专利名称：以脂溶性光敏剂为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系的制备方法及其在制备光动力疗法 ...的制作方法
技术领域：
本发明属于具有光动力活性的光敏剂技术领域，涉及一种以脂溶性光敏剂为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系的制备方法及其在光动力疗法中的应用。
背景技术：
光动力疗法(Photodynamic therapy，PDT)是一种新型治疗各种肿瘤、心血管、皮肤及眼科疾病的治疗方法。PDT是基于光动力反应的一种新型医疗技术，将光敏剂在注入患者体内，间隔一段时间，待其相对富聚在肿瘤组织中后，使用恰当波长的光(一般为激光) 照射肿瘤部位，此时富聚在肿瘤组织中的光敏剂能引发光动力反应释放活性氧，导致氧化损伤和自由基链式反应，最终导致肿瘤组织中的氧化损伤，从而致使肿瘤细胞死亡进而肿瘤被摧毁。或者通过间接杀伤作用于肿瘤组织的微血管，造成血管完全封闭，使肿瘤组织缺氧或营养枯竭，从而导致肿瘤组织坏死。由于PDT疗法具有对健康组织损伤小、毒副作用低、手术后并发症少、以及经济方便等独特的优点，尤其适合治疗癌症晚期和由于年龄、体质等原因不适合使用传统治疗技术的病人，因此该疗法成为倍受重视的研究领域。目前，随着激光技术和光导纤维技术的发展和应用，光动力治疗疾病过程中所必需的三要素(光敏剂、氧和光源与光传导)中的光源与光传导的问题得到了很好的解决，因此寻求理想的光敏剂及其给药体系成为PDT中一个至关重要的问题。然而，多数光敏剂为脂溶性疏水物质，水溶性差，在生理条件下难以溶解，在血液传输过程中容易聚集形成团块堵塞毛细血管，进而影响到药物的有效传输，因而阻碍其制作成为静脉注射药物制剂。因此，开展脂溶性光敏剂临床前期的应用基础研究，解决其在血液中的有效传输等问题，成为推动光动力疗法临床应用进程的关键。在改善脂溶性光敏剂的途径中，通过构建脂溶性光敏剂纳米载体来改善其在水体系中的稳定度，继而达到血液中有效传输，即通过EPR (Enhanced Permeability and Retention)效应实现肿瘤组织有效富集过程受到广泛关注。到目前为止，已被应用于脂溶性光敏剂给药体系领域的纳米材料主要有脂质体、蛋白、聚合物、无机化合物和金属材料等，体外研究表明，利用上述纳米材料构建出给药体系都可以有效的装载或吸附药物以改善其在水体系中的稳定程度并可被细胞有效吸收以发挥其光敏活性。然而，随着系统的体内研究不断地深入，以及对纳米材料的体内安全性问题的重视，使得一些纳米材料作为药物载体的缺陷逐渐显露，如存在细胞毒性、诱导凋亡作用、体内沉积现象及无法代谢等问题，这主要是由于纳米材料本身的安全性不高，或使用量过高(即载药量低)所导致的 ’另外，一些给药体系复杂的构建工艺同样也在一定程度上限制了其临床应用潜力。因此，继续寻求生理相容性更高的载体材料和制备工艺更简单易行的构建方法，以期获得稳定性高、 载药量大和拥有一定靶向性的给药体系，仍然是当前脂溶性光敏剂给药体系研究领域中的軍:点ο磷酸钙是人体骨骼与牙齿的重要天然组成部分之一，在人体血液中Ca2+与
3HPO42-含量可达毫摩尔级别，可见磷酸钙具有优越的生理安全性。而纳米磷酸钙还具有在血液PH范围(7. 35-7. 45)内稳定，在酸性条件下(如内涵体pH=5_6和溶酶体pH=4_5中)逐渐溶解的独特性质，可保证其在血液中能很好地保持其纳米结构的完整性，只在肿瘤细胞胞吞过程中或被肿瘤细胞吸收后会逐渐溶解而释放药物，因此纳米磷酸钙给药体系拥有较高体内传输过程的稳定性。另外，与其他纳米给药体系一样，纳米磷酸钙也可以通过EI^R效应在肿瘤组织处富集，使其具有一定的靶向性。纳米磷酸钙的这些特点使其具有作为药物的载体材料的优秀品质，受到从事给药体系研究工作者的广泛关注。然而，目前开发纳米磷酸钙作为药物载体的模式与其他类载体基本相同，主要为装载或表面吸附两种模式。以上两种模式难以解决给药体系的载药量(即提高载药量与载体材料用量的比值)、稳定性和简化构建工艺等问题。因此，本发明开发以脂溶性光敏剂自组装纳米结构为骨架，利用纳米磷酸钙作为骨架的稳定支撑结构构建以脂溶性光敏剂为骨架与纳米磷酸钙自组装给药体系，以同时实现改善脂溶性光敏剂水溶性及提高给药体系载药量两个临床应用中的瓶颈问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以脂溶性光敏剂为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系的制备方法，以克服脂溶性光敏剂由于水溶性差而不便于制成药剂及现有给药体系载药量小的缺点，构建以脂溶性光敏剂自组装纳米结构为骨架，纳米磷酸钙为骨架支撑结构的脂溶性光敏剂与纳米磷酸钙自组装给药体系，并将该方法应用于光动力疗法领域，即本申请将提供一种以脂溶性光敏剂为骨架的水溶性药物-纳米磷酸钙给药体系的制备方法及其在制备光动力疗法静脉注射剂中的应用。所述的给药体系可以达到使脂溶性光敏剂在血液中有效传输及增加给药体系载药量的目的。本发明所采用的技术方案是以脂溶性光敏剂为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系的制备方法，包括如下步骤
在含磷酰基有机物存在或不存在情况下，加入蒸馏水、钙盐水溶液搅拌均勻制备得到A 体系；加入蒸馏水、磷酸盐水溶液搅拌均勻后制备得到B体系；脂溶性光敏剂溶液加入A体系或B体系中，或同时加入两体系中，搅拌均勻后将A体系与B体系混合后制得以脂溶性光敏剂为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系。所述的钙盐包括氯化钙、硝酸钙或氢氧化钙等。所述的磷酸盐包括磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二氨、磷酸等。所述的含磷酰基有机物包括3-磷酰基丙酸、N-(磷酰基甲基)甘氨酸、2-羟基磷酰基乙酸等，制备过程中加入含磷酰基有机物可以增加骨架结构稳定型。所述Ca2+与PO43-的摩尔比为1 100 100 1，优选1 10 10 1 ；脂溶性光敏剂与 Ca2+的质量比为1:100 100:1，优选1:10 10:1。含磷酰基有机物与PO43-的摩尔比为0 100:1，优选为0. 01 100:1。上述方法制备的以脂溶性光敏剂为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系，是一种适合静脉注射的水溶性无机盐纳米粒体系。本发明中所涉及的脂溶性光敏剂包括竹红菌素光敏剂、痂囊腔菌素光敏剂、2"脱乙烯基-2-(1-己基氧乙基)焦脱镁叶绿甲酯一酸光敏剂、二氢卟吩类光敏剂、吓啉类光敏剂、酞菁类光敏剂等脂溶性光敏剂及其衍生物，或是其中两种以上光敏剂的混合物。所述的竹红菌素包括竹红菌甲素、竹红菌乙素或是它们的衍生物；所述的痂囊腔菌素包括痂囊腔菌素A、痂囊腔菌素B、痂囊腔菌素C或是它们的衍生物；二氢卟吩类光敏剂包括四间羟基苯基二氢卟吩及二氢卟吩e6等；吓啉类光敏剂包括血卟啉甲醚及血卟啉衍生物等；酞菁类光敏剂包括铝酞菁及锌酞菁等。更具体和更优化地说，本发明的技术方案是
反应体系中先后加入蒸馏水10 mL、氯化钙溶液、3-磷酰基丙酸水溶液磁力搅拌均勻制备得到A体系；先后加入蒸馏水10 mL、脂溶性光敏剂溶液、磷酸氢二钠水溶液磁力搅拌均勻后制备得到B体系；将A体系与B体系磁力搅拌及超声条件下混合后即可得到以脂溶性光敏剂为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系。本发明还涉及所述的以脂溶性光敏剂为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系在光动力疗法领域中的应用，实现本发明第二个发明目的的技术方案是，所述方法制备的以脂溶性光敏剂为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系在制备光动力疗法药物中的应用。同样，该发明在光动力疗法领域中的应用所涉及的脂溶性光敏剂包括竹红菌素光敏剂、痂囊腔菌素光敏剂、2-脱乙烯基-2-(1-己基氧乙基)焦脱镁叶绿甲酯一酸光敏剂、二氢卟吩类光敏剂、吓啉类光敏剂、酞菁类光敏剂等脂溶性光敏剂及其衍生物。本发明所制得的以脂溶性光敏药物为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系具有如下的优点
1.制备方法简单、易操作、稳定性高且成本低廉；
2.与单独存在的脂溶性光敏剂相比，该纳米粒不但水溶性高和分散性好，可以促进脂溶性光敏剂在血液中的有效传输，同时消除其单独使用时产生的毒副作用；
3.该给药体系以脂溶性光敏剂自组装纳米结构为骨架，利用纳米磷酸钙作为骨架的稳定支撑结构构建以脂溶性光敏剂为骨架与纳米磷酸钙自组装给药体系，极大的提高给药体系载药量；
4.该纳米粒光敏产生单重态氧(1O2)活性氧的能力也得到保留。离体癌细胞实验结果表明，该类纳米粒子的暗毒性低，光毒性高。综上所述，本发明对推动脂溶性光敏剂的实用化进程具有理论和实用双重意义。
图1为以竹红菌甲素为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系(HA-CaP)透射电镜图。图2A-图2D为以竹红菌甲素为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系(HA-CaP)及竹红菌甲素(DMF助溶)对HeLa细胞光敏损伤前(图2A)、后(图2C)细胞形貌及光敏损伤前(图 2B)、后(图2D)细胞核DNA形态及分布变化(使用细胞核DNA染料Hoechst 33342标记)。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明进行详细描述，所述的实施例有助于对本发明的理解和实施，并非构成对本发明的限制。实施本发明，除具体实施例中所涉及的物质外，本领域技术人员还可以对其中所用的光敏剂和其它组分采用功能上相同或相似的替换物，或根据不同的目的改变组分间的比例。本发明的保护范围并不以具体实施方式
为限，而是由权利要求加以限定。以下实施例中，对药物-纳米磷酸钙复合体系表征以光敏剂竹红菌甲素(HA)为例作出详细说明。HA为一种天然的光敏剂，已被用于临床治疗皮肤病、眼病及妇科疾病等， 研究表明HA还具有一定的抗肿瘤和抗病毒活性。本发明的药物-纳米磷酸钙复合体系的制备方法同样适用于其他的脂溶性光敏剂，对制得的复合体系进行表征具有与HA体系 (HA-CaP)相类似的结果。 实施例1
实验体系中先后加入蒸馏水10 mL、500 μ L氯化钙溶液(0. 25Μ) >500 μ L 3-磷酰基丙酸水溶液(0.25Μ)磁力搅拌均勻制备得到A体系；先后加入蒸馏水10 mL,500yL HA溶液 (15 mM)、500 μ L磷酸氢二钠水溶液(0. 25Μ)磁力搅拌均勻后制备得到B体系；将A体系与 B体系混合后即可得到以竹红菌甲素为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系(HA-CaP)水溶液，冷冻干燥后得到以竹红菌甲素为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系固体。以竹红菌甲素为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系表征
本实施例所制得的纳米粒的形貌以透射电子显微镜观测。纳米粒的光敏活性使用荧光显微镜对Hoechst 33342标记的肿瘤细胞形貌及核酸分布表征。(1)以竹红菌甲素为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系的电镜观察
透射电镜观察纳米粒大小及形貌，透射电镜照片显示以竹红菌甲素为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系粒径分布均勻且单分散性良好。(2)光敏杀伤肿瘤细胞能力比较
光敏损伤肿瘤细胞试验表明，竹红菌甲素为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系可以有效杀伤宫颈癌细胞(HeLa cell)，光敏损伤前细胞形态完整贴壁完好，HoeChSt33342燃料均勻分布于整个细胞核中。光敏损伤后，细胞皱缩呈圆形，HoeChst33342染色表明染色质聚集、分块、位于核膜周围。
实施例2
与实施例1基本相同，但所述的HA溶液加入量为20 μ L lmL。 实施例3
与实施例1基本相同，但所述的氯化钙溶液加入量为5 μ L lmL。 实施例4
与实施例1基本相同，但所述的磷酸氢二钠水溶液加入量为5μ L lmL。 实施例5
实验体系中先后加入蒸馏水10 mL、500 μ L氯化钙溶液(0. 25Μ) ,50 μ L 3-磷酰基丙酸水溶液(0. 25Μ)磁力搅拌均勻制备得到A体系；先后加入蒸馏水10 mL、500y L痂囊腔菌素 A溶液(15 mM)、500 μ L磷酸氢二钠水溶液(0. 25Μ)磁力搅拌均勻后制备得到B体系；将A体系与B体系混合后即可得到以痂囊腔菌素A为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系。
实施例6
实验体系中先后加入蒸馏水10 mL、500 μ L氯化钙溶液(0. 25Μ)、5 μ L 3-磷酰基丙酸水溶液(0. 25Μ)磁力搅拌均勻制备得到A体系；先后加入蒸馏水10 mL、500 μ L 2-脱乙烯基-2-(1-己基氧乙基)焦脱镁叶绿甲酯一酸溶液(15 mM)、500yL磷酸氢二钠水溶液 (0. 25M)磁力搅拌均勻后制备得到B体系；将A体系与B体系混合后即可得到以2-脱乙烯基-2-(1-己基氧乙基)焦脱镁叶绿甲酯一酸为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系。
实施例7
实验体系中先后加入蒸馏水10 mL、500 μ L氯化钙溶液(0. 25Μ) >500 μ L 3-磷酰基丙酸水溶液(0. 25Μ)磁力搅拌均勻制备得到A体系；先后加入蒸馏水10 mL、500y L竹红菌甲素(10 mM)和500 μ L痂囊腔菌素A溶液(5 mM)、500 μ L磷酸氢二钠水溶液(0. 25Μ)磁力搅拌均勻后制备得到B体系；将A体系与B体系混合后即可得到脂溶性光敏剂为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系。
实施例8，与实施例1基本相同，但所述的氯化钙水溶液改用如硝酸钙或氢氧化钙水溶液。
实施例9，与实施例1基本相同，但所述的磷酸氢二钠水溶液改用磷酸氢二钾、磷酸氢二氨或磷酸水溶液。
实施例10，与实施例1基本相同，但所述的3-磷酰基丙酸水溶液改用N-(磷酰基甲基) 甘氨酸或2-羟基磷酰基乙酸水溶液。
实施例11，与实施例1基本相同，但不使用含磷酸有机物。
权利要求
1.一种以脂溶性光敏剂为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系的制备方法，包括如下步骤在含磷酰基有机物存在或不存在情况下，加入蒸馏水、钙盐水溶液搅拌均勻制备得到A 体系；加入蒸馏水、磷酸盐水溶液搅拌均勻后制备得到B体系；脂溶性光敏剂溶液加入A体系或B体系中，或同时加入两体系中，搅拌均勻后将A体系与B体系混合后得到以脂溶性光敏剂为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系。
2.根据权利要求1所述的药物-纳米磷酸钙复合体系的制备方法，其特征在于所述 Ca2+与P043_的摩尔比为1:100 100:1 ；脂溶性光敏剂与Ca2+的质量比为1:100 100:1。
3.根据权利要求1所述的药物-纳米磷酸钙复合体系的制备方法，其特征在于所述的含磷酰基有机物与Ρ0Λ的摩尔比为0 100:1。
4.根据权利要求1所述的药物-纳米磷酸钙复合体系的制备方法，其特征在于所述的脂溶性光敏剂包括竹红菌素光敏剂、痂囊腔菌素光敏剂、2-脱乙烯基-2-(1-己基氧乙基)焦脱镁叶绿甲酯一酸光敏剂、二氢卟吩类光敏剂、吓啉类光敏剂、酞菁类光敏剂，或是其中两种以上光敏剂的混合物。
5.根据权利要求4所述的药物-纳米磷酸钙复合体系的制备方法，其特征在于所述的竹红菌素为竹红菌甲素、竹红菌乙素或是它们的衍生物；所述的痂囊腔菌素为痂囊腔菌素A、痂囊腔菌素B、痂囊腔菌素C或是它们的衍生物；二氢卟吩类光敏剂为四间羟基苯基二氢卟吩或二氢卟吩；卟啉类光敏剂为血卟啉甲醚或血卟啉衍生物；酞菁类光敏剂为铝酞菁或锌酞菁。
6.根据权利要求1所述的药物-纳米磷酸钙复合体系的制备方法，其特征在于所述的钙盐为氯化钙、硝酸钙或氢氧化钙；所述的磷酸盐为磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二氨或磷酸。
7.根据权利要求1所述的药物-纳米磷酸钙复合体系的制备方法，其特征在于所述的含磷酰基有机物为3-磷酰基丙酸、N-(磷酰基甲基)甘氨酸或2-羟基磷酰基乙酸。
8.—种权利要求1所述的方法制备的以脂溶性光敏剂为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系在制备光动力疗法药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的以脂溶性光敏剂为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系在制备光动力疗法药物中的应用，其特征在于所述的脂溶性光敏剂包括竹红菌素光敏剂、痂囊腔菌素光敏剂、2-脱乙烯基-2-(1-己基氧乙基)焦脱镁叶绿甲酯一酸光敏剂、二氢卟吩类光敏剂、吓啉类光敏剂或酞菁类光敏剂，或是其中两种以上光敏剂的混合物。
10.根据权利要求8所述的以脂溶性光敏剂为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系在制备光动力疗法药物中的应用，其特征在于所述的光动力疗法药物为静脉注射用水溶性无机盐纳米粒。
全文摘要
本发明公开了一种以脂溶性光敏剂为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系的制备方法，在含磷酰基有机物存在或不存在情况下，加入蒸馏水、钙盐水溶液搅拌均匀制备得到A体系；加入蒸馏水、磷酸盐水溶液搅拌均匀后制备得到B体系；脂溶性光敏剂溶液加入A体系或B体系中，或同时加入两体系中，搅拌均匀后将A体系与B体系混合后得到以脂溶性光敏剂为骨架的药物-纳米磷酸钙复合体系。本发明方法制备的给药体系水溶性高、分散性好，可以促进脂溶性光敏剂在血液中有效传输，增加给药体系载药量；同时本发明制备方法简单、易操作、稳定性高且成本低。本发明还涉及所述方法制备的给药体系在制备光动力疗法药物中的应用。
文档编号A61K41/00GK102198271SQ20111012824
公开日2011年9月28日 申请日期2011年5月18日 优先权日2011年5月18日
发明者冯玉英, 周家宏, 周林, 沈健, 魏少华 申请人:南京师范大学