专利名称：：一种双重靶向肿瘤的纳米脂质体及其制备方法
技术领域：
：本发明属于医药领域，更具体地，本发明公开了一种靶向肿瘤的纳米脂质体及其制备方法。
背景技术：
：近年来恶性肿瘤的发病率和死亡率呈明显上升趋势，已经成为威胁人类健康和生命的主要疾病。国际癌症研究机构的报道显示，1975年到2000年间，全球癌症病例数增长了一倍，每年新发病例约1200万，死亡患者超过700万。2010年癌症将跃居为全球的首要死因，2030年肿瘤患者人数将为现在的三倍，新发病例数将增至2000-2600万。化疗是恶性肿瘤综合治疗中的主要手段之一，合理的化疗策略可显著延长肿瘤患者的生存时间，极大改善患者的生存质量。但目前常用的各种化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞也可能造成巨大的损伤。毒副反应的出现往往是限制药物剂量和使用的直接原因，其产生主要与化疗药物缺乏靶向性有关，某些毒副反应的产生也与药物的药代动力学和药效动力学行为欠佳及药物辅剂毒性相关。因此新型化疗药物的研发成为目前肿瘤领域研究的热点之一。脂质体是一种主要由磷脂和/或胆固醇构成的类似于生物膜双分子层的囊泡状结构，由于磷脂分子具有一个亲水性的头部和两条疏水性的尾部，因此脂质体在水中平衡后具有双亲性质，既可用于包封脂溶性药物也可包封水溶性药物。脂质体有良好的组织相容性，且无毒无害，无免疫原性，因此其作为药物载体的研究越来越受到重视，这方面的发展十分迅速。目前，许多学者开始致力于肿瘤靶向给药系统的研发。靶向给药系统即靶向制剂，是指借助一定的载体将药物通过局部、胃肠道或血液循环给药而选择性地浓集于靶器官、靶组织、靶细胞或细胞内结构的制剂。与普通制剂相比，肿瘤靶向制剂可以提高化疗药物的疗效，降低药物毒副作用，提高用药的安全性、有效性和可靠性。针对肿瘤的特异性靶点众多，其中肿瘤血管是目前公认最佳的靶点，这与肿瘤及肿瘤血管的特性有关。实体瘤的生长和转移有赖于血管的生成，肿瘤的生长分为两期无血管期和血管期。在无血管期，肿瘤主要依靠周围组织的弥散来获取营养物质和排泄代谢产物，瘤体直径一般不超过l-2mm;而到血管期，肿瘤内出现新生血管，并获得进一步生长的能力，肿瘤从而迅速生长并可发生转移。采用肿瘤新生血管作为靶点有诸多优势(Holig,P.，etal.，NovelRGDlipopeptidesforthetargetingofliposomestointegrin-expressingendothelialandmelanomacells.ProteinEngDesSel，2004.17(5):p.433-41)，如药物可避开内皮细胞的屏障直接到达靶区，局部血管的破坏可影响依赖其血供的许多肿瘤细胞，肿瘤新生血管内皮细胞不易产生耐药等。对于实体瘤来说，药物直接导入肿瘤组织非常困难(Hambley，Τ.W.andW.N.Halt,Isanticancerdrugdevelopmentheadingintherightdirection？CancerRes,2009.69(4)p.1259-62.)，原因与肿瘤血管功能失常，血液灌注不良及肿瘤组织中淋巴组织功能异常，月中瘤组织间压增高(Jain,R.K.,Transportofmolecules,particles,andcellsinsolidtumors.AnnuRevBiomedEng，1999.1:p.241-63.)，影响了药物从血管中的渗入有关。肿瘤血管的另一个特性是通透性增高，这在一定程度上似乎可以弥补药物难以渗入肿瘤组织的问题，但实际上这种方式并不十分有效，药物通过通透性增高的血管内皮进入肿瘤组织是粒径依赖性的，且不同的肿瘤内皮细胞通透性增高的程度不同(Maeda，H.，etal.，Tumorvascu1arpermeabi1ityandtheEPReffectinmacromoleculartherapeuticsareview.JControlRelease，2000.65(1-2):p.271-84.，Iyer,A.K.，etal.，Exploitingtheenhancedpermeabilityandretentioneffectfortumortargeting.DrugDiscovToday,2006.11(17-18):p·812-8.，Sugahara，K.N.,etal.,Tissue-penetratingdeliveryofcompoundsandnanoparticlesintotumors.CancerCell,2009.16(6)p.510-20.)。主动靶向血管的治疗则可以避免上述问题，进入血液循环的靶向药物可直接和靶点相结合，在肿瘤组织局部的血管中浓聚，局部增高的药物浓度也进一步有利于药物渗入肿瘤组织的内部。肿瘤血管破坏后，接受其血供的肿瘤细胞将继发死亡，因而药物无须进入肿瘤组织的内部即可发挥作用。同时，针对肿瘤血管的靶向分子许多也在肿瘤细胞表面高表达，因此主动靶向血管的药物可同时对血管内皮和肿瘤细胞起作用。由于肿瘤血管内皮细胞在微环境的作用下呈异质性，不同类型的肿瘤中其表达的抗原和受体种类和数量不同，相同的配体或抗体与不同类型肿瘤血管内皮细胞的亲和力也有较大的差异，目前尚未发现一种靶分子可以高特异性、高亲和力地识别多种肿瘤。因此，设想采用双靶点策略来进一步提高多肽与血管内皮细胞或肿瘤细胞的特异性识别和结合能力。理论上连接双靶点多肽的药物载体较连接单靶点多肽的药物载体有诸多优势。由于细胞表面抗原或受体的数量决定了靶向药物载体的定向释药能力(Park，J.W.，etal.，Anti-HER2immunoIiposomesenhancedefficacyattributabletotargeteddelivery.ClinCancerRes,2002.8(4):p.1172-81.)，双靶点药物载体能够增加可识别的细胞数，进而增加药物载体与细胞的结合量；双靶位同时结合可增强药物载体与细胞间的结合能力，促进细胞对药物的摄取；双靶点策略可降低药物对非靶向细胞的毒性(Saul，J.Μ.，Α.V.Annapragada，andR.V.Bellamkonda，Adual—ligandapproachforenhancingtargetingselectivityoftherapeuticnanocarriers.JControlRelease,2006.114(3)p.277-87.)；此外还可通过两种不同的机制发挥抗肿瘤的作用等。关于双靶点药物载体的研究甚少，能检索到的文献报道如下=McAteer等将血管内皮细胞粘附分子-1和P-选择素连接于氧化铁颗粒用于粥样硬化动脉内皮细胞的磁共振显像(McAteer,Μ.A.，etal.，Magneticresonanceimagingofendothelialadhesionmoleculesinmouseatherosclerosisusingdual-targetedmicroparticlesofironoxide.ArteriosclerThrombVascBiol,2008.28(1):p.77-83.)0表面连接整合素配体和半乳凝素特异多肽的脂质药物载体可增强磁共振造影剂的显像能力，还可用于提高抗肿瘤药物的疗效(Kluza,Ε.,etal.,Synergistictargetingofalphavbeta3integrinandgalectin—1withheteromultivalentparamagneticliposomesforcombinedMRimagingandtreatmentofangiogenesis.NanoLett,2010.10(1):p.52—8.)。3VEGF—2禾口^合素ανβ3抗体的微泡可增强卵巢癌移植瘤模型中肿瘤血管的超声成像能力(Willmarm，J.K.,etal.,Dual-targetedcontrastagentforUSassessmentoftumorangiogenesisinvivo.Radiology,2008.248(3):p.936-44.)。连接叶酸分子和内皮细胞生长因子受体抗体的阿霉素脂质体及连接aCD19和aCD20双抗体的阿霉素脂质体被证实具有很好的月中瘤细胞毒作用(Laginha，K.，D.Mumbengegwi,andΤ.Allen，Liposomestargetedviatwodifferentantibodies:assay，B—cellbindingandcytotoxicity.BiochimBiophysActa,2005.1711(1):p.25-32.)。上述试验均将制备的双靶点药物载体与单靶点药物载体进行比较，结果显示双靶点药物有更好的肿瘤细胞特异性结合力，从实践上证实了双靶点策略的可行性。深入分析上述研究可以发现，上述双靶点药物载体有一共同点，即研究者均将不同的独立的靶分子以一定比例混合后直接连接于药物载体表面。由于靶分子的有效连接数量与载药颗粒的靶向能力相关，故在载药颗粒表面积有限的情况下，载体表面的靶分子数量有限。
发明内容为了解决上述问题，本发明的发明人将两个不同结构的靶分子串联后再与载药颗粒相连，两个靶分子连接后空间构象互不影响，能维持各自原有的生物学活性，从而在功能上产生协同效应。本发明公开了一种双重靶向肿瘤的纳米脂质体，含有ARYCRGDCFDATWLPra多肽；本发明提供的双重靶向肿瘤的纳米脂质体主要由三部分组成，ARYCRGDCFDATffLPPR多肽，脂质连接物和脂质体纳米粒。本发明还公开了上述双重靶向肿瘤的纳米脂质体的制备方法，首先合成双重靶向肿瘤的ARYCRGDCFDATWLPra多肽，然后合成多肽接枝物，制备双重靶向肿瘤纳米脂质体。本发明还公开了上述上述双重靶向肿瘤的纳米脂质体在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。首先，本发明采用固相合成法获得双重靶向肿瘤的多肽，所述多肽的氨基酸序列如下=ARYCRGDCFDATffLPPR0其中ARYCRGDCFDG其核心结构为RGD三肽，即精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列，针对靶点是整合素αV家族。αV整合素为细胞黏附分子家族的重要成员之一，是一组跨膜糖蛋白受体，通过参与内皮细胞的激活和迁移、介导内皮细胞增殖、抑制内皮细胞凋亡、参与碱性成纤维细胞生长因子和VEGF诱导的血管生成、诱导环加氧酶2的产生等多种途径促进肿瘤的发生发展。αV整合素高表达于活化的肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞表面，在生理状态下静止的血管内皮细胞和正常组织器官内呈低表达。药物载体连接含RGD序列的短肽后可显著增强其靶向肿瘤的能力。ATWLPra序列是从噬菌体肽库中筛选出来的一个含有7个氨基酸残基的短肽，针对的靶点为VEGFR2的共受体神经内皮素-1(Neuropilin-1，NRP-1)οVEGFR-2(VascularEndothelialGrowthFactorReceptor-2)是VEGF/VEGFR家族成员，主要识别低分子量的VEGF(含110-165个氨基酸残基的VEGF)，在血管内皮细胞迁移、增殖、存活及血管通透性调节中起重要作用。NRP-I是一种非酪氨酸跨膜糖蛋白，是VEGFR-2的辅助受体，和VEGFR-2的共表达可显著促进VEGF165与VEGFR-2的结合，增强VEGF165介导的生物学作用，促进血管内皮的增殖。NRP-I亦高表达于活化的肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞表面，在生理状态下静止的血管内皮细胞和正常组织器官内呈低表达。本发明采用Fmoc固相合成法合成了多肽配体-赖氨酸-甘氨酸-甘氨酸-棕榈酸(lysine-glycine-glycine，KGG-pal)联结物(结构见附图1)，连接新型多肽和脂质体载药纳米粒。KGG序列是带正电荷的疏水性三肽，研究证实其连接14碳的脂肪酸后可稳定连于脂质体表面。由于赖氨酸具有两个氨基，故可同时与两个棕榈酸分子偶合，以模拟磷脂分子的两条疏水性长烃基链，插入脂质体双分子层后可显著增加多肽连接的牢固性。本发明采用薄膜超声分散法制备脂质体载药颗粒，采用薄膜过滤法或高压均质法控制脂质体粒径在60-200nm。小粒径的纳米粒作为抗肿瘤药物载体有其独特优势。恶性肿瘤的侵袭性生长和转移有赖于血管的生成，虽然相对于正常血管来说，肿瘤组织中血管对药物的选择性渗透力较弱，内皮细胞间或细胞上的特异通道孔径更大，但最大直径仍不超过400nm。大粒径的脂质体在脾脏的截留更多，从血液中清除更快，到达肿瘤组织的脂质体明显减少。因此理论上小粒径长循环药物脂质体更易透过血管间隙发挥抗肿瘤的作用。细胞学研究证实，本发明的含有RGD及ATWLPI3R序列的双重靶向肿瘤的多肽修饰的脂质体纳米粒。新型多肽分子量小，核心载药颗粒粒径控制在60-100nm，故易穿透内皮细胞屏障进入肿瘤组织。研究证实，RGD及ATWLPra序列连接后空间构象互不影响，能维持序列各自原有的生物学活性，从而产生协同效应。相较于只含有RGD或ATWLPra序列的单靶向脂质体纳米粒，研发的双重靶向肿瘤的脂质体纳米粒有显著为优的与新生血管内皮细胞及肿瘤细胞的特异性结合力，可用于肿瘤显像和治疗领域。与无靶向及单靶向肿瘤的脂质体药物载体纳米粒相比，双重靶向肿瘤的脂质体药物载体纳米粒有更强的与新生血管内皮细胞及肿瘤细胞特异性结合能力。该药物载体可用于荷载多种药物如磁共振造影剂钆喷酸葡胺、抗肿瘤药物多西紫杉醇、阿霉素、喜树碱后，进一步用于恶性肿瘤的早期诊断和靶向治疗领域。图1多肽配体-赖氨酸-甘氨酸-甘氨酸(lysine-glycine-glycine，KGG)-pal联结物的结构图；图2流式细胞仪检测荧光标记多肽与AM9、HUVEC的结合能力实验结果；其中左起第一组线为FITC-P4=FITC-ATffLPPR(单靶点多肽)；第二组线为FITC-P2:FITC-ARYCRGDCFDG(单靶点多肽)；第三组线为FITC-P16FITC-ARYCRGDCFDAI￥LPPR(双重靶向多肽)。图3荧光酶标仪检测FITC标记多肽与A549细胞、HUVEC的结合能力实验结果；其中FITC-Pl:FITC-ARYCRADCFDG(非血管靶向多肽)FITC-P2=FITC-ATffLPPR(单靶点多肽)FITC-P4=FITC-ATffLPPR(单靴向多肽)FITC-Pl6=FITC-ARYCRGDCFDATffLPPR(双重靴向多肽)(*vsFITC-PlP<0.05；#vsFITC-P2<0.05；ΔvsFITC-P4P<0.05)图4荧光倒置显微镜下观察各荧光脂质体与细胞结合力实验结果；其中A_DA549细胞；E-H=HUVEC；A、E非靶向荧光脂质体；B、F:ARYCRADCFDG-荧光脂质体；C、GATffLPPR-荧光脂质体；D、HARYCRGDCFDATffLPPR-荧光脂质体。图5粒度分析结果(5-1)，透射电镜下粒径结果(5-2)。具体实施例方式实验材料1.细胞和试剂HUVEC(HumanUmbilicalVeinEndothelialCells，HUVEC)及A549细胞(肺腺癌细胞系)由上海市肺科医院中心实验室提供；Dulbecco'sModifiedEagleMedia(DMEM高糖细胞培养基)购自^witrogen公司；新生牛血清购自奥地利PAA公司；CoulterIsotonIII稀释液购自美国BECKMAN公司；青霉素、链霉素、胰蛋白酶等购自华美公司；荧光标记多肽委托吉尔生化(上海)有限公司合成。2.溶液配制权利要求1.一种双重靶向肿瘤的纳米脂质体，其特征在于含有ARYCRGDCFDATWLPra多肽。2.根据权利要求1所述的双重靶向肿瘤的纳米脂质体，其特征在于主要由三部分组成ARYCRGDCFDATWLPPR多肽，脂质连接物和脂质体纳米粒。3.权利要求1或2所述的双重靶向肿瘤的纳米脂质体的制备方法，其特征在于首先合成双重靶向肿瘤的ARYCRGDCFDATWLPra多肽，然后合成多肽接枝物，最后制备双重靶向肿瘤的纳米脂质体。4.权利要求1或2所述的双重靶向肿瘤的纳米脂质体在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。全文摘要本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明公开了一种双重靶向肿瘤的纳米脂质体，含有ARYCRGDCFDATWLPPR多肽，本发明还公开了上述双重靶向肿瘤的纳米脂质体的制备方法及其在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。文档编号A61P35/00GK102188380SQ20111009417公开日2011年9月21日申请日期2011年4月14日优先权日2011年4月14日发明者周彩存,周蔚,孟淑燕,宋胤,李玮,粟波申请人:上海市肺科医院