照品采用如下方法自制将金樱根的根茎，粉碎，用提取溶剂提取后，将提取液减压浓缩，进行溶剂萃取或上大孔树脂吸附，并依次用水、30%、40 90 %乙醇洗脱，收集40 90 %乙醇洗脱物，回收溶剂，再将萃取物或洗脱物经过柱层析分离，或将提取液浓缩至干后，直接经过柱层析分离；将含有野蔷薇苷和蔷薇苷的馏分再次经过硅胶柱层析分离，收集含有野蔷薇苷和蔷薇苷的馏分，得野蔷薇苷和蔷薇苷粗晶，再加入重结晶试剂反复重结晶即得。具体地说采用如下方法自制取新鲜金樱根根茎10Kg，粉碎，用60%乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过，浓缩得浸膏。浸膏加蒸馏水IOOOmL使均勻分散，加同样体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯，浓缩回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏。乙酸乙酯浸膏用硅胶柱层析粗分离，以氯仿/甲醇(10 0 0 10)梯度洗脱，每个梯度洗脱3000mL，TLC检测合并相同部分，得到9个主要部分。其中富含野蔷薇苷和蔷薇苷的馏分，以氯仿/甲醇(10 1) 为洗脱剂进行硅胶柱层析，收集富含野蔷薇苷的馏分，在体积比为10 1的氯仿/甲醇混合溶液中重结晶，得白色不定型固体，即野蔷薇苷；收集富含蔷薇苷的馏分，以55%甲醇为洗脱剂反复进行中压反相柱层析，在体积比为10 1的氯仿/甲醇混合溶液中重结晶，得白色不定型固体，即蔷薇苷。2、色谱条件的选择色谱柱Nova_pakC18 (3. 9 X 150mm, 4um)；流动相甲醇-水(48 52)；流速0. 8ml/min ；漂移管温度90°C ；气体流速2. 4L/min ；在流动相选择中，试验了不同比例的甲醇-水系统的分离效果，结果以甲醇-水 (48 52)为最佳，保留时间适宜，分离效果能满足要求。在选定的条件下，三批供试品的野蔷薇苷与蔷薇苷色谱峰的分离度、理论板数的结果见表1。表1、野蔷薇苷与蔷薇苷理论板数和分离度的结果
““~ 野蔷薇苷蔷薇苷~ I"~ 供试品批号分离度 __理论板数理论板数__0910020312530381.585
0910021261325191.566
0910022__2347__2407__1.588野蔷薇苷与左侧蔷薇苷峰分离度=R1 = 2 (tE-tE1) / (W+A)tE-为相邻两峰中后一峰的保留时间tE1-为相邻两峰中前一峰的保留时间W、W1此相邻两峰的峰宽根据试验结果，考虑到仪器、色谱柱、流动相的配制和温度等系统因素的影响，规定理论板数按野蔷薇苷峰计算，应不低于2000。3、线性范围的考察对照品溶液的制备取经105°C干燥至恒重的野蔷薇苷与蔷薇苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每Iml各含Img的混合溶液(野蔷薇苷实取54. 25mg，蔷薇苷实取 51. 20mg，定容至 50ml，即分别为 1. 085mg/ml、l. 024mg/ml)，即得。测定分别精密吸取混合对照品溶液溶液1、2μ 1、4μ 1、6μ 1、8μ 1、10μ 1注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积的自然对数为横坐标，以进样量的自然对数为纵坐标，回归计算，得线性方程，测定结果见表2，表3。表2、野蔷薇苷对照品线性考察结果
序号进样量峰面积进样量取对数峰面积取对数 ^ g
11.085884990.081611.39
22.172857350.774712.56
34.348178191.467913.61
46.5114493021.873314.19
58.6823889262.161014.69
610.8530100622.384214.92以上结果表明，在进样量1. 085 10. 85 μ g范围内，野蔷薇苷峰面积的自然对数与进样量的自然对数有良好的线性关系。表3、蔷薇苷对照品线性考察结果
序号进样量yg峰面积进样量取对数峰面积取对数
11.024389480.023710.57
22.048904170.716911.4134.0962099851.410012.25
46.1443149991.815512.66
58.1924793812.103213.08
610.245634362.326313.24以上结果表明，在进样量1. 024 10. M μ g范围内，蔷薇苷峰的自然对数与进样量的自然对数有良好的线性关系。4、供试品溶液制备方法的研究(1)提取溶剂的选择分别考察50%甲醇，80%甲醇，甲醇，乙醇作为提取试剂，对比不同溶剂对提取效果的影响。具体方法为取本品(批号0910021) 60片，除去包衣，精密称定，研细，分别取约1.5g，精密称定，精密加入不同提取溶剂50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz) 45分钟，放冷，再称定重量，用相应的提取溶剂补足减失的重量，摇勻，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次15ml，取正丁醇液，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇勻，进样10 μ 1，结果见表4。表4、提取溶剂的选择
权利要求
1.一种三金制剂的质量控制方法，包括采用HPLC-ELSD法测定羟基积雪草苷和/或积雪草苷含量的步骤，其特征在于，该方法还包括采用HPLC-ELSD法测定野蔷薇苷和/或蔷薇苷含量的步骤。
2.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于，所述的采用HPLC-ELSD法测定野蔷薇苷和/或蔷薇苷含量的步骤包括色谱条件与系统适应性试验、对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量测定。
3.根据权利要求2所述的质量控制方法，其特征在于，所述色谱条件与系统适应性试验是用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为48 52的甲醇-水为流动相；用蒸发光散射检测器检测，理论板数按野蔷薇苷峰计算应不低于2000。
4.根据权利要求2所述的质量控制方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备采用以下方法分别取野蔷薇苷与蔷薇苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每Iml各含0. 5mg的混合溶液，即得。
5.根据权利要求4所述的质量控制方法，其特征在于，所述野蔷薇苷与蔷薇苷对照品采用如下方法自制将金樱根的根茎，粉碎，用提取溶剂提取后，将提取液减压浓缩，进行溶剂萃取或上大孔树脂吸附，并依次用水、30%、40 90%乙醇洗脱，收集40 90%乙醇洗脱物，回收溶剂，再将萃取物或洗脱物经过柱层析分离，或将提取液浓缩至干后，直接经过柱层析分离；将含有野蔷薇苷和蔷薇苷的馏分再次经过硅胶柱层析分离，收集含有野蔷薇苷和蔷薇苷的馏分，得野蔷薇苷和蔷薇苷粗晶，再加入重结晶试剂反复重结晶即得。
6.根据权利要求2所述的质量控制方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备采用以下方法取本品30片小片或20片大片，除去包衣，精密称定，研细，取约1. 5g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量，在功率250W、频率40kHz条件下超声处45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇勻，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加水 20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次15ml，取正丁醇液，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇勻，即得。
7.根据权利要求2所述的质量控制方法，其特征在于，所述野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量测定的步骤中，含量测定采用以下方法分别精密吸取对照品溶液5μ 1、10μ 1与供试品溶液10 20μ 1，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算野蔷薇苷、蔷薇苷的含量，即得；本品每片含金樱根以野蔷薇苷(C36H58Oltl)计，小片不得少于0. IOmg ；大片不得少于0. 16mg ；含金樱根以蔷薇苷(C36H58Oltl)计，小片不得少于0. IOmg ；大片不得少于 0. 16mg0
8.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于，所述采用HPLC-ELSD法测定羟基积雪草苷和/或积雪草苷含量包括如下步骤照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定；色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为48 52 的甲醇-水为流动相；用蒸发光散射检测器检测或使用紫外检测器检测，检测波长210nm， 理论板数按羟基积雪草苷峰计算应不低于2000 ；对照品溶液的制备分别取羟基积雪草苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每Iml分别含0. 2mg的溶液和每Iml含0. 6mg的溶液，即得；供试品溶液的制备取本品30小片或20大片，除去包衣，精密称定，研细，取约1. 5g， 精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量，在功率250W、频率40kHz的条件下超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇勻，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次15ml，取正丁醇液，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇勻，即得；测定法分别精密吸取上述两种浓度的对照品溶液各10 μ 1与供试品溶液5 10 μ 1， 注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得；本品每片含积雪草以羟基积雪草苷(C48H78O2tl)计，小片不得少于0. 22mg ；大片不得少于0. 35mg。
全文摘要
本发明涉及一种三金制剂的质量控制方法，包括采用HPLC-ELSD法测定羟基积雪草苷和/或积雪草苷含量的步骤，其中，该方法还包括采用HPLC-ELSD法测定野蔷薇苷和/或蔷薇苷含量的步骤。本发明在HPLC-ELSD法测定羟基积雪草苷含量的基础上增加了HPLC-ELSD法测定野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量，使三金制剂的质量控制指标更加全面；本发明方法精密度、重现性、稳定性好。
文档编号A61P31/04GK102526561SQ20111002831
公开日2012年7月4日 申请日期2011年1月26日 优先权日2010年12月31日
发明者云强, 周艳林, 邹节明 申请人:桂林三金药业股份有限公司